Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

במבחנה טריז פרוסה הכנה עבור חיקוי בקישוריות מעגל עצבי Vivo

Published: August 18, 2020 doi: 10.3791/61664
Automatic Translation
1, 1
1Section on Neuronal Circuitry, National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, NIH

Summary

שילוב של תשומות סינפטיות מגוונות לנוירונים נמדד בצורה הטובה ביותר בהכנה שמשמרת את כל הגרעין הטרום-סינפטי לתזמון טבעי ול פלסטיות מעגל, אבל פרוסות מוח בדרך כלל מנתקות חיבורים רבים. פיתחנו פרוסת מוח שונה כדי לחקות פעילות מעגל vivo תוך שמירה על יכולת ניסויים במבחנה.

Abstract

במבחנה פרוסה אלקטרופיזיולוגיה טכניקות למדוד פעילות חד תאית עם רזולוציה חשמלית וזמנית מדויקת. פרוסות המוח חייבות להיות דקות יחסית כדי לדמיין כראוי ולגשת נוירונים עבור תיקון-הידוק או הדמיה, ובדיקת מבחנה של מעגלים במוח מוגבל רק מה שקיים פיזית בפרוסה חריפה. כדי לשמור על היתרונות של ניסויי פרוסת מבחנה תוך שמירה על חלק גדול יותר של גרעין פרסינאפטי, פיתחנו הכנת פרוסה חדשנית. "פרוסת טריז" זו תוכננה עבור הקלטות אלקטרופיזיולוגיה טלאי-מהדק לאפיין את התשומות המנוארות, מונחות קול, לנוירונים אוליבוקוליאר (MOC) בגזע המוח. נוירונים אלה מקבלים את תשומות מעוררות ומעכבות העיקריות שלהם מנויונים המופעלים על ידי גירויים באוזן ההתפלה וגרעין השבלול המתאים (CN). פרוסת מוח אסימטרית תוכננה שהיא העבה ביותר בתחום הרוזטרו-סיבתי בקצה הצדדי של חצי כדור אחד ולאחר מכן מדללת לכיוון הקצה הצדדי של חצי הכדור הנגדי. פרוסה זו מכילה, בצד העבה, את שורש העצב השמיעתי המעביר מידע על גירויים שמיעתיים למוח, המעגלים הפנימיים של CN, וגם את המסלולים המעכבים הדיסינפטיים והטריסינופטיים המתכנסים על נוירונים MOC נגדי. ההקלטה מבוצעת מנויונים MOC בצד הדק של הפרוסה, שם הם מדמיינים באמצעות אופטיקה DIC לניסויים טיפוסיים תיקון-מהדק. גירוי ישיר של עצב השמיעה מבוצע כאשר הוא נכנס לגזע המוח השמיעתי, המאפשר פעילות מעגל CN פנימית פלסטיות סינפטית להתרחש בסינופסות במעלה הזרם של נוירונים MOC. עם טכניקה זו, ניתן לחקות את הפעלת מעגל vivo קרוב ככל האפשר בתוך הפרוסה. הכנת פרוסת טריז זו ישימה למעגלים אחרים במוח שבהם ניתוחי מעגלים ייהנו משימור קישוריות במעלה הזרם וכניסות ארוכות טווח, בשילוב עם היתרונות הטכניים של פיזיולוגיה של פרוסה חוץ-חוץית.

Introduction

תצפית על פעילות של מעגלים עצביים מבוצעת באופן אידיאלי עם תשומות חושיות ומשוב מקוריים, וקישוריות שלמה בין אזורי המוח, ב vivo. עם זאת, ביצוע ניסויים הנותנים רזולוציה של תא יחיד של תפקוד מעגל עצבי עדיין מוגבל על ידי אתגרים טכניים במוח שלם. בעוד ב-vivo אלקטרופיזיולוגיה חוץ תאית או שיטות הדמיה multiphoton יכול לשמש לחקירת פעילות במערכות עצבים שלמות, לפרש כיצד תשומות שונות לשלב או מדידה תשומות סינפטיות subthreshold נשאר קשה. בהקלטות vivo תא שלם להתגבר על מגבלות אלה, אבל הם מאתגרים לבצע, אפילו באזורים במוח אשר נגישים בקלות. אתגרים טכניים של ניסויים ברזולוציה של תא יחיד מוגברים עוד יותר באוכלוסיות נוירון מסוימות הממוקמות עמוק במוח, או באוכלוסיות מפוזרות מרחבית הדורשות כלים גנטיים כדי לאתר תאים ב-vivo (למשל, ביטוי גנטי של channelrhodopsin בשילוב עם הקלטת optrode) או זיהוי היסטוכימי פוסט הוק לאחר תיוג אתר הקלטה (למשל עם סמנים ספציפיים לנוירוטרנסמיט). להיות ממוקם באופן מפוזר ליד פני השטח החנונים של גזע המוח, נוירונים olivocochlear מדיאלי (MOC) סובלים מהמגבלות לעיל1, מה שהופך אותם קשהמאוד לגשת לניסויים vivo.

פרוסות מוח (~ 100-500 μm עובי) שימשו זמן רב כדי ללמוד מעגלים במוח, כולל מעגלים גזע המוח השמיעתי, בשל ההפרדה הפיזית של נוירונים מחוברים הכלוליםבתוך אותה פרוסה 2,3,4,5,6,7,8,9. ניסויים באמצעות פרוסות עבות הרבה יותר (>1 מ"מ) הועסקו במעבדות אחרות כדי להבין כיצד תשומות דו-צדדיות משתלבות באזורים של קומפלקס אוליברי מעולה (SOC) כולל זיתמעולה מדיאלי 10,11. פרוסות אלה הוכנו כך כי האקסונים של עצב השמיעה (AN) נשאר שלם בתוך הפרוסה היו מגורה חשמלית ליזום שחרור מוליך עצבי סינפטי ב CN, מחקה פעילות של נוירונים שמיעתיים סדר ראשון כפי שהם יגיבו לקול. אחד החיסרון העיקרי של פרוסות עבות אלה הוא ניראות של נוירונים עבור הקלטות אלקטרופיזיולוגיות תיקון-מהדק ("תיקון"). תיקון הופך קשה יותר ויותר כמו האקסונים הרבים באזור זה הופכים מילינציה עם גיל12,13 ,14,15,מהשהופךאת הרקמה צפופה אופטית וסמיך נוירונים אפילו בפרוסת מוח טיפוסית, דקה. המטרה שלנו היא ליצור בהכנות מבחנה הדומות יותר לקישוריות המעגל של הקלטות vivo, אבל עם תפוקה גבוהה ויכולות הקלטה ברזולוציה גבוהה של אלקטרופיזיולוגיה מדבקה מונחית חזותית לפרוסות מוח.

המעבדה שלנו חוקרת את הפיזיולוגיה של תאי העצב של מערכת אפרטשמיעתית, כולל נוירונים MOC. נוירונים כולינרגית אלה מספקים משוב אדיש לשבלול על ידי לווסת את הפעילות של תאי שיער בחוץ (OHCs)16,17,18,19,20. מחקרים קודמים הראו כי אפנון זה ממלא תפקיד בהשיגשליטה בשבלול 21,22,23,24,25,26 והגנהמפני טראומה אקוסטית 27,28,29,30,31,32,33. בעכברים, נוירונים MOC ממוקמים באופן מפוזר בגרעין הפתח של גוף הטרפז (VNTB) בגזע המוחהשמיעתי 1. הקבוצה שלנו השתמשה בקו העכבר ChAT-IRES-Cre חצה עם קו העכבר כתב tdTomato למקד נוירונים MOC בפרוסות גזע המוח תחת תאורה אפיפלואורסצנטית. הראינו כי נוירונים MOC לקבל קלט מעכב אפיל מן הגרעין המדיואלי ipsilateral של גוף טרפז (MNTB), אשר נרגש, בתורו, על ידי אקסונים מתאים סבוך כדורי (GBC) בגרעין השבלול הניטרי (CN)34, 35,36,37,38. בנוסף, נוירונים MOC סביר לקבל קלט מעורר שלהם מתאי T-stellate ב CN39 ההתפלהההתפלה ,40,41. יחד, מחקרים אלה מראים נוירונים MOC לקבל הן תשומות מעוררות ומעכבות נגזר מאותה (קונטרה חוץ) אוזן. עם זאת, הנוירונים presynaptic, ואת האקסונים שלהם מתכנסים על נוירונים MOC, הם לא ממש קרובים זה לזה כדי להיות שלמים לחלוטין בהכנה פרוסת קורונל טיפוסית. כדי לחקור כיצד שילוב של תשומות סינפטיות לנוירונים MOC משפיע על דפוסי ירי פוטנציאליים הפעולה שלהם, עם דגש על עיכוב שתואר לאחרונה, פיתחנו הכנה שבה אנו יכולים לעורר את אפרטנטים מגוונים לנוירונים MOC מאוזן אחת בדרך הפיזיולוגית ביותר מציאותית האפשרית, אבל עם היתרונות הטכניים של ניסויי פרוסת מוח במבחנה.

פרוסת הטריז היא הכנת פרוסה עבה שונה שנועדה לחקירה של שילוב מעגלים בנוירונים MOC (ממוכמת בדמות 1A). בצד העבה של הפרוסה, הטריז מכיל את האקסונים הקותעים של עצב השמיעה (בשם "שורש עצב שמיעתי" להלן) כשהם נכנסים לגזע המוח מהפריפריה ולסינאפסה ב-CN. שורש העצב השמיעתי יכול להיות מגורה חשמלית כדי לעורר שחרור מוליך עצבי והפעלה סינפטית של תאים של CN42שלםלחלוטין,43,44,45,46. תבנית גירוי זו כוללת מספר יתרונות לניתוח מעגלים. ראשית, במקום לגרות ישירות את האקסונים T-stellate ו GBC המספקים קלט אדיש לנוירונים MOC, אנו לעורר את AN כדי לאפשר הפעלה של מעגלים פנימיים בשפע ב CN. מעגלים אלה לווסת את התפוקה של נוירונים CN ליעדים שלהם ברחבי המוח, כולל נוירונים MOC46,47,48,49,50,51. שנית, ההפעלה polysynaptic של מעגלים אפילים מן AN דרך CN במעלה הזרם של נוירונים MOC מאפשר תזמון הפעלה טבעי יותר עבור פלסטיות להתרחש בסינפסות אלה כפי שהם היו vivo במהלך גירוי שמיעתי. שלישית, אנחנו יכולים לשנות את דפוסי הגירוי שלנו כדי לחקות פעילות AN. לבסוף, הן תחזיות מונוארות מעוררות ומעכבות לנוירונים MOC הם שלמים פרוסת טריז, ואת השילוב שלהם ניתן למדוד בנוירון MOC עם הדיוק של אלקטרופיזיולוגיה טלאי-מהדק. ככלל, ערכת הפעלה זו מספקת מעגל שלם יותר לנוירונים MOC בהשוואה הכנה פרוסת מוח טיפוסית. פרוסת טריז גזע המוח זה יכול לשמש גם כדי לחקור אזורים שמיעתיים אחרים אשר מקבלים קלט מעכב מ-MNTB ipsilateral כולל זית מעולה לחוץ, גרעין אוליברימעולה וזית מעולהמדיאלי 10,11,52,53,54,55,56. מעבר להכנה הספציפית שלנו, ניתן להשתמש בשיטת חיתוך זו או לשנות כדי להעריך מערכות אחרות עם היתרונות של שמירה על קישוריות של תשומות ארוכות טווח ושיפור החזותיה של נוירונים עבור מגוון רחב של אלקטרופיזיולוגיה ברזולוציה חד-תאית או טכניקות הדמיה.

פרוטוקול זה דורש שימוש בשלב או בפלטפורמה של vibratome שניתן להטות כ- 15°. כאן אנו משתמשים בשלב מגנטי זמין מסחרית של שני חלקים שבו ה"במה" הוא דיסק מתכת עם תחתית מעוקלת הממוקמת ב"בסיס במה" מגנטי קעור. לאחר מכן ניתן להזיז את השלב כדי להתאים את זווית הפרוסה. עיגולים קונצנטריים בבסיס הבמה משמשים להערכת הזווית באופן רפרודוקטיבי. בסיס הבמה והשלב ממוקמים בתא החיתוך, שם ניתן גם לסובב את בסיס הבמה המגנטית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים הניסיוניים אושרו על ידי המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ / המכון הלאומי לחירשות והפרעות תקשורת אחרות טיפול בבעלי חיים וועדת שימוש.

1. הכנות ניסיוניות

הערה: פרטים לגבי הכנת פרוסה כולל תמיסת חיתוך, חיתוך טמפרטורה, טמפרטורת דגירה פרוסה וערכון (וכו ') הם ספציפיים להכנת גזע המוח שבוצעו בניסוי זה. ניתן לשנות את פרטי הדגירה לפרוסה לכל חוויית מעבדה.

  1. הכן פתרונות פנימיים להצמדת תיקון.
    1. הכן תמיסת מהדק מתח המכילה (ב- mM) 76 Cs-methanesulfonate, 56 CsCl, 1 MgCl2, 1 CaCl2, 10 HEPES, 10 EGTA, 0.3 Na-GTP, 2 מ"ג-ATP, 5 Na2-פוספוקרן, 5 QX-314, ו 0.01 אלקסה פלור-488 הידרזיד. כוונן את ה-pH ל- 7.2 באמצעות CsOH.
    2. הכן פתרון מהדק נוכחי המכיל (ב- mM) 125 K-gluconate, 5 KCl, 1 MgCl2, 0.1 CaCl2, 10 HEPES, 1 EGTA, 0.3 Na-GTP, 2 מ"ג-ATP, 1 Na2-phosphocreatine, ו 0.01 אלקסה פלור-488 הידרזיד. כוונן את ה-pH ל- 7.2 באמצעות KOH.
  2. להכין 100 מ"ל של 4% אגר על ידי הוספת 4 גרם של אגר 100 מ"ל חם (ליד רותח) מים. מניחים על לוח ערבוב מחומם כדי לשמור על הטמפרטורה ומערבבים עד להמסה מוחלטת. יוצקים לתוך 100 מ"מ פלסטיק פטרי מנות לעומק של כ 1 ס"מ ולתת להתקרר. למקרר עד שיהיה צורך.
  3. הכן 1 L נוזל מוחי שדרתי מלאכותי (ACSF) המכיל mM: 124 NaCl, 1.2 CaCl2, 1.3 MgSO4, 5 KCl, 26 NaHCO3, 1.25 KH2PO4, ו 10 דקסטרוז. בועה עם קרבוגן (5% CO2 / 95% O2) לפחות10 דקות, ולאחר מכן להתאים pH הסופי ל 7.4 עם 1 M NaOH במידת הצורך. לשמור על חמצון וחומציות של פתרון על ידי מבעבע ברציפות עם קרבוגן לאורך כל הניסוי.
  4. הכן 200 מ"ל חיתוך פתרון על ידי הוספת 1 mM חומצה kynurenic ACSF. תמיסת Sonicate באמבט מים sonicating במשך 10 דקות עד חומצה kynurenic מומס. בועות ללא הרף עם קרבוגן והמקום על קרח.
    התראה: השתמש בציוד מגן אישי מתאים בעת טיפול בחומצה קינורית.
  5. הר להב מתאים ברעידת התנודות בהתאם להוראות היצרן. צינו את תא החיתוך של ויברטום על ידי כך שהם מקיפים אותו בקרח.

2. הסרת מוח עם שורש עצבי שמיעתי שלם לגירוי

הערה: עכברים לניסויים אלה הושגו על ידי חציית עכברים טרנסגניים ChAT-IRES-Cre על רקע C57BL/6J עם עכברים כתב tdTomato (Ai14). עכברים המשמשים להיסטולוגיה ואלקטרופיזיולוגיה היו לאחר השמיעה תחילת (P14-P23), שהוא סביב P12 בעכברים. נוירונים המביעים tdTomato בגרעין הפתח של הגוף טרפז (VNTB) כבר מאופיינים בעבר כנוירונים MOC בקו העכברהזה 57.

  1. המתת סד (למשל, חנק CO2) ולערוף את ראשו של בעל החיים באמצעות הליכים מוסדיים מאושרים.
  2. באמצעות סכין גילוח, לחתוך את העור בקו האמצע של הגולגולת מהאף אל החלק האחורי של הצוואר. לקלף עור בחזרה כדי לחשוף את הגולגולת.
  3. באמצעות מספריים קטנות, לעשות חתך בגולגולת דרך קו האמצע החל בבסיס (קצה סיבתי ליד חוט השדרה) של הגולגולת וממשיך לכיוון האף.
  4. בתפר lambda, לעשות חתכים בגולגולת מן קו האמצע, לצדדים לכיוון האוזן משני הצדדים. לקלף בחזרה את הגולגולת כדי לחשוף את המוח.
  5. החל מקצה הרוזל, הרם בעדינות את המוח מהגולגולת עם מרית מעבדה קטנה או משקולות קהות. חותכים את עצב הראייה וממשיכים לעבוד בעדינות על המוח לאחור, וחושפים את פני השטח הגחונים.
  6. חותכים את העצבים התלת-מינליים על-ידי צביטתם במקציצות עדינות ליד פני השטח הגינון של גזע המוח.
    הערה: עשה זאת בזהירות כמו העצב vestibulocochlear נמצא ממש מתחת לזה וצריך להיות שלם לגירוי בסופו של דבר.
  7. מניחים את ההכנה בצלחת פטרי זכוכית מלאה בתמיסת חיתוך קרה. מניחים את הצלחת מתחת למיקרוסקופ לנתח. בועות בעדינות עם קרבוגן.
  8. לקצץ את עצב הפנים קרוב לגזע המוח ולחשוף את העצב vestibulocochlear.
  9. באמצעות מקצות עדינים, לדחוף את הטיפים לתוך foramina שבו עצב vestibulocochlear יוצא מהגולגולת ככל האפשר וצובט את העצב כדי לנתק אותו, עוזב את שורש העצב מחובר לגזע המוח. חזור על זה בצד השני.
  10. ברגע ששני שורשי העצבים חופשיים, הסר את קרום המוח וכלי הדם מפני השטח האוורריים של גזע המוח ליד גוף הטרפז.
  11. שחררו את המוח לחלוטין מהגולגולת על ידי צביטת עצבי הגולגולת הנותרים ורקמות החיבור שדאגו לשמר את חוט השדרה הנותר במידת האפשר.

3. לחסום ולהר המוח על הבמה (דיסק מגנטי)

  1. הכן את פני השטח של המוח כדי לתקן את הבמה על ידי חסימת המוח ברמה של chiasm אופטי.
    1. עם פני השטח הפתח, לייצב את המוח באמצעות כלי קהה כדי לשתק בעדינות את חוט השדרה, כך שהמוח לא להטות במהלך השלב הבא.
    2. ברמת chiasm אופטי, להשתמש מכריחים פתוחים כדי ליצור את המטוס לחסימת המוח על ידי החדרת דרך המוח עד לתחתית הצלחת. הכנס את המקציצות בזווית של כ-20° אנכית, כך שהקצוות יוצאים מפני השטח הגביים של המוח לקסם האופתי.
    3. חותכים לאורך המקצות בעזרת סכין הגילוח.
  2. הדבק את המוח לפני השטח של הבמה.
    1. להכין בלוק קטן (~ 1ס"מ 3)של 4% אגר לתמיכה במוח.
    2. מניחים טיפת דבק קטנה על הבמה ומורחים אותה למלבן כך שניתן יהיה להדביק את המוח ואת גוש הגר כלפי מטה.
    3. בעזרת מקצות, הרם בזהירות את המוח וטבול בעדינות את הנוזל העודף בעזרת מגבת נייר. מניחים את המשטח החסום על הדבק, משטח גחן יהיה לכיוון הלהב במהלך החיתוך.
    4. לחץ את בלוק אגר בעדינות על פני השטח הגב של המוח כדי לתמוך בו במהלך החיתוך ולהבטיח מיקום המוח הנכון (כלומר, זווית).

4. פרוסת מוח כדי ליצור פרוסת טריז

הערה: להכין פרוסת מוח באמצעות vibratome כי יש את שורש עצב שבלול בצד עבה וoivocochlear מדיאלי (MOC) נוירונים ואת הגרעין המיקלי של גוף הטרפז (MNTB) בצד הדק.

  1. מניחים את הדיסק המגנטי עם מוח מחובר על בסיס הבמה והניחו אותו בתא החיתוך עם המשטח האוורני של המוח הכוון לכיוון הלהב.
  2. ממלאים את התא בתמיסת חיתוך קרה כקרח ובועות עם קרבוגן.
  3. מנמיכים את הלהב לתמיסה וחותכים פרוסות סיבתיות לאזור העניין כדי לוודא שהפרוסות סימטריות. אם הפרוסות מופיעות א-סימטריות, הטה מעט את השלב כדי להשיג סימטריה.
    הערה: מהירויות הלהב בין 0.05-0.10 מ"מ/s היו יעילות לחיתוך פרוסות בריאות עשויות להשתנות בהתאם לגיל בעלי החיים ולאזור המוח.
  4. לאחר שהפרוסות סימטריות, הסט את השלב ~ 15° (המתאים לכ-3 טבעות קונצנטריות בבסיס הבמה) לצד אחד.
    הערה: הסט את השלב הרחק מהשורש העצבי השמיעתי שברצונך לשמר בפרוסה.
  5. המשיכו לחתוך בזהירות עד שורש עצב השמיעה קרוב לפני השטח בצד אחד, ואת עצב הפנים ניתן לראות על פני השטח של הצד השני.
  6. הזז את הבמה אחורה ב-15° למיקום המקורי.
  7. הזיזו את הלהב מהרקמה וסובבו את בסיס הבמה ב-90° כך שהקצה הצדדי של הצד הדק יעמוד מול הלהב. מנמיך את הלהב כמה מאות מיקרון ולאחר מכן לאט להביא את הלהב קרוב לקצה הרקמה. חזור על כך עד שהלהב נוגע בקצה הניגע. מנמיכים את הלהב לעובי הרצוי של הקצה הדק של הפרוסה, כאן 200 מיקרון נוספים.
    הערה: הפרוסה שנוצרת היא באופן אידיאלי ~ 300 מ"מ עבה ברמה של גרעין גחן של הגוף טרפז (VNTB) בצד שבו הידוק תיקון יתקיים.
  8. הזז את הלהב בחזרה מהרקמה וסובב את בסיס הבמה בחזרה כך שמשטח האוורור פונה אליו.
  9. בצע את החתך המייעד את פני השטח הרוזסטרליים של פרוסת הטריז. מעבירים את הפרוסה לפיסת נייר ממשק (1 ס"מ2)כלפי מטה. מעבירים את הפרוסה לתא הדגירה או ללחן דגירה מתאים אחר להתאוששות (30 דקות ב-35°C).
    הערה: עצב הפנים צריך להיות גלוי על שתי ההמיספרות של הפרוסה על פני השטח rostral (ראה איור 1B).

5. התענווות והקלטה אלקטרופיזיולוגית

  1. מניחים את פרוסת הטריז בתא ההקלטה ומאבטחים פרוסה עם נבל או מערכת ייצוב. להסתב את הרקמה ברציפות בקצב של 7-10 מ"ל/ דקה עם חם (35 ° C) ACSF מבעבע עם קרבוגן.
  2. זהה נוירונים MOC מתויגים גנטית ב VNTB באמצעות epifluorescence עם מסנני פליטה 561 ננ"מ עבור הקלטות תיקון-clamp. הפוך פרוסה אם אין תאים שעשויים להיות לא תקן.
  3. באמצעות אופטיקה DIC, להתמקד שורש עצב השמיעה בצד העבה של הפרוסה ולהשתמש micromanipulator כדי להזיז את האלקטרודה טונגסטן דו קוטבית מגרה עד שורש העצב השמיעתי בעדינות לתוך פני השטח של הרקמה.
    הערה: אלקטרודות יניקה שימשו בניסויי גירוי עצבי שמיעתי במעבדות אחרות. אלקטרודות זכוכית תטא, או שיטות גירוי אופטי ניתן להשתמש אם ישים על הכנות ספציפיות אחרות.
  4. העבר את שדה התצוגה בחזרה לVNTB כדי לבחור נוירון MOC למקד אלקטרופיזיולוגיה מהדק תיקון.
  5. מלא פיפט הקלטה עם פתרון פנימי מתאים לניסוי המוצע.
  6. תיקון ותיעוד מהנוירון MOC בתצורת התא כולו. לפצות על קיבוליות קרום והתנגדות סדרה במידת הצורך.
  7. להתאים משרעת גירוי חשמלי של שורש העצב השמיעתי כדי לקבל אירועים postsynaptic עקבי בנוירון MOC.
    הערה: ייתכן שיהיה צורך להזיז את אלקטרודה הגירוי.
  8. הפעל פרוטוקולי גירוי מתאימים כדי לצפות זרמים סינפטיים עוררו MOC (מהדק מתח) או דפוסי פעולה פוטנציאליים (מהדק הנוכחי).
    הערה: הכנת פרוסת טריז יכול לשמש עם כל כלי תיקון-מהדק טיפוסי כגון הקלטות תיקון רופף, פרמקולוגיה, אופטוגנטיקה, הדמיית סידן, מוליך עצבי uncaging, וכו '.

6. אישור היסטולוגי של גרעין גזע המוח

הערה: פעולה זו נעשית עם כתמי cresyl סגול, קבוע, פרוסת טריז מחדש לחתוך. שיטה זו מאפשרת הדמיה של גרעין הכלולים בפרוסה.

  1. לאחר הכנת פרוסת טריז, לשקוע פרוסה קיבע (4% PFA ב PBS) בן לילה. לשטוף את הפרוסה 3x במשך 10 דקות PBS (טמפרטורת החדר על שייקר), ולאחר מכן למקם 30% סוכרוז ב PBS לילה ב 4 מעלות צלזיוס cryoprotect.
  2. לחתוך מחדש את הפרוסה על microtome קפוא (40-70 מ"מ) ולאסוף קטעים טוריים בצלחת 24 באר PBS.
  3. הר קטעים על שקופיות מצופה ג'לטין ולתת להתייבש לחלוטין. מקם שקופיות בכרכרה שקופיות.
  4. הכנת פתרונות סיגלית קרסיל
    1. להכין 1% אצטט סגול cresyl על ידי ערבוב 5 g cresyl סגול אצטט ב 500 מ"ל dH2O
    2. להכין מאגר אצטט על ידי הכנת פתרון 90 מ"ל הראשון A (540 מ"ל חומצה אצטית קרחונית + 89.46 מ"ל dH2O) ו 10 מ"ל פתרון B (136 מ"ג נתרן אצטט ב 10 מ"ל dH2O). שלב פתרון א' ופתרון ב' המניבים את מאגר אצטט.
    3. שלב 1% cresyl סגול אצטט עם מאגר אצטט 1:1 עבור 0.5% cresyl סגול במאגר אצטט. סנן לפני השימוש.
    4. להכין 95% ו 70% אתנול על ידי דילול 100% אתנול עם נפחים מתאימים של dH2O
  5. בצע פרוטוקול כתמים סגול cresyl. מעבירים את מדרכה במגשי הפתרונות, וממיסים פתרון עודף על מגבת נייר בין מגשים: קסילן – 5 דקות; 95% אתנול – 3 דקות; 70% אתנול – 3 דקות; dH2O – 3 דקות; 0.5% תמיסת קרסיל סגול – 8-14 דקות ניטור לעתים קרובות עד כתמים גרעיניים הופך סגול כהה; dH2O – 3 דקות; 70% אתנול – 3 דקות; 95% אתנול – 1-2 דקות; 100% אתנול – לטבול שקופיות פעמיים; xylene – 5 דקות; xylene: 25 דקות עד ביצוע הרכבה.
    התראה: השתמשו קסילנים רק מתחת למכסה אדים.
  6. הסר שקופיות מ- xylene אחד בכל פעם ומיד מניח מחליקי כיסוי על שקופיות באמצעות אמצעי הרכבה. אפשר הרכבה בינונית עד יבשה (בן לילה).
  7. מקטעי תמונה.

7. תיוג ביוציטין למעקב anterograde של אקסונים ברקמות חיות, לא תקינה

  1. הכן פרוסת טריז כאמור לעיל (שלבים 2-4).
  2. מעבירים את הפרוסה לנייר ממשק (כ-1ס"מ 2). תחת מיקרוסקופ לנתח, לאתר את CN בצד העבה של הפרוסה.
  3. הסר בזהירות ACSF עודף מהאזור המקיף את הפרוסה על ידי פיתול פינה של נייר טישו כדי למשוך את ACSF מן הרקמה. זה מונע ביוציטין מהתפשטות לאזורים שמסביב של הפרוסה אשר יכול להוביל ספיגה לתאים מחוץ CN.
  4. עם מפלצות עדינות, בחר גביש קטן של ביוציטין והישם אותו על פני השטח של CN. בעדינות לחץ על הגביש לתוך הרקמה כדי לקדם את הקשר עם נוירונים וספיגה לאחר מכן לתוך somata. חזור על שלב זה כדי לכסות את האזור הרצוי של עניין, במקרה זה אזורי CN המכילים T-stellate ונוירונים GBC.
  5. מניחים את הפרוסה בתא דגירה. אפשר לפרוסה לדגר במשך 2-4 שעות ב-35°C כדי לאפשר ספיגה והובלה של הביוציטין. לאחר הדגירה, לשטוף את הפרוסה ACSF כדי להסיר את כל חלקיקי ביוציטין.
  6. מניחים פרוסה במתקן (4% PFA ב-PBS) למשך הלילה. לשטוף 3x במשך 10 דקות PBS.
  7. פרוסת Cryoprotect ב-30% סוכרוז ב-PBS למשך הלילה ב-4°C או עד שהפרוסה שוקעת.
  8. ללקט את הרקמה כדי לייצר קטעים רוחביים על microtome קפוא ב 70-100 מ"מ.
  9. תהליך רקמת באמצעות שיטות אימונוהיסטוכימיות סטנדרטיות עם סטרפטאבידין פלואורסצנטי.
    הערה: אימונוהיסטוכימיה נוספת יכולה להתבצע על הסעיפים אם מועיל לתיוג גופים תאי presynaptic, אקסונים, קולטנים, או מולקולות סינפטיות אחרות חשוב עבור החזות מעגל (כלומר, צעדי נוגדנים ראשיים לא צריך להשפיע לרעה על הדמיה משנית ביוציטין).
  10. תדמינו את הרקמה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בדיקה היסטולוגית של פרוסת טריז
לחקירה שלנו של תפקוד נוירון גזע המוח השמיעתי, הכנת פרוסת טריז תוכנן להכיל את שורש העצב השמיעתי ו CN נגדי לנוירונים MOC המיועדים להקלטות (פרוסה לדוגמה המוצגת איור 1B). בדיקה היסטולוגית ראשונית של ההכנה חשובה כדי לאשר כי הפרוסה מכילה את הגרעין הדרוש להפעלת מעגלים ושתחזיות אקזונל אינן שלמות. שני סוגי תאים בתוך CN לספק מידע קול לנוירונים MOC. תאי T-stellate הם שיערו כדי לספק את הקלט מעורר לנוירונים MOC39,40,41,58. תאים כדוריים סבוכים (GBC) לרגש נוירונים MNTB בחצי הכדור ההתפלה (באמצעות calyx מיוחד של סינפסה מוחזק)34,36,37,38,59,60 אשר, בתורו, לספק קלט מעכב לנוירונים MOC57 (איור סכמטי 1A). כדי לאשר את הנוכחות של שני תאי T-stellate ו GBCs, אנחנו מחדש לחתוך (כדי 50 μm) פרוסת טריז שתוקנה על ידי צוללת ב 4% PFA וביצע כתמימת סגול cresyl לתייג סומטה. בצד העבה של פרוסת הטריז(איור 2, חצי הכדור השמאלי), CN היה נוכח כמעט בהיקף הרוזטרו-סיבתי המלא שלו. בנוסף, תת-החטיבות של ה-CN היו שלמות(איור 2; חץוחץ ב-S19). נוירונים T-stellate ואשכול GBCs בגרעין שבלולים גחוני ליד שבוהעצב השמיעתי( איור 2 ; חץ ב S17) נכנס CN61,62,63,64,65. פרוסת הטריז מכילה גם נוירונים של ה-MNTB ipsilateral לנוירונים MOC שממנו מבוצעים הקלטות (חצי הכדור הדק של פרוסת הטריז המקורית, בצד ימין בדמות 2). זה מאשר כי לפחות חלק מהקלט המעכב לנוירונים MOC הוא שלם(איור 2, פרוסות 1-15, מודגש על ידי אליפסות מקווקו ב S11).

בניסויים נפרדים, אישרנו כי האקסונים והמסופים presynaptic של נוירונים CN היו שלמים בפרוסת טריז באמצעות תיוג anterograde עם ביוציטין. ראשית, פרוסת הטריז החיה הוכנה והונחה על נייר ממשק. מיד לאחר הכנת פרוסת הטריז, גבישי ביוציטין הונחו ב-CN אשר אפשר ספיגה והובלה anterograde לאורך אקסונים במהלך תקופת דגירה. לאחר מכן בוצע תיקון וקתיע מחדש של הרקמה (70 מ"מ). כתם של קטעים עם סטרפטאבידין פלואורסצנטים בוצע כדי לדמיין אקסונים המסויגים עם ביוציטין. תמונות קונפוקליות של מקטעים אלה להראות תיוג בהיר ב CN שבו הגבישים הונחוונלקחו לתוך גופים תא (איור 3A,חצי הכדור השמאלי, אזור מקווק). אקסונים היוצאים מה-CN לאורך הסטריה האקוסטית הקונדרית(איור 3A, ראשי חץ לבנים) סומנו בבירור וניתן היה לעקוב אחריהם לנקודות הסיום שלהם. ביוציטין חיובי puncta סביב נוירונים MOC contralateral מציע ההכנה שלנו משמרת מגעים סינפטיים שמקורם CN(איור 3B). כמו כן, מתויג calyces של החזיק ב MNTB ההתפלה ההתפלה מצביע על אקסונים הקרנה מ GBCs לנוירונים MNTB נשמרים פרוסת טריז(איור 3C). בדיקות היסטולוגיות אלה מאשרות שפרוסת הטריז שלנו מכילה הן את גופי התא והן את התחזיות האקסונאליות של מעגלי הקלט האדישים לנוירונים של MOC, מה שמאפשר לנו למדוד תגובות פוסט-סינטטיות שהתעוררו על ידי גירוי של עצב השמיעה והפצת הפעילות לאחר מכן באמצעות מעגלים עולים.

פיזיולוגיה סינפטית בפרוסת טריז
שילוב של תשומות סינפטיות מעוררות ומעכבות מעצבות באופן ביקורתי פעילות עצבית. לאחרונה תיארנו תשומות מעכבות לנוירונים MOC מנוירים של MNTB57, אבל ההשפעה של שילוב של תשומות אלה עם תשומות מעוררות על פעילות נוירון MOC אינה ידועה. בפרוסת טריז מעכבר ChAT-IRES-Cre x tdTomato, הקלטות מתח-מהדק בוצעו מנוירן MOC. הזרם הוחל באמצעות אלקטרודה טונגסטן דו קוטבית מגרה מונע על ידי יחידת בידוד גירוי לעורר שחרור מוליך עצבי מאקסונים presynaptic. ראשית סטריה אקוסטית גחונה (VAS) בקו האמצע היה מגורה חשמלית כדי להפעיל את האקסונים T-stellate ישירות ונוירונים MNTB באמצעות גירוי Axon GBC(איור 4A),כדי למדוד את ההשהיה לתגובות פוסט-סינפטיות בתצורת הקלטה המחקה ניסויים טיפוסיים שלפרוסה דקה (איור 4B), עקבות לדוגמה,אפור, מחזיק פוטנציאל -60 mV). בניסויים נפרדים, שורש העצב השמיעתי היה מגורה להפעיל מעגלים עולים מונואר ותגובות פוסט סינפטי נמדדו בנוירונים MOC כמתואר לעיל. גירוי חשמלי בכל אחד מהמקומות עורר חפץ חשמלי מהיר ואחריו תגובות זרם מרובות (תגובות לדוגמה מגירוי AN באות 4C, עקבות שחורים, מחזיק פוטנציאל -60 mV). השווינו את מדדי ההשהיה הראשונים של הזרם הפוסט-סינפטי הראשון (PSC) שעוררו גירוי ישיר של ה-VAS עם אלה שעוררו גירוי עצבי שמיעתי ומצאו השהיה ארוכה יותר באופן משמעותי באירועי גירוי AN. זה יוחס לעיכוב הסינאפטי שנצבר בסינפסה AN/CN (גירוי AN: 5.27 ± 0.43 השנייה, חציון ± סטייה מוחלטת חציון (MAD), טווח 4.26-5.93 ms, n = 8; גירוי VAS: 1.98 ± 0.28 ms, חציון ± MAD, טווח 0.75-3.46 ms, n = 17; וילקוקסון חתם דירוגים מבחן, p = 0.014, איור 4D). תוצאות אלה מאשרות כי גירוי של שורש עצב השמיעה תוצאות הפעלה סינפטית של נוירונים CN ופעילות המעגל הבא, המייצג באופן הדוק יותר vivo – כמו תזמון מאשר גירוי ישיר של T-stellate או GBC / MNTB אקסונים.

עם צסיום שלנו מבוסס, גבוה [Cl-] פתרון פנימי המשמש במלחצי מתח, מעורר (גלוטמטורגית) ומעכב (GABA ו glycinergic) PSCs שניהם פנימה במנוחה פוטנציאל קרום (-60 mV) ולכן לא ניתן להבחין. תוך כדי העלאת פעילות המעגלים בתצורת הגירוי של AN, בודדנו חשמלית את הקלט המעכב המשוער על-ידי הסטת פוטנציאל ההחזקה ל-0 mV, פוטנציאל ההיפוך המשוער עבור זרמי גלוטמטורגית מתווכים של AMPA. בדוגמה שלנו נוירון, תגובות זרם כלפי חוץ נצפו ב 0 mV (איור 4Ci, עקבות אדומים) המציין מוליכות כלוריד. אלה צפויים להיות גאבא- או ג'יקינירגי תגובות סינפטיות. נתונים אלה מדגימים את התועלת של פרוסת הטריז כדי להפעיל הן תשומות מעוררות ומעכבות לנוירונים MOC על ידי גירוי שורש העצב השמיעתי, עם הפעלה של מעגלים שונים הבאים. יתר על כן, דפוסים מגוונים של תגובות פוסט-סינפטיות עוררו גירוי AN, המצביע על כך שגם בתנאים של גירוי זהה של אקסונים AN, הפעילות של המעגל כולו היא דינמית ומורכבת. פרדיגמה ניסיונית זו מאפשרת ניתוח מפורט של האופן שבו גירויים שמיעתיים מורכבים להפיץ דרך גזע המוח ולהשתלב בנוירונים MOC, קביעת התפוקה של מערכת EOC אפרט ובסופו של דבר השפעה על השבלול.

Figure 1
איור 1: סכמטי פרוסת טריז ותמונה לדוגמה. (א)סכמטי של מעגל המשוב האוליבוקוכליר המדל. חצים כחולים מצביעים על המסלול העולה א-ק-ט לנוירונים של MOC וחצים שחורים המעידים על מסלול המשוב היורד מנויונים MOC לבסיס תאי השיער בחוץ (OHC). (ב)תמונת Brightfield של פרוסת טריז עם תוויות של שורש העצב השמיעתי (ANR) וגרעין השבלל (קווי מתאר מקווקווים) בצד העבה. כוכבית מציינת את המיקום המשוער של גרעין הפתח של גוף הטרפז שבו נוירונים MOC מכוונים לדבק תיקון בצד הדק של פרוסת טריז. קווים שחורים מקווקווים מצביעים על עצבי הפנים שניתן לראות בשני ההמיספרות של הפרוסה על פני השטח הרוזל. IHC - תא שיער פנימי, GBC - תא כדורי סבוך, SPN - גרעין paraolivary מעולה, MNTB - גרעין המדאלי של גוף הטרפז, VNTB - גרעין גחוני של הגוף טרפז, LSO - זית מעולה לבסוף. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: מקטעים מוכתמים של סגול Cresyl מפרוסת טריז שנותח מחדש ב- 50 μm. כל חלק אחר היה בתמונה. המקטעים ממוספרים ברוסטאל --> סיבתי. פרוסות טריז נטו להכיל את כל גרעין השבלל (CN) כולל הן CN הגב (חץ ב S19) ו CN גחוני (ראש חץ ב S19), שורש עצב שמיעתי (ראש חץ פתוח ב S17) והרבה MNTB (אזור כהה ליד משטח גחוני S3-S15, מודגש עם אליפסות מקושצות ב S11). D ו-V על סרגל קנה מידה מייצגים גב וגנון בכיוון פרוסה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: אקסונים של קלט עולה לנוירונים MOC מגרעין השבלת הניטרי נשארים שלמים בפרוסת הטריז. (א)המקטע rostral-most מפרוסת טריז נלקח P23 ChAT-IRES-Cre x tdTomato (פלואורסצינטי אדום) עכבר שנקטע מחדש (70 μm) ומעובד עבור הדמיה ביוציטין. תמונה קונפוקלית היא z-stack הקרנה מרוצף בעוצמה מקסימלית. אקסונים בסטריה האקוסטית הפתחית מודגשים על ידי ראשי חץ לבנים. קווי מתאר מקווקוויים מציינים את החלק הקטן של גרעין השבלול שנותר בפרוסה זו. סרגל קנה מידה 500 μm. (ב)תמונה קונפוקלית של צ'אט-IRES-Cre x tdTomato נוירון חיובי ב VNTB עם נקסטה חיובית ביוציטין בnozil שמסביב. סרגל קנה מידה 50 μm. (ג)ביוציטין שכותרתו אקסונים המוצגים חוצים את קו האמצע וסיום MNTB ההתפלה כcalyces של החזיק. קו מקווקו אנכי מייצג את קו האמצע של הפרוסה. סרגל קנה מידה 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו.

Figure 4
איור 4: גירוי חשמלי של כניסות א-שונים במלחצי מתח מניב זרמים פוסט-סינפטיים רבים בנוירונים MOC. (א)סכמטי של פרוסת טריז עם הגדרת הקלטה עבור גירוי סטריה אקוסטית (VAS) גחוני (אלקטרודה מגרה אפור) וגירוי עצבי שמיעתי (AN) (אלקטרודה מגרה שחורה) של תשומות א-שונים ל-MOC. (ב)דוגמאות של זרמים postsynaptic (PSCs) מנוירן P17 בודד עורר עם גירוי חשמלי יחיד ליד קו האמצע ב -60 mV. (ג)PSCs עורר במהלך גירוי ב -60 mV בנוירון P15. (Ci) PSCs לדוגמה באותו תא כמו C עורר ב 0 mV מחזיק פוטנציאל (פוטנציאל היפוך משוער עבור זרמים מתווכים AMPA בהגדרת ההקלטה שלנו, אדום). (D)נתוני אוכלוסין לכמת את ההשהיה ל- PSC הראשון עבור VAS וגירוי AN. תיבות: מריבות, קו inset: חציון, התחלה מרובעת: ממוצע, שפם: סטייה מוחלטת חציון. * p < 0.05. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הליך החיתוך המתואר כאן כננה פרוסת טריז הוא רב עוצמה לשמירה על מעגלים עצביים presynaptic שלם, אבל עם הנגישות של ניסויים פרוסת המוח לניתוח של תפקוד עצבי. יש לנקוט בזהירות רבה במספר צעדים ראשוניים על מנת למקסם את התועלת של ההכנה לניתוח מעגלים. יש לאשר את ממדי הטריז באמצעות בדיקה היסטולוגית, שהיא חלק בלתי נפרד מאישור כי הן הגרעין הקדם-סינפטי והן ההקרנה האקזונלית שלהם כלולים בתוך פרוסת הטריז המוכנה. גיאומטריית הפרוסה עשויה לדרוש שינוי אם ההקרנה נחתכה או כמה אקסונים מגיעים לגרעין היעד. באופן כללי יותר, החיתוך הסופי על הויברטום עבור פרוסת הטריז חשוב באופן קריטי. הכנה אופטימלית לפרוסת טריז תדרוש שילוב של שימוש עקבי בתצורות ויברטום כולל שימוש בסמוני עיגול קונצנטריים בבסיס הבמה, יחד עם התאמת הגדרות המבוססות על ציוני דרך ידועים במוח. לאחר אופטימיזציה של גיאומטריית פרוסה, הקלטנו PSCs עקביים בנוירונים MOC עורר על ידי גירוי חשמלי של שורש עצב השמיעה ב 8 של 18 פרוסות טריז. בעבודה הקודמת שלנו הצלחנו לעורר PSCs מעכב באמצעות גירוי ישיר של אקסונים MNTB בכ 60% של נוירונים MOC57, מה שמצביע על כך שיעור ההצלחה שלנו כאן הוא רק הפחתה צנועה בהתחשב בטווח הארוך של תשומות וצורך הפעלת מעגל polysynaptic. בעת הכנת הפרוסה, מומלץ לתוות בצד העבה יותר כמו ירידה בראות בשל פרוסה עבה יותר הוא חיובי על פני סעיף לא שאף אשר אינו שלם או חסר קישוריות מעגל. ניתן להשתמש בכל תצורת פרוסה או ממדים, כל עוד הפרוסה מתאימה למטרת מיקרוסקופ ההקלטה, נגישה באמצעות תיקון ואלקטרודות מגרה (או גששים או ציוד אחרים), והיא דקה מספיק עבור הידוק תיקון מבוסס אופטי בתא העניין הפוסט-סינטטי. פעולה מהירה, עדינה ותנאי דגירה והתאוששות נאותים חשובים גם כדי לשמור על הכדאיות של המעגל לניסויים מדבקת מהדק. ספציפית להכנת גזע המוח השמיעתי שלנו, יש להסיר את המוח בזהירות רבה מהגולגולת על מנת לשמר שורשי עצב שמיעתיים שלמים ופונקציונליים. מתיחה או קריעת העצב ישפיעו על היכולת לעורר את הסיבים ולעורר פעילות בנוירונים שמיעתיים. בשל נפח גדול יותר של רקמות בפרוסה, שינוי של פתרונות חיתוך מסורתיים, טמפרטורות, פרטי דגירה, ומערכות עירוי עשוי לשפר את הבריאות של הפרוסה. כאן אנו משתמשים בשינויים קלים בהכנת הפרוסה הרגילה שלנו. אלה כוללים זמני דגירה קצרים יותר של התאוששות (30 דקות לעומת 60 דקות) ומהירות זרימה מהירה יותר במערכת התערוב של תא הפרוסה.

לאחר שנקבעו מידות הפרוסה ופרטי הדגירה, יש להפגין את הפונקציה והקישוריות של רכיבים שונים של מעגלים חשמליים בתוך הפרוסה. בהכנה שלנו, אנו מבטיחים כי הן תשומות מעוררות ומעכבות, שיערו שמקורן בגרעין השבלול עם T-stellate ו-GBC (באמצעות MNTB), תהיה נוכחת כצפוי. שיטות גירוי חלופיות כגון אלקטרודות יניקה עבור עצב השמיעה, או שיטות גירוי אופטי כגון optogenetics או נוירוטרנסמיטר מוקד uncaging עשוי גם להגביר את הפעלת מעגל או לאפשר הפעלה ספציפית מסוג תא כאשר בשילוב עם פילוח גנטי של תת סוגי תאים.

בעוד ששיטת חיתוך זו תהיה שימושית בתקווה עבור מערכות ומעגלים רבים, חלק מהמגבלות של מקטעים סטנדרטיים של פרוסות דקות רלוונטיות גם להכנה זו. בדרך כלל, ייתכן שיהיה קשה לשמר מעגלים עם דפוסי הקרנה פחות כנכניים, כפי שסביר להניח שהאקסונים נותקו. הפעלת המעגל בעצבי הגולגולת, כפי שנעשה כאן כדי לחקות תשומות שמיעתיות, לא יכולה להיות אפשרית במעגלים רבים. כמו בהכנות פרוסה אחרות, יש לקחת בחשבון את השפעות הרשת של כל פרמקולוגיה. לדוגמה, יישום אמבטיה של חוסמי קולטן גלוטמט כדי לבודד מעכב (GABA- או ג'יצינרגי) או מצבי שידור אחרים לא ניתן להשתמש עם הפעלת מעגל פוליסינופטי כאשר גלוטמט יש צורך בהפעלה של נוירונים במעלה הזרם של נוירון היעד התיקון. זה נכון במקרה שלנו כמו שני AN / CN ו GBC / MNTB synapses הם גלוטמטורגית, לכן, כל השידור יבוטל בנוירונים MOC עם יישום אמבטיה של חוסמי קולטן גלוטמט. בנוסף, יישום של חוסמי קולטן גאבא או גליסין לחסל תגובות סינפטיות MNTB-MOC תהיה תוצאה לא מכוונת של ביטול קישוריות מעכבת פנימית בתוך CN שעשוי לעצב את הדפוסים של תשומות שונות לנוירונים MOC. יישום מוקד של חוסמי קולטן, עם פליטת לחץ או iontophoresis, יכול לשמש כדי להגביל את התפקוד התרופתי.

לבסוף, המגבלה העיקרית של זה, וכל, בטכניקה מבחנה היא כי למרות הכנה זו ממקסמת את ההפעלה של מעגלים שמיעתיים עולה מונאאלי, שאר מערכת העצבים, כולל קולטנים היקפיים המקודדים גירויים, נעדר. זה כולל את השבלול עצמו, תשומות מעוררותמהאוזן השנייה 66, חיבורי CN קומיסרליים67,68,69,70,וירידתקליפת המוח 71 , 72,73,74 ו קוליקולרי75,76 תחזיות וכניסות מודולטוריות77, 78,79,80 ידוע להשפיע על הפעילות של CN ו SOC nuclei. אמנם זה אפשרי כי חלק של תחזיות IC יורד נשמרים זה יהיה בלתי אפשרי לכלול גם תחזיות קליפתיות ותחזיות CN קומיסרלית בשל גיאומטריה פרוסה. לפיכך, אנו מתמקדים במעגל השמיעה העולה מהשבלול עם הניסויים הנוכחיים. העובי המינימלי של הפרוסה בצד הדק גם מפחית את היכולת לבצע ניתוחי מעגלים פוליסינפטיים דו-לאומיים, שהוא יתרון של תכשירי פרוסה עבהסימטרית 10,11. בנוסף, אין באפשרותנו לעורר את עצב השמיעה עם קול כדי לעורר דפוסים טבעיים של פעילות מעגל. תגובות עצביות שמיעתיות מגוונות באופן טונוטופי, עצבניות ופלסטיק81,82,83,84 ,מה שמקשה עלהדמיה מושלמת עם שיטת הגירוי החשמלי שלנו. זהו חסרון גדול של ניסויים במבחנה במערכת השמיעה. הגבלה טונוטופית של הגירוי שלנו אינה אפשרית שכן גירוי שורש AN כולו יעורר spiking בסיבים AN על פני מעבר הצבע tonotopic. חיקוי מדויק של המגוון של תגובות סיבים AN (כלומר, סיבים נמוכים לעומת קצב ספונטני גבוה) לדפוס גירוי חשמלי גם אינו אפשרי. כמו כן, קשה להתאים במדויק את קידוד העוצמה הדינמית של סיבי AN מרובים ב-CN. עם זאת, אנו מסוגלים להשתמש בתוכנת האלקטרופיזיולוגיה שלנו כדי לייצר מגוון של דפוסי גירוי שמטרתם לחקות את תפוקת העצב השמיעתי המתאימה במהלך גירויים אקוסטיים שונים (למשל צלילים קצרים, רועשים, צלילים שקטים, ממושכים או צלילים ברעש רקע) על ידי שינוי תדירות הגירוי הן בין פרוטוקולי גירוי חשמלי והן בתוך פרוטוקול בודד כדי לתשומות משולבות משולבות (במודלשל ref. 85). ניטור תפוקת MOC במהלך ניסויים אלה יבדוק את ההשערות שלנו לגבי מה דפוסי גירוי עשוי להעדיף עיכוב או ריסוק בנוירונים MOC.

למרות המגבלות המתוארות לעיל, שיטת הכנת פרוסת טריז יש יתרונות לעומת vivo אופייני בשיטות פיזיולוגיה פרוסה חוץ חוץית, ניתן להשתמש כדי לגשת בהפעלת מעגל vivo קרוב ככל האפשר בפרוסה עבור תאים שקשה לגשת. בהקלטות של תאי Vivo בגזע המוח השמיעתי היו נדירים בשל קשיים בגישה לאזור זה בניתוח86. במקום זאת, הפרוסה הייתה מוכנה לכלול תשומות עולות לנוירונים MOC החל בעצב השמיעה, אשר מגורה ישירות כדי להפעיל את המעגל העולה המונורי כולו. אנו מדגימים הפעלה של תשומות סינפטיות מעוררות ומעכבות, ותגובות לתשומות אלה מספקות מידע רב ערך על תזמון של תשומות סינפטיות כאשר הן מגיעות לנוירונים MOC. זה מספק פלטפורמה לניסויים בתפוקה גבוהה שבו אנחנו יכולים להשתמש רפרטואר גדול של כלים אלקטרופיזיולוגיים במבחנה כגון סידן או הדמיית מתח, נוירוטרנסמיטר uncaging, ו הן תאית (באמצעות פיפטת התיקון) ו extracellular (באמצעות יישום אמבטיה או iontophoresis) פרמקולוגיה. ההכנה צריכה גם להציע עלייה בתפוקה על פני תכשירים פרוסה עבה בשל ראות טובה יותר של נוירונים היעד באמצעות אופטיקה DIC, אשר לטשטש עם עובי רקמות מוגברת, במיוחד בגזע המוח הגחני. בסך הכל, טכניקה זו מספקת שיפורים פילוח ותפוקה מעל בשיטות vivo, והזדמנויות טובות יותר לניתוח מעגלים מאשר שיטות פיזיולוגיות פרוסה מסורתית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לסופרים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי תוכנית המחקר התוך-מזוראלי של NIH, NIDCD, Z01 DC000091 (CJCW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Experimental Preparations
Agar, powder Fisher Scientific BP1423500 4% agar block used to stabilize brain tissue during vibratome sectioning
AlexaFluor Hydrazide 488 Invitrogen A10436 Fluorophore used in internal solution to confirm successful MOC neuron patch
Analytical Balance Geneses Scientific (Intramalls) AV114 Weighing chemicals
Double edged razor blade Ted Pella 121-6 Vibratome cutting blade
Kynurenic acid (5g) Sigma Aldrich K3375-5G Slicing ACSF additive used to reduce neuron activity during dissection and slicing in order to improve tissue health for patch clamping
pH Meter Fisher Scientific (Intramalls) 13-620-451 Solution pH tester
Plastic petri dishes 100mm dia X 20mm Fisher Scientific (Intramalls) 12-556-002 4% Agar Prep
Stirring Hotplate Fisher Scientific (Intramalls) 11-500-150 Heating for 4% Agar preparation
Dissection and Slicing
Biocytin Sigma Aldrich B4261-250MG Chemical used for axonal tracing (conjugated to Streptavidin 488)
Dissecting Microscope Amscope SM-1BN For precision dissection during brain removal
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20 Fine forceps dissection tool
Economy tweezers #3 WPI 501976 Forceps dissection tool
Glass Petri Dish 150mm dia x 15mm H Fisher Scientific (Intramalls) 08-747E Dissection dish
Interface paper (203 X 254mm PCTE Membrane 10um) Thomas Scientific 1220823 Slice incubation/biocytin application
Leica VT1200S Vibratome Leica 1491200S001 Vibratome for wedge slice sectioning
Mayo scissors Roboz RS-6872 Dissection tool
Single-edged carbon steel blades Fisher Scientific (Intramalls) 12-640 Razor blade for dissection
Specimen disc, orienting Leica 14048142068 Specialized vibratome stage for reproducible tilting
Spoonula FisherSci 14-375-10 Dissection tool
Super Glue Newegg 15187 Used for glueing tissue to vibratome stage
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 91500-09 Dissection tool
Electrophysiology
A1R Upright Confocal Microscope Nikon Instruments Electrophysiology and imaging microscope, can be any microscope compatible with electrophysiology
Electrode Borosilicate glass w/ Filament OD 1.5mm, ID 1.1mm, 10 cm long Sutter Instrument BF150-110-10 Patch clamping pipette glass
Electrode Filler MicroFil WPI CMF20G Patch electrode pipette filler
In-line solution heater Warner Instruments (GSAdvantage) SH-27B Slice perfusion system heater
Multi-Micromanipulator Systems Sutter Intruments MPC-200 with MP285 Micromanipulators for patch clamp and stimulation electrode placement
P-1000 horizontal pipette puller for glass micropipettes Sutter instruments FG-P1000 Patch clamp pipetter puller
Patch-clamp amplifier and Software HEKA EPC-10 / Patchmaster Next Can be any amplifier/software
Recording Chamber Warner Instruments RC26G Slice "bath" during recording
Recording Chamber Harp Warner Instruments 640253 Stablizes slice during electrophysiology recording
Slice Incubation Chamber Custom Build Heated, oxygenated holding chamber for slices during recovery after slicing
Stimulus isolation unit A.M.P.I. Iso-Flex Stimulus isolation unit for electrophysiology
Syringe 60CC Fischer Scientific (Intramalls) 14-820-11 Electrophysiology perfusion fluid handling
Temperature controller Warner Instruments (GSAdvantage) TC-324C Slice perfusion system temperature controller
Tubing 1/8 OD 1/16 ID Fischer Scientific (Intramalls) 14-171-129 Electrophysiology perfusion fluid handling
Tugsten concentric bipolar microelectrode WPI TM33CCINS Stimulating electrode for electrophysiology
Histology
24 well Plate Fisher Scientific (Intramalls) 12-556006 Histology slice collection and immunostaining
Alexa Fluor 488 Streptavidin Jackson Immuno labs 016-540-084 Secondary antibody for biocytin visualization
Corning Orbital Shaker Sigma CLS6780FP Shaker for immunohistochemistry agitation
Cresyl Violet Acetate Sigma Aldrich (Intramalls) C5042-10G Cellular stain for histology
Disposable Microtome Blades Fisher Scientific 22-210-052 Sliding microtome blade
Filter-syringe Nalgene 4mm Cellulose Acetate 0.2um Fisher Scientific (Intramalls) 09-740-34A Syringe filter for filling recording pipettes with internal solution
Fluoromount-G Slide Mounting Medium Fisher Scientific OB100-01 Immunohistochemistry fluorescence mounting medium
glass slide staining dish with rack Fisher Scientific (Intramalls) 08-812 Cresyl Violet staining chamber
Microm HM450 Sliding Microtome ThermoFisher 910020 Freezing microtome for histology
Microscope Cover Glasses: Rectangles 50mm X 24mm Fisher Scientific (Intramalls) 12-543D Histochemistry slide cover glass
Permount mounting medium Fisher Scientific SP15-100 Cresyl violet section mounting medium
Superfrost Slides Fisher Scientific 22-034980 Histology slides

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Campbell, J. P., Henson, M. M. Olivocochlear neurons in the brainstem of the mouse. Hearing Research. 35 (2-3), 271-274 (1988).
  2. Grothe, B., Sanes, D. H. Synaptic inhibition influences the temporal coding properties of medial superior olivary neurons: An in vitro study. Journal of Neuroscience. 14, 1701-1709 (1994).
  3. Kotak, V. C., Sanes, D. H. Long-lasting inhibitory synaptic depression is age- and calcium-dependent. Journal of Neuroscience. 20 (15), 5820-5826 (2000).
  4. Smith, A. J., Owens, S., Forsythe, I. D. Characterisation of inhibitory and excitatory postsynaptic currents of the rat medial superior olive. The Journal of Physiology. 529 (3), 681-698 (2000).
  5. Scott, L. L., Mathews, P. J., Golding, N. L. Posthearing developmental refinement of temporal processing in principal neurons of the medial superior olive. Journal of Neuroscience. 25 (35), 7887-7895 (2005).
  6. Fischl, M. J., Combs, T. D., Klug, A., Grothe, B., Burger, R. M. Modulation of synaptic input by GABAB receptors improves coincidence detection for computation of sound location. Journal of Physiology. 590 (13), 3047-3066 (2012).
  7. Clause, A., et al. The Precise Temporal Pattern of Prehearing Spontaneous Activity Is Necessary for Tonotopic Map Refinement. Neuron. 82 (4), 822-835 (2014).
  8. Oertel, D. Use of brain slices in the study of the auditory system: Spatial and temporal summation of synaptic inputs in cells in the anteroventral cochlear nucleus of the mouse. Journal of the Acoustical Society of America. 78 (1), 328-333 (1985).
  9. Hermann, J., Pecka, M., Von Gersdorff, H., Grothe, B., Klug, A. Synaptic transmission at the calyx of held under in vivo-like activity levels. Journal of Neurophysiology. 98 (2), 807-820 (2007).
  10. Jercog, P. E., Svirskis, G., Kotak, V. C., Sanes, D. H., Rinzel, J. Asymmetric excitatory synaptic dynamics underlie interaural time difference processing in the auditory system. PLoS Biology. 8 (6), 1000406 (2010).
  11. Roberts, M. T., Seeman, S. C., Golding, N. L. A mechanistic understanding of the role of feedforward inhibition in the mammalian sound localization circuitry. Neuron. 78 (5), 923-935 (2013).
  12. Sinclair, J. L., et al. Sound-evoked activity influences myelination of brainstem axons in the trapezoid body. Journal of Neuroscience. 37 (34), 8239-8255 (2017).
  13. Wang, J., et al. Myelination of the postnatal mouse cochlear nerve at the peripheral-central nervous system transitional zone. Frontiers in Pediatrics. 1, 5-8 (2013).
  14. Long, P., Wan, G., Roberts, M. T., Corfas, G. Myelin development, plasticity, and pathology in the auditory system. Developmental Neurobiology. 78 (2), 80-92 (2018).
  15. Leão, R. M., et al. Presynaptic Na+ channels: Locus, development, and recovery from inactivation at a high-fidelity synapse. Journal of Neuroscience. 25 (14), 3724-3738 (2005).
  16. Fex, J. Efferent Inhibition in the Cochlea Related to Hair-Cell dc Activity: Study of Postsynaptic Activity of the Crossed Olivocochlear Fibres in the Cat. The Journal of the Acoustical Society of America. 41 (3), 666-675 (1967).
  17. Mountain, D. C. Changes in endolymphatic potential and crossed olivocochlear bundle stimulation alter cochlear mechanics. Science. 210 (4465), 71-72 (1980).
  18. Siegel, J. H., Kim, D. O. Efferent neural control of cochlear mechanics? Olivocochlear bundle stimulation affects cochlear biomechanical nonlinearity. Hearing Research. 6 (2), 171-182 (1982).
  19. Guinan, J. J. Cochlear efferent innervation and function. Current Opinion in Otolaryngology & Head and Neck Surgery. 18 (5), 447-453 (2010).
  20. Elgoyhen, A. B., Katz, E. The efferent medial olivocochlear-hair cell synapse. Journal of Physiology-Paris. 106 (1-2), 47-56 (2012).
  21. Galambos, R. Suppression of auditory nerve activity by stimulation of efferent fibers to cochlea. Journal of Neurophysiology. 19 (5), 424-437 (1956).
  22. Desmedt, J. E. Auditory-Evoked Potentials from Cochlea to Cortex as Influenced by Activation of the Efferent OlivoCochlear Bundle. Journal of the Acoustical Society of America. 34 (9), 1478-1496 (1962).
  23. Wiederhold, M. L., Kiang, N. Y. S. Effects of Electric Stimulation of the Crossed Olivocochlear Bundle on Single Auditory-Nerve Fibers in the Cat. The Journal of the Acoustical Society of America. 48 (4), 950-965 (1970).
  24. Wiederhold, M. L., Peake, W. T. Efferent Inhibition of Auditory-Nerve Responses: Dependence on Acoustic-Stimulus Parameters. Journal of the Acoustical Society of America. 40 (6), 1427-1430 (1966).
  25. Geisler, D. C. Hypothesis on the function of the crossed olivocochlear bundle. Journal of the Acoustical Society of America. 56 (6), 1908-1909 (1974).
  26. Guinan, J. J., Gifford, M. L. Effects of electrical stimulation of efferent olivocochlear neurons on cat auditory-nerve fibers. III. Tuning curves and thresholds at CF. Hearing Research. 37 (1), 29-45 (1988).
  27. Rajan, R. Involvement of cochlear efferent pathways in protective effects elicited with binaural loud sound exposure in cats. Journal of Neurophysiology. 74 (2), 582-597 (1995).
  28. Rajan, R. Effect of electrical stimulation of the crossed olivocochlear bundle on temporary threshold shifts in auditory sensitivity. II. Dependence on the level of temporary threshold shifts. Journal of Neurophysiology. 60 (2), 569-579 (1988).
  29. Reiter, E. R., Liberman, M. C. Efferent-mediated protection from acoustic overexposure: Relation to slow effects of olivocochlear stimulation. Journal of Neurophysiology. 73 (2), 506-514 (1995).
  30. Taranda, J., et al. A point mutation in the hair cell nicotinic cholinergic receptor prolongs cochlear inhibition and enhances noise protection. PLoS Biology. 7 (1), 1000018 (2009).
  31. Maison, S. F., Usubuchi, H., Liberman, C. M. Efferent feedback minimizes cochlear neuropathy from moderate noise exposure. Journal of Neuroscience. 33 (13), 5542-5552 (2013).
  32. Tong, H., et al. Protection from noise-induced hearing loss by Kv2. 2 potassium currents in the central medial olivocochlear system. Journal of Neuroscience. 33 (21), 9113-9121 (2013).
  33. Boero, L. E., et al. Enhancement of the medial olivocochlear system prevents hidden hearing loss. Journal of Neuroscience. 38 (34), 7440-7451 (2018).
  34. Spirou, G. A., Brownell, W. E., Zidanic, M. Recordings from cat trapezoid body and HRP labeling of globular bushy cell axons. Journal of Neurophysiology. 63 (5), 1169-1190 (1990).
  35. von Gersdorff, H., Borst, J. G. G. Short-term plasticity at the calyx of held. Nature Reviews Neuroscience. 3 (1), 53-64 (2002).
  36. Smith, P. H., Joris, P. X., Carney, L. H., Yin, T. C. T. Projections of physiologically characterized globular bushy cell axons from the cochlear nucleus of the cat. Journal of Comparative Neurology. 304 (3), 387-407 (1991).
  37. Kuwabara, N., DiCaprio, R. A., Zook, J. M. Afferents to the medial nucleus of the trapezoid body and their collateral projections. Journal of Comparative Neurology. 314 (4), 684-706 (1991).
  38. Friauf, E., Ostwald, J. Divergent projections of physiologically characterized rat ventral cochlear nucleus neurons as shown by intra-axonal injection of horseradish peroxidase. Experimental Brain Research. 73 (2), 263-284 (1988).
  39. De Venecia, R. K., Liberman, M. C., Guinan, J. J., Brown, M. C. Medial olivocochlear reflex interneurons are located in the posteroventral cochlear nucleus: A kainic acid lesion study in guinea pigs. Journal of Comparative Neurology. 487 (4), 345-360 (2005).
  40. Darrow, K. N., Benson, T. E., Brown, M. C. Planar multipolar cells in the cochlear nucleus project to medial olivocochlear neurons in mouse. Journal of Comparative Neurology. 520 (7), 1365-1375 (2012).
  41. Brown, M. C., De Venecia, R. K., Guinan, J. J. Responses of medial olivocochlear neurons: Specifying the central pathways of the medial olivocochlear reflex. Experimental Brain Research. 153 (4), 491-498 (2003).
  42. Wang, Y., Manis, P. B. Synaptic transmission at the cochlear nucleus endbulb synapse during age-related hearing loss in mice. Journal of Neurophysiology. 94 (3), 1814-1824 (2005).
  43. Golding, N. L., Robertson, D., Oertel, D. Recordings from slices indicate that octopus cells of the cochlear nucleus detect coincident firing of auditory nerve fibers with temporal precision. Journal of Neuroscience. 15 (4), 3138-3153 (1995).
  44. Ferragamo, M. J., Golding, N. L., Oertel, D. Synaptic inputs to stellate cells in the ventral cochlear nucleus. Journal of Neurophysiology. 79 (1), 51-63 (1998).
  45. Oertel, D. Synaptic responses and electrical properties of cells in brain slices of the mouse anteroventral cochlear nucleus. Journal of Neuroscience. 3 (10), 2043-2053 (1983).
  46. Xie, R., Manis, P. B. Radiate and planar multipolar neurons of the mouse anteroventral cochlear nucleus: Intrinsic excitability and characterization of their auditory nerve input. Frontiers in Neural Circuits. 11, 1-17 (2017).
  47. Wu, S., Oertel, D. Inhibitory circuitry in the ventral cochlear nucleus is probably mediated by glycine. The Journal of Neuroscience. 6 (9), 2691-2706 (1986).
  48. Xie, R., Manis, P. B. Target-specific IPSC kinetics promote temporal processing in auditory parallel pathways. Journal of Neuroscience. 33 (4), 1598-1614 (2013).
  49. Wickesberg, R. E., Oertel, D. Delayed, frequency-specific inhibition in the cochlear nuclei of mice: A mechanism for monaural echo suppression. Journal of Neuroscience. 10 (6), 1762-1768 (1990).
  50. Campagnola, L., Manis, P. B. A map of functional synaptic connectivity in the mouse anteroventral cochlear nucleus. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2214-2230 (2014).
  51. Doucet, J. R., Ryugo, D. K. Projections from the ventral cochlear nucleus to the dorsal cochlear nucleus in rats. Journal of Comparative Neurology. 385 (2), 245-264 (1997).
  52. Kopp-Scheinpflug, C., et al. The sound of silence: Ionic mechanisms encoding sound termination. Neuron. 71 (5), 911-925 (2011).
  53. Alamilla, J., Gillespie, D. C. Maturation of Calcium-Dependent GABA, Glycine, and Glutamate Release in the Glycinergic MNTB-LSO Pathway. PLoS One. 8 (9), 0075688 (2013).
  54. Spangler, K. M., Warr, W. B., Henkel, C. K. The projections of principal cells of the medial nucleus of the trapezoid body in the cat. Journal of Comparative Neurology. 238 (3), 249-262 (1985).
  55. Kramer, F., et al. Inhibitory glycinergic neurotransmission in the mammalian auditory brainstem upon prolonged stimulation: Short-term plasticity and synaptic reliability. Frontiers in Neural Circuits. 8, 1-22 (2014).
  56. Roberts, M. T., Seeman, S. C., Golding, N. L. The relative contributions of MNTB and LNTB neurons to inhibition in the medial superior olive assessed through single and paired recordings. Frontiers in Neural Circuits. 8, 1-14 (2014).
  57. Torres Cadenas, L., Fischl, M. J., Weisz, C. J. C. Synaptic Inhibition of Medial Olivocochlear Efferent Neurons by Neurons of the Medial Nucleus of the Trapezoid Body. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 40 (3), 509-525 (2020).
  58. Brown, M. C., Mukerji, S., Drottar, M., Windsor, A. M., Lee, D. J. Identification of inputs to olivocochlear neurons using transneuronal labeling with pseudorabies virus (PRV). JARO - Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 14 (5), 703-717 (2013).
  59. Morest, D. K. The collateral system of the medial nucleus of the trapezoid body of the cat, its neuronal architecture and relation to the olivo-cochlear bundle. Brain Research. 9 (2), 288-311 (1968).
  60. Warr, B. W. Fiber degeneration following lesions in the multipolar and globular cell areas in the ventral cochlear nucleus of the cat. Brain Research. 40 (2), 247-270 (1972).
  61. Osen, K. K. Cytoarchitecture of the cochlear nuclei in the cat. Journal of Comparative Neurology. 136 (4), 453-483 (1969).
  62. Cant, N. B., Morest, D. K. The bushy cells in the anteroventral cochlear nucleus of the cat. A study with the electron microscope. Neuroscience. 4 (12), 1925-1945 (1979).
  63. Cant, N. B., Morest, D. K. Organization of the neurons in the anterior division of the anteroventral cochlear nucleus of the cat. Light-microscopic observations. Neuroscience. 4 (12), 1909-1923 (1979).
  64. Lauer, A. M., Connelly, C. J., Graham, H., Ryugo, D. K. Morphological Characterization of Bushy Cells and Their Inputs in the Laboratory Mouse (Mus musculus) Anteroventral Cochlear Nucleus. PLoS One. 8 (8), 1-16 (2013).
  65. Harrison, J. M., Warr, W. B. A study of the cochlear nuclei and ascending auditory pathways of the medulla. Journal of Comparative Neurology. 119 (3), 341-379 (1962).
  66. Robertson, D., Gummer, M. Physiological and morphological characterization of efferent neurones in the guinea pig cochlea. Hearing Research. 20 (1), 63-77 (1985).
  67. Bledsoe, S. C., et al. Ventral cochlear nucleus responses to contralateral sound are mediated by commissural and olivocochlear pathways. Journal of Neurophysiology. 102 (2), 886-900 (2009).
  68. Zhou, J., Zeng, C., Cui, Y., Shore, S. Vesicular glutamate transporter 2 is associated with the cochlear nucleus commissural pathway. JARO - Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 11 (4), 675-687 (2010).
  69. Kuenzel, T. Modulatory influences on time-coding neurons in the ventral cochlear nucleus. Hearing Research. 384, 107824 (2019).
  70. Cant, N. B., Gaston, K. C. Pathways connecting the right and left cochlear nuclei. Journal of Comparative Neurology. 212 (3), 313-326 (1982).
  71. Feliciano, M., Saldana, E., Mugnaini, E. Direct projections from the rat primary auditory neocortex to nucleus sagulum, paralemniscal regions, superior olivary complex and cochlear nuclei. Auditory Neuroscience. 1 (3), 287-308 (1995).
  72. Mulders, W. H. A. M., Robertson, D. Evidence for direct cortical innervation of medial olivocochlear neurones in rats. Hearing Research. 144 (1-2), 65-72 (2000).
  73. Schofield, B. R., Coomes, D. L. Pathways from auditory cortex to the cochlear nucleus in guinea pigs. Hearing Research. 216-217 (1-2), 81-89 (2006).
  74. Meltzer, N. E., Ryugo, D. K. Projections from auditory cortex to cochlear nucleus: A comparative analysis of rat and mouse. Anatomical Record - Part A Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 288 (4), 397-408 (2006).
  75. Schofield, B. R., Cant, N. B. Descending auditory pathways: Projections from the inferior colliculus contact superior olivary cells that project bilaterally to the cochlear nuclei. Journal of Comparative Neurology. 409 (2), 210-223 (1999).
  76. Thompson, A. M., Schofield, B. R. Afferent projections of the superior olivary complex. Microscopy Research and Technique. 51 (4), 330-354 (2000).
  77. Woods, C. I., Azeredo, W. J. Noradrenergic and serotonergic projections to the superior olive: Potential for modulation of olivocochlear neurons. Brain Research. 836 (1-2), 9-18 (1999).
  78. Mulders, W. H. A. M., Robertson, D. Morphological relationships of peptidergic and noradrenergic nerve terminals to olivocochlear neurones in the rat. Hearing Research. 144 (1-2), 53-64 (2000).
  79. Thompson, A. M., Thompson, G. C. Light microscopic evidence of serotoninergic projections to olivocochlear neurons in the bush baby (Otolemur garnettii). Brain Research. 695 (2), 263-266 (1995).
  80. Wang, X., Robertson, D. Substance P-induced inward current in identified auditory efferent neurons in rat brain stem slices. Journal of Neurophysiology. 80 (1), 218-229 (1998).
  81. Taberner, A. M., Liberman, M. C. Response properties of single auditory nerve fibers in the mouse. Journal of Neurophysiology. 93 (1), 557-569 (2005).
  82. Galambos, R., Davis, H. The response of single auditory-nerve stimulation. Journal of Neurophysiology. 6 (1), 39-57 (1943).
  83. Sachs, M. B., Abbas, P. J. Rate versus level functions for auditory-nerve fibers in cats: Tone-burst stimuli. Journal of the Acoustical Society of America. 56 (6), 1835-1847 (1974).
  84. Zhang, X., Heinz, M. G., Bruce, I. C., Carney, L. H. A phenomenological model for the responses of auditory-nerve fibers: I. Nonlinear tuning with compression and suppression. The Journal of the Acoustical Society of America. 109 (2), 648-670 (2001).
  85. Zilany, M. S. A., Bruce, I. C., Carney, L. H. Updated parameters and expanded simulation options for a model of the auditory periphery. The Journal of the Acoustical Society of America. 135 (1), 283-286 (2014).
  86. Franken, T. P., Smith, P. H., Joris, P. X. In vivo whole-cell recordings combined with electron microscopy reveal unexpected morphological and physiological properties in the lateral nucleus of the trapezoid body in the auditory brainstem. Frontiers in Neural Circuits. 10, 1-20 (2016).

Tags

מדעי המוח גיליון 162 נוירונים אוליבוקוכליאר מדיאליים באלקטרופיזיולוגיה פרוסה חוץ-וטה אינטגרציה סינפטית עצב שמיעתי גזע מוח שמיעתי גרעין שבלול נוירוטרנסמיטר מעכב
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fischl, M. J., Weisz, C. J. C. In… More

Fischl, M. J., Weisz, C. J. C. In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity. J. Vis. Exp. (162), e61664, doi:10.3791/61664 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter