Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

In Vitro Wedge Slice Forberedelse til efterligne In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

Published: August 18, 2020 doi: 10.3791/61664
Automatic Translation
1, 1
1Section on Neuronal Circuitry, National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, NIH

Summary

Integration af forskellige synaptiske input til neuroner måles bedst i et præparat, der bevarer alle præ-synaptiske kerner for naturlig timing og kredsløb plasticitet, men hjernen skiver typisk afskære mange forbindelser. Vi udviklede en modificeret hjerneskive til at efterligne in vivo kredsløbsaktivitet, samtidig med at vitro-eksperimenterne opretholdes.

Abstract

In vitro skive elektrofysiologi teknikker måle encellet aktivitet med præcis elektrisk og tidsmæssig opløsning. Hjerne skiver skal være relativt tynde til korrekt visualisere og få adgang til neuroner til patch-fastspænding eller billeddannelse, og in vitro undersøgelse af hjernen kredsløb er begrænset til kun, hvad der er fysisk til stede i den akutte skive. For at opretholde fordelene ved in vitro skive eksperimenter og samtidig bevare en større del af præsynaptiske kerner, udviklede vi en ny skive forberedelse. Denne "kile skive" var designet til patch-clamp elektrofysiologi optagelser til at karakterisere de forskellige monaural, lyd-drevne input til mediale olivocochlear (MOC) neuroner i hjernestammen. Disse neuroner får deres primære afferente excitatoriske og hæmmende input fra neuroner aktiveret af stimuli i det kontralaterale øre og tilsvarende cochlear kerne (CN). En asymmetrisk hjerne skive blev designet, som er tykkest i rostro-caudal domæne på sidekanten af en halvkugle og derefter tynder mod den laterale kant af den modsatte halvkugle. Denne skive indeholder, på den tykke side, den auditive nerve rod formidle oplysninger om auditive stimuli til hjernen, den iboende CN kredsløb, og både den disynaptiske excitatoriske og trisynaptiske hæmmende afferent veje, der konvergerer på kontralaterale MOC neuroner. Optagelse udføres fra MOC neuroner på den tynde side af skiven, hvor de visualiseres ved hjælp af DIC optik til typiske patch-clamp eksperimenter. Direkte stimulering af hørenerven udføres, da den kommer ind i den auditive hjernestamme, hvilket giver mulighed for iboende CN kredsløb aktivitet og synaptisk plasticitet at forekomme på synapser opstrøms for MOC neuroner. Med denne teknik, kan man efterligne in vivo kredsløb aktivering så tæt som muligt i skiven. Denne kile skive forberedelse gælder for andre hjerne kredsløb, hvor kredsløb analyser ville drage fordel af bevarelse af upstream tilslutningsmuligheder og langtrækkende input, i kombination med de tekniske fordele ved in vitro skive fysiologi.

Introduction

Observation af aktiviteten af neurale kredsløb er ideelt udført med indfødte sensoriske indgange og feedback, og intakt forbindelse mellem hjernen regioner, in vivo. Men, udfører eksperimenter, der giver encellet opløsning af neurale kredsløb funktion er stadig begrænset af tekniske udfordringer i den intakte hjerne. Mens in vivo ekstracellulære elektrofysiologi eller multiphoton billeddannelse metoder kan bruges til at undersøge aktivitet i intakte nervesystemer, fortolke, hvordan forskellige indgange integrere eller måle subthreshold synaptiske indgange er fortsat vanskeligt. In vivo helcelleoptagelser overvinder disse begrænsninger, men er udfordrende at udføre, selv i hjerneregioner, der er let tilgængelige. Tekniske udfordringer i forbindelse med enkeltcelleopløsningsforsøg forstærkes yderligere i visse neuronpopulationer, der er placeret dybt inde i hjernen, eller i rumligt diffuse populationer, der kræver enten genetiske værktøjer til at lokalisere celler in vivo (f.eks. genetisk ekspression af channelrhodopsin parret med optrodeoptagelse) eller post-hoc histoktisk identifikation efter registrering af mærkning af celler (f.eks. med neurotransmissionsspecifikke markører). At være placeret diffust nær den ventrale overflade af hjernestammen, mediale olivocochlear (MOC) neuroner lider af ovenståendebegrænsninger 1,hvilket gør dem yderst vanskelige at få adgang til in vivo eksperimenter.

Hjerne skiver (~ 100-500 μm tykkelse) har længe været brugt til at studere hjernen kredsløb, herunder auditive hjernestamme kredsløb, på grund af den fysiske adskillelse af tilsluttede neuroner, der er indeholdt i samme skive2,3,4,5,6,7,8,9. Der er i andre laboratorier anvendt forsøg med meget tykkere skiver (>1 mm) for atforstå,hvordan bilaterale input integreres i områder af det overlegne olivary-kompleks (SOC), herunder den mediale overlegneoliven 10,11. Disse skiver blev udarbejdet således, at axoner af hørenerven (AN) forblev intakt i skiven og blev elektrisk stimuleret til at indlede synaptisk neurotransmitter frigivelse i CN, efterligne aktivitet første orden auditive neuroner, som de ville reagere på lyd. En væsentlig ulempe ved disse tykke skiver er synligheden af neuroner til patch-clamp elektrofysiologiske optagelser ("patching"). Patching bliver stadig vanskeligere som de mange axoner i dette område bliver myelinated medalderen 12,13,14,15, hvilket gør vævet optisk tæt og tilsløre neuroner selv i en typisk, tynd hjerne skive. Vores mål er at skabe in vitro præparater, der mere ligner kredsløbet tilslutning smuligheder in vivo optagelser, men med den høje kapacitet og høj opløsning optagelse evner visuelt guidet patch-clamp elektrofysiologi i hjernen skiver.

Vores laboratorium undersøger fysiologien af neuroner i det auditive efferent-system, herunder MOC-neuroner. Disse kolinerge neuroner giver efferent feedback til cochlea ved at modulere aktiviteten af ydre hårceller (OHCs)16,17,18,19,20. Tidligere undersøgelser harvist,at denne graduering spiller en rolle i at opnå kontrol i cochlea21,22,23,24,25,26 ogbeskyttelse mod akustisktraume27,28,29,30,31,32,33. I mus, MOC neuroner er diffust placeret i ventrale kernen i trapez kroppen (VNTB) i auditivehjernestammen 1. Vores gruppe har udnyttet ChAT-IRES-Cre muselinjen krydset med tdTomato reporter muselinjen til at målrette MOC neuroner i hjernestamme skiver under epifluorescerende belysning. Vi viste, at MOC neuroner modtager afferent hæmmende input fra ipsilateral mediale kerne af trapez kroppen (MNTB), som er ophidset, igen, af axoner fra kugleformede buskede celler (GBC) i den kontralaterale cochlear kerne (CN)34,35,36,37,38. Derudover, MOC neuroner sandsynligvis modtage deres excitatoriske input fra T-stellate celler i den kontralaterale CN39,40,41. Tilsammen viser disse undersøgelser, at MOC-neuroner får både excitatoriske og hæmmende input fra det samme (kontralaterale) øre. Men, de præsynaptiske neuroner, og deres axoner konvergerende på MOC neuroner, er ikke helt tæt nok til hinanden til at være helt intakt i en typisk koronal skive forberedelse. For at undersøge, hvordan integration af synaptiske input til MOC neuroner påvirker deres indsats potentielle fyring mønstre, med fokus på nyligt beskrevne hæmning, vi udviklet et præparat, hvor vi kunne stimulere de forskellige afferenter til MOC neuroner fra det ene øre i den mest fysiologisk realistiske måde muligt, men med de tekniske fordele ved in vitro hjerne skive eksperimenter.

Kilen skive er en modificeret tyk skive forberedelse designet til undersøgelse af kredsløb integration i MOC neuroner (schematized i figur 1A). På den tykke side af skiven indeholder kilen de afhuggede axoner af hørenerven (benævnt "auditiv nerverod" herefter), da de kommer ind i hjernestammen fra periferien og synapser i CN. Den auditive nerverod kan stimuleres elektrisk til at fremkalde neurotransmitter frigivelse og synaptisk aktivering af celler i den fuldt intakte KN42,43,44,45,46. Dette stimuleringsformat har flere fordele for kredsløbsanalyse. For det første, i stedet for direkte at stimulere T-stellate og GBC axoner, der giver afferent input til MOC neuroner, vi stimulerer AN at tillade aktivering af iboende kredsløb rigelige i CN. Disse kredsløb modulere produktionen af CN neuroner til deres mål i hele hjernen, herunder MOC neuroner46,47,48,49,50,51. For det andet giver den polysynaptiske aktivering af afferentkredsløb fra AN gennem CN opstrøms for MOC-neuroner mulighed for mere naturlig aktiveringstidspunktet og for plasticitet ved disse synapser, som de ville in vivo under auditiv stimulation. For det tredje kan vi variere vores stimulationsmønstre for at efterligne EN aktivitet. Endelig er både excitatoriske og hæmmende monaural projektioner til MOC neuroner intakt i kilen skive, og deres integration kan måles ved en MOC neuron med præcisionen af patch-clamp elektrofysiologi. Som helhed, denne aktivering ordning giver en mere intakt kredsløb til MOC neuroner i forhold til en typisk hjerne skive forberedelse. Denne hjernestamme kile skive kan også bruges til at undersøge andre auditiveområder,der modtager hæmmende input fra ipsilateral MNTB herunder lateral overlegen oliven, overlegen olivary kerne og mediale overlegne oliven10,11,52,53,54,55,56. Ud over vores specifikke præparat kan denne udskæringsmetode bruges eller ændres til at evaluere andre systemer med fordelene ved at opretholde tilslutning af langtrækkende indgange og forbedre visualiseringen af neuroner til en række elektrofysiologi eller billeddannelsesteknikker med en enkelt celleopløsning.

Denne protokol kræver brug af en vibratome fase eller platform, som kan vippes ca 15°. Her bruger vi en kommercielt tilgængelig 2-delt magnetisk fase, hvor "scenen" er en metalskive med en buet bund placeret i en konkav magnetisk "scenebase." Scenen kan derefter flyttes for at justere udsnitsvinklen. Koncentriske cirkler på scenebasen bruges til at estimere vinklen reproducerbart. Scene- og scenebasen er placeret i udskæringskammeret, hvor den magnetiske scenebase også kan drejes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimentelle procedurer blev godkendt af National Institute of Neurological Disorders and Stroke /National Institute on Døvhed og andre kommunikationsforstyrrelser Animal Care and Use Committee.

1. Forsøgspræparater

BEMÆRK: Nærmere oplysninger om skiveforberedelse, herunder udskæringsopløsning, udskæringstemperatur, skiveinkubationstemperatur og apparater (osv.), er specifikke for det præparat for hjernestammer, der udføres i dette eksperiment. Slice inkubation detaljer kan ændres pr laboratorieerfaring.

  1. Forbered interne løsninger til patch-fastspænding.
    1. Der klargør spændingsklemmeropløsning, der indeholder (i mM) 76 Cs-methansulfonat 56 CsCl, 1 MgCl2, 1 CaCl2, 10 HEPES, 10 EGTA, 0,3 Na-GTP, 2 Mg-ATP, 5 Na2-fosforkrekt, 5 QX-314 og 0,01 Alexa Fluor-488 hydrazid. Juster pH-3 til 7,2 med CsOH.
    2. Forbered nuværende klemme opløsning, der indeholder (i mM) 125 K-gluconat, 5 KCl, 1 MgCl2,0.1 CaCl2,10 HEPES, 1 EGTA, 0.3 Na-GTP, 2 Mg-ATP, 1 Na2-fosphocreatine, og 0,01 Alexa Fluor-488 hydrazid. PH til 7,2 med KOH.
  2. Forbered 100 ml 4% agar ved at tilsætte 4 g agar til 100 ml varmt (nær kogende) vand. Placer på opvarmet røre plade for at opretholde temperaturen og rør indtil helt opløst. Hæld i 100 mm plast petriskåle til ca 1 cm dybde og lad afkøle. Opbevares i køleskab, indtil det er nødvendigt.
  3. Der klargøres 1 L kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) indeholdende i mM: 124 NaCl, 1.2 CaCl2, 1.3 MgSO4, 5 KCl, 26 NaHCO3, 1.25 KH2PO4og 10 dextrose. Boble med carbogen (5% CO2 / 95% O2) i mindst 10 min, og juster derefter den endelige pH til 7,4 med 1 M NaOH, hvis det er nødvendigt. Bevar iltning og pH af opløsning ved boblende kontinuerligt med carbogen hele eksperimentet.
  4. Der tilbered 200 ml snitopløsning ved at tilsætte 1 mM kynurensyre til ACSF. Sonikere opløsning i et sonikerende vandbad i 10 min, indtil kynurensyre er opløst. Kontinuerligt boble med carbogen og sted på is.
    FORSIGTIG: Brug passende personlige værnemidler ved håndtering af kynurensyre.
  5. Monter en passende klinge i vibratomen efter producentens anvisninger. Chill vibratome udskæring kammer ved at omgive det med is.

2. Fjernelse af hjernen med intakt auditiv nerverod til stimulering

BEMÆRK: Mus til disse forsøg blev opnået ved at krydse ChAT-IRES-Cre transgene mus på en C57BL/6J baggrund med tdTomato reporter mus (Ai14). Mus, der anvendes til histologi og elektrofysiologi var post-hørelse debut (P14-P23), som er omkring P12 i mus. Neuroner udtrykker tdTomato i ventrale kernen i trapez kroppen (VNTB) har tidligere været karakteriseret som MOC neuroner i denne mus linje57.

  1. Aflive (f.eks. CO2-kvælning) og halshugge dyret ved hjælp af godkendte institutionelle procedurer.
  2. Brug et barberblad, skære huden på midterlinjen af kraniet fra næsen til bagsiden af halsen. Skræl huden tilbage for at afsløre kraniet.
  3. Ved hjælp af små saks, foretage et snit i kraniet gennem midterlinjen starter ved bunden (caudal ende nær rygmarven) af kraniet og fortsætter mod næsen.
  4. På lambda sutur, foretage nedskæringer i kraniet fra midterlinjen, lateral mod øret på begge sider. Skræl kraniet tilbage for at afsløre hjernen.
  5. Start ved rostral ende, forsigtigt løfte hjernen væk fra kraniet med en lille lab spatel eller stumpe stænt. Skær synsnerven og fortsætte med at forsigtigt arbejde hjernen baglæns, udsætter den ventrale overflade.
  6. Skær trigeminusnerver ved at klemme dem med fine scener nær hjernestammens ventrale overflade.
    BEMÆRK: Gør dette omhyggeligt, da vestibulocochlear nerve ligger lige under dette og skal være intakt for eventuel stimulation.
  7. Præparatet er placeret i en petriskål fyldt med kold udskæringsopløsning. Ansink skålen under et dissekerende mikroskop. Forsigtigt boble med carbogen.
  8. Trim ansigtsnerven tæt på hjernestammen og udsætte vestibulocochlear nerve.
  9. Brug fine scefængsel, skubbe tips i foramina, hvor vestibulocochlear nerve udgange kraniet så vidt muligt og knibe nerven til at afskære det, forlader nerveroden knyttet til hjernestammen. Gentag dette på den anden side.
  10. Når begge nerve rødder er frie, fjerne meninges og vaskulatur fra den ventrale overfladen af hjernestammen nær trapez kroppen.
  11. Befri hjernen helt fra kraniet ved at klemme de resterende kranienerver og bindevæv, der tager sig af at bevare den resterende rygmarv, hvis det er muligt.

3. Bloker og monter hjernen på scenen (magnetisk disk)

  1. Forbered overfladen af hjernen til at fastsætte til scenen ved at blokere hjernen på niveau med den optiske chiasm.
    1. Med den ventrale overflade op, stabilisere hjernen ved hjælp af en stump værktøj til forsigtigt at immobilisere rygmarven, så hjernen ikke vippe i løbet af følgende trin.
    2. På niveau med den optiske chiasm, bruge åbne kraftføringer til at skabe flyet for at blokere hjernen ved at indsætte gennem hjernen ned til bunden af skålen. Sæt snøreglasset i en vinkel på ca. 20° fra lodret, så spidserne forlader hjernefladen til den optiske chiasm.
    3. Skær langs snakterne ved hjælp af barberbladet.
  2. Lim hjernen til overfladen af scenen.
    1. Forbered en lille blok (~ 1 cm3) af 4% agar til støtte for hjernen.
    2. Placer en lille dråbe lim på scenen og sprede det ind i et rektangel, så både hjernen og agar blok kan limes ned.
    3. Brug snævle, løft forsigtigt hjernen og forsigtigt dud den overskydende væske ved hjælp af kanten af en køkkenrulle. Placer den blokerede overflade på limen, ventral overflade vil være mod bladet under udskæring.
    4. Skub agarblokken forsigtigt mod hjernens dorsale overflade for at støtte den under udskæringen og for at sikre korrekt hjernepositionering (dvs. vinkel).

4. Skær hjernen til at skabe kile skive

BEMÆRK: Forbered en hjerne skive ved hjælp af vibratome, der har cochlear nerve rod på den tykke side og mediale olivocochlear (MOC) neuroner og den mediale kerne af trapez kroppen (MNTB) på den tynde side.

  1. Placer den magnetiske skive med fastgjort hjerne på scenen base og læg den i udskæring kammer med ventrale overflade af hjernen orienteret mod bladet.
  2. Fyld kammeret med iskold udskæringsopløsning og boble med carbogen.
  3. Sænk klingen ned i opløsningen og skær skiver caudal til regionen af interesse for at sikre skiverne er symmetriske. Hvis skiverne ser asymmetriske ud, skal du vippe scenen en smule for at opnå symmetri.
    BEMÆRK: Klingehastigheder mellem 0,05-0,10 mm/s var effektive til at skære sunde skiver og kan variere afhængigt af dyrenes alder og hjerneregionen.
  4. Når skiverne er symmetriske, skal du skifte scenen ~ 15° (svarende til ca. 3 koncentriske ringe på scenebasen) til den ene side.
    BEMÆRK: Skift scenen væk fra den auditive nerverod, du vil bevare i skiven.
  5. Fortsæt med at skære forsigtigt, indtil den auditive nerverod er tæt på overfladen på den ene side, og ansigtsnerven kan ses på overfladen af den anden side.
  6. Skift scenen 15° tilbage til den oprindelige position.
  7. Flyt klingen væk fra vævet, og drej scenebasen 90°, så den laterale kant af den tynde side vender mod klingen. Sænk klingen flere hundrede mikron og derefter langsomt bringe bladet tæt på kanten af vævet. Gentag dette, indtil klingen rører den laterale kant. Sænk klingen til den ønskede tykkelse af den tynde kant af skiven, her yderligere to hundrede mikron.
    BEMÆRK: Den resulterende skive er ideelt ~ 300 mm tyk på niveau med ventrale kernen i trapezhuset (VNTB) på den side, hvor patch fastspænding vil finde sted.
  8. Flyt klingen væk fra vævet, og drej scenebasen tilbage, så den ventrale overflade vender mod den.
  9. Gør det snit, der betegner rostraloverfladen af kile skiven. Overfør skiven til et stykke interface papir (1 cm2)caudal overflade ned. Skærsen flyttes til inkubationskammeret eller et andet egnet inkubationsapparat til genvinding (30 min. ved 35 °C).
    BEMÆRK: Ansigtsnerven skal være synlig på begge dele af skiven på rostraloverfladen (se figur 1B).

5. Opsætning og optagelse af elektrofysiologi

  1. Anlæg kileskivet i optagekammeret, og fastgør skiven med et harpe- eller stabiliserende system. Kig vævet kontinuerligt med en hastighed på 7-10 ml/min. med varm (35 °C) ACSF boblede med carbogen.
  2. Identificer genetisk mærkede MOC-neuroner i VNTB ved hjælp af epifluorescens med 561 nm emissionsfiltre til patch-clamp-optagelser. Spejlvend udsnit, hvis der ikke er nogen potentielt patchable celler.
  3. Brug DIC optik, fokusere på den auditive nerverod på den tykke side af skiven og bruge en mikromanipulator til at flytte den bipolare wolfram stimulere elektrode ned til den auditive nerverod og forsigtigt ind i overfladen af vævet.
    BEMÆRK: Sugeelektroder er blevet brugt i auditive nervestimulationsforsøg i andre laboratorier. Theta glaselektroder, eller optisk stimulation metoder kan anvendes, hvis det er relevant for andre specifikke præparater.
  4. Flyt synsfeltet tilbage til VNTB for at vælge en MOC neuron til at målrette for patch clamp elektrofysiologi.
  5. Fyld en optagelsespipette med en passende intern løsning til det foreslåede eksperiment.
  6. Patch og optage fra MOC neuron i hele celle konfigurationen. Kompensere membran kapacitans og serie modstand, hvis det kræves.
  7. Juster elektrisk stimulation amplitude af hørenerven for at opnå konsekvente postsynaptiske hændelser i MOC neuron.
    BEMÆRK: Det kan være nødvendigt at flytte stimuleringselektroden.
  8. Kør passende stimuleringsprotokoller for at observere fremkaldte synaptiske strømme i MOC (spændingsklemme) eller handlingspotentialemønstre (aktuel klemme).
    BEMÆRK: Kilen skive forberedelse kan bruges med alle typiske patch-clamp værktøjer såsom løs patch optagelser, farmakologi, optogenetik, calcium billeddannelse, neurotransmitter uncaging, osv.

6. Histologisk bekræftelse af hjernestammekerner

BEMÆRK: Dette gøres med cresyl violet farvning, i faste, re-sektionsopdeler skive. Denne metode giver mulighed for visualisering af kerner, som er indeholdt i skiven.

  1. Efter klargøring af en kile skive, nedsænkes skive i fiksativ (4% PFA i PBS) natten over. Snittet skylles 3x i 10 minutter i PBS (stuetemperatur på en shaker), hvor efter ca. 30 % saccharose i PBS natten over ved 4 °C skal kryobeskyttes.
  2. Skær skiven på en frysende mikrotom (40-70 mm) og opsaml serielle sektioner igen i en 24 brøndplade i PBS.
  3. Monter sektioner på gelatine belagt dias og lad tørre helt. Placer slides i slidevogn.
  4. Forbered cresyl violette opløsninger
    1. Forbered 1% cresyl violet acetat ved at blande 5 g cresyl violet acetat i 500 ml dH2O
    2. Acetatbufferen klargøres ved første fremstilling af 90 ml opløsning A (540 ml isacetat + 89,46 ml dH2O) og 10 ml opløsning B (136 mg natriumacetat i 10 ml dH2O). Kombiner løsning A og løsning B, der giver acetatbufferen.
    3. Kombiner 1% cresyl violet acetat med acetat buffer 1:1 for 0,5% cresyl violet i acetat buffer. Filtrer før brug.
    4. 95 % og 70 % ethanol tilberedes ved at fortynde 100 % ethanol med passende mængder dH2O
  5. Udfør cresyl violet farvning protokol. Flyt slidevognen gennem løsningsbakker, hvor overskydende opløsning er på en køkkenrulle mellem bakkerne: xylen – 5 min; 95% ethanol – 3 min; 70% ethanol – 3 min; dH2O – 3 min; 0,5% cresyl violet opløsning – 8-14 min overvågning ofte, indtil nuklear farvning bliver mørk lilla; dH2O – 3 min; 70% ethanol – 3 min; 95% ethanol – 1-2 min; 100% ethanol – dip dias to gange; xylen – 5 min; xylen: 25 min. indtil monteringen udføres.
    FORSIGTIG: Brug kun xylener under en røghætte.
  6. Fjern slides fra xylen en ad gangen og straks placere dække glider på dias ved hjælp af montering medium. Lad monteringsmediet tørre (natten over).
  7. Billedsektioner.

7. Biocytin-mærkning for anterograde-sporing af axoner i levende, ikke-fastfødt væv

  1. Forbered et kileskudsnit som ovenfor (trin 2-4).
  2. Overfør skiven til interface papir (~ 1 cm2). Under et dissekerende mikroskop skal du finde CN'en på den tykke side af skiven.
  3. Fjern forsigtigt overskydende ACSF fra området omkring skiven ved at dreje et hjørne af et silkepapir op for at trække ACSF væk fra vævet. Dette forhindrer biocytinen i at sprede sig til de omkringliggende områder af skiven, hvilket kan føre til optagelse i celler uden for KN.
  4. Med fine snævninger skal du vælge en lille krystal af biocytin og placere den på overfladen af CN. Tryk forsigtigt krystallen ind i vævet for at fremme kontakt med neuroner og efterfølgende optagelse i somata. Gentag dette trin for at dække den ønskede region af interesse, i dette tilfælde CN-områder, der indeholder T-stellate og GBC neuroner.
  5. Skært i et inkubationskammer. Lad skiven inkubere i 2-4 timer ved 35 °C for at muliggøre optagelse og transport af biocytinen. Efter inkubation skylles skiven i ACSF for at fjerne eventuelle biocytinpartikler.
  6. Placer skive i fiksativ (4% PFA i PBS) natten over. Skyl 3x i 10 min i PBS.
  7. Kryobeskyttelsesskive i 30% saccharose i PBS natten over ved 4 °C, eller indtil skiven synker.
  8. Resect vævet til at producere tværgående sektioner på en frysning mikrotom ved 70-100 mm.
  9. Bearbejde væv ved hjælp af standard immunhisemiske metoder med en fluorescerende konjugeret streptavidin.
    BEMÆRK: Yderligere immunohistochemistry kan udføres på sektionerne, hvis det er nyttigt til mærkning af præsynaptiske cellestoffer, axoner, receptorer eller andre synaptiske molekyler, der er vigtige for kredsløbsvisualisering (dvs. primære antistoftrin bør ikke påvirke biocytin sekundær visualisering negativt).
  10. Billede vævet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Histologisk undersøgelse af kile skive
Til vores undersøgelse af auditive hjernestammen neuron funktion, kilen skive forberedelse var designet til at indeholde auditive nerve rod og CN kontralaterale til MOC neuroner målrettet til optagelser (eksempel skive vist i figur 1B). Indledende histologisk undersøgelse af præparatet er vigtigt for at bekræfte, at skiven indeholder de kerner, der er nødvendige for kredsløbsaktivering, og at axonale projektioner er intakte. To celletyper inden for KN giver lydoplysninger til MOC neuroner. T-stellate celler er en hypotese for at give excitatoriske input til MOC neuroner39,40,41,58. Kugleformede buskede celler (GBC) ophidse MNTB neuroner i den kontralaterale halvkugle (via den specialiserede blomsterbæger af Held synapse)34,36,37,38,59,60, som igen giver hæmmende input til MOC neuroner57 (skematisk figur 1A). For at bekræfte tilstedeværelsen af både T-stellate celler og GBC'er, vi re-opdelt (til 50 μm) en kile skive, der blev fastsat ved nedsænkning i 4% PFA og udført cresyl violet farvning til etiket somata. I den tykke side af kilen skive(Figur 2, venstre halvkugle), CN var til stede i næsten sin fulde rostro-caudal omfang. Desuden var KN's dorsale og ventrale underopdelinger intakte (figur 2; pil og pilespids i S19). T-stellate neuroner og GBC'er klynge i ventrale cochlear kernen i nærheden af, hvor hørenerven (Figur 2; pil i S17) kommer ind i KN61,62,63,64,65. Kilen skive indeholder også neuroner af MNTB ipsilateral til MOC neuroner, hvorfra optagelser udføres (tynd halvkugle af den oprindelige kile skive, højre side i figur 2). Dette bekræfter, at i det mindste en del af den hæmmende input til MOC neuroner er intakt(Figur 2, skiver 1-15, fremhævet af stiplede ovaler i S11).

I separate eksperimenter bekræftede vi, at axoner og præsynaptiske terminaler af CN-neuroner var intakte i kileskiven ved hjælp af anterograde mærkning med biocytin. For det første blev den levende kile skive forberedt og placeret på interface papir. Umiddelbart efter forberedelsen af kileskiven blev biocytinkrystaller anbragt i KN, som tillod optagelse og anterogradetransport langs axoner i en inkubationstid. Derefter blev der foretaget fastgørelse og resektion af vævet (70 mm sektioner). Farvning af sektioner med fluorescerende mærket streptavidin blev udført for at visualisere axoner mærket med biocytin. Konfokale billeder af disse sektioner viser lyse mærkning i CN, hvor krystallerne blev placeret og taget op i celle organer (Figur 3A, venstre halvkugle, stiplede område). Axoner, der forlod CN langs den ventrale akustiske stria (Figur 3A, hvide pilespidser) var tydeligt mærket og kunne følges til deres termineringspunkter. Biocytin-positive punktform og mellem contralaterale MOC-neuroner tyder på, at vores præparat bevarer synaptiske kontakter fra CN (Figur 3B). Ligeledes, mærket calyces af holdt i den kontralaterale MNTB angive axons projicere fra GBCs til MNTB neuroner er bevaret i kile skive (Figur 3C). Disse histologiske undersøgelser bekræfter vores kile skive indeholder både celle organer og axonal fremskrivninger af afferent input kredsløb til MOC neuroner, som derfor giver os mulighed for at måle postsynaptiske reaktioner fremkaldt ved stimulering af hørenerven og efterfølgende udbredelse af aktivitet gennem stigende kredsløb.

Synaptisk fysiologi i kile skive
Integration af excitatoriske og hæmmende synaptiske input kritisk former neuronal aktivitet. Vi har for nylig beskrevet hæmmende input til MOC neuroner fra neuroner af MNTB57, men effekten af integration af disse input med excitatoriske input på MOC neuron aktivitet er ukendt. I en kile skive fra en ChAT-IRES-Cre x tdTomato mus, spænding-klemme optagelser blev udført fra en MOC neuron. Nuværende blev anvendt via en bipolar wolfram stimulere elektrode drevet af en stimulus isolation enhed til at fremkalde neurotransmitter frigivelse fra præsynaptiske axoner. Først blev den ventrale akustiske stria (VAS) ved midterlinjen elektrisk stimuleret til at aktivere T-stellate axoner direkte og MNTB neuroner via GBC axon stimulation (Figur 4A), for at måle ventetiden til post-synaptiske reaktioner i en optagelseskonfiguration, der efterligner typiske tyndskive eksperimenter (Figur 4B), eksempel spor, grå, bedrift potentiale -60 mV). I separate eksperimenter blev den auditive nerverod stimuleret til at aktivere monaural stigende kredsløb og post-synaptiske reaktioner blev målt ved MOC neuroner som beskrevet ovenfor. Elektrisk stimulation på begge steder fremkaldte en hurtig-elektrisk artefakt efterfulgt af flerpekserede aktuelle reaktioner (eksempel svar fra AN stimulation i figur 4C, sorte spor, bedrift potentielle -60 mV). Vi sammenlignede debut latenstid foranstaltninger af den første postsynaptiske strøm (PSC) fremkaldt med direkte stimulering af VAS med dem fremkaldt med auditive nerve stimulation og fundet en betydeligt længere latenstid til AN stimulation begivenheder. Dette blev tilskrevet den synaptiske forsinkelse ved AN/CN synapse (AN stimulation: 5,27 ± 0,43 ms, median ± median absolut afvigelse (MAD), interval 4,26-5,93 ms, n = 8; VAS stimulation: 1,98 ± 0,28 ms, median ± MAD, interval 0,75-3,46 ms, n = 17; Wilcoxon Underskrevet Ranks Test, p = 0,014, Figur 4D). Disse resultater bekræfter, at stimulering af den auditive nerverod resulterer i synaptisk aktivering af CN neuroner og efterfølgende kredsløb aktivitet, tættere repræsenterer in vivo - ligesom timing end direkte stimulation af T-stellate eller GBC / MNTB axoner.

Med vores cæsium baseret, høj [Cl-]intern opløsning, der anvendes i spænding klemme, excitatoriske (glutamatergic) og hæmmende (GABA og glycinergic) KPC'er er begge indad ved hvile membran potentiale (-60 mV) og derfor umulig at skelne. Mens fremmane kredsløb aktivitet i AN-stimulerende konfiguration, vi elektrisk isoleret den formodede hæmmende input ved at flytte bedriften potentiale til 0 mV, den omtrentlige vending potentiale for AMPA medieret glutamatergic strømme. I vores eksempel neuron, passiv nuværende reaktioner blev observeret ved 0 mV (Figur 4Ci, røde spor) vejledende for klorid ledningsans. Disse er sandsynligvis GABA- eller glycinergic synaptiske reaktioner. Disse data viser nytten af kile skiven til at aktivere både excitatoriske og hæmmende input til MOC neuroner ved at stimulere auditive nerverod, med aktivering af efterfølgende afferent kredsløb. Yderligere, forskellige mønstre af post-synaptiske reaktioner blev fremkaldt af AN stimulation, hvilket tyder på, at selv under forhold med identisk stimulation af AN axoner, aktivitet af hele kredsløbet er dynamisk og kompleks. Dette eksperimentelle paradigme giver mulighed for en detaljeret analyse af, hvordan komplekse auditive stimuli formerer sig gennem hjernestammen og integreres på MOC neuroner, bestemme MOC efferent systemets output og eventuel indvirkning på cochlea.

Figure 1
Figur 1: Skematisk skematisk og eksempelbillede for kileskiver. (A) Skematisk af den mediale olivocochlear feedback kredsløb. Blå pile angiver den afferente stigende vej til MOC neuroner og sorte pile angiver den faldende feedback vej fra MOC neuroner til bunden af ydre hårceller (OHC). (B) Brightfield billede af en kile skive med etiketter af hørenerven rod (ANR) og cochlear kerne (stiplede kontur) på den tykke side. Stjerne angiver den omtrentlige placering af den ventrale kerne af trapezkroppen, hvor MOC-neuroner er målrettet til patch-fastspænding på den tynde side af kileskiven. Stiplede sorte linjer angiver ansigtsnervene, som kan ses på begge halvkugler af skiven på rostraloverfladen. IHC - indre hår celle, GBC - kugleformede busket celle, SPN - overlegen paraolivary kerne, MNTB - mediale kernen i trapez kroppen, VNTB - ventral kerne af trapez kroppen, LSO - lateral overlegen oliven. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Cresyl violet farvede sektioner fra en kile skive, der blev re-sectioned på 50 μm. Hver anden sektion blev afbildet. Sektioner er nummererede rostral --> caudal. Kile skiver tendens til at indeholde hele cochlear kernen (CN), herunder både dorsale CN (pil i S19) og ventral CN (pilespids i S19), auditive nerve rod (åben pilespids i S17) og meget af MNTB (mørkt område nær ventraloverflade i S3-S15, fremhævet med stiplede ovaler i S11). D og V på skalaen repræsenterer dorsal og ventral i skive orientering. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Axoner af stigende input til MOC-neuroner fra den kontralaterale cochlearkerne forbliver intakt i kileskiven. a) Den rostral-mest sektion fra en kile skive taget fra en P23 ChAT-IRES-Cre x tdTomato (rød fluorescens) mus, der blev re-sektion (70 μm) og forarbejdet til biocytin visualisering. Konfokale billeder er en flisebelagt, maksimal intensitet projektion z-stack. Axoner i den ventrale akustiske stria er fremhævet af hvide pilespidser. Stiplede kontur angiver den lille del af den cochlear-kerne, der er tilbage i denne rostral-mest skive. Skalabar 500 μm. (B) Konfokalbillede af en ChAT-IRES-Cre x tdTomato positiv neuron i VNTB med biocytinpositiv punktform i den omgivende neuropil. Skalabar 50 μm. (C) Biocytin-aksoner vist krydse midterlinjen og afsluttes i den kontralaterale MNTB som calyces af Held. Lodret stiplet linje repræsenterer midterlinjen af udsnittet. Skala bar 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Elektrisk stimulering af afferente indgange i spændingsklemme giver multipeak postsynaptiske strømme i MOC-neuroner. (A) Skematisk kile skive med optagelse set-up for både ventral akustisk stria (VAS) stimulation (grå stimulerende elektrode) og auditive nerve (AN) stimulation (sort stimulerende elektrode) af affede indgange til MOC. (B)Eksempler på postsynaptiske strømme (KPC'er) fra en individuel P17 neuron fremkaldt med en enkelt elektrisk stimulus nær midterlinjen på -60 mV. (C) KPC'er fremkaldt under AN stimulation på -60 mV i en P15 neuron. -Eksempelpå KPC'er i samme celle som C fremkaldte ved 0 mV-potentiale (det omtrentlige tilbageførselspotentiale for AMPA-medieret strøm i vores optagelsesopsætning, red). d)Befolkningsdata for kvantificering af ventetid til første PSC for VAS- og AN-stimulering. Kasser: kvartiler, linje indsat: median, firkantet indsat: middelværdi, whiskers: median absolut afvigelse. * p < 0,05. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Udskæringsproceduren beskrevet her kaldes en kile skive er kraftfuld til at opretholde intakt præsynaptiske neuronal kredsløb, men med tilgængeligheden af hjernen skive eksperimenter til analyse af neuronal funktion. Der skal være stor omhu i flere indledende skridt for at maksimere nytten af forberedelsen til kredsløbsanalyse. Kilens dimensioner skal bekræftes ved hjælp af histologisk undersøgelse, som er integreret for bekræftelse af, at både præsynaptiske kerner og deres aksonale projektioner er indeholdt i den forberedte kileskive. Skivegeometri kan kræve ændringer, hvis projektionerne afskæres, eller få axoner når målkernerne. Mere generelt er det afsluttende snit på vibratomen til kileskiven af afgørende betydning. Optimal kile skive forberedelse vil kræve en kombination af konsekvent brug af vibratome konfigurationer, herunder brug af koncentriske cirkel markeringer på scenen base, sammen med justering af indstillinger baseret på kendte hjernen vartegn. Efter optimering af skivegeometri registrerede vi ensartede KPC'er i MOC-neuroner fremkaldt af elektrisk stimulering af hørenerven i 8 af 18 kileskiver. I vores tidligere arbejde var vi i stand til at fremkalde hæmmende KPC'er via direkte stimulering af MNTB axoner i ca. 60% af MOC neuroner57,hvilket tyder på, at vores succesrate her er kun en beskeden reduktion i betragtning af den lange række af input og nødvendighed for polysynaptisk kredsløb aktivering. Ved udarbejdelsen af skiven, er det tilrådeligt at fejle på den tykkere side som et fald i synlighed på grund af en tykkere skive er gunstig over en ubrugelig sektion, som er ufuldstændig eller mangler kredsløb tilslutningsmuligheder. Enhver skive konfiguration eller dimensioner kan bruges, så længe skiven passer under optagelsen mikroskop mål, er tilgængelig ved patch og stimulere elektroder (eller andre sonder eller udstyr), og er tynd nok til optisk-baserede patch-fastspænding på postsynaptiske celle af interesse. Hurtig, blid dissektion og korrekt inkubation og nyttiggørelse betingelser er også vigtigt at opretholde levedygtigheden af kredsløbet for patch-clamp eksperimenter. Specifikt for vores auditive hjernestamme forberedelse, hjernen skal fjernes meget omhyggeligt fra kraniet for at bevare intakt og funktionelle auditive nerve rødder. Strækker eller rive nerven vil påvirke evnen til at stimulere fibre og fremkalde aktivitet i auditive neuroner. På grund af den større mængde væv i skiven, ændring af traditionelle udskæringsopløsninger, temperaturer, inkubation detaljer, og perfusion systemer kan forbedre sundheden for skiven. Her anvender vi mindre ændringer til vores normale skive forberedelse. Disse omfatter kortere restitutionsindspuvningstider (30 minutter vs. 60 minutter) og hurtigere strømningshastigheder i skivekammeret perfusionssystem.

Når skivens dimensioner og inkubationsdetaljer er fastlagt, skal funktionen og forbindelsen af forskellige kredsløbskomponenter i skiven påvises. I vores forberedelse, sikrer vi, at både excitatoriske og hæmmende input, hypotese at stamme fra cochlear kernen med T-stellate og GBC (via MNTB), er til stede som forventet. Alternative stimulationsmetoder såsom sugeelektroder til hørenerven eller optiske stimulationsmetoder såsom optogenetik eller fokal neurotransmitterudsugning kan også øge kredsløbsaktiveringen eller muliggøre celletypespecifik aktivering, når de kombineres med genetisk målretning af celleundertyper.

Mens denne udskæring metode vil forhåbentlig være nyttigt for mange systemer og kredsløb, nogle af de begrænsninger af standard tynd-slice sektioner er også relevante for dette præparat. Generelt kan det være vanskeligt at bevare kredsløb med mindre planar projektion mønstre, som axoner sandsynligvis ville blive afskåret. Aktivering af kredsløbet ved kranienerver, som gjort her for at efterligne auditive indgange, kan ikke være muligt i mange kredsløb. Som med andre skivepræparater skal netværksvirkningerne af enhver farmakologi tages i betragtning. For eksempel, bad anvendelse af glutamat receptor blokkere til at isolere hæmmende (GABA- eller glycinergic) eller andre former for transmission kan ikke bruges med polysynaptiske kredsløb aktivering, når glutamat er nødvendig for aktivering af neuroner opstrøms for lappet mål neuron. Dette gælder i vores tilfælde som både AN / CN og GBC / MNTB synapser er glutamatergic, derfor ville al transmission blive elimineret på MOC neuroner med bad anvendelse af glutamamate receptor blokkere. Derudover, anvendelse af GABA eller glycin receptor blokkere til at fjerne MNTB-MOC synaptiske reaktioner ville have den utilsigtede konsekvens af at fjerne iboende hæmmende forbindelse inden for CN, der kan forme mønstre af afferente input til MOC neuroner. Fokal anvendelse af receptorblokkere, med tryk udslyngning eller iontophoresis, kan bruges til at begrænse farmakologisk funktion.

Endelig er den vigtigste begrænsning af dette, og enhver, in vitro teknik er, at selv om dette præparat maksimerer aktivering af monaural stigende auditive kredsløb, resten af nervesystemet, herunder perifere receptorer, der koder stimuli, er fraværende. Dette omfatter cochlea selv, excitatoriske indgange fra detandet øre 66, commissural CN-forbindelser67,68,69,70, og faldende kortikale71,72,73,74 og collicular75,76 fremskrivninger og modulerende input77,78,79,80 kendt for at påvirke aktiviteten af CN og SOC nuklei. Selv om det er muligt, at en del af faldende IC fremskrivninger opretholdes, ville det være umuligt at medtage både kortikale fremskrivninger og commissural CN fremskrivninger på grund af skive geometri. Derfor fokuserer vi på det stigende auditive kredsløb fra cochlea med de aktuelle eksperimenter. Den minimale tykkelse af skiven på den tynde side reducerer også evnen til at udføre binaural polysynaptiske kredsløbsanalyser, hvilket er en fordel ved symmetriske tykke skivepræparater10,11. Derudover er vi ikke i stand til at stimulere hørenerven med lyd for at fremkalde naturlige mønstre af kredsløbsaktivitet. Auditive nervereaktioner er tonotopisk varierede, nervøse og plast81,82,83,84, hvilket gør det vanskeligt at simulere perfekt med vores elektriske stimulationsmetode. Dette er en stor ulempe ved in vitro-eksperimenter i det auditive system. Tonotopic begrænsning af vores stimulation er ikke muligt, da stimulere hele EN rod vil fremkalde spiking i AN fibre på tværs af tonotopic gradient. Præcist efterligne mangfoldigheden af EN fiber svar (dvs. lav vs høj spontan sats fibre) til en elektrisk stimulus mønster er heller ikke muligt. Det er også vanskeligt præcist at matche den dynamiske intensitet kodning af flere AN fibre på CN. Men vi er i stand til at bruge vores elektrofysiologi software til at producere en række stimulation mønstre til formål at efterligne passende auditive nerve output under forskellige akustiske stimuli (f.eks korte, høje lyde, stille, langvarige lyde eller lyde i baggrundsstøj) ved at variere stimulus frekvens både mellem elektriske stimulus protokoller og også inden for en individuel protokol til at tilnærme kombinerede AN indgange (modelleret i ref.85). Overvågning MOC output i løbet af disse eksperimenter vil teste vores hypoteser om, hvad stimulus mønstre kan favorisere hæmning eller excitation på MOC neuroner.

På trods af de begrænsninger, der er beskrevet ovenfor, en kile skive forberedelse metode har fordele i forhold til in vivo og typiske in vitro skive fysiologi metoder og kan bruges til at nærme in vivo kredsløb aktivering så tæt som muligt i skiven for celler, der er vanskelige at få adgang til. In vivo-optagelser af hele cellerne i den auditive hjernestamme har været sjældne på grund af vanskeligheder med at få adgang til dette område kirurgisk86. I stedet skiven var parat til at omfatte stigende indgange til MOC neuroner begynder med hørenerven, som stimuleres direkte til at aktivere hele monaural stigende kredsløb. Vi demonstrerer aktivering af både excitatoriske og hæmmende synaptiske input, og reaktioner på disse input giver værdifulde oplysninger om timingen af synaptiske indgange, når de når MOC-neuronerne. Dette giver en platform for høj gennemløbseksperimenter, hvor vi kan anvende et stort repertoire af in vitro-elektrofysiologiværktøjer som calcium- eller spændingsbilleddannelse, neurotransmitteren, der ikke kan bære, og både intracellulær (via plasterpipetten) og ekstracellulær (via badapplikation eller iontophoresis) farmakologi. Præparatet bør også tilbyde en stigning i gennemløb over tykke skive præparater på grund af bedre synlighed af målet neuroner ved hjælp af DIC optik, som slører med øget vævstykkelse, især i ventral hjernestamme. Samlet set denne teknik giver forbedringer i målretning og gennemløb over in vivo metoder, og bedre muligheder for kredsløb analyse end traditionelle skive fysiologi metoder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Denne forskning blev støttet af Intramural Research Program af NIH, NIDCD, Z01 DC000091 (CJCW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Experimental Preparations
Agar, powder Fisher Scientific BP1423500 4% agar block used to stabilize brain tissue during vibratome sectioning
AlexaFluor Hydrazide 488 Invitrogen A10436 Fluorophore used in internal solution to confirm successful MOC neuron patch
Analytical Balance Geneses Scientific (Intramalls) AV114 Weighing chemicals
Double edged razor blade Ted Pella 121-6 Vibratome cutting blade
Kynurenic acid (5g) Sigma Aldrich K3375-5G Slicing ACSF additive used to reduce neuron activity during dissection and slicing in order to improve tissue health for patch clamping
pH Meter Fisher Scientific (Intramalls) 13-620-451 Solution pH tester
Plastic petri dishes 100mm dia X 20mm Fisher Scientific (Intramalls) 12-556-002 4% Agar Prep
Stirring Hotplate Fisher Scientific (Intramalls) 11-500-150 Heating for 4% Agar preparation
Dissection and Slicing
Biocytin Sigma Aldrich B4261-250MG Chemical used for axonal tracing (conjugated to Streptavidin 488)
Dissecting Microscope Amscope SM-1BN For precision dissection during brain removal
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20 Fine forceps dissection tool
Economy tweezers #3 WPI 501976 Forceps dissection tool
Glass Petri Dish 150mm dia x 15mm H Fisher Scientific (Intramalls) 08-747E Dissection dish
Interface paper (203 X 254mm PCTE Membrane 10um) Thomas Scientific 1220823 Slice incubation/biocytin application
Leica VT1200S Vibratome Leica 1491200S001 Vibratome for wedge slice sectioning
Mayo scissors Roboz RS-6872 Dissection tool
Single-edged carbon steel blades Fisher Scientific (Intramalls) 12-640 Razor blade for dissection
Specimen disc, orienting Leica 14048142068 Specialized vibratome stage for reproducible tilting
Spoonula FisherSci 14-375-10 Dissection tool
Super Glue Newegg 15187 Used for glueing tissue to vibratome stage
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 91500-09 Dissection tool
Electrophysiology
A1R Upright Confocal Microscope Nikon Instruments Electrophysiology and imaging microscope, can be any microscope compatible with electrophysiology
Electrode Borosilicate glass w/ Filament OD 1.5mm, ID 1.1mm, 10 cm long Sutter Instrument BF150-110-10 Patch clamping pipette glass
Electrode Filler MicroFil WPI CMF20G Patch electrode pipette filler
In-line solution heater Warner Instruments (GSAdvantage) SH-27B Slice perfusion system heater
Multi-Micromanipulator Systems Sutter Intruments MPC-200 with MP285 Micromanipulators for patch clamp and stimulation electrode placement
P-1000 horizontal pipette puller for glass micropipettes Sutter instruments FG-P1000 Patch clamp pipetter puller
Patch-clamp amplifier and Software HEKA EPC-10 / Patchmaster Next Can be any amplifier/software
Recording Chamber Warner Instruments RC26G Slice "bath" during recording
Recording Chamber Harp Warner Instruments 640253 Stablizes slice during electrophysiology recording
Slice Incubation Chamber Custom Build Heated, oxygenated holding chamber for slices during recovery after slicing
Stimulus isolation unit A.M.P.I. Iso-Flex Stimulus isolation unit for electrophysiology
Syringe 60CC Fischer Scientific (Intramalls) 14-820-11 Electrophysiology perfusion fluid handling
Temperature controller Warner Instruments (GSAdvantage) TC-324C Slice perfusion system temperature controller
Tubing 1/8 OD 1/16 ID Fischer Scientific (Intramalls) 14-171-129 Electrophysiology perfusion fluid handling
Tugsten concentric bipolar microelectrode WPI TM33CCINS Stimulating electrode for electrophysiology
Histology
24 well Plate Fisher Scientific (Intramalls) 12-556006 Histology slice collection and immunostaining
Alexa Fluor 488 Streptavidin Jackson Immuno labs 016-540-084 Secondary antibody for biocytin visualization
Corning Orbital Shaker Sigma CLS6780FP Shaker for immunohistochemistry agitation
Cresyl Violet Acetate Sigma Aldrich (Intramalls) C5042-10G Cellular stain for histology
Disposable Microtome Blades Fisher Scientific 22-210-052 Sliding microtome blade
Filter-syringe Nalgene 4mm Cellulose Acetate 0.2um Fisher Scientific (Intramalls) 09-740-34A Syringe filter for filling recording pipettes with internal solution
Fluoromount-G Slide Mounting Medium Fisher Scientific OB100-01 Immunohistochemistry fluorescence mounting medium
glass slide staining dish with rack Fisher Scientific (Intramalls) 08-812 Cresyl Violet staining chamber
Microm HM450 Sliding Microtome ThermoFisher 910020 Freezing microtome for histology
Microscope Cover Glasses: Rectangles 50mm X 24mm Fisher Scientific (Intramalls) 12-543D Histochemistry slide cover glass
Permount mounting medium Fisher Scientific SP15-100 Cresyl violet section mounting medium
Superfrost Slides Fisher Scientific 22-034980 Histology slides

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Campbell, J. P., Henson, M. M. Olivocochlear neurons in the brainstem of the mouse. Hearing Research. 35 (2-3), 271-274 (1988).
  2. Grothe, B., Sanes, D. H. Synaptic inhibition influences the temporal coding properties of medial superior olivary neurons: An in vitro study. Journal of Neuroscience. 14, 1701-1709 (1994).
  3. Kotak, V. C., Sanes, D. H. Long-lasting inhibitory synaptic depression is age- and calcium-dependent. Journal of Neuroscience. 20 (15), 5820-5826 (2000).
  4. Smith, A. J., Owens, S., Forsythe, I. D. Characterisation of inhibitory and excitatory postsynaptic currents of the rat medial superior olive. The Journal of Physiology. 529 (3), 681-698 (2000).
  5. Scott, L. L., Mathews, P. J., Golding, N. L. Posthearing developmental refinement of temporal processing in principal neurons of the medial superior olive. Journal of Neuroscience. 25 (35), 7887-7895 (2005).
  6. Fischl, M. J., Combs, T. D., Klug, A., Grothe, B., Burger, R. M. Modulation of synaptic input by GABAB receptors improves coincidence detection for computation of sound location. Journal of Physiology. 590 (13), 3047-3066 (2012).
  7. Clause, A., et al. The Precise Temporal Pattern of Prehearing Spontaneous Activity Is Necessary for Tonotopic Map Refinement. Neuron. 82 (4), 822-835 (2014).
  8. Oertel, D. Use of brain slices in the study of the auditory system: Spatial and temporal summation of synaptic inputs in cells in the anteroventral cochlear nucleus of the mouse. Journal of the Acoustical Society of America. 78 (1), 328-333 (1985).
  9. Hermann, J., Pecka, M., Von Gersdorff, H., Grothe, B., Klug, A. Synaptic transmission at the calyx of held under in vivo-like activity levels. Journal of Neurophysiology. 98 (2), 807-820 (2007).
  10. Jercog, P. E., Svirskis, G., Kotak, V. C., Sanes, D. H., Rinzel, J. Asymmetric excitatory synaptic dynamics underlie interaural time difference processing in the auditory system. PLoS Biology. 8 (6), 1000406 (2010).
  11. Roberts, M. T., Seeman, S. C., Golding, N. L. A mechanistic understanding of the role of feedforward inhibition in the mammalian sound localization circuitry. Neuron. 78 (5), 923-935 (2013).
  12. Sinclair, J. L., et al. Sound-evoked activity influences myelination of brainstem axons in the trapezoid body. Journal of Neuroscience. 37 (34), 8239-8255 (2017).
  13. Wang, J., et al. Myelination of the postnatal mouse cochlear nerve at the peripheral-central nervous system transitional zone. Frontiers in Pediatrics. 1, 5-8 (2013).
  14. Long, P., Wan, G., Roberts, M. T., Corfas, G. Myelin development, plasticity, and pathology in the auditory system. Developmental Neurobiology. 78 (2), 80-92 (2018).
  15. Leão, R. M., et al. Presynaptic Na+ channels: Locus, development, and recovery from inactivation at a high-fidelity synapse. Journal of Neuroscience. 25 (14), 3724-3738 (2005).
  16. Fex, J. Efferent Inhibition in the Cochlea Related to Hair-Cell dc Activity: Study of Postsynaptic Activity of the Crossed Olivocochlear Fibres in the Cat. The Journal of the Acoustical Society of America. 41 (3), 666-675 (1967).
  17. Mountain, D. C. Changes in endolymphatic potential and crossed olivocochlear bundle stimulation alter cochlear mechanics. Science. 210 (4465), 71-72 (1980).
  18. Siegel, J. H., Kim, D. O. Efferent neural control of cochlear mechanics? Olivocochlear bundle stimulation affects cochlear biomechanical nonlinearity. Hearing Research. 6 (2), 171-182 (1982).
  19. Guinan, J. J. Cochlear efferent innervation and function. Current Opinion in Otolaryngology & Head and Neck Surgery. 18 (5), 447-453 (2010).
  20. Elgoyhen, A. B., Katz, E. The efferent medial olivocochlear-hair cell synapse. Journal of Physiology-Paris. 106 (1-2), 47-56 (2012).
  21. Galambos, R. Suppression of auditory nerve activity by stimulation of efferent fibers to cochlea. Journal of Neurophysiology. 19 (5), 424-437 (1956).
  22. Desmedt, J. E. Auditory-Evoked Potentials from Cochlea to Cortex as Influenced by Activation of the Efferent OlivoCochlear Bundle. Journal of the Acoustical Society of America. 34 (9), 1478-1496 (1962).
  23. Wiederhold, M. L., Kiang, N. Y. S. Effects of Electric Stimulation of the Crossed Olivocochlear Bundle on Single Auditory-Nerve Fibers in the Cat. The Journal of the Acoustical Society of America. 48 (4), 950-965 (1970).
  24. Wiederhold, M. L., Peake, W. T. Efferent Inhibition of Auditory-Nerve Responses: Dependence on Acoustic-Stimulus Parameters. Journal of the Acoustical Society of America. 40 (6), 1427-1430 (1966).
  25. Geisler, D. C. Hypothesis on the function of the crossed olivocochlear bundle. Journal of the Acoustical Society of America. 56 (6), 1908-1909 (1974).
  26. Guinan, J. J., Gifford, M. L. Effects of electrical stimulation of efferent olivocochlear neurons on cat auditory-nerve fibers. III. Tuning curves and thresholds at CF. Hearing Research. 37 (1), 29-45 (1988).
  27. Rajan, R. Involvement of cochlear efferent pathways in protective effects elicited with binaural loud sound exposure in cats. Journal of Neurophysiology. 74 (2), 582-597 (1995).
  28. Rajan, R. Effect of electrical stimulation of the crossed olivocochlear bundle on temporary threshold shifts in auditory sensitivity. II. Dependence on the level of temporary threshold shifts. Journal of Neurophysiology. 60 (2), 569-579 (1988).
  29. Reiter, E. R., Liberman, M. C. Efferent-mediated protection from acoustic overexposure: Relation to slow effects of olivocochlear stimulation. Journal of Neurophysiology. 73 (2), 506-514 (1995).
  30. Taranda, J., et al. A point mutation in the hair cell nicotinic cholinergic receptor prolongs cochlear inhibition and enhances noise protection. PLoS Biology. 7 (1), 1000018 (2009).
  31. Maison, S. F., Usubuchi, H., Liberman, C. M. Efferent feedback minimizes cochlear neuropathy from moderate noise exposure. Journal of Neuroscience. 33 (13), 5542-5552 (2013).
  32. Tong, H., et al. Protection from noise-induced hearing loss by Kv2. 2 potassium currents in the central medial olivocochlear system. Journal of Neuroscience. 33 (21), 9113-9121 (2013).
  33. Boero, L. E., et al. Enhancement of the medial olivocochlear system prevents hidden hearing loss. Journal of Neuroscience. 38 (34), 7440-7451 (2018).
  34. Spirou, G. A., Brownell, W. E., Zidanic, M. Recordings from cat trapezoid body and HRP labeling of globular bushy cell axons. Journal of Neurophysiology. 63 (5), 1169-1190 (1990).
  35. von Gersdorff, H., Borst, J. G. G. Short-term plasticity at the calyx of held. Nature Reviews Neuroscience. 3 (1), 53-64 (2002).
  36. Smith, P. H., Joris, P. X., Carney, L. H., Yin, T. C. T. Projections of physiologically characterized globular bushy cell axons from the cochlear nucleus of the cat. Journal of Comparative Neurology. 304 (3), 387-407 (1991).
  37. Kuwabara, N., DiCaprio, R. A., Zook, J. M. Afferents to the medial nucleus of the trapezoid body and their collateral projections. Journal of Comparative Neurology. 314 (4), 684-706 (1991).
  38. Friauf, E., Ostwald, J. Divergent projections of physiologically characterized rat ventral cochlear nucleus neurons as shown by intra-axonal injection of horseradish peroxidase. Experimental Brain Research. 73 (2), 263-284 (1988).
  39. De Venecia, R. K., Liberman, M. C., Guinan, J. J., Brown, M. C. Medial olivocochlear reflex interneurons are located in the posteroventral cochlear nucleus: A kainic acid lesion study in guinea pigs. Journal of Comparative Neurology. 487 (4), 345-360 (2005).
  40. Darrow, K. N., Benson, T. E., Brown, M. C. Planar multipolar cells in the cochlear nucleus project to medial olivocochlear neurons in mouse. Journal of Comparative Neurology. 520 (7), 1365-1375 (2012).
  41. Brown, M. C., De Venecia, R. K., Guinan, J. J. Responses of medial olivocochlear neurons: Specifying the central pathways of the medial olivocochlear reflex. Experimental Brain Research. 153 (4), 491-498 (2003).
  42. Wang, Y., Manis, P. B. Synaptic transmission at the cochlear nucleus endbulb synapse during age-related hearing loss in mice. Journal of Neurophysiology. 94 (3), 1814-1824 (2005).
  43. Golding, N. L., Robertson, D., Oertel, D. Recordings from slices indicate that octopus cells of the cochlear nucleus detect coincident firing of auditory nerve fibers with temporal precision. Journal of Neuroscience. 15 (4), 3138-3153 (1995).
  44. Ferragamo, M. J., Golding, N. L., Oertel, D. Synaptic inputs to stellate cells in the ventral cochlear nucleus. Journal of Neurophysiology. 79 (1), 51-63 (1998).
  45. Oertel, D. Synaptic responses and electrical properties of cells in brain slices of the mouse anteroventral cochlear nucleus. Journal of Neuroscience. 3 (10), 2043-2053 (1983).
  46. Xie, R., Manis, P. B. Radiate and planar multipolar neurons of the mouse anteroventral cochlear nucleus: Intrinsic excitability and characterization of their auditory nerve input. Frontiers in Neural Circuits. 11, 1-17 (2017).
  47. Wu, S., Oertel, D. Inhibitory circuitry in the ventral cochlear nucleus is probably mediated by glycine. The Journal of Neuroscience. 6 (9), 2691-2706 (1986).
  48. Xie, R., Manis, P. B. Target-specific IPSC kinetics promote temporal processing in auditory parallel pathways. Journal of Neuroscience. 33 (4), 1598-1614 (2013).
  49. Wickesberg, R. E., Oertel, D. Delayed, frequency-specific inhibition in the cochlear nuclei of mice: A mechanism for monaural echo suppression. Journal of Neuroscience. 10 (6), 1762-1768 (1990).
  50. Campagnola, L., Manis, P. B. A map of functional synaptic connectivity in the mouse anteroventral cochlear nucleus. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2214-2230 (2014).
  51. Doucet, J. R., Ryugo, D. K. Projections from the ventral cochlear nucleus to the dorsal cochlear nucleus in rats. Journal of Comparative Neurology. 385 (2), 245-264 (1997).
  52. Kopp-Scheinpflug, C., et al. The sound of silence: Ionic mechanisms encoding sound termination. Neuron. 71 (5), 911-925 (2011).
  53. Alamilla, J., Gillespie, D. C. Maturation of Calcium-Dependent GABA, Glycine, and Glutamate Release in the Glycinergic MNTB-LSO Pathway. PLoS One. 8 (9), 0075688 (2013).
  54. Spangler, K. M., Warr, W. B., Henkel, C. K. The projections of principal cells of the medial nucleus of the trapezoid body in the cat. Journal of Comparative Neurology. 238 (3), 249-262 (1985).
  55. Kramer, F., et al. Inhibitory glycinergic neurotransmission in the mammalian auditory brainstem upon prolonged stimulation: Short-term plasticity and synaptic reliability. Frontiers in Neural Circuits. 8, 1-22 (2014).
  56. Roberts, M. T., Seeman, S. C., Golding, N. L. The relative contributions of MNTB and LNTB neurons to inhibition in the medial superior olive assessed through single and paired recordings. Frontiers in Neural Circuits. 8, 1-14 (2014).
  57. Torres Cadenas, L., Fischl, M. J., Weisz, C. J. C. Synaptic Inhibition of Medial Olivocochlear Efferent Neurons by Neurons of the Medial Nucleus of the Trapezoid Body. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 40 (3), 509-525 (2020).
  58. Brown, M. C., Mukerji, S., Drottar, M., Windsor, A. M., Lee, D. J. Identification of inputs to olivocochlear neurons using transneuronal labeling with pseudorabies virus (PRV). JARO - Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 14 (5), 703-717 (2013).
  59. Morest, D. K. The collateral system of the medial nucleus of the trapezoid body of the cat, its neuronal architecture and relation to the olivo-cochlear bundle. Brain Research. 9 (2), 288-311 (1968).
  60. Warr, B. W. Fiber degeneration following lesions in the multipolar and globular cell areas in the ventral cochlear nucleus of the cat. Brain Research. 40 (2), 247-270 (1972).
  61. Osen, K. K. Cytoarchitecture of the cochlear nuclei in the cat. Journal of Comparative Neurology. 136 (4), 453-483 (1969).
  62. Cant, N. B., Morest, D. K. The bushy cells in the anteroventral cochlear nucleus of the cat. A study with the electron microscope. Neuroscience. 4 (12), 1925-1945 (1979).
  63. Cant, N. B., Morest, D. K. Organization of the neurons in the anterior division of the anteroventral cochlear nucleus of the cat. Light-microscopic observations. Neuroscience. 4 (12), 1909-1923 (1979).
  64. Lauer, A. M., Connelly, C. J., Graham, H., Ryugo, D. K. Morphological Characterization of Bushy Cells and Their Inputs in the Laboratory Mouse (Mus musculus) Anteroventral Cochlear Nucleus. PLoS One. 8 (8), 1-16 (2013).
  65. Harrison, J. M., Warr, W. B. A study of the cochlear nuclei and ascending auditory pathways of the medulla. Journal of Comparative Neurology. 119 (3), 341-379 (1962).
  66. Robertson, D., Gummer, M. Physiological and morphological characterization of efferent neurones in the guinea pig cochlea. Hearing Research. 20 (1), 63-77 (1985).
  67. Bledsoe, S. C., et al. Ventral cochlear nucleus responses to contralateral sound are mediated by commissural and olivocochlear pathways. Journal of Neurophysiology. 102 (2), 886-900 (2009).
  68. Zhou, J., Zeng, C., Cui, Y., Shore, S. Vesicular glutamate transporter 2 is associated with the cochlear nucleus commissural pathway. JARO - Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 11 (4), 675-687 (2010).
  69. Kuenzel, T. Modulatory influences on time-coding neurons in the ventral cochlear nucleus. Hearing Research. 384, 107824 (2019).
  70. Cant, N. B., Gaston, K. C. Pathways connecting the right and left cochlear nuclei. Journal of Comparative Neurology. 212 (3), 313-326 (1982).
  71. Feliciano, M., Saldana, E., Mugnaini, E. Direct projections from the rat primary auditory neocortex to nucleus sagulum, paralemniscal regions, superior olivary complex and cochlear nuclei. Auditory Neuroscience. 1 (3), 287-308 (1995).
  72. Mulders, W. H. A. M., Robertson, D. Evidence for direct cortical innervation of medial olivocochlear neurones in rats. Hearing Research. 144 (1-2), 65-72 (2000).
  73. Schofield, B. R., Coomes, D. L. Pathways from auditory cortex to the cochlear nucleus in guinea pigs. Hearing Research. 216-217 (1-2), 81-89 (2006).
  74. Meltzer, N. E., Ryugo, D. K. Projections from auditory cortex to cochlear nucleus: A comparative analysis of rat and mouse. Anatomical Record - Part A Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 288 (4), 397-408 (2006).
  75. Schofield, B. R., Cant, N. B. Descending auditory pathways: Projections from the inferior colliculus contact superior olivary cells that project bilaterally to the cochlear nuclei. Journal of Comparative Neurology. 409 (2), 210-223 (1999).
  76. Thompson, A. M., Schofield, B. R. Afferent projections of the superior olivary complex. Microscopy Research and Technique. 51 (4), 330-354 (2000).
  77. Woods, C. I., Azeredo, W. J. Noradrenergic and serotonergic projections to the superior olive: Potential for modulation of olivocochlear neurons. Brain Research. 836 (1-2), 9-18 (1999).
  78. Mulders, W. H. A. M., Robertson, D. Morphological relationships of peptidergic and noradrenergic nerve terminals to olivocochlear neurones in the rat. Hearing Research. 144 (1-2), 53-64 (2000).
  79. Thompson, A. M., Thompson, G. C. Light microscopic evidence of serotoninergic projections to olivocochlear neurons in the bush baby (Otolemur garnettii). Brain Research. 695 (2), 263-266 (1995).
  80. Wang, X., Robertson, D. Substance P-induced inward current in identified auditory efferent neurons in rat brain stem slices. Journal of Neurophysiology. 80 (1), 218-229 (1998).
  81. Taberner, A. M., Liberman, M. C. Response properties of single auditory nerve fibers in the mouse. Journal of Neurophysiology. 93 (1), 557-569 (2005).
  82. Galambos, R., Davis, H. The response of single auditory-nerve stimulation. Journal of Neurophysiology. 6 (1), 39-57 (1943).
  83. Sachs, M. B., Abbas, P. J. Rate versus level functions for auditory-nerve fibers in cats: Tone-burst stimuli. Journal of the Acoustical Society of America. 56 (6), 1835-1847 (1974).
  84. Zhang, X., Heinz, M. G., Bruce, I. C., Carney, L. H. A phenomenological model for the responses of auditory-nerve fibers: I. Nonlinear tuning with compression and suppression. The Journal of the Acoustical Society of America. 109 (2), 648-670 (2001).
  85. Zilany, M. S. A., Bruce, I. C., Carney, L. H. Updated parameters and expanded simulation options for a model of the auditory periphery. The Journal of the Acoustical Society of America. 135 (1), 283-286 (2014).
  86. Franken, T. P., Smith, P. H., Joris, P. X. In vivo whole-cell recordings combined with electron microscopy reveal unexpected morphological and physiological properties in the lateral nucleus of the trapezoid body in the auditory brainstem. Frontiers in Neural Circuits. 10, 1-20 (2016).

Tags

Neurovidenskab mediale olivocochlear neuroner in vitro skive elektrofysiologi synaptisk integration auditive nerve auditive hjernestamme cochlear kerne hæmmende neurotransmission
In Vitro Wedge Slice Forberedelse til efterligne In Vivo Neuronal Circuit Connectivity
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fischl, M. J., Weisz, C. J. C. In… More

Fischl, M. J., Weisz, C. J. C. In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity. J. Vis. Exp. (162), e61664, doi:10.3791/61664 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter