Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

In Vitro Kile skive Forberedelse for å etterligne In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

Published: August 18, 2020 doi: 10.3791/61664
Automatic Translation
1, 1
1Section on Neuronal Circuitry, National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, NIH

Summary

Integrering av ulike synaptiske innganger til nevroner måles best i et preparat som bevarer alle presynaptiske kjerner for naturlig timing og kretsplastisitet, men hjerneskiver som vanligvis bryte mange tilkoblinger. Vi utviklet en modifisert hjerneskive for å etterligne in vivo kretsaktivitet samtidig som in vitro eksperimenteringsevne.

Abstract

In vitro skive elektrofysiologi teknikker måle encellede aktivitet med presis elektrisk og timelig oppløsning. Hjerneskiver må være relativt tynne for å visualisere og få tilgang til nevroner for patch-klemming eller bildebehandling, og in vitro-undersøkelse av hjernekretser er begrenset til bare det som er fysisk tilstede i den akutte skiven. For å opprettholde fordelene med in vitro skive eksperimentering samtidig bevare en større del av presynaptic kjerner, utviklet vi en ny skive forberedelse. Denne "kile skive" ble designet for patch-clamp elektrofysiologi opptak for å karakterisere de ulike monaural, lyddrevne innganger til mediale olivocochlear (MOC) nevroner i hjernestammen. Disse nevronene får sine primære afferent excitatory og hemmende innganger fra nevroner aktivert av stimuli i det kontralaterale øret og tilsvarende cochleakjerne (CN). En asymmetrisk hjerneskive ble designet som er tykkest i rostro-caudal domenet på sidekanten av en halvkule og deretter tynner mot den laterale kanten av motsatt halvkule. Denne skiven inneholder, på den tykke siden, den hørbare nerveroten som formidler informasjon om auditive stimuli til hjernen, de indre CN-kretsene, og både de disynaptiske eksitatoriske og trisynaptiske hemmende afferentbanene som konvergerer på kontralaterale MOC-nevroner. Opptak utføres fra MOC nevroner på den tynne siden av skiven, hvor de visualiseres ved hjelp av DIC optikk for typiske patch-klemme eksperimenter. Direkte stimulering av hørselsnerven utføres når den kommer inn i den hørbare hjernestammen, slik at iboende CN-kretsaktivitet og synaptisk plastisitet kan forekomme ved synapser oppstrøms av MOC-nevroner. Med denne teknikken kan man etterligne in vivo kretsaktivering så nært som mulig i stykket. Dette kileskivepreparatet gjelder for andre hjernekretser der kretsanalyser vil ha nytte av bevaring av oppstrøms tilkobling og langdistanseinnganger, i kombinasjon med de tekniske fordelene med in vitro skive fysiologi.

Introduction

Observasjon av aktiviteten til nevrale kretser er ideelt utført med innfødte sensoriske innganger og tilbakemeldinger, og intakt tilkobling mellom hjerneregioner, in vivo. Men å utføre eksperimenter som gir encellede oppløsning av nevrale kretsfunksjon er fortsatt begrenset av tekniske utfordringer i den intakte hjernen. Mens in vivo ekstracellulær elektrofysiologi eller multiphoton bildemetoder kan brukes til å undersøke aktivitet i intakte nervesystemer, tolke hvordan ulike innganger integrere eller måle subthreshold synaptiske innganger er fortsatt vanskelig. In vivo hele celleopptak overvinner disse begrensningene, men er utfordrende å utføre, selv i hjerneregioner som er lett tilgjengelig. Tekniske utfordringer med encellede oppløsningseksperimenter forsterkes ytterligere i visse nevronpopulasjoner som ligger dypt i hjernen, eller i romlig diffuse populasjoner som krever enten genetiske verktøy for å lokalisere celler in vivo (f.eks. genetisk uttrykk for kanalrhodopsin sammen med optrode-opptak) eller post-hoc histokjemisk identifikasjon etter registrering av stedmerking (f.eks. med nevrotransmisjonsspesifikke markører). Å være plassert diffust nær ventral overflaten av hjernestammen, lider mediale olivocochlear (MOC) nevroner av de ovennevntebegrensningene 1,noe som gjør dem ekstremt vanskelige å få tilgang til for in vivo eksperimentering.

Hjerneskiver (~ 100-500 μm tykkelse) har lenge vært brukt til å studere hjernekretser, inkludert auditive hjernestammekretser, på grunn av fysisk segregering av tilkoblede nevroner som finnes i samme skive2,3,4,5,6,7,8,9. Eksperimenter ved hjelp av mye tykkere skiver (> 1 mm) har blitt brukt i andre laboratorier for å forstå hvordan bilaterale innganger integreres i områder av det overlegne olivary komplekset (SOC), inkludert medial overlegen oliven10,11. Disse skivene ble utarbeidet slik at aksoner av hørselsnerven (AN) forble intakt i skiven og ble elektrisk stimulert til å initiere synaptisk nevrotransmitterutgivelse i CN, etterligne aktiviteten til første orden auditive nevroner som de ville reagere på lyd. En stor ulempe med disse tykke skiver er synlighet av nevroner for patch-klemme elektrofysiologiske opptak ("patching"). Patching blir stadig vanskeligere som de mange aksoner i dette området blir myelinated medalderen 12,13,14,15, noe som gjør vevet optisk tett og skjule nevroner selv i en typisk, tynn hjerneskive. Vårt mål er å skape in vitro-preparater som ligner tettere på kretstilkoblingen til in vivo-opptak, men med høy gjennomstrømning og høyoppløselige opptaksevner av visuelt styrt patch-clamp elektrofysiologi i hjerneskiver.

Laboratoriet vårt undersøker fysiologien til nevroner i det auditive efferent-systemet, inkludert MOC-nevroner. Disse kolinerge nevronene gir efferent tilbakemelding til sneglehuset ved å modulere aktiviteten til ytre hårceller (OHCs)16,17,18,19,20. Tidligere studier har vist at denne moduleringen spiller en rolle i gevinstkontroll i sneglehuset21,22,23,24,25,26 og beskyttelse mot akustisk traumer27,28,29,30,31,32,33. Hos mus er MOC-nevroner diffust plassert i ventral kjernen i trapeskroppen (VNTB) i den auditive hjernestammen1. Vår gruppe har benyttet ChAT-IRES-Cre muselinjen krysset med tdTomato reporter muselinje for å målrette MOC nevroner i hjernestamme skiver under epifluorescent belysning. Vi viste at MOC nevroner får afferent hemmende innspill fra ipsilateral medial kjerne av trapeskroppen (MNTB), som er begeistret, i sin tur, av aksler fra kuleformede buskete celler (GBC) i den kontralaterale cochleakjernen (CN)34,35,36,37,38. I tillegg får MOC-nevroner sannsynligvis sine eksitatoriske innspill fra T-stellate celler i kontralaterale CN39,40,41. Samlet viser disse studiene moc nevroner får både excitatory og hemmende innganger avledet fra samme (kontralaterale) øre. Imidlertid er de presynaptiske nevronene, og deres aksoner som konvergerer på MOC-nevroner, ikke helt nær nok til hverandre til å være helt intakte i et typisk koronarskivepreparat. For å undersøke hvordan integrering av synaptiske innganger til MOC-nevroner påvirker deres virkningspotensiale avfyringsmønstre, med fokus på nylig beskrevet hemming, utviklet vi et preparat der vi kunne stimulere de ulike afferentene til MOC-nevroner fra ett øre på den mest fysiologisk realistiske måten mulig, men med de tekniske fordelene med in vitro hjerneskiver eksperimenter.

Kileskiven er et modifisert tykt stykkepreparat designet for undersøkelse av kretsintegrasjon i MOC-nevroner (skjematisert i figur 1A). På den tykke siden av skiven inneholder kilen de avkuttede aksonene til hørselsnerven (kalt "auditiv nerverot" heretter) når de kommer inn i hjernestammen fra periferien og synapse i CN. Den auditive nerveroten kan stimuleres elektrisk til å fremkalle nevrotransmitterutgivelse og synaptisk aktivering av celler i den helt intakte CN42,43,44,45,46. Dette stimuleringsformatet har flere fordeler for kretsanalyse. Først, i stedet for å direkte stimulere T-stellate og GBC axons som gir afferent inngang til MOC nevroner, stimulerer vi AN for å tillate aktivering av iboende kretser rikelig i CN. Disse kretsene modulere produksjonen av CN nevroner til sine mål i hele hjernen, inkludert MOC nevroner46,47,48,49,50,51. For det andre, polysynaptisk aktivering av afferent kretser fra AN gjennom CN oppstrøms av MOC nevroner gir mer naturlig aktivering timing og for plastisitet å skje på disse synapser som de ville in vivo under auditiv stimulering. For det tredje kan vi variere våre stimuleringsmønstre for å etterligne AN-aktivitet. Til slutt er både excitatory og hemmende monaural projeksjoner til MOC nevroner intakt i kilehæren, og deres integrasjon kan måles ved en MOC neuron med presisjonen av patch-clamp elektrofysiologi. Som helhet gir denne aktiveringsordningen en mer intakt krets til MOC-nevronene sammenlignet med et typisk hjerneskiverpreparat. Denne brainstem kile skive kan også brukes til å undersøke andre auditive områder som mottar hemmende innspill fra ipsilateral MNTB inkludert lateral overlegen oliven, overlegen olivary kjerne og mediale overlegen oliven10,11,52,53,54,55,56. Utover vårt spesifikke preparat kan denne kuttemetoden brukes eller endres til å evaluere andre systemer ved å opprettholde tilkobling av langdistanseinnganger og forbedre visualisering av nevroner for en rekke encellede oppløsning elektrofysiologi eller bildeteknikker.

Denne protokollen krever bruk av et vibratomstadium eller en plattform som kan vippes ca. 15°. Her bruker vi et kommersielt tilgjengelig 2-delt magnetisk stadium hvor "scenen" er en metallplate med en buet bunn plassert i en konkav magnetisk "scenebase". Scenen kan deretter skiftes for å justere skivevinkelen. Konsentriske sirkler på scenebasen brukes til å estimere vinkelen reproduserbar. Scenen og scenebasen er plassert i kuttekammeret, hvor den magnetiske scenebasen også kan roteres.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimentelle prosedyrer ble godkjent av National Institute of Neurological Disorders and Stroke/National Institute on Døvhet og andre kommunikasjonsforstyrrelser Animal Care and Use Committee.

1. Eksperimentelle preparater

MERK: Detaljer om skiveforberedelse, inkludert skjæreløsning, skjæretemperatur, skiveinkubasjonstemperatur og apparat (etc.) er spesifikke for hjernestammeforberedelse utført i dette eksperimentet. Slice inkubasjon detaljer kan endres per laboratorieerfaring.

  1. Klargjør interne løsninger for patch-klemming.
    1. Klargjør spenningsklemmeløsning som inneholder (i mM) 76 Cs-metansulfonat, 56 CsCl, 1 MgCl2, 1 CaCl2, 10 HEPES, 10 EGTA, 0,3 Na-GTP, 2 Mg-ATP, 5 Na2-fosfokreatin, 5 QX-314 og 0,01 Alexa Fluor-488 hydrazid. Juster pH til 7.2 med CsOH.
    2. Klargjør gjeldende klemmeløsning som inneholder (i mM) 125 K-glukosat, 5 KCl, 1 MgCl2,0,1 CaCl2,10 HEPES, 1 EGTA, 0,3 Na-GTP, 2 Mg-ATP, 1 Na2-fosforatin og 0,01 Alexa Fluor-488 hydrazid. Juster pH-en til 7,2 med KOH.
  2. Forbered 100 ml 4% agar ved å tilsette 4 g agar til 100 ml varmt (nær kokende) vann. Plasser på oppvarmet røreplate for å opprettholde temperaturen og rør til den er fullstendig oppløst. Hell i 100 mm plast Petri retter til ca 1 cm dybde og la avkjøles. Oppbevares i kjøleskap til det er nødvendig.
  3. Forbered 1 L kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) som inneholder i mM: 124 NaCl, 1,2 CaCl2,1,3 MgSO4,5 KCl, 26 NaHCO3,1,25 KH2PO4og 10 dekstrose. Boble med karbagen (5% CO2 / 95% O2) i minst 10 min, og juster deretter endelig pH til 7,4 med 1 M NaOH om nødvendig. Opprettholde oksygenering og pH av løsningen ved å boble kontinuerlig med karbagen gjennom hele eksperimentet.
  4. Forbered 200 ml kuttløsning ved å tilsette 1 mM kynurensyre til ACSF. Sonicate løsning i et sonikering vannbad i 10 min til kynurenic syre er oppløst. Kontinuerlig boble med karbagen og legg på is.
    FORSIKTIG: Bruk egnet personlig verneutstyr ved håndtering av kynurensyre.
  5. Monter et passende blad i vibratomen i følge produsentens anvisninger. Chill vibratome kutte kammer ved å omgi den med is.

2. Hjernefjerning med intakt auditiv nerverot for stimulering

MERK: Mus for disse eksperimentene ble oppnådd ved å krysse ChAT-IRES-Cre transgene mus på en C57BL/6J bakgrunn med tdTomato reporter mus (Ai14). Mus som brukes til histologi og elektrofysiologi var post-hearing utbruddet (P14-P23), som er rundt P12 hos mus. Nevroner som uttrykker tdTomato i ventral kjernen i trapeskroppen (VNTB) har tidligere blitt karakterisert som MOC-nevroner i denne muselinjen57.

  1. Euthanize (f.eks. CO2 kvelning) og halshugge dyret ved hjelp av godkjente institusjonelle prosedyrer.
  2. Bruk et barberblad, kutt huden midt i skallen fra nesen til baksiden av nakken. Skrell tilbake huden for å eksponere skallen.
  3. Ved hjelp av liten saks, gjør et snitt i skallen gjennom midtlinjen starter ved basen (caudal end nær ryggmargen) av skallen og fortsetter mot nesen.
  4. På lambda sutur, gjør kutt i skallen fra midtlinjen, lateral mot øret på begge sider. Skrell tilbake skallen for å eksponere hjernen.
  5. Starter ved rostral enden, forsiktig løfte hjernen bort fra skallen med en liten lab slikkepott eller stump tang. Skjær optisk nerve og fortsett å forsiktig arbeide hjernen bakover, utsette ventral overflaten.
  6. Klipp trigeminusnervene ved å klemme dem med fine tang nær hjernestammens ventrale overflate.
    MERK: Gjør dette forsiktig da vestibulocochlearnerven ligger like under dette og må være intakt for eventuell stimulering.
  7. Legg preparatet i et glass Petriskål fylt med kald kuttingsløsning. Plasser parabolen under et dissekerende mikroskop. Forsiktig boble med karbaogen.
  8. Trim ansiktsnerven nær hjernestammen og eksponer vestibulocochlearnerven.
  9. Ved hjelp av fine tang, skyv spissene inn i foraminaen der vestibulocochlearnerven kommer ut av skallen så langt som mulig og klemmer nerven for å bryte den, slik at nerveroten er festet til hjernestammen. Gjenta dette på den andre siden.
  10. Når begge nerverøttene er frie, fjern meningene og vaskulaturen fra hjernestammens ventrale overflate nær trapeskroppen.
  11. Frigjør hjernen helt fra skallen ved å klemme de gjenværende kraniale nervene og bindevevet som tar vare på å bevare den gjenværende ryggmargen hvis mulig.

3. Blokker og monter hjernen på scenen (magnetisk plate)

  1. Forbered overflaten av hjernen for å fikse til scenen ved å blokkere hjernen på nivået av optisk chiasm.
    1. Med ventral overflaten opp, stabilisere hjernen ved hjelp av et sløvt verktøy for å forsiktig immobilisere ryggmargen slik at hjernen ikke vippes i løpet av følgende trinn.
    2. På nivået av optisk chiasm, bruk åpne tang for å lage flyet for å blokkere hjernen ved å sette inn gjennom hjernen ned til bunnen av parabolen. Sett tangen i en vinkel på ca. 20° fra vertikal, slik at spissene går ut av hjerneoverflaten til den optiske chiasmen.
    3. Skjær langs tangen ved hjelp av barberbladet.
  2. Lim hjernen til overflaten av scenen.
    1. Forbered en liten blokk (~ 1 cm3) på 4% agar for å støtte hjernen.
    2. Plasser en liten dråpe lim på scenen og spre det til et rektangel slik at både hjernen og agarblokken kan limes ned.
    3. Bruk tang, løft forsiktig hjernen og dab forsiktig overflødig væske ved hjelp av kanten av et papirhåndkle. Plasser den blokkerte overflaten på limet, ventral overflate vil være mot bladet under kutting.
    4. Skyv agarblokken forsiktig mot den dorsale overflaten av hjernen for å støtte den under kutting og for å sikre riktig hjerneposisjonering (det vil si vinkel).

4. Skjær hjernen for å lage kileskive

MERK: Forbered en hjerneskive ved hjelp av vibratom som har cochleanernerven på den tykke siden og mediale olivocochlear (MOC) nevroner og den mediale kjernen i trapeskroppen (MNTB) på den tynne siden.

  1. Plasser den magnetiske platen med festet hjerne på scenebasen og plasser den i skjærekammeret med hjernens ventrale overflate orientert mot bladet.
  2. Fyll kammeret med iskald kuttløsning og boble med karbaogen.
  3. Senk bladet ned i løsningen og kutt skiver caudal til interesseområdet for å sikre at skivene er symmetriske. Hvis skivene vises asymmetrisk, vipp scenen litt for å oppnå symmetri.
    MERK: Bladhastighetene mellom 0,05 og 0,10 mm/s var effektive for kutting av sunne skiver og kan variere avhengig av dyrs alder og hjerneregion.
  4. Når skivene er symmetriske, skift scenen ~ 15 ° (tilsvarende ca 3 konsentriske ringer på scenen basen) til den ene siden.
    MERK: Flytt scenen bort fra den auditive nerveroten du vil beholde i stykket.
  5. Fortsett å kutte forsiktig til hørselsnerven roten er nær overflaten på den ene siden, og ansiktsnerven kan ses på overflaten av den andre siden.
  6. Flytt scenen tilbake 15° til den opprinnelige posisjonen.
  7. Flytt bladet bort fra vevet og spinn scenebasen 90° slik at den laterale kanten på den tynne siden vender mot bladet. Senk bladet flere hundre mikrometer og ta deretter langsomt bladet nær kanten av vevet. Gjenta dette til bladet berører sidekanten. Senk bladet til ønsket tykkelse på den tynne kanten av skiven, her ytterligere to hundre mikrometer.
    MERK: Den resulterende skiven er ideelt ~300 mm tykk på nivået av ventral kjernen i trapeskroppen (VNTB) på siden der patch klemming vil finne sted.
  8. Flytt bladet tilbake fra vevet og spinn scenebasen tilbake slik at ventraloverflaten vender mot den.
  9. Lag kuttet som angir rostral overflaten av kileskiven. Overfør skiven til et stykke grensesnittpapir (1 cm2) caudal overflate ned. Flytt skiven til inkubasjonskammeret eller annet egnet inkubasjonsapparat for utvinning (30 min ved 35 °C).
    MERK: Ansiktsnerven skal være synlig på begge halvkulene i skiven på rostraloverflaten (se figur 1B).

5. Elektrofysiologi oppsett og opptak

  1. Plasser kileskjivet i opptakskammeret og fest skiven med en harpe eller stabiliserende system. Perfuse vevet kontinuerlig med en hastighet på 7-10 ml / min med varm (35 ° C) ACSF bobler med karbaogen.
  2. Identifiser genetisk merkede MOC-nevroner i VNTB ved hjelp av epifluorescens med 561 nm-utslippsfiltre for patch-clamp-opptak. Flip skive hvis det ikke er noen potensielt patchable celler.
  3. Bruk DIC optikk, fokuser på den hørbare nerveroten på den tykke siden av skiven og bruk en mikromanipulator til å flytte den bipolare wolframstimulerende elektroden ned til den hørbare nerveroten og forsiktig inn i overflaten av vevet.
    MERK: Sugeelektroder har blitt brukt i auditive nervestimuleringseksperimenter i andre laboratorier. Theta glasselektroder, eller optiske stimuleringsmetoder kan brukes hvis det er aktuelt for andre spesifikke preparater.
  4. Flytt synsfeltet tilbake til VNTB for å velge en MOC neuron å målrette for patch klemme elektrofysiologi.
  5. Fyll en opptakspipette med passende intern løsning for det foreslåtte eksperimentet.
  6. Patch og ta opp fra MOC neuron i hele cellekonfigurasjonen. Kompensere membrankaacitance og seriemotstand om nødvendig.
  7. Juster elektrisk stimulering amplitude av hørselsnerven rot for å oppnå konsistente postsynaptiske hendelser i MOC neuron.
    MERK: Det kan være nødvendig å flytte stimuleringselektroden.
  8. Kjør passende stimuleringsprotokoller for å observere fremkalte synaptiske strømmer i MOC (spenningsklemme) eller handling potensielle mønstre (nåværende klemme).
    MERK: Kileskiven forberedelse kan brukes med alle typiske patch-clamp verktøy som løs patch opptak, farmakologi, optogenetikk, kalsiumavbildning, nevrotransmitter uncaging, etc.

6. Histologisk bekreftelse på hjernestammekjerner

MERK: Dette gjøres med cresyl fiolett farging, i fast, re-delt kile skive. Denne metoden gjør det mulig å visualisere kjerner som finnes i stykket.

  1. Etter å ha forberedt en kileskive, senk skive i fikseringsmiddel (4% PFA i PBS) over natten. Skyll skiven 3x i 10 min i PBS (romtemperatur på en shaker), og legg deretter i 30% sukrose i PBS over natten ved 4 ° C for å kryobeskytte.
  2. Del skiven på en frysende mikrotom (40-70 mm) på nytt og samle serieseksjoner i en 24-brønnplate i PBS.
  3. Monter seksjoner på gelatinbelagte sklier og la det tørke helt. Plasser lysbilder i lysbildevognen.
  4. Klargjør cresylfiolette løsninger
    1. Forbered 1% cresylfiolett acetat ved å blande 5 g cresylfiolett acetat i 500 ml dH2O
    2. Klargjør acetatbuffer ved først å forberede 90 ml oppløsning A (540 ml isbrediksyre + 89,46 ml dH2O) og 10 ml oppløsning B (136 mg natriumacetat i 10 ml dH2O). Kombiner løsning A og løsning B som gir acetatbufferen.
    3. Kombiner 1% cresylfiolett acetat med acetatbufferen 1:1 for 0,5% cresylfiolett i acetatbuffer. Filtrer før bruk.
    4. Forbered 95 % og 70 % etanol ved å fortynne 100 % etanol med passende volumer av dH2O
  5. Utfør cresylfiolett fargingsprotokoll. Flytt skyvevognen gjennom løsningsbrettene, og flekk overflødig løsning på et papirhåndkle mellom skuffene: xylen – 5 min; 95% etanol – 3 min; 70% etanol – 3 min; dH2O – 3 min; 0,5% cresyl fiolett løsning – 8-14 min overvåking ofte til kjernefysisk farging blir mørk lilla; dH2O – 3 min; 70% etanol – 3 min; 95% etanol – 1-2 min; 100% etanol – dip lysbilder to ganger; xylen – 5 min; xylen: 25 min til monteringen utføres.
    FORSIKTIG: Bruk xylens kun under en røykhette.
  6. Fjern lysbildene fra xylen én om gangen og plasser umiddelbart dekselslippene på lysbildene ved hjelp av monteringsmediet. La monteringsmediet tørke (over natten).
  7. Bildedeler.

7. Biocytin merking for anterograde sporing av aksoner i levende, uløst vev

  1. Forbered en kileskive som ovenfor (trinn 2-4).
  2. Overfør skiven til grensesnittpapir (~1 cm2). Under et dissekerende mikroskop, finn CN på den tykke siden av skiven.
  3. Fjern forsiktig overflødig ACSF fra området rundt skiven ved å vri opp et hjørne av et vevspapir for å trekke ACSF bort fra vevet. Dette hindrer biocytin fra å spre seg til omkringliggende områder av skiven som kan føre til opptak i celler utenfor CN.
  4. Med fine tang, velg en liten krystall av biocytin og plasser den på overflaten av CN. Trykk forsiktig krystallen inn i vevet for å fremme kontakt med nevroner og påfølgende opptak i somata. Gjenta dette trinnet for å dekke ønsket interesseområde, i dette tilfellet CN-regioner som inneholder T-stellate og GBC nevroner.
  5. Plasser skiven i et inkubasjonskammer. La skiven inkubere i 2-4 t ved 35 °C for å tillate opptak og transport av biocytin. Etter inkubasjon, skyll skiven i ACSF for å fjerne eventuelle biocytinpartikler.
  6. Legg skive i fikseringsmiddel (4% PFA i PBS) over natten. Skyll 3x i 10 min i PBS.
  7. Kryobeskyttelsesskive i 30 % sukrose i PBS over natten ved 4 °C eller til skiven synker.
  8. Resect vevet for å produsere tverrgående seksjoner på en frysing mikrotom på 70-100 mm.
  9. Behandle vev ved hjelp av standard immunohistokjemiske metoder med en fluorescerende konjugert streptavidin.
    MERK: Ytterligere immunohistokjemi kan utføres på seksjonene hvis det er nyttig for merking av presynaptiske cellelegemer, aksoner, reseptorer eller andre synaptiske molekyler som er viktige for kretsvisualisering (det vil si primære antistofftrinn bør ikke påvirke biocytin sekundær visualisering negativt).
  10. Bilde vevet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Histologisk undersøkelse av kilehive
For vår undersøkelse av auditiv hjernestamme neuron funksjon, kile skive preparatet ble designet for å inneholde auditiv nerve rot og CN contralateral til MOC nevroner målrettet for opptak (eksempel skive vist i figur 1B). Innledende histologisk undersøkelse av preparatet er viktig for å bekrefte at skiven inneholder kjernene som er nødvendige for kretsaktivering, og at aksonære projeksjoner er intakte. To celletyper i CN gir lydinformasjon til MOC-nevroner. T-stellate celler er hypotetisk for å gi excitatory input til MOC nevroner39,40,41,58. Kuleformede buskete celler (GBC) opphisse MNTB nevroner i den kontralaterale halvkule (via spesialisert calyx av Held synapse)34,36,37,38,59,60 som igjen gir hemmende inngang til MOC nevroner57 (skjematisk figur 1A). For å bekrefte tilstedeværelsen av både T-stellate celler og GBCer, re-seksjonert vi (til 50 μm) en kile skive som ble festet ved nedsenking i 4% PFA og utført cresyl fiolett farging for å merke somata. I den tykke siden av kileskiven (Figur 2, venstre halvkule) var CN tilstede i nesten sin fulle rostro-caudal-grad. I tillegg var dorsale og ventrale underavdelinger av CN intakte (figur 2; pil og pilhode i S19). T-stellate nevroner og GBCs klynge i ventral cochlea kjerne i nærheten av der hørselsnerven (Figur 2; pil i S17) går inn i CN61,62,63,64,65. Kilehivet inneholder også nevroner av MNTB ipsilateral til MOC nevroner hvorfra opptakene utføres (tynn halvkule av den opprinnelige kile skive, høyre side i figur 2). Dette bekrefter at minst en del av den hemmende inngangen til MOC nevroner er intakt (Figur 2, skiver 1-15, fremhevet av stiplede ovaler i S11).

I separate eksperimenter bekreftet vi at aksonene og presynaptiske terminalene til CN-nevroner var intakte i kilehæren ved hjelp av anterograd merking med biocytin. Først ble den levende kileskiven forberedt og plassert på grensesnittpapir. Umiddelbart etter å ha forberedt kilehæren, ble biocytinkrystaller plassert i CN som tillot opptak og anterograde transport langs aksoner i en inkubasjonsperiode. Deretter ble det utført feste og reseksjon av vevet (70 mm seksjoner). Farging av seksjoner med fluorescerende merket streptavidin ble utført for å visualisere aksoner merket med biocytin. Konfokale bilder av disse delene viser lys merking i CN hvor krystallene ble plassert og tatt opp i cellelegemer (Figur 3A, venstre halvkule, stiplet område). Axons som gikk ut av CN langs ventral akustisk stria (Figur 3A, hvite pilspisser) var tydelig merket og kunne følges til deres termineringspunkter. Biocytin-positive punktpunkt rundt kontralaterale MOC nevroner foreslår at vårt preparat bevarer synaptiske kontakter som stammer fra CN (figur 3B). Likeledes, merket calyces av Holdt i kontralaterale MNTB indikerer aksoner som projiserer fra GBCs til MNTB nevroner er bevart i kile skive (Figur 3C). Disse histologiske undersøkelsene bekrefter at kilehivet vårt inneholder både cellelegemer og aksonale projeksjoner av de afferent input-kretsene til MOC-nevroner, som derfor tillater oss å måle postsynaptiske responser fremkalt ved stimulering av hørselsnerven og påfølgende forplantning av aktivitet gjennom stigende kretser.

Synaptisk fysiologi i kileskive
Integrering av eksitiverende og hemmende synaptiske innganger former kritisk nevronal aktivitet. Vi har nylig beskrevet hemmende innganger til MOC nevroner fra nevroner av MNTB57, men effekten av integrering av disse inngangene med excitatory innganger på MOC neuron aktivitet er ukjent. I en kileskive fra en ChAT-IRES-Cre x tdTomato-mus ble det utført spenningsklemmeopptak fra et MOC-nevron. Strømmen ble brukt via en bipolar wolfram stimulerende elektrode drevet av en stimulans isolasjon enhet for å fremkalle nevrotransmitter frigjøring fra presynaptiske aksoner. Først ble ventral akustisk stria (VAS) på midtlinjen elektrisk stimulert til å aktivere T-stellate axons direkte og MNTB nevroner via GBC axon stimulering (Figur 4A), for å måle ventetiden til postsynaptiske responser i en opptakskonfigurasjon som etterligner typiske tynne skiver eksperimenter (Figur 4B), eksempel spor, grå, holder potensial -60 mV). I separate eksperimenter ble den auditive nerveroten stimulert til å aktivere monaural stigende kretser og postsynaptiske responser ble målt ved MOC nevroner som beskrevet ovenfor. Elektrisk stimulering på begge steder fremkalte en rask elektrisk artefakt etterfulgt av multipeaked strømresponser (eksempel svar fra AN stimulering i figur 4C,svarte spor, holder potensial -60 mV). Vi sammenlignet latency tiltak av den første postsynaptiske strømmen (PSC) fremkalt med direkte stimulering av VAS med de som fremkales med auditiv nervestimulering og fant en betydelig lengre ventetid til AN stimuleringshendelser. Dette ble tilskrevet synaptisk forsinkelse pådratt ved AN /CN synapse (AN stimulering: 5,27 ± 0,43 ms, median ± median absolutt avvik (MAD), område 4,26-5,93 ms, n = 8; VAS stimulering: 1,98 ± 0,28 ms, median ± MAD, område 0,75-3,46 ms, n = 17; Wilcoxon signert rekker Test, p = 0,014, figur 4D). Disse resultatene bekrefter at stimulering av den auditive nerveroten resulterer i synaptisk aktivering av CN-nevroner og påfølgende kretsaktivitet, som representerer in vivo – som timing enn direkte stimulering av T-stellate eller GBC/MNTB-aksoner.

Med vår cesium basert, høy [Cl-] intern løsning som brukes i spenning klemme, excitatory (glutamatergic) og hemmende (GABA og glysinrg) PSCer er både innover på hvile membran potensial (-60 mV) og derfor umulig å skille. Mens vi fremkaller kretsaktivitet i AN-stimulerende konfigurasjon, isolerte vi elektrisk den antatte hemmende inngangen ved å flytte holdingpotensialet til 0 mV, det omtrentlige reverseringspotensialet for AMPA medierte glutamatergiske strømmer. I vårt eksempel neuron ble ytre nåværende responser observert ved 0 mV (Figur 4Ci, røde spor) som indikerer kloridledninger. Disse vil sannsynligvis være GABA- eller glykergiske synaptiske responser. Disse dataene viser nytten av kilehæren for å aktivere både eksitatoriske og hemmende innganger til MOC-nevroner ved å stimulere den auditive nerveroten, med aktivering av påfølgende afferentkretser. Videre ble ulike mønstre av postsynaptiske responser fremkalt av AN-stimulering, noe som tyder på at selv under forhold med identisk stimulering av AN-aksoner er aktiviteten til hele kretsen dynamisk og kompleks. Dette eksperimentelle paradigmet muliggjør en detaljert analyse av hvordan komplekse auditive stimuli forplanter seg gjennom hjernestammen og integreres ved MOC-nevroner, og bestemmer MOC-efferent-systemets utgang og eventuell innvirkning på sneglehuset.

Figure 1
Figur 1: Kileskive skjematisk og eksempelbilde. (A) Skjematisk av medial olivocochlear feedback krets. Blå piler indikerer den afferent stigende veien til MOC nevroner og svarte piler indikerer den synkende tilbakemeldingsveien fra MOC nevroner til bunnen av ytre hårceller (OHC). (B)Brightfield bilde av en kile skive med etiketter av den hørbare nerveroten (ANR) og cochlea kjerne (stiplet omriss) på den tykke siden. Stjerne indikerer den omtrentlige plasseringen av ventral kjernen i trapeskroppen der MOC-nevroner er rettet mot patch-klemming på den tynne siden av kilehæren. Stiplede svarte linjer indikerer ansiktsnervene som kan ses på begge halvkulene i skiven på rostraloverflaten. IHC - indre hårcelle, GBC - kuleformet buskete celle, SPN - overlegen paraolivary kjerne, MNTB - mediale kjernen i trapeskroppen, VNTB - ventral kjerne av trapeskroppen, LSO - lateral overlegen oliven. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Cresyl fiolette beisede seksjoner fra en kilehive som ble re-delt på 50 μm. Alle andre deler ble avbildet. Seksjoner er nummerert rostral --> caudal. Kileskiver hadde en tendens til å inneholde hele cochleakjernen (CN), inkludert både den dorsale CN (pilen i S19) og ventral CN (pilhode i S19), auditiv nerverot (åpent pilspiss i S17) og mye av MNTB (mørkt område nær ventral overflate i S3-S15, uthevet med stiplede ovaler i S11). D og V på skalalinjen representerer dorsal og ventral i skiveretning. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Axons av stigende inngang til MOC nevroner fra den kontralaterale cochlea kjernen forblir intakt i kile skive. (A)Den rostral-mest delen fra en kile skive tatt fra en P23 ChAT-IRES-Cre x tdTomato (rød fluorescens) mus som ble re-seksjonert (70 μm) og behandlet for biocytin visualisering. Konfokalt bilde er en flislagt, maksimal intensitet projeksjon z-stabel. Axons i ventral akustisk stria er uthevet av hvite pilspisser. Stiplet omriss indikerer den lille delen av sneglekjernen som er igjen i denne rostral-mest skive. Vektlinje 500 μm. (B) Konfokalbilde av et ChAT-IRES-Cre x tdTomato positivt nevron i VNTB med biocytinpositiv punktpunkt i den omkringliggende nevropilen. Vektstangen 50 μm. (C) Biocytin merkede aksoner vist kryssing av midtlinjen og avslutte i kontralateral MNTB som calyces av Held. Vertikal stiplet linje representerer midtlinjen i stykket. Skala bar 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Elektrisk stimulering av afferent innganger i spenning klemme gir multipeak postsynaptiske strømmer i MOC nevroner. (A)Skjematisk kile skive med opptak oppsett for både ventral akustisk stria (VAS) stimulering (grå stimulerende elektrode) og auditiv nerve (AN) stimulering (svart stimulerende elektrode) av afferent innganger til MOC. (B)Eksempler på postsynaptiske strømmer (PSCer) fra en individuell P17 neuron fremkalt med en enkelt elektrisk stimulans nær midtlinjen ved -60 mV. (C) PSCer fremkalt under AN stimulering ved -60 mV i en P15 nevron. (Ci) Eksempel PSCer i samme celle som C fremkalt ved 0 mV holding potensial (den omtrentlige reversering potensialet for AMPA medierte strømmer i vårt opptak oppsett, rød). (D)Befolkningsdata for kvantifisering av ventetid til første PSC for VAS og AN stimulering. Bokser: kvartiler, linje innsetter: median, firkantet innsett: gjennomsnitt, whiskers: median absolutt avvik. * p < 0,05. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kutteprosedyren beskrevet her kalt en kile skive er kraftig for å opprettholde intakt presynaptic neuronal kretser, men med tilgjengeligheten av hjernen skive eksperimentering for analyse av nevronal funksjon. Stor forsiktighet må tas i flere innledende trinn for å maksimere nytten av preparatet for kretsanalyse. Dimensjonene på kilen bør bekreftes ved hjelp av histologisk undersøkelse, noe som er integrert for bekreftelse på at både presynaptiske kjerner og deres aksonale projeksjoner finnes i den tilberedte kilehæren. Slice geometri kan kreve endring hvis projeksjoner er kuttet eller få aksoner når målet kjerner. Mer generelt er etterbehandling kuttet på vibratom for kileskiven kritisk viktig. Optimal kile skive forberedelse vil kreve en kombinasjon av konsekvent bruk av vibratom konfigurasjoner inkludert bruk av konsentriske sirkel markeringer på scenen basen, sammen med justering av innstillinger basert på kjente hjernen landemerker. Etter optimalisering av skivegeometri registrerte vi konsistente PSCer i MOC-nevroner fremkalt av elektrisk stimulerende hørselsnerveroten i 8 av 18 kilehæler. I vårt tidligere arbeid var vi i stand til å fremkalle hemmende PSCer via direkte stimulering av MNTB aksoner i ca 60% av MOC nevroner57,noe som tyder på at vår suksessrate her er bare en beskjeden reduksjon gitt lang rekkevidde av innganger og nødvendighet for polysynaptisk krets aktivering. Når du forbereder skiven, er det tilrådelig å feile på tykkere side som en reduksjon i synlighet på grunn av en tykkere skive er gunstig over en ubrukelig seksjon som er ufullstendig eller mangler kretstilkobling. Enhver skivekonfigurasjon eller dimensjoner kan brukes, så lenge skiven passer under registreringsmikroskopmålet, er tilgjengelig med patch og stimulerende elektroder (eller andre sonder eller utstyr), og er tynn nok for optisk basert patch-klemming på den postsynaptiske cellen av interesse. Rask, mild disseksjon og riktige inkubasjons- og gjenopprettingsforhold er også viktige for å opprettholde levedyktigheten til kretsen for patch-clamp eksperimenter. Spesifikk for vårt auditive hjernestammepreparat, må hjernen fjernes veldig nøye fra skallen for å bevare intakte og funksjonelle auditive nerverøtter. Strekking eller rive nerven vil påvirke evnen til å stimulere fibrene og fremkalle aktivitet i auditive nevroner. På grunn av det større volumet av vev i skiven, kan modifisering av tradisjonelle kutteløsninger, temperaturer, inkubasjonsdetaljer og perfusjonssystemer forbedre helsen til skiven. Her bruker vi små modifikasjoner på vår normale skive forberedelse. Disse inkluderer kortere utvinning inkubasjonstider (30 minutter vs. 60 minutter) og raskere strømningshastigheter i skivekammeret perfusjonssystem.

Når skivedimensjonene og inkubasjonsdetaljene er bestemt, skal funksjonen og tilkoblingen til forskjellige komponenter i kretsene i skiven demonstreres. I vårt preparat sørger vi for at både eksitiverende og hemmende innganger, hypotetiske for å stamme fra cochleakjernen med T-stellate og GBC (via MNTB), er tilstede som forventet. Alternative stimuleringsmetoder som sugeelektroder for hørselsnerven, eller optiske stimuleringsmetoder som optogenetikk eller fokal nevrotransmitter uncaging kan også øke kretsaktivering eller tillate celletypespesifikk aktivering når de kombineres med genetisk målretting av celleundertyper.

Selv om denne kuttemetoden forhåpentligvis vil være nyttig for mange systemer og kretser, er noen av begrensningene i standard tynne seksjoner også relevante for dette preparatet. Generelt kan det være vanskelig å bevare kretser med mindre planar projeksjon mønstre, som aksoner vil trolig bli kuttet. Aktivering av kretsen ved kranialnervene, som gjort her for å etterligne auditive innganger, kan ikke være mulig i mange kretser. Som med andre skivepreparater må nettverkseffektene av enhver farmakologi vurderes. For eksempel, bad anvendelse av glutamat reseptor blokkere for å isolere hemmende (GABA- eller glykergic) eller andre overføringsmekanismer kan ikke brukes med polysynaptisk krets aktivering når glutamat er nødvendig for aktivering av nevroner oppstrøms av lappet mål neuron. Dette gjelder i vårt tilfelle som både AN / CN og GBC / MNTB synapser er glutamatergic, derfor vil all overføring bli eliminert ved MOC nevroner med bad påføring av glutamatreseptorblokkere. I tillegg vil anvendelse av GABA eller glycinreseptorblokkere for å eliminere MNTB-MOC synaptiske responser ha den utilsiktede konsekvensen av å eliminere iboende hemmende tilkobling i CN som kan forme mønstrene av afferent innganger til MOC nevroner. Fokal påføring av reseptorblokkere, med trykkutstøting eller iiontoforese, kan brukes til å begrense farmakologisk funksjon.

Til slutt er den viktigste begrensningen av dette, og enhver, in vitro-teknikk at selv om dette preparatet maksimerer aktiveringen av monaural stigende hørselskretser, er resten av nervesystemet, inkludert perifere reseptorer som koder stimuli, fraværende. Dette inkluderer selve sneglehuset, eksitivatoriske innganger fra det andre øret66, commissuralCN-tilkoblinger 67,68,69,70,og synkende kortikal71,72,73,74 og kollokulær75,76 projeksjoner og modulativeinnganger 77,78,79,80 kjent for å påvirke aktiviteten til CN og SOC-kjerner. Selv om det er mulig at en del av synkende IC-projeksjoner opprettholdes, ville det være umulig å inkludere både kortikale projeksjoner og kommissære CN-projeksjoner på grunn av skivegeometri. Derfor fokuserer vi på de stigende hørselskretsene fra sneglehuset med dagens eksperimenter. Den minimale tykkelsen på skiven på den tynne siden reduserer også evnen til å utføre binaural polysynaptiske kretsanalyser, noe som er en fordel med symmetriske tykkeskivepreparater 10,11. I tillegg kan vi ikke stimulere hørselsnerven med lyd for å fremkalle naturlige mønstre av kretsaktivitet. Auditiv nerveresponser er tonotopisk varierte, nervøse og plast81,82,83,84,noe som gjør det vanskelig å simulere perfekt med vår elektriske stimuleringsmetode. Dette er en stor ulempe med in vitro eksperimentering i hørselssystemet. Tonotopisk begrensning av vår stimulering er ikke mulig siden stimulere hele AN roten vil fremkalle spiking i AN fibre over tonotopisk gradient. Nøyaktig etterligne mangfoldet av AN fiber svar (det vil si lav vs. høy spontan hastighet fibre) til en elektrisk stimulans mønster er heller ikke mulig. Det er også vanskelig å nøyaktig matche dynamisk intensitet koding av flere AN-fibre på CN. Vi er imidlertid i stand til å bruke vår elektrofysiologiprogramvare til å produsere en rekke stimuleringsmønstre som tar sikte på å etterligne passende auditiv nerveutgang under forskjellige akustiske stimuli (f.eks. korte, høye lyder, stille, langvarige lyder eller lyder i bakgrunnsstøy) ved å variere stimulansfrekvensen både mellom elektriske stimulansprotokoller og også innenfor en individuell protokoll for å omtrentligere kombinerte AN-innganger (modellert i ref.85). Overvåking av MOC-utgang under disse eksperimentene vil teste våre hypoteser om hvilke stimulansmønstre som kan favorisere hemming eller eksitasjon ved MOC-nevroner.

Til tross for begrensningene beskrevet ovenfor, har en kileskiveforberedelsesmetode fordeler sammenlignet med in vivo og typiske in vitro-skiver fysiologimetoder og kan brukes til å nærme seg in vivo-kretsaktivering så nært som mulig i skiven for celler som er vanskelige å få tilgang til. In vivo hele celleopptak i den hørbare hjernestammen har vært sjeldne på grunn av vanskeligheter med å få tilgang til dette området kirurgisk86. I stedet ble skiven forberedt på å inkludere stigende innganger til MOC-nevroner som begynner med hørselsnerven, som stimuleres direkte for å aktivere hele monaural stigende krets. Vi demonstrerer aktivering av både ekstiende og hemmende synaptiske innganger, og svar på disse inngangene gir verdifull informasjon om tidspunktet for synaptiske innganger når de når MOC-nevronene. Dette gir en plattform for eksperimentering med høy gjennomstrømning der vi kan bruke et stort repertoar av in vitro elektrofysiologiverktøy som kalsium- eller spenningsavbildning, nevrotransmitter uncaging og både intracellulær (via patchpipetten) og ekstracellulær (via badapplikasjon eller iontoforese) farmakologi. Preparatet bør også gi en økning i gjennomstrømningen over tykke skivepreparater på grunn av bedre synlighet av målnevroner ved hjelp av DIC-optikk, som visker ut med økt vevstykkelse, spesielt i ventral hjernestammen. Samlet sett gir denne teknikken forbedringer i målretting og gjennomstrømning over in vivo-metoder, og bedre muligheter for kretsanalyse enn tradisjonelle skivefysiologimetoder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Denne forskningen ble støttet av Intramural Research Program av NIH, NIDCD, Z01 DC000091 (CJCW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Experimental Preparations
Agar, powder Fisher Scientific BP1423500 4% agar block used to stabilize brain tissue during vibratome sectioning
AlexaFluor Hydrazide 488 Invitrogen A10436 Fluorophore used in internal solution to confirm successful MOC neuron patch
Analytical Balance Geneses Scientific (Intramalls) AV114 Weighing chemicals
Double edged razor blade Ted Pella 121-6 Vibratome cutting blade
Kynurenic acid (5g) Sigma Aldrich K3375-5G Slicing ACSF additive used to reduce neuron activity during dissection and slicing in order to improve tissue health for patch clamping
pH Meter Fisher Scientific (Intramalls) 13-620-451 Solution pH tester
Plastic petri dishes 100mm dia X 20mm Fisher Scientific (Intramalls) 12-556-002 4% Agar Prep
Stirring Hotplate Fisher Scientific (Intramalls) 11-500-150 Heating for 4% Agar preparation
Dissection and Slicing
Biocytin Sigma Aldrich B4261-250MG Chemical used for axonal tracing (conjugated to Streptavidin 488)
Dissecting Microscope Amscope SM-1BN For precision dissection during brain removal
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20 Fine forceps dissection tool
Economy tweezers #3 WPI 501976 Forceps dissection tool
Glass Petri Dish 150mm dia x 15mm H Fisher Scientific (Intramalls) 08-747E Dissection dish
Interface paper (203 X 254mm PCTE Membrane 10um) Thomas Scientific 1220823 Slice incubation/biocytin application
Leica VT1200S Vibratome Leica 1491200S001 Vibratome for wedge slice sectioning
Mayo scissors Roboz RS-6872 Dissection tool
Single-edged carbon steel blades Fisher Scientific (Intramalls) 12-640 Razor blade for dissection
Specimen disc, orienting Leica 14048142068 Specialized vibratome stage for reproducible tilting
Spoonula FisherSci 14-375-10 Dissection tool
Super Glue Newegg 15187 Used for glueing tissue to vibratome stage
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 91500-09 Dissection tool
Electrophysiology
A1R Upright Confocal Microscope Nikon Instruments Electrophysiology and imaging microscope, can be any microscope compatible with electrophysiology
Electrode Borosilicate glass w/ Filament OD 1.5mm, ID 1.1mm, 10 cm long Sutter Instrument BF150-110-10 Patch clamping pipette glass
Electrode Filler MicroFil WPI CMF20G Patch electrode pipette filler
In-line solution heater Warner Instruments (GSAdvantage) SH-27B Slice perfusion system heater
Multi-Micromanipulator Systems Sutter Intruments MPC-200 with MP285 Micromanipulators for patch clamp and stimulation electrode placement
P-1000 horizontal pipette puller for glass micropipettes Sutter instruments FG-P1000 Patch clamp pipetter puller
Patch-clamp amplifier and Software HEKA EPC-10 / Patchmaster Next Can be any amplifier/software
Recording Chamber Warner Instruments RC26G Slice "bath" during recording
Recording Chamber Harp Warner Instruments 640253 Stablizes slice during electrophysiology recording
Slice Incubation Chamber Custom Build Heated, oxygenated holding chamber for slices during recovery after slicing
Stimulus isolation unit A.M.P.I. Iso-Flex Stimulus isolation unit for electrophysiology
Syringe 60CC Fischer Scientific (Intramalls) 14-820-11 Electrophysiology perfusion fluid handling
Temperature controller Warner Instruments (GSAdvantage) TC-324C Slice perfusion system temperature controller
Tubing 1/8 OD 1/16 ID Fischer Scientific (Intramalls) 14-171-129 Electrophysiology perfusion fluid handling
Tugsten concentric bipolar microelectrode WPI TM33CCINS Stimulating electrode for electrophysiology
Histology
24 well Plate Fisher Scientific (Intramalls) 12-556006 Histology slice collection and immunostaining
Alexa Fluor 488 Streptavidin Jackson Immuno labs 016-540-084 Secondary antibody for biocytin visualization
Corning Orbital Shaker Sigma CLS6780FP Shaker for immunohistochemistry agitation
Cresyl Violet Acetate Sigma Aldrich (Intramalls) C5042-10G Cellular stain for histology
Disposable Microtome Blades Fisher Scientific 22-210-052 Sliding microtome blade
Filter-syringe Nalgene 4mm Cellulose Acetate 0.2um Fisher Scientific (Intramalls) 09-740-34A Syringe filter for filling recording pipettes with internal solution
Fluoromount-G Slide Mounting Medium Fisher Scientific OB100-01 Immunohistochemistry fluorescence mounting medium
glass slide staining dish with rack Fisher Scientific (Intramalls) 08-812 Cresyl Violet staining chamber
Microm HM450 Sliding Microtome ThermoFisher 910020 Freezing microtome for histology
Microscope Cover Glasses: Rectangles 50mm X 24mm Fisher Scientific (Intramalls) 12-543D Histochemistry slide cover glass
Permount mounting medium Fisher Scientific SP15-100 Cresyl violet section mounting medium
Superfrost Slides Fisher Scientific 22-034980 Histology slides

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Campbell, J. P., Henson, M. M. Olivocochlear neurons in the brainstem of the mouse. Hearing Research. 35 (2-3), 271-274 (1988).
  2. Grothe, B., Sanes, D. H. Synaptic inhibition influences the temporal coding properties of medial superior olivary neurons: An in vitro study. Journal of Neuroscience. 14, 1701-1709 (1994).
  3. Kotak, V. C., Sanes, D. H. Long-lasting inhibitory synaptic depression is age- and calcium-dependent. Journal of Neuroscience. 20 (15), 5820-5826 (2000).
  4. Smith, A. J., Owens, S., Forsythe, I. D. Characterisation of inhibitory and excitatory postsynaptic currents of the rat medial superior olive. The Journal of Physiology. 529 (3), 681-698 (2000).
  5. Scott, L. L., Mathews, P. J., Golding, N. L. Posthearing developmental refinement of temporal processing in principal neurons of the medial superior olive. Journal of Neuroscience. 25 (35), 7887-7895 (2005).
  6. Fischl, M. J., Combs, T. D., Klug, A., Grothe, B., Burger, R. M. Modulation of synaptic input by GABAB receptors improves coincidence detection for computation of sound location. Journal of Physiology. 590 (13), 3047-3066 (2012).
  7. Clause, A., et al. The Precise Temporal Pattern of Prehearing Spontaneous Activity Is Necessary for Tonotopic Map Refinement. Neuron. 82 (4), 822-835 (2014).
  8. Oertel, D. Use of brain slices in the study of the auditory system: Spatial and temporal summation of synaptic inputs in cells in the anteroventral cochlear nucleus of the mouse. Journal of the Acoustical Society of America. 78 (1), 328-333 (1985).
  9. Hermann, J., Pecka, M., Von Gersdorff, H., Grothe, B., Klug, A. Synaptic transmission at the calyx of held under in vivo-like activity levels. Journal of Neurophysiology. 98 (2), 807-820 (2007).
  10. Jercog, P. E., Svirskis, G., Kotak, V. C., Sanes, D. H., Rinzel, J. Asymmetric excitatory synaptic dynamics underlie interaural time difference processing in the auditory system. PLoS Biology. 8 (6), 1000406 (2010).
  11. Roberts, M. T., Seeman, S. C., Golding, N. L. A mechanistic understanding of the role of feedforward inhibition in the mammalian sound localization circuitry. Neuron. 78 (5), 923-935 (2013).
  12. Sinclair, J. L., et al. Sound-evoked activity influences myelination of brainstem axons in the trapezoid body. Journal of Neuroscience. 37 (34), 8239-8255 (2017).
  13. Wang, J., et al. Myelination of the postnatal mouse cochlear nerve at the peripheral-central nervous system transitional zone. Frontiers in Pediatrics. 1, 5-8 (2013).
  14. Long, P., Wan, G., Roberts, M. T., Corfas, G. Myelin development, plasticity, and pathology in the auditory system. Developmental Neurobiology. 78 (2), 80-92 (2018).
  15. Leão, R. M., et al. Presynaptic Na+ channels: Locus, development, and recovery from inactivation at a high-fidelity synapse. Journal of Neuroscience. 25 (14), 3724-3738 (2005).
  16. Fex, J. Efferent Inhibition in the Cochlea Related to Hair-Cell dc Activity: Study of Postsynaptic Activity of the Crossed Olivocochlear Fibres in the Cat. The Journal of the Acoustical Society of America. 41 (3), 666-675 (1967).
  17. Mountain, D. C. Changes in endolymphatic potential and crossed olivocochlear bundle stimulation alter cochlear mechanics. Science. 210 (4465), 71-72 (1980).
  18. Siegel, J. H., Kim, D. O. Efferent neural control of cochlear mechanics? Olivocochlear bundle stimulation affects cochlear biomechanical nonlinearity. Hearing Research. 6 (2), 171-182 (1982).
  19. Guinan, J. J. Cochlear efferent innervation and function. Current Opinion in Otolaryngology & Head and Neck Surgery. 18 (5), 447-453 (2010).
  20. Elgoyhen, A. B., Katz, E. The efferent medial olivocochlear-hair cell synapse. Journal of Physiology-Paris. 106 (1-2), 47-56 (2012).
  21. Galambos, R. Suppression of auditory nerve activity by stimulation of efferent fibers to cochlea. Journal of Neurophysiology. 19 (5), 424-437 (1956).
  22. Desmedt, J. E. Auditory-Evoked Potentials from Cochlea to Cortex as Influenced by Activation of the Efferent OlivoCochlear Bundle. Journal of the Acoustical Society of America. 34 (9), 1478-1496 (1962).
  23. Wiederhold, M. L., Kiang, N. Y. S. Effects of Electric Stimulation of the Crossed Olivocochlear Bundle on Single Auditory-Nerve Fibers in the Cat. The Journal of the Acoustical Society of America. 48 (4), 950-965 (1970).
  24. Wiederhold, M. L., Peake, W. T. Efferent Inhibition of Auditory-Nerve Responses: Dependence on Acoustic-Stimulus Parameters. Journal of the Acoustical Society of America. 40 (6), 1427-1430 (1966).
  25. Geisler, D. C. Hypothesis on the function of the crossed olivocochlear bundle. Journal of the Acoustical Society of America. 56 (6), 1908-1909 (1974).
  26. Guinan, J. J., Gifford, M. L. Effects of electrical stimulation of efferent olivocochlear neurons on cat auditory-nerve fibers. III. Tuning curves and thresholds at CF. Hearing Research. 37 (1), 29-45 (1988).
  27. Rajan, R. Involvement of cochlear efferent pathways in protective effects elicited with binaural loud sound exposure in cats. Journal of Neurophysiology. 74 (2), 582-597 (1995).
  28. Rajan, R. Effect of electrical stimulation of the crossed olivocochlear bundle on temporary threshold shifts in auditory sensitivity. II. Dependence on the level of temporary threshold shifts. Journal of Neurophysiology. 60 (2), 569-579 (1988).
  29. Reiter, E. R., Liberman, M. C. Efferent-mediated protection from acoustic overexposure: Relation to slow effects of olivocochlear stimulation. Journal of Neurophysiology. 73 (2), 506-514 (1995).
  30. Taranda, J., et al. A point mutation in the hair cell nicotinic cholinergic receptor prolongs cochlear inhibition and enhances noise protection. PLoS Biology. 7 (1), 1000018 (2009).
  31. Maison, S. F., Usubuchi, H., Liberman, C. M. Efferent feedback minimizes cochlear neuropathy from moderate noise exposure. Journal of Neuroscience. 33 (13), 5542-5552 (2013).
  32. Tong, H., et al. Protection from noise-induced hearing loss by Kv2. 2 potassium currents in the central medial olivocochlear system. Journal of Neuroscience. 33 (21), 9113-9121 (2013).
  33. Boero, L. E., et al. Enhancement of the medial olivocochlear system prevents hidden hearing loss. Journal of Neuroscience. 38 (34), 7440-7451 (2018).
  34. Spirou, G. A., Brownell, W. E., Zidanic, M. Recordings from cat trapezoid body and HRP labeling of globular bushy cell axons. Journal of Neurophysiology. 63 (5), 1169-1190 (1990).
  35. von Gersdorff, H., Borst, J. G. G. Short-term plasticity at the calyx of held. Nature Reviews Neuroscience. 3 (1), 53-64 (2002).
  36. Smith, P. H., Joris, P. X., Carney, L. H., Yin, T. C. T. Projections of physiologically characterized globular bushy cell axons from the cochlear nucleus of the cat. Journal of Comparative Neurology. 304 (3), 387-407 (1991).
  37. Kuwabara, N., DiCaprio, R. A., Zook, J. M. Afferents to the medial nucleus of the trapezoid body and their collateral projections. Journal of Comparative Neurology. 314 (4), 684-706 (1991).
  38. Friauf, E., Ostwald, J. Divergent projections of physiologically characterized rat ventral cochlear nucleus neurons as shown by intra-axonal injection of horseradish peroxidase. Experimental Brain Research. 73 (2), 263-284 (1988).
  39. De Venecia, R. K., Liberman, M. C., Guinan, J. J., Brown, M. C. Medial olivocochlear reflex interneurons are located in the posteroventral cochlear nucleus: A kainic acid lesion study in guinea pigs. Journal of Comparative Neurology. 487 (4), 345-360 (2005).
  40. Darrow, K. N., Benson, T. E., Brown, M. C. Planar multipolar cells in the cochlear nucleus project to medial olivocochlear neurons in mouse. Journal of Comparative Neurology. 520 (7), 1365-1375 (2012).
  41. Brown, M. C., De Venecia, R. K., Guinan, J. J. Responses of medial olivocochlear neurons: Specifying the central pathways of the medial olivocochlear reflex. Experimental Brain Research. 153 (4), 491-498 (2003).
  42. Wang, Y., Manis, P. B. Synaptic transmission at the cochlear nucleus endbulb synapse during age-related hearing loss in mice. Journal of Neurophysiology. 94 (3), 1814-1824 (2005).
  43. Golding, N. L., Robertson, D., Oertel, D. Recordings from slices indicate that octopus cells of the cochlear nucleus detect coincident firing of auditory nerve fibers with temporal precision. Journal of Neuroscience. 15 (4), 3138-3153 (1995).
  44. Ferragamo, M. J., Golding, N. L., Oertel, D. Synaptic inputs to stellate cells in the ventral cochlear nucleus. Journal of Neurophysiology. 79 (1), 51-63 (1998).
  45. Oertel, D. Synaptic responses and electrical properties of cells in brain slices of the mouse anteroventral cochlear nucleus. Journal of Neuroscience. 3 (10), 2043-2053 (1983).
  46. Xie, R., Manis, P. B. Radiate and planar multipolar neurons of the mouse anteroventral cochlear nucleus: Intrinsic excitability and characterization of their auditory nerve input. Frontiers in Neural Circuits. 11, 1-17 (2017).
  47. Wu, S., Oertel, D. Inhibitory circuitry in the ventral cochlear nucleus is probably mediated by glycine. The Journal of Neuroscience. 6 (9), 2691-2706 (1986).
  48. Xie, R., Manis, P. B. Target-specific IPSC kinetics promote temporal processing in auditory parallel pathways. Journal of Neuroscience. 33 (4), 1598-1614 (2013).
  49. Wickesberg, R. E., Oertel, D. Delayed, frequency-specific inhibition in the cochlear nuclei of mice: A mechanism for monaural echo suppression. Journal of Neuroscience. 10 (6), 1762-1768 (1990).
  50. Campagnola, L., Manis, P. B. A map of functional synaptic connectivity in the mouse anteroventral cochlear nucleus. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2214-2230 (2014).
  51. Doucet, J. R., Ryugo, D. K. Projections from the ventral cochlear nucleus to the dorsal cochlear nucleus in rats. Journal of Comparative Neurology. 385 (2), 245-264 (1997).
  52. Kopp-Scheinpflug, C., et al. The sound of silence: Ionic mechanisms encoding sound termination. Neuron. 71 (5), 911-925 (2011).
  53. Alamilla, J., Gillespie, D. C. Maturation of Calcium-Dependent GABA, Glycine, and Glutamate Release in the Glycinergic MNTB-LSO Pathway. PLoS One. 8 (9), 0075688 (2013).
  54. Spangler, K. M., Warr, W. B., Henkel, C. K. The projections of principal cells of the medial nucleus of the trapezoid body in the cat. Journal of Comparative Neurology. 238 (3), 249-262 (1985).
  55. Kramer, F., et al. Inhibitory glycinergic neurotransmission in the mammalian auditory brainstem upon prolonged stimulation: Short-term plasticity and synaptic reliability. Frontiers in Neural Circuits. 8, 1-22 (2014).
  56. Roberts, M. T., Seeman, S. C., Golding, N. L. The relative contributions of MNTB and LNTB neurons to inhibition in the medial superior olive assessed through single and paired recordings. Frontiers in Neural Circuits. 8, 1-14 (2014).
  57. Torres Cadenas, L., Fischl, M. J., Weisz, C. J. C. Synaptic Inhibition of Medial Olivocochlear Efferent Neurons by Neurons of the Medial Nucleus of the Trapezoid Body. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 40 (3), 509-525 (2020).
  58. Brown, M. C., Mukerji, S., Drottar, M., Windsor, A. M., Lee, D. J. Identification of inputs to olivocochlear neurons using transneuronal labeling with pseudorabies virus (PRV). JARO - Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 14 (5), 703-717 (2013).
  59. Morest, D. K. The collateral system of the medial nucleus of the trapezoid body of the cat, its neuronal architecture and relation to the olivo-cochlear bundle. Brain Research. 9 (2), 288-311 (1968).
  60. Warr, B. W. Fiber degeneration following lesions in the multipolar and globular cell areas in the ventral cochlear nucleus of the cat. Brain Research. 40 (2), 247-270 (1972).
  61. Osen, K. K. Cytoarchitecture of the cochlear nuclei in the cat. Journal of Comparative Neurology. 136 (4), 453-483 (1969).
  62. Cant, N. B., Morest, D. K. The bushy cells in the anteroventral cochlear nucleus of the cat. A study with the electron microscope. Neuroscience. 4 (12), 1925-1945 (1979).
  63. Cant, N. B., Morest, D. K. Organization of the neurons in the anterior division of the anteroventral cochlear nucleus of the cat. Light-microscopic observations. Neuroscience. 4 (12), 1909-1923 (1979).
  64. Lauer, A. M., Connelly, C. J., Graham, H., Ryugo, D. K. Morphological Characterization of Bushy Cells and Their Inputs in the Laboratory Mouse (Mus musculus) Anteroventral Cochlear Nucleus. PLoS One. 8 (8), 1-16 (2013).
  65. Harrison, J. M., Warr, W. B. A study of the cochlear nuclei and ascending auditory pathways of the medulla. Journal of Comparative Neurology. 119 (3), 341-379 (1962).
  66. Robertson, D., Gummer, M. Physiological and morphological characterization of efferent neurones in the guinea pig cochlea. Hearing Research. 20 (1), 63-77 (1985).
  67. Bledsoe, S. C., et al. Ventral cochlear nucleus responses to contralateral sound are mediated by commissural and olivocochlear pathways. Journal of Neurophysiology. 102 (2), 886-900 (2009).
  68. Zhou, J., Zeng, C., Cui, Y., Shore, S. Vesicular glutamate transporter 2 is associated with the cochlear nucleus commissural pathway. JARO - Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 11 (4), 675-687 (2010).
  69. Kuenzel, T. Modulatory influences on time-coding neurons in the ventral cochlear nucleus. Hearing Research. 384, 107824 (2019).
  70. Cant, N. B., Gaston, K. C. Pathways connecting the right and left cochlear nuclei. Journal of Comparative Neurology. 212 (3), 313-326 (1982).
  71. Feliciano, M., Saldana, E., Mugnaini, E. Direct projections from the rat primary auditory neocortex to nucleus sagulum, paralemniscal regions, superior olivary complex and cochlear nuclei. Auditory Neuroscience. 1 (3), 287-308 (1995).
  72. Mulders, W. H. A. M., Robertson, D. Evidence for direct cortical innervation of medial olivocochlear neurones in rats. Hearing Research. 144 (1-2), 65-72 (2000).
  73. Schofield, B. R., Coomes, D. L. Pathways from auditory cortex to the cochlear nucleus in guinea pigs. Hearing Research. 216-217 (1-2), 81-89 (2006).
  74. Meltzer, N. E., Ryugo, D. K. Projections from auditory cortex to cochlear nucleus: A comparative analysis of rat and mouse. Anatomical Record - Part A Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 288 (4), 397-408 (2006).
  75. Schofield, B. R., Cant, N. B. Descending auditory pathways: Projections from the inferior colliculus contact superior olivary cells that project bilaterally to the cochlear nuclei. Journal of Comparative Neurology. 409 (2), 210-223 (1999).
  76. Thompson, A. M., Schofield, B. R. Afferent projections of the superior olivary complex. Microscopy Research and Technique. 51 (4), 330-354 (2000).
  77. Woods, C. I., Azeredo, W. J. Noradrenergic and serotonergic projections to the superior olive: Potential for modulation of olivocochlear neurons. Brain Research. 836 (1-2), 9-18 (1999).
  78. Mulders, W. H. A. M., Robertson, D. Morphological relationships of peptidergic and noradrenergic nerve terminals to olivocochlear neurones in the rat. Hearing Research. 144 (1-2), 53-64 (2000).
  79. Thompson, A. M., Thompson, G. C. Light microscopic evidence of serotoninergic projections to olivocochlear neurons in the bush baby (Otolemur garnettii). Brain Research. 695 (2), 263-266 (1995).
  80. Wang, X., Robertson, D. Substance P-induced inward current in identified auditory efferent neurons in rat brain stem slices. Journal of Neurophysiology. 80 (1), 218-229 (1998).
  81. Taberner, A. M., Liberman, M. C. Response properties of single auditory nerve fibers in the mouse. Journal of Neurophysiology. 93 (1), 557-569 (2005).
  82. Galambos, R., Davis, H. The response of single auditory-nerve stimulation. Journal of Neurophysiology. 6 (1), 39-57 (1943).
  83. Sachs, M. B., Abbas, P. J. Rate versus level functions for auditory-nerve fibers in cats: Tone-burst stimuli. Journal of the Acoustical Society of America. 56 (6), 1835-1847 (1974).
  84. Zhang, X., Heinz, M. G., Bruce, I. C., Carney, L. H. A phenomenological model for the responses of auditory-nerve fibers: I. Nonlinear tuning with compression and suppression. The Journal of the Acoustical Society of America. 109 (2), 648-670 (2001).
  85. Zilany, M. S. A., Bruce, I. C., Carney, L. H. Updated parameters and expanded simulation options for a model of the auditory periphery. The Journal of the Acoustical Society of America. 135 (1), 283-286 (2014).
  86. Franken, T. P., Smith, P. H., Joris, P. X. In vivo whole-cell recordings combined with electron microscopy reveal unexpected morphological and physiological properties in the lateral nucleus of the trapezoid body in the auditory brainstem. Frontiers in Neural Circuits. 10, 1-20 (2016).

Tags

Nevrovitenskap utgave 162 mediale olivocochlearonroner in vitro skive elektrofysiologi synaptisk integrasjon auditiv nerve auditiv hjernestamme cochleakjerne hemmende nevrotransmisjon
In Vitro Kile skive Forberedelse for å etterligne In Vivo Neuronal Circuit Connectivity
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fischl, M. J., Weisz, C. J. C. In… More

Fischl, M. J., Weisz, C. J. C. In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity. J. Vis. Exp. (162), e61664, doi:10.3791/61664 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter