Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

In Vitro Клин Фрагмент Подготовка для имитации In Vivo Нейрональной цепи подключения

Published: August 18, 2020 doi: 10.3791/61664
Automatic Translation
1, 1
1Section on Neuronal Circuitry, National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, NIH

Summary

Интеграция различных синаптических входов в нейроны лучше всего измеряется в препарате, который сохраняет все до синаптические ядра для естественного времени и пластичности цепи, но ломтики мозга обычно разрывают многие соединения. Мы разработали модифицированный срез мозга, чтобы имитировать активность цепи in vivo, сохраняя при этом возможности экспериментов в пробирке.

Abstract

Электрофизиологические методы in vitro измеряют одноклеточную активность с точным электрическим и временным разрешением. Мозг ломтики должны быть относительно тонкими, чтобы правильно визуализировать и доступ к нейронам для патч-зажима или изображения, и в пробирке изучение схемы мозга ограничивается только то, что физически присутствует в острой ломтик. Чтобы сохранить преимущества экспериментов в пробирке, сохраняя при этом большую часть пресинаптических ядер, мы разработали новую подготовку ломтика. Этот "клин ломтик" был разработан для патч-зажим электрофизиологии записей для характеристики различных монауральных, звуковых входов в медиальной olivocochlear (MOC) нейронов в стволе мозга. Эти нейроны получают свои первичные возбудительные и ингибирующие входы от нейронов, активированных стимулами в контралатеральной уха и соответствующего кохлеарного ядра (CN). Был разработан асимметричный кусочек мозга, который является самым толстым в ростро-каудальном домене на боковом краю одного полушария, а затем истончается к боковому краю противоположного полушария. Этот ломтик содержит, на толстой стороне, корень слухового нерва, передающий информацию о слуховых стимулах к мозгу, внутренней схеме CN, и как дисинаптическом возбуждающих и трисинаптических ингибирующие афферентные пути, которые сходятся на контралатеральных нейронов MOC. Запись выполняется из нейронов MOC на тонкой стороне ломтика, где они визуализированы с помощью оптики DIC для типичных экспериментов патч-зажим. Прямая стимуляция слухового нерва осуществляется при входе в слуховой ствол мозга, что позволяет внутренней активности цепи CN и синаптической пластичности происходит в синапсах вверх по течению нейронов MOC. С помощью этого метода можно имитировать активацию цепи in vivo как можно ближе в пределах среза. Этот клин срез подготовки применима к другим схемам мозга, где схема анализы выиграют от сохранения подключения вверх по течению и дальнего ввода, в сочетании с техническими преимуществами физиологии в пробирке ломтик.

Introduction

Наблюдение за активностью нейронных цепей идеально выполняется с помощью местных сенсорных входов и обратной связи, а также нетронутой связи между областями мозга, in vivo. Тем не менее, выполнение экспериментов, которые дают одноклеточное разрешение функции нейронной цепи по-прежнему ограничивается техническими проблемами в нетронутом мозге. В то время как экстрацеллюлярная электрофизиология in vivo или многофотонные методы визуализации могут быть использованы для исследования активности в нетронутой нервной системе, интерпретация того, как различные входные данные интегрируются или измеряют синаптические входы подразводки, остается трудной. In vivo цельноклеточные записи преодолевают эти ограничения, но являются сложными для выполнения, даже в областях мозга, которые легко доступны. Технические проблемы одноклеточного разрешения экспериментов еще более усиливаются в определенных популяциях нейронов, которые расположены глубоко в головном мозге, или в пространственно диффузных популяциях, которые требуют либо генетических инструментов для обнаружения клеток in vivo (например, генетическое выражение channelrhodopsin в паре с optrode записи) или пост-специальной гистохимической идентификации после записи сайта маркировки (например, с нейротрансмиссии конкретных маркеров). Находясь диффузно вблизи брюшной поверхности ствола мозга, медиальные оливокохлеарные (MOC) нейроны страдают отвышеуказанных ограничений 1, что делает их чрезвычайно трудно получить доступ для in vivo экспериментов.

Мозг ломтики (толщиной 100-500 мкм) уже давно используются для изучения схем мозга, в том числе слуховой ствол мозга схемы, из-за физической сегрегации подключенных нейронов, которые содержатсяв том же ломтик 2,3,4,5,6,7,8,9. Эксперименты с использованием гораздо толще ломтиками (Nogt;1 мм) были использованы в других лабораториях, чтобыпонять,как двусторонние входы интегрировать в областях высшего оливариального комплекса (SOC), включая медиальный превосходныйоливковый 10,11. Эти ломтики были подготовлены таким образом, что аксоны слухового нерва (АН) остались нетронутыми в ломтик и были электрически стимулировали инициировать синаптический нейромедиатор релиз в CN, имитируя активность первого порядка слуховых нейронов, как они будут реагировать на звук. Одним из основных недостатков этих толстых ломтиков является видимость нейронов для патч-зажим электрофизиологических записей ("патч"). Патчирование становится все болеетрудным,как многочисленные аксоны в этой области становятся myelinatedс возрастом 12,13,14,15, что делает ткань оптически плотной и заслоняющих нейронов даже в типичный, тонкий срез мозга. Наша цель состоит в том, чтобы создать в пробирке препараты, которые больше напоминают цепи подключения in vivo записей, но с высокой пропускной способностью и высоким разрешением записи способности визуально управляемых патч-зажим электрофизиологии в мозге ломтиками.

Наша лаборатория исследует физиологию нейронов слуховой эфферентной системы, включая нейроны MOC. Эти холинергические нейроны обеспечивают эфферентную обратную связь с улиткой, модулируя активность наружных волосковых клеток (OHCs)16,17,18,19,20. Предыдущие исследования показали, что эта модуляция играет определенную роль вусилении контроля в улитке 21,22,23,24,25,26 изащитеот акустической травмы 27,28,29,30,31,32,33. У мышей, MOC нейроны диффузно расположены в брюшном ядре трапециевидного тела (VNTB) в слуховой стволмозга 1. Наша группа использовала chAT-IRES-Cre мыши линии пересекли с tdTomato репортер мыши линии для целевой MOC нейронов в ствол мозга ломтиками под эпифлуоресцентным освещением. Мы показали, что нейроны MOC получают афферентный ингибильный вход от ипсилатерального медиального ядра трапециевидного тела (MNTB), который возбуждается, в свою очередь, аксонами из шаровых густых клеток (GBC) в контралатерального кохлеарного ядра (CN)34,35,36,37,38. Кроме того, нейроны MOC, вероятно, получают их возбудительный вход от Т-стеллат клеток в контралатеральной CN39,40,41. Взятые вместе, эти исследования показывают, MOC нейроны получают как возбуждательные и ингибирующие входы, полученные из того же (контралатерального) уха. Тем не менее, пресинаптические нейроны, и их аксоны сходятся на нейронах MOC, не совсем достаточно близко друг к другу, чтобы быть полностью нетронутыми в типичной подготовки корональной ломтик. Чтобы исследовать, как интеграция синаптических входов в нейроны MOC влияет на их действия потенциальных моделей стрельбы, с акцентом на недавно описанные ингибирования, мы разработали препарат, в котором мы могли бы стимулировать различные афференты MOC нейронов из одного уха в наиболее физиологически реалистичным способом возможно, но с техническими преимуществами in vitro мозга ломтик экспериментов.

Срез клина является модифицированным толстым ломтиком подготовки, предназначенной для исследования цепи интеграции в нейронах MOC (схематизирована на рисунке 1A). На толстой стороне ломтика, клин содержит отрубленные аксоны слухового нерва (так называют "корень слухового нерва" в дальнейшем), как они входят в ствол мозга с периферии и синапса в CN. Корень слухового нерва можно электрически стимулировать, чтобы вызвать высвобождение нейромедиатора и синаптической активации клеток полностью нетронутыми CN42,43,44,45,46. Этот формат стимуляции имеет ряд преимуществ для анализа схемы. Во-первых, вместо того, чтобы непосредственно стимулировать T-stellate и GBC аксоны, которые обеспечивают афферентный вход в нейроны MOC, мы стимулируем AN, чтобы позволить активацию внутренних цепей, обильных в CN. Эти схемы модулировать выход нейронов CN к своим целям по всему мозгу, в том числе MOCнейронов 46,47,48,49,50,51. Во-вторых, полисинаптическая активация афферентных цепей от AN через CN вверх по течению нейронов MOC позволяет более естественное время активации и для пластичности происходить на этих синапсах по мере того как они in vivo во время слуховой стимуляции. В-третьих, мы можем изменять наши модели стимуляции, чтобы имитировать активность АН. Наконец, как возбуждательные, так и ингибирующие монауральные проекции на нейроны MOC не повреждены в срезе клина, и их интеграция может быть измерена в нейроне MOC с точностью электрофизиологии патч-зажима. В целом, эта схема активации обеспечивает более нетронутой цепи нейронов MOC по сравнению с типичной подготовки ломтик мозга. Этот срез клина ствола мозга также может быть использован для исследования других слуховыхобластей,которые получают ингибирующие входы от ипсилатерального MNTB, включая боковое превосходное оливковое, превосходное оливариальное ядро и медиальное превосходноеоливковое 10,11,52,53,54,55,56. Помимо нашей конкретной подготовки, этот метод нарезки может быть использован или изменен для оценки других систем с преимуществами поддержания подключения дальнего ввода и улучшения визуализации нейронов для различных одноклеточного разрешения электрофизиологии или методов визуализации.

Этот протокол требует использования вибромной сцены или платформы, которые могут быть наклонены примерно на 15 градусов. Здесь мы используем коммерчески доступные 2-кусок магнитной стадии, где "этап" является металлический диск с изогнутым дном помещены в вогнутой магнитной "стадии базы". Этап может быть сдвинут для регулировки угла разреза. Концентрические круги на сценической базе используются для оценки угла воспроизведения. Этапная и сценическая основа помещаются в камеру нарезки, где также может вращаться основание магнитной сцены.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все экспериментальные процедуры были одобрены Национальным институтом неврологических расстройств и инсульта / Национальный институт по глухоте и другим коммуникационным расстройствам ухода за животными и использования комитета.

1. Экспериментальные препараты

ПРИМЕЧАНИЕ: Подробная информация о подготовке ломтика, включая нарезку раствора, температуру нарезки, температуру инкубации ломтика и аппарат (и т.д.), специфичны для подготовки ствола мозга, выполненной в этом эксперименте. Детали инкубации ломтиков могут быть изменены в ходе лабораторных исследований.

  1. Подготовь внутренние решения для зажима патчей.
    1. Подготовка раствора зажима напряжения, содержащего (в mM) 76 Cs-метансульфонат, 56 CsCl, 1 MgCl2, 1 CaCl2, 10 HEPES, 10 EGTA, 0.3 Na-GTP, 2 Mg-ATP, 5 Na2-фосфокреатин, 5 х-314, и 0,01 Alexa Fluor-488 гидразида. Отрегулируйте pH до 7.2 с CsOH.
    2. Подготовка текущего раствора зажима, содержащего (в mM) 125 K-глюконат, 5 KCl, 1 MgCl2, 0.1 CaCl2, 10 HEPES, 1 EGTA, 0.3 Na-GTP, 2 Mg-ATP, 1 Na2-phosphocreatine, и 0.01 Alexa Fluor-488 гидразида. Отрегулируйте рН до 7,2 с KOH.
  2. Приготовьте 100 мл 4% агара, добавив 4 г агара в горячую (около кипения) воду 100 мл. Поместите на нагретую тарелку для поддержания температуры и перемешайте до полного растворения. Налейте в 100 мм пластиковые чашки Петри примерно на 1 см глубины и дайте остыть. Охладить до необходимости.
  3. Подготовка 1 л искусственной спинномозговой жидкости (ACSF), содержащейся в mM: 124 NaCl, 1.2 CaCl2, 1.3 MgSO4, 5 KCl, 26 NaHCO3, 1.25 KH2PO4, и 10 декстрозы. Пузырь с карбогеном (5% CO2 / 95% O2) по крайней мере 10 мин, а затем настроить окончательный рН до 7,4 с 1 М NaOH, если это необходимо. Поддерживайте оксигенацию и рН раствора, постоянно пузырись карбогеном на протяжении всего эксперимента.
  4. Приготовьте раствор нарезки 200 мл, добавив 1 мМ кинуреновую кислоту в ACSF. Раствор Sonicate в звуковой водяной бане в течение 10 мин, пока кинуреновая кислота не растворяется. Непрерывно пузыриться карбогеном и высовывьте на лед.
    ВНИМАНИЕ: Используйте соответствующее средства индивидуальной защиты при обращении с кинуреновой кислотой.
  5. Намонтировать соответствующее лезвие в виброме в соответствии с инструкциями производителя. Охладите вибромную нарезку камеры, окружив ее льдом.

2. Удаление мозга с нетронутыми слуховой нервный корень для стимуляции

ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши для этих экспериментов были получены путем пересечения ChAT-IRES-Cre трансгенных мышей на фоне C57BL/6J с tdTomato репортер мышей (Ai14). Мыши, используемые для гистологии и электрофизиологии, были послесвешательным началом (P14-P23), который составляет около P12 у мышей. Нейроны, выражаюющие tdTomato в брюшном ядре трапециевидного тела (VNTB) ранее были охарактеризованы как нейроны MOC в этойлинии мыши 57.

  1. Euthanize (например, удушье CO2) и обезглавить животное с помощью утвержденных институциональных процедур.
  2. Используя лезвие бритвы, вырезать кожу в средней линии черепа от носа до задней части шеи. Очистите кожу спины, чтобы разоблачить череп.
  3. Используя маленькие ножницы, сделайте разрез в черепе через середину, начиная с основания (хвостовой конец возле спинного мозга) черепа и продолжая к носу.
  4. На шве лямбды, сделать порезы в черепе от средней линии, боковой к уху с обеих сторон. Очистите череп, чтобы разоблачить мозг.
  5. Начиная с рострального конца, аккуратно поднимите мозг от черепа с помощью небольшого лабораторного шпателя или тупых типсов. Вырезать зрительный нерв и продолжать мягко работать мозг назад, подвергая брюшной поверхности.
  6. Вырезать тригеминальные нервы, ущипнув их с тонкой щипся вблизи брюшной поверхности ствола мозга.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сделайте это тщательно, как вестибюльно-охлеарный нерв лежит чуть ниже этого и должен быть нетронутым для возможной стимуляции.
  7. Поместите препарат в стеклянную чашку Петри, наполненную холодным нарезаным раствором. Поместите блюдо под рассечение микроскопа. Аккуратно пузырь с карбогеном.
  8. Обрезать лицевой нерв близко к стволу мозга и подвергать вестибюльно-скелетного нерва.
  9. Используя тонкие щипцы, нажмите кончики в foramina, где вестибюльно-бликохлеарный нерв выходит из черепа, насколько это возможно, и ущипнуть нерв, чтобы разорвать его, оставляя нервный корень прилагается к стволу мозга. Повторите это на другой стороне.
  10. После того, как оба нервных корня свободны, удалить оверинги и сосуды с брюшной поверхности ствола мозга вблизи трапециевидного тела.
  11. Освободите мозг полностью от черепа, ущипнув оставшиеся черепные нервы и соединительной ткани, заботясь, чтобы сохранить оставшийся спинной мозг, если это возможно.

3. Блок и монтировать мозг на сцене (магнитный диск)

  1. Подготовьте поверхность мозга, чтобы исправить на сцену, блокируя мозг на уровне оптического чиазма.
    1. С брюшной поверхности вверх, стабилизировать мозг с помощью тупого инструмента, чтобы мягко обездвижить спинной мозг так, что мозг не наклоняется в течение следующего шага.
    2. На уровне оптического чиазма, использовать открытые миппы для создания плоскости для блокирования мозга, вставив через мозг вниз к нижней части блюда. Вставьте типсы под углом около 20 градусов от вертикального, так что кончики выйти спинной поверхности мозга caudal к оптической чиазмы.
    3. Вырезать вдоль типсов с помощью лезвия бритвы.
  2. Приклейте мозг к поверхности сцены.
    1. Приготовьте небольшой блок (1 см3) 4% агара для поддержки мозга.
    2. Поместите небольшую каплю клея на сцену и распределите его в прямоугольник, чтобы мозг и агар блок могут быть приклеены вниз.
    3. Используя миппы, осторожно поднимите мозг и аккуратно мазите лишнюю жидкость, используя край бумажного полотенца. Поместите заблокированную поверхность на клей, вентрал поверхности будет к лезвию во время нарезки.
    4. Нажмите агар блок осторожно против спинной поверхности мозга, чтобы поддержать его во время нарезки и обеспечить надлежащее позиционирование мозга (т.е. угол).

4. Нарежьте мозг, чтобы создать клин ломтик

ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте ломтик мозга с помощью вибромы, которая имеет корень кохлеарного нерва на толстой стороне и медиальной оливокохлеарных (MOC) нейронов и медиальное ядро трапециевидного тела (MNTB) на тонкой стороне.

  1. Поместите магнитный диск с прикрепленным мозгом на сценическое основание и поместите его в камеру нарезки с брюшной поверхностью мозга, ориентированной на лезвие.
  2. Заполните камеру раствором ледяной нарезки и пузырь карбогеном.
  3. Опустите лезвие в раствор и вырезать ломтики caudal в область интереса, чтобы убедиться, что ломтики симметричны. Если срезы кажутся асимметричными, слегка наклоните сцену, чтобы получить симметрию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость лезвия между 0.05-0.10 мм/с были эффективны для резки здоровых ломтиков и может варьироваться в зависимости от возраста животных и области мозга.
  4. После того, как ломтики симметричны, переложите этап на 15 градусов (соответствующий примерно 3 концентрическим кольцам на сцене) в одну сторону.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сдвиг этапе от слухового корня нерва, что вы хотите сохранить в ломтик.
  5. Продолжить нарезки тщательно, пока слуховой нервный корень близко к поверхности с одной стороны, и лицевой нерв можно увидеть на поверхности другой стороны.
  6. Сдвиг этапе обратно 15 "в исходное положение.
  7. Перемести лезвие от ткани и закрути основание сцены на 90 градусов, чтобы боковой край тонкой стороны обращен к лезвию. Опустите лезвие на несколько сотен микрон, а затем медленно принесите лезвие близко к краю ткани. Повторяйте это до тех пор, пока лезвие не коснется бокового края. Опустите лезвие до нужной толщины тонкого края ломтика, здесь еще двести микрон.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Полученный срез идеально толщиной 300 мм на уровне брюшного ядра трапециевидного тела (VNTB) на стороне, где патч зажима будет иметь место.
  8. Перемести лезвие обратно от ткани и спина стадии базы назад так, что брюшной поверхности сталкивается с ним.
  9. Сделайте разрез, который обозначает ростральной поверхности клина ломтик. Перенесите срез на кусок интерфейсной бумаги (1см 2)хвостовой поверхности вниз. Переместите срез в инкубационую камеру или другой подходящий инкубационный аппарат для восстановления (30 мин при 35 градусов по Цельсию).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Лицевой нерв должен быть виден на обоих полушариях ломтика на ростральной поверхности (см. Рисунок 1B).

5. Электрофизиологическая настройка и запись

  1. Поместите ломтик клина в камеру записи и закрепите ломтик арфой или стабилизирующей системой. Перелив ткани непрерывно со скоростью 7-10 мл/мин с теплым (35 градусов по Цельсию) ACSF пузырились карбогеном.
  2. Определите генетически помеченные нейроны MOC в VNTB с помощью эпифлюоресценции с 561 нм фильтров выбросов для записи патч-зажима. Переверните срез, если нет потенциально патчируемых ячеек.
  3. Используя оптику DIC, сосредоточьтесь на корень слухового нерва на толстой стороне ломтика и используйте микроманипулятор для перемещения биполярного вольфрама, стимулирующего электрод до корня слухового нерва и осторожно в поверхность ткани.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Всасывающие электроды были использованы в экспериментах по стимуляции слухового нерва в других лабораториях. Эти стеклянные электроды, или методы оптической стимуляции могут быть использованы, если это применимо к другим конкретным препаратам.
  4. Перемести поле зрения обратно в VNTB, чтобы выбрать нейрон MOC для целевой для электрофизиологии зажима патча.
  5. Заполните записывающую пипетут соответствующим внутренним решением для предлагаемого эксперимента.
  6. Патч и запись с нейрона MOC в конфигурации всей клетки. При необходимости компенсируют емкость мембраны и сопротивление сериям.
  7. Отрегулируйте амплитуду электрической стимуляции корня слухового нерва, чтобы получить последовательные постсинаптические события в нейроне MOC.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это может быть необходимо для перемещения стимула электрода.
  8. Вы запустите соответствующие протоколы стимуляции для наблюдения вызванных синаптических течений в MOC (зажим напряжения) или потенциальных моделей действия (текущий зажим).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Препарат клина ломтик может быть использован с любыми типичными патч-зажим инструменты, такие как свободные записи патч, фармакология, оптогенетика, кальций изображений, нейромедиатор uncaging, и т.д.

6. Гистологическое подтверждение ядер ствола мозга

ПРИМЕЧАНИЕ: Это делается с cresyl фиолетовый окрашивания, в фиксированной, повторно секционированы клин ломтик. Этот метод позволяет визуализировать ядра, которые содержатся в срезе.

  1. После подготовки клина ломтик, погрузить ломтик в фиксатор (4% PFA в PBS) на ночь. Промыть ломтик 3x в течение 10 мин в PBS (комнатная температура на шейкер), а затем поместить в 30% сахарозы в PBS ночь при температуре 4 градусов по Цельсию, чтобы криопротектор.
  2. Повторно раздел ломтик на замораживание микротом (40-70 мм) и собирать серийные разделы в 24 хорошо пластины в PBS.
  3. Гора разделы на желатин покрытием слайды и дайте высохнуть полностью. Поместите слайды в слайд-карету.
  4. Подготовка кресиле фиолетовых решений
    1. Приготовьте 1% крезилового фиолетового ацетата, смешивая 5 г крезилового фиолетового ацетата в 500 мл dH2O
    2. Подготовьте буфер ацетата, сначала подготовив раствор А (540 мл ледниковой уксусной кислоты и 89,46 мл dH2O) и раствор 10 мл B (136 мг ацетата натрия в 10 мл dH2O). Объедините решение A и решение B, дать буфер ацетата.
    3. Комбинат 1% cresyl фиолетовый ацетат с буфером ацетата 1:1 для 0,5% cresyl фиолетовый в буфер ацетата. Фильтр перед использованием.
    4. Подготовка 95% и 70% этанола путем разбавления 100% этанола с соответствующими объемами dH2O
  5. Выполните протокол окрашивания кресилей. Перемещение слайд перевозки через раствор лотки, blotting избыток раствора на бумажное полотенце между лотки: ксилен - 5 мин; 95% этанола - 3 мин; 70% этанола - 3 мин; dH2O - 3 мин; 0,5% крезил фиолетовый раствор - 8-14 мин мониторинга часто, пока ядерное окрашивание становится темно-фиолетовый; dH2O - 3 мин; 70% этанола - 3 мин; 95% этанола - 1-2 мин; 100% этанол - падение слайды в два раза; ксилен - 5 мин; ксилен: 25 мин. до монтажа.
    ВНИМАНИЕ: Используйте ксилены только под капотом дыма.
  6. Удалите слайды из ксилена по одному и сразу же поместите крышку скользит на слайдах с помощью монтажной среды. Разрешить монтаж средних до сухих (на ночь).
  7. Разделы изображений.

7. Маркировка биоцитина для антероградного отслеживания аксонов в живой, нефиксированной ткани

  1. Подготовьте ломтик клина, как указано выше (Шаги 2-4).
  2. Перенесите срез в интерфейсную бумагу (1 см2). Под рассечением микроскопа, найти CN на толстой стороне ломтика.
  3. Тщательно удалите избыток ACSF из области, окружающей ломтик, скручивая угол бумаги ткани, чтобы привлечь ACSF от ткани. Это предотвращает распространение биоцитина на окружающие участки ломтика, что может привести к поглощению в клетки за пределами CN.
  4. С тонкой типсов, выберите небольшой кристалл биоцитина и поместите его на поверхность CN. Аккуратно нажмите кристалл в ткань, чтобы способствовать контакту с нейронами и последующего поглощения в сомата. Повторите этот шаг, чтобы покрыть желаемую область интереса, в данном случае CN регионов, содержащих T-stellate и GBC нейронов.
  5. Поместите кусочек в инкубационую камеру. Разрешить ломтик инкубировать в течение 2-4 ч при 35 градусов по Цельсию, чтобы обеспечить поглощение и транспортировку биоцитина. После инкубации, промыть ломтик в ACSF, чтобы удалить любые частицы биоцитина.
  6. Поместите ломтик в фиксатор (4% PFA в PBS) на ночь. Промыть 3x в течение 10 мин в PBS.
  7. Cryoprotect ломтик в 30% сахарозы в PBS ночь на 4 градусов по Цельсию или до тех пор, пока ломтик раковины.
  8. Переразделите ткань для получения поперечных секций на замерзающую микротому на 70-100 мм.
  9. Процесс ткани с использованием стандартных иммуноистохимических методов с флуоресцентно конъюгированных стрептавидин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительная иммуногистохимия может быть выполнена на секциях, если полезно для маркировки пресинаптических клеток органов, аксонов, рецепторов или других синаптических молекул, важных для визуализации цепи (т.е. основные шаги антитела не должны негативно влиять на вторичную визуализацию биоцитина).
  10. Изображение ткани.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Гистологическое исследование ломтика клина
Для нашего исследования слуховой функции нейрона ствола мозга, препарат ломтика клина был разработан, чтобы содержать корень слухового нерва и CN контралатеральных нейронов MOC, предназначенных для записи (пример ломтик показано на рисунке 1B). Первоначальная гистологическая экспертиза препарата важна для подтверждения того, что срез содержит ядра, необходимые для активации цепи, и что аксональные проекции целы. Два типа клеток в ПРЕДЕЛА обеспечивают звуковую информацию нейронам MOC. Т-стеллат клетки предполагаются, чтобы обеспечить возбуждающей вход в нейроны MOC39,40,41,58. Глобулярные густые клетки (GBC) возбуждают нейроны MNTB в контралатеральное полушарие (через специализированный каликс Хельд synapse)34,36,37,38,59,60, которые, в свою очередь, обеспечивают ингибирующее ввода нейронов MOC57 (схематический рисунок 1A). Чтобы подтвердить наличие как T-stellate клеток и GBCs, мы повторно секционированы (до 50 мкм) клин ломтик, который был зафиксирован погружением в 4% PFA и выполняется cresyl фиолетовый окрашивания для обозначения сомата. В толстой стороне ломтика клина(рисунок 2, левое полушарие), CN присутствовал почти в полном ростро-каудальной степени. Кроме того, спинные и брюшной подразделения CN были нетронутыми(рисунок 2;стрелка и наконечник стрелы в S19). T-stellate нейронов и GBCs кластера в брюшной кохлеарного ядра рядом, где слуховой нерв(рисунок 2;стрелка в S17) входит в CN61,62,63,64,65. Срез клина также содержит нейроны MNTB ipsilateral к нейронам MOC, из которых выполняются записи (тонкое полушарие исходного ломтика клина, правая сторона на рисунке 2). Это подтверждает, что по крайней мере часть ингибирующего ввода нейронов MOC не повреждена(рисунок 2, ломтики 1-15, выделенные пунктирной овалы в S11).

В отдельных экспериментах мы подтвердили, что аксоны и пресинаптические терминалы нейронов CN были нетронутыми в ломтике клина с помощью антероградной маркировки биоцитином. Во-первых, живой клин ломтик был подготовлен и помещен на бумаге интерфейса. Сразу же после подготовки ломтик клина, кристаллы биоцитина были помещены в CN, что позволило поглощения и антероградного транспорта вдоль аксонов в инкубационный период. Затем была проведена фиксация и повторное сечение ткани (70 мм секций). Окрашивание секций флуоресцентно помеченным стрептавидином было выполнено для визуализации аксонов, помеченных биоцитином. Конфокальные изображения этих разделов показывают яркую маркировку в CN, где кристаллы были помещены и взяты в телаклеток (рисунок 3A, левое полушарие, пунктирной области). Аксоны, выходящие из CN вдоль брюшной акустическойстрии (рисунок 3A, белые наконечники стрел) были четко обозначены и могут быть соблюдены к их точкам прекращения. Биоцитин-положительная панкта окружающих контралатеральных нейронов MOC предложить наш препарат сохраняет синаптические контакты, происходящие из CN (Рисунок 3B). Аналогичным образом, помеченные калики, удерживаемые в контралатеральной MNTB, указывают на то, что аксоны, проецирующиеся от ГБК к нейронам MNTB, сохраняются в срезеклина (рисунок 3C). Эти гистологические исследования подтверждают, что наш клин содержит как клеточные тела, так и аксональные проекции афферентной входной схемы нейронов MOC, что, таким образом, позволяет измерять постсинаптические реакции, вызванные стимуляцией слухового нерва и последующим распространением активности через восходящую схему.

Синаптическая физиология в ломтике клина
Интеграция возбуждающей и ингибирующей синаптической вводимой энергии критически формирует нейронную активность. Недавно мы описали ингибирующие входы в нейроны MOC от нейронов MNTB57, но эффект интеграции этих входов с возбуждающей входы на активность нейронов MOC неизвестен. В клиновидном срезе от мыши ChAT-IRES-Cre x tdTomato записи напряжения были выполнены из нейрона MOC. Ток был применен через биполярный вольфрам стимулирующий электрод, управляемый блоком изоляции стимула, чтобы вызвать высвобождение нейромедиатора из пресинаптических аксонов. Сначала вентралическая акустическая стрима (VAS) в средней линии была электрически стимулирована для активации аксонов T-stellate непосредственно и нейронов MNTB через стимуляцию аксона GBC(рисунок 4A), чтобы измерить задержку до пост-синаптических реакций в конфигурации записи, которая имитирует типичные тонконарезаные эксперименты(рисунок 4B), например, следы, серый, проведение потенциальных -60 мВ). В отдельных экспериментах, корень слухового нерва стимулировался для активации монауральной восходящей схемы и пост-синаптические реакции были измерены на нейронах MOC, как описано выше. Электрическая стимуляция в любом месте вызвала быстро-электрический артефакт с последующим многопиковой текущей реакцией (пример ответов от стимуляции AN на рисунке 4C,черные следы, удерживав потенциал -60 мВ). Мы сравнили показатели задержки начала первого постсинаптического тока (PSC), вызванные прямой стимуляцией VAS, с показателями, вызванными слуховой стимуляцией нерва, и обнаружили значительно более длинную задержку с событиями стимуляции AN. Это было связано с синаптической задержкой, понеся на AN/CN synapse (стимуляция AN: 5.27 ± 0.43 ms, медианное ± медианное абсолютное отклонение (MAD), диапазон 4.26-5.93 ms, n q 8; СТИМУЛЯЦИя VAS: 1,98 ± 0,28 мс, медианный ± MAD, диапазон 0,75-3,46 мс, n No 17; Уилкоксон Подпись Ранги Тест, р No 0,014, Рисунок 4D). Эти результаты подтверждают, что стимуляция корня слухового нерва приводит к синаптической активации нейронов CN и последующей активности цепи, более тесно представляющих in vivo - как сроки, чем прямая стимуляция T-stellate или GBC / MNTB аксонов.

С нашим цезия на основе, высокой "Cl- " внутреннийраствор, используемый в зажим напряжения, возбуждающей (глутаматергической) и ингибирующей (ГАМК и глицинергической) PSCs оба внутренне на отдых мембраны потенциал (-60 мВ) и, следовательно, неотличимы. Вызывая активность цепи в ан-стимулирующей конфигурации, мы электрически изолировали предполагаемый ингибирующий вход, перео смещение потенциала холдинга на 0 мВ, приблизительный потенциал разворота для АМРА опосредованных глутаматергических течений. В нашем примере нейрона, внешние текущие реакции наблюдались на 0 мВ (Рисунок 4Ci, красные следы) свидетельствует о поведении хлорида. Это, вероятно, будет ГАМК- или глицинергической синаптической реакции. Эти данные демонстрируют полезность ломтика клина, чтобы активировать как возбуждающее, так и ингибирующее вводимое вещество в нейроны MOC, стимулируя корень слухового нерва, с активацией последующих афферентных схем. Кроме того, различные модели пост-синаптических реакций были вызваны стимуляцией АН, что свидетельствует о том, что даже в условиях идентичной стимуляции аксонов АН активность всей цепи является динамичной и сложной. Эта экспериментальная парадигма позволяет провести подробный анализ того, как сложные слуховые стимулы распространяются через ствол мозга и интегрироваться в нейроны MOC, определяя выход MOC эфферентной системы и в конечном итоге влияние на улитку.

Figure 1
Рисунок 1: Схема среза клина и пример изображения. (A)Схема медиальной схемы обратной связи olivocochlear. Синие стрелки указывают на афферентный восходящий путь к нейронам MOC, а черные стрелки указывают на нисходящий путь обратной связи от нейронов MOC к основанию наружных волосковых клеток (OHC). (B)Яркое изображение ломтика клина с этикетками корня слухового нерва (ANR) и кохлеарного ядра (dashed outline) на толстой стороне. Звездочка указывает приблизительное расположение брюшного ядра трапециевидного тела, где нейроны MOC предназначены для зажима патча на тонкой стороне ломтика клина. Dashed черные линии указывают на лицевые нервы, которые можно увидеть в обоих полушариях ломтик на рострной поверхности. IHC - внутренняя волосяная клетка, GBC - шаровые густые клетки, SPN - превосходное параоливарное ядро, MNTB - медиальное ядро трапециевидного тела, VNTB - вентральное ядро трапециевидного тела, LSO - боковое превосходное оливковое. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Cresyl фиолетовый окрашенных разделов из клина ломтик, который был вновь секционирован на 50 мкм. Каждый другой раздел был изображен. Разделы проумеровы ростральными --'gt; caudal. Клин ломтики, как правило, содержат всю кохлеарное ядро (CN), включая как спинной CN (стрелка в S19) и брюшной CN (стрелка в S19), слуховой нервный корень (открытая наконечник стрелы в S17) и большая часть MNTB (темная область вблизи брюшной поверхности в S3-S15, выделенные с пунктирной овалов в S11). D и V по шкале бар представляют спинной и брюшной в ломтик ориентации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Аксоны восходящего ввода нейронов MOC из контралатерального кохлеарного ядра остаются нетронутыми в ломтике клина. (A) Ростральный-самый раздел из клина ломтик взяты из P23 ChAT-IRES-Cre х tdTomato (красная флуоресценция) мышь, которая была повторно секционирована (70 мкм) и обработаны для визуализации биоцитина. Confocal изображение плиткой, максимальная интенсивность проекции z-стек. Аксоны в брюшной акустической стрии выделены белыми наконечниками стрел. Dashed план указывает на небольшую часть кохлеарного ядра, оставшегося в этом ростральном наиболее ломтик. Шкала бар 500 мкм. (B) Конфокальные изображения ChAT-IRES-Cre х tdTomato положительный нейрон в VNTB с биоцититином положительный панкта в окружающих нейропилов. Шкала бар 50 мкм. (C) Биоцитин помечены аксоны показано пересечения средней линии и прекращения в контралатеральной MNTB как calyces Хельд. Вертикальная пунктирной линия представляет собой середину среза. Масштабная планка 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Электрическая стимуляция афферентных входов в зажим напряжения дает многопиковых постсинаптических тока в нейронах MOC. (A) Схема ломтика клина с записью настройки для как брюшной акустической стрии (VAS) стимуляции (серый стимулирующий электрод) и слухового нерва (AN) стимуляции (черный стимулирующий электрод) афферентных входов в MOC. (B) Примеры постсинаптических токов (PSCs) от индивидуального нейрона P17, вызванного одним электрическим стимулом вблизи средней линии при -60 мВ. (C)PSCs вызвали во время стимуляции AN при -60 мВ в нейроне P15. (Ci) Пример PSCs в той же камере, как C вызвал на 0 мВ холдинга потенциал (приблизительный потенциал разворота для AMPA опосредовано токов в нашей установке записи, красный). (D)Данные о населении для количественной оценки задержки до первого PSC для VAS и AN стимуляции. Коробки: квартили, вставка линии: средняя, квадратная вставка: средняя, усы: среднее абсолютное отклонение. 0,05 р-л; Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Процедура нарезки, описанная здесь, называют ломтик клина является мощным для поддержания нетронутыми пресинаптических нейрональных схем, но с доступностью мозга ломтик экспериментов для анализа нейрональной функции. Необходимо принять меры в несколько первоначальных шагов, с тем чтобы максимизировать полезность подготовки к анализу схемы. Размеры клина должны быть подтверждены с помощью гистологического исследования, которое является неотъемлемой частью для подтверждения того, что как пресинаптические ядра, так и их аксональные проекции содержатся в подготовленном срезе клина. Геометрия фрагмента может потребовать модификации, если проекции разорваны или несколько аксонов достигают целевых ядер. В более общем плане, отделка вырезать на виброме для клина ломтик критически важно. Оптимальная подготовка ломтика клина потребует сочетания последовательного использования конфигураций вибромы, включая использование концентрической разметки круга на сцене базы, наряду с корректировкой настроек на основе известных ориентиров мозга. После оптимизации геометрии ломтика, мы записали последовательные PSCs в нейронах MOC вызванных электрически стимулируя корень слухового нерва в 8 из 18 ломтиков клина. В нашей предыдущей работе мы смогли вызвать ингибирующие PSCs через прямую стимуляцию аксонов MNTB примерно в 60% нейронов MOC57, предполагая, что наш успех здесь является лишь скромным снижением, учитывая большой диапазон входов и необходимость для активации полисинаптической цепи. При подготовке ломтик, желательно ошибиться на более толстой стороне, как снижение видимости из-за толще ломтик является благоприятным для непригодных раздел, который является неполным или не хватает подключения цепи. Любая конфигурация ломтика или размеры могут быть использованы, до тех пор, как срез вписывается под запись микроскопа цели, доступен патч и стимулирования электродов (или других зондов или оборудования), и является достаточно тонким для оптически основе патч-зажима на постсинаптической ячейки интереса. Быстрое, нежное вскрытие и надлежащие инкубационные и восстановительные условия также важны для поддержания жизнеспособности схемы для экспериментов с зажимами для патчей. Специфический для нашей слуховой подготовки ствола мозга, мозг должен быть удален очень тщательно из черепа, чтобы сохранить нетронутыми и функциональными слуховых нервных корешей. Растяжение или разрыв нерва повлияет на способность стимулировать волокна и вызвать активность в слуховых нейронов. Благодаря большему объему ткани в ломтике, изменение традиционных нарезных растворов, температуры, инкубационные детали и перфузионные системы могут улучшить здоровье ломтика. Здесь мы используем небольшие изменения в нашей обычной подготовки ломтик. К ним относятся более короткие сроки инкубации восстановления (30 минут против 60 минут) и более быстрые скорости потока в системе перфузии камеры среза.

После того, как размеры среза и детали инкубации будут определены, следует продемонстрировать функцию и подключение различных компонентов схемы внутри среза. В нашей подготовке, мы гарантируем, что как возбуждающей и ингибирующие входы, предположил, происходят в кохлеарном ядре с T-stellate и GBC (через MNTB), присутствуют, как ожидалось. Альтернативные методы стимуляции, такие как всасывание электродов для слухового нерва, или оптические методы стимуляции, такие как оптогенетика или координационный нейромедиатор uncaging может также увеличить активацию цепи или позволяют клеточного типа конкретной активации в паре с генетическим таргетинга клеток подтипов.

Хотя этот метод нарезки, как мы надеемся, будет полезен для многих систем и схем, некоторые ограничения стандартных тонкосрезаных секций также имеют отношение к этой подготовке. Как правило, может быть трудно сохранить схемы с менее планарными проекционными моделями, так как аксоны, скорее всего, будут разорваны. Активация цепи на черепных нервах, как это делается здесь, чтобы имитировать слуховые входы, не может быть возможным во многих схемах. Как и в случае с другими препаратами ломтик, сетевые эффекты любой фармакологии должны быть рассмотрены. Например, применение в ванне блокаторов рецепторов глутамата для изоляции ингибиторов (ГАМК- или глицинергических) или других способов передачи не может быть использовано с активацией полисинаптической цепи, когда глутамат необходим для активации нейронов вверх по течению исправленного целевого нейрона. Это верно в нашем случае, как и AN / CN и GBC / MNTB синапсы глутаматергические, поэтому, вся передача будет устранена на нейронах MOC с применением ванны блокаторов рецепторов глутамата. Кроме того, применение ГАМК или блокаторов рецепторов глицина для устранения синаптических реакций MNTB-MOC будет иметь непреднамеренное последствие устранения внутренней ингибирующей связи в CN, которые могут формировать модели афферентных входов в нейроны MOC. Фокусное применение блокаторов рецепторов, с выбросом давления или ионтофорезом, может быть использовано для ограничения фармакологической функции.

Наконец, основное ограничение этого, и любой, in vitro метод заключается в том, что, хотя этот препарат максимизирует активацию монауральной восходящей слуховой схемы, остальная часть нервной системы, в том числе периферических рецепторов, которые кодируют стимулы, отсутствует. Это включает в себя улитку себя, возбуждающие входыиз другого уха 66, комиссариарной CN соединения67,68,69,70, и нисходящийкорковых 71,72,73,74 иcollicular 75,76 прогнозов имодуляции входов 77,78,79,80 известновлиять на деятельность CN и SOC ядра. Хотя вполне возможно, что часть нисходящих прогнозов IC сохраняется, было бы невозможно включить как корковые проекции, так и комиссарические прогнозы CN из-за геометрии среза. Таким образом, мы сосредоточиваемся на восходящей слуховой схеме из улитки с текущими экспериментами. Минимальная толщина ломтика на тонкой стороне также снижает способность выполнять бинауральный анализ поликинаптической цепи, что является преимуществом симметричных препаратов толстоголомтика 10,11. Кроме того, мы не в состоянии стимулировать слуховой нерв со звуком, чтобы вызвать естественные модели цепной активности. Слуховые нервные реакции тонотопически разнообразны, нервный,и пластиковые 81,82,83,84, что делает его трудно прекрасно имитировать с нашим методом электрической стимуляции. Это является основным недостатком экспериментов in vitro в слуховой системе. Тонотопическое ограничение нашей стимуляции не возможно, так как стимулирование всего корня AN вызовет пики в волокнах AN через тонотопический градиент. Точно имитировать разнообразие ответов волокна AN (т.е., низкие против волокон высокой самопроизвольной скорости) к электрической картине стимула также не по возможности. Кроме того, трудно точно соответствовать динамической интенсивности кодирования нескольких волокон AN в CN. Тем не менее, мы можем использовать наше программное обеспечение электрофизиологии для производства различных моделей стимуляции, направленных на имитацию соответствующих слуховых нервных выходов во время различных акустических стимулов (например, короткие, громкие звуки, тихие, продолжительные звуки или звуки в фоновом шуме), изменяя частоту стимула как между электрическими протоколами стимула, так и в рамках индивидуального протокола, чтобы приблизить комбинированные входы AN (по образцу ref.85). Мониторинг выхода MOC во время этих экспериментов будет проверить наши гипотезы относительно того, что стимул модели могут способствовать ингибированию или возбуждения на MOC нейронов.

Несмотря на описанные выше ограничения, метод подготовки клина имеет преимущества по сравнению с in vivo и типичными методами физиологии в пробирке и может быть использован для подхода к активации цепи in vivo как можно ближе в срезе для клеток, которые трудно получить доступ. In vivo цельноклеточных записей в слуховой ствол мозга были редки из-за трудностей доступа к этой области хирургически86. Вместо этого срез был готов включить восходящие входы в нейроны MOC, начиная со слухового нерва, который стимулируется непосредственно активировать всю монаурную восходящую цепь. Мы демонстрируем активацию как возбуждательных, так и ингибирующие синаптические входы, и ответы на эти входы дают ценную информацию о сроках синаптических входов по мере их достижения нейронами MOC. Это обеспечивает платформу для высокой пропускной способности экспериментов, где мы можем использовать большой репертуар в пробирке электрофизиологических инструментов, таких как кальций или напряжение изображения, нейромедиатор uncaging, и как внутриклеточный (через патч пипетки) и внеклеточной (через применение ванны или ионтофорез) фармакологии. Препарат должен также предложить увеличение пропускной способности над толстыми препаратами ломтик из-за лучшей видимости целевых нейронов с использованием оптики DIC, которые размытия с увеличением толщины тканей, особенно в брюшной ствол мозга. В целом, этот метод обеспечивает улучшение таргетинга и пропускной способности над методами in vivo, а также лучшие возможности для анализа схемы, чем традиционные методы физиологии среза.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторов нечего раскрывать.

Acknowledgments

Это исследование было поддержано Программой интрамуральных исследований NIH, NIDCD, No01 DC000091 (CJCW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Experimental Preparations
Agar, powder Fisher Scientific BP1423500 4% agar block used to stabilize brain tissue during vibratome sectioning
AlexaFluor Hydrazide 488 Invitrogen A10436 Fluorophore used in internal solution to confirm successful MOC neuron patch
Analytical Balance Geneses Scientific (Intramalls) AV114 Weighing chemicals
Double edged razor blade Ted Pella 121-6 Vibratome cutting blade
Kynurenic acid (5g) Sigma Aldrich K3375-5G Slicing ACSF additive used to reduce neuron activity during dissection and slicing in order to improve tissue health for patch clamping
pH Meter Fisher Scientific (Intramalls) 13-620-451 Solution pH tester
Plastic petri dishes 100mm dia X 20mm Fisher Scientific (Intramalls) 12-556-002 4% Agar Prep
Stirring Hotplate Fisher Scientific (Intramalls) 11-500-150 Heating for 4% Agar preparation
Dissection and Slicing
Biocytin Sigma Aldrich B4261-250MG Chemical used for axonal tracing (conjugated to Streptavidin 488)
Dissecting Microscope Amscope SM-1BN For precision dissection during brain removal
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20 Fine forceps dissection tool
Economy tweezers #3 WPI 501976 Forceps dissection tool
Glass Petri Dish 150mm dia x 15mm H Fisher Scientific (Intramalls) 08-747E Dissection dish
Interface paper (203 X 254mm PCTE Membrane 10um) Thomas Scientific 1220823 Slice incubation/biocytin application
Leica VT1200S Vibratome Leica 1491200S001 Vibratome for wedge slice sectioning
Mayo scissors Roboz RS-6872 Dissection tool
Single-edged carbon steel blades Fisher Scientific (Intramalls) 12-640 Razor blade for dissection
Specimen disc, orienting Leica 14048142068 Specialized vibratome stage for reproducible tilting
Spoonula FisherSci 14-375-10 Dissection tool
Super Glue Newegg 15187 Used for glueing tissue to vibratome stage
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 91500-09 Dissection tool
Electrophysiology
A1R Upright Confocal Microscope Nikon Instruments Electrophysiology and imaging microscope, can be any microscope compatible with electrophysiology
Electrode Borosilicate glass w/ Filament OD 1.5mm, ID 1.1mm, 10 cm long Sutter Instrument BF150-110-10 Patch clamping pipette glass
Electrode Filler MicroFil WPI CMF20G Patch electrode pipette filler
In-line solution heater Warner Instruments (GSAdvantage) SH-27B Slice perfusion system heater
Multi-Micromanipulator Systems Sutter Intruments MPC-200 with MP285 Micromanipulators for patch clamp and stimulation electrode placement
P-1000 horizontal pipette puller for glass micropipettes Sutter instruments FG-P1000 Patch clamp pipetter puller
Patch-clamp amplifier and Software HEKA EPC-10 / Patchmaster Next Can be any amplifier/software
Recording Chamber Warner Instruments RC26G Slice "bath" during recording
Recording Chamber Harp Warner Instruments 640253 Stablizes slice during electrophysiology recording
Slice Incubation Chamber Custom Build Heated, oxygenated holding chamber for slices during recovery after slicing
Stimulus isolation unit A.M.P.I. Iso-Flex Stimulus isolation unit for electrophysiology
Syringe 60CC Fischer Scientific (Intramalls) 14-820-11 Electrophysiology perfusion fluid handling
Temperature controller Warner Instruments (GSAdvantage) TC-324C Slice perfusion system temperature controller
Tubing 1/8 OD 1/16 ID Fischer Scientific (Intramalls) 14-171-129 Electrophysiology perfusion fluid handling
Tugsten concentric bipolar microelectrode WPI TM33CCINS Stimulating electrode for electrophysiology
Histology
24 well Plate Fisher Scientific (Intramalls) 12-556006 Histology slice collection and immunostaining
Alexa Fluor 488 Streptavidin Jackson Immuno labs 016-540-084 Secondary antibody for biocytin visualization
Corning Orbital Shaker Sigma CLS6780FP Shaker for immunohistochemistry agitation
Cresyl Violet Acetate Sigma Aldrich (Intramalls) C5042-10G Cellular stain for histology
Disposable Microtome Blades Fisher Scientific 22-210-052 Sliding microtome blade
Filter-syringe Nalgene 4mm Cellulose Acetate 0.2um Fisher Scientific (Intramalls) 09-740-34A Syringe filter for filling recording pipettes with internal solution
Fluoromount-G Slide Mounting Medium Fisher Scientific OB100-01 Immunohistochemistry fluorescence mounting medium
glass slide staining dish with rack Fisher Scientific (Intramalls) 08-812 Cresyl Violet staining chamber
Microm HM450 Sliding Microtome ThermoFisher 910020 Freezing microtome for histology
Microscope Cover Glasses: Rectangles 50mm X 24mm Fisher Scientific (Intramalls) 12-543D Histochemistry slide cover glass
Permount mounting medium Fisher Scientific SP15-100 Cresyl violet section mounting medium
Superfrost Slides Fisher Scientific 22-034980 Histology slides

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Campbell, J. P., Henson, M. M. Olivocochlear neurons in the brainstem of the mouse. Hearing Research. 35 (2-3), 271-274 (1988).
  2. Grothe, B., Sanes, D. H. Synaptic inhibition influences the temporal coding properties of medial superior olivary neurons: An in vitro study. Journal of Neuroscience. 14, 1701-1709 (1994).
  3. Kotak, V. C., Sanes, D. H. Long-lasting inhibitory synaptic depression is age- and calcium-dependent. Journal of Neuroscience. 20 (15), 5820-5826 (2000).
  4. Smith, A. J., Owens, S., Forsythe, I. D. Characterisation of inhibitory and excitatory postsynaptic currents of the rat medial superior olive. The Journal of Physiology. 529 (3), 681-698 (2000).
  5. Scott, L. L., Mathews, P. J., Golding, N. L. Posthearing developmental refinement of temporal processing in principal neurons of the medial superior olive. Journal of Neuroscience. 25 (35), 7887-7895 (2005).
  6. Fischl, M. J., Combs, T. D., Klug, A., Grothe, B., Burger, R. M. Modulation of synaptic input by GABAB receptors improves coincidence detection for computation of sound location. Journal of Physiology. 590 (13), 3047-3066 (2012).
  7. Clause, A., et al. The Precise Temporal Pattern of Prehearing Spontaneous Activity Is Necessary for Tonotopic Map Refinement. Neuron. 82 (4), 822-835 (2014).
  8. Oertel, D. Use of brain slices in the study of the auditory system: Spatial and temporal summation of synaptic inputs in cells in the anteroventral cochlear nucleus of the mouse. Journal of the Acoustical Society of America. 78 (1), 328-333 (1985).
  9. Hermann, J., Pecka, M., Von Gersdorff, H., Grothe, B., Klug, A. Synaptic transmission at the calyx of held under in vivo-like activity levels. Journal of Neurophysiology. 98 (2), 807-820 (2007).
  10. Jercog, P. E., Svirskis, G., Kotak, V. C., Sanes, D. H., Rinzel, J. Asymmetric excitatory synaptic dynamics underlie interaural time difference processing in the auditory system. PLoS Biology. 8 (6), 1000406 (2010).
  11. Roberts, M. T., Seeman, S. C., Golding, N. L. A mechanistic understanding of the role of feedforward inhibition in the mammalian sound localization circuitry. Neuron. 78 (5), 923-935 (2013).
  12. Sinclair, J. L., et al. Sound-evoked activity influences myelination of brainstem axons in the trapezoid body. Journal of Neuroscience. 37 (34), 8239-8255 (2017).
  13. Wang, J., et al. Myelination of the postnatal mouse cochlear nerve at the peripheral-central nervous system transitional zone. Frontiers in Pediatrics. 1, 5-8 (2013).
  14. Long, P., Wan, G., Roberts, M. T., Corfas, G. Myelin development, plasticity, and pathology in the auditory system. Developmental Neurobiology. 78 (2), 80-92 (2018).
  15. Leão, R. M., et al. Presynaptic Na+ channels: Locus, development, and recovery from inactivation at a high-fidelity synapse. Journal of Neuroscience. 25 (14), 3724-3738 (2005).
  16. Fex, J. Efferent Inhibition in the Cochlea Related to Hair-Cell dc Activity: Study of Postsynaptic Activity of the Crossed Olivocochlear Fibres in the Cat. The Journal of the Acoustical Society of America. 41 (3), 666-675 (1967).
  17. Mountain, D. C. Changes in endolymphatic potential and crossed olivocochlear bundle stimulation alter cochlear mechanics. Science. 210 (4465), 71-72 (1980).
  18. Siegel, J. H., Kim, D. O. Efferent neural control of cochlear mechanics? Olivocochlear bundle stimulation affects cochlear biomechanical nonlinearity. Hearing Research. 6 (2), 171-182 (1982).
  19. Guinan, J. J. Cochlear efferent innervation and function. Current Opinion in Otolaryngology & Head and Neck Surgery. 18 (5), 447-453 (2010).
  20. Elgoyhen, A. B., Katz, E. The efferent medial olivocochlear-hair cell synapse. Journal of Physiology-Paris. 106 (1-2), 47-56 (2012).
  21. Galambos, R. Suppression of auditory nerve activity by stimulation of efferent fibers to cochlea. Journal of Neurophysiology. 19 (5), 424-437 (1956).
  22. Desmedt, J. E. Auditory-Evoked Potentials from Cochlea to Cortex as Influenced by Activation of the Efferent OlivoCochlear Bundle. Journal of the Acoustical Society of America. 34 (9), 1478-1496 (1962).
  23. Wiederhold, M. L., Kiang, N. Y. S. Effects of Electric Stimulation of the Crossed Olivocochlear Bundle on Single Auditory-Nerve Fibers in the Cat. The Journal of the Acoustical Society of America. 48 (4), 950-965 (1970).
  24. Wiederhold, M. L., Peake, W. T. Efferent Inhibition of Auditory-Nerve Responses: Dependence on Acoustic-Stimulus Parameters. Journal of the Acoustical Society of America. 40 (6), 1427-1430 (1966).
  25. Geisler, D. C. Hypothesis on the function of the crossed olivocochlear bundle. Journal of the Acoustical Society of America. 56 (6), 1908-1909 (1974).
  26. Guinan, J. J., Gifford, M. L. Effects of electrical stimulation of efferent olivocochlear neurons on cat auditory-nerve fibers. III. Tuning curves and thresholds at CF. Hearing Research. 37 (1), 29-45 (1988).
  27. Rajan, R. Involvement of cochlear efferent pathways in protective effects elicited with binaural loud sound exposure in cats. Journal of Neurophysiology. 74 (2), 582-597 (1995).
  28. Rajan, R. Effect of electrical stimulation of the crossed olivocochlear bundle on temporary threshold shifts in auditory sensitivity. II. Dependence on the level of temporary threshold shifts. Journal of Neurophysiology. 60 (2), 569-579 (1988).
  29. Reiter, E. R., Liberman, M. C. Efferent-mediated protection from acoustic overexposure: Relation to slow effects of olivocochlear stimulation. Journal of Neurophysiology. 73 (2), 506-514 (1995).
  30. Taranda, J., et al. A point mutation in the hair cell nicotinic cholinergic receptor prolongs cochlear inhibition and enhances noise protection. PLoS Biology. 7 (1), 1000018 (2009).
  31. Maison, S. F., Usubuchi, H., Liberman, C. M. Efferent feedback minimizes cochlear neuropathy from moderate noise exposure. Journal of Neuroscience. 33 (13), 5542-5552 (2013).
  32. Tong, H., et al. Protection from noise-induced hearing loss by Kv2. 2 potassium currents in the central medial olivocochlear system. Journal of Neuroscience. 33 (21), 9113-9121 (2013).
  33. Boero, L. E., et al. Enhancement of the medial olivocochlear system prevents hidden hearing loss. Journal of Neuroscience. 38 (34), 7440-7451 (2018).
  34. Spirou, G. A., Brownell, W. E., Zidanic, M. Recordings from cat trapezoid body and HRP labeling of globular bushy cell axons. Journal of Neurophysiology. 63 (5), 1169-1190 (1990).
  35. von Gersdorff, H., Borst, J. G. G. Short-term plasticity at the calyx of held. Nature Reviews Neuroscience. 3 (1), 53-64 (2002).
  36. Smith, P. H., Joris, P. X., Carney, L. H., Yin, T. C. T. Projections of physiologically characterized globular bushy cell axons from the cochlear nucleus of the cat. Journal of Comparative Neurology. 304 (3), 387-407 (1991).
  37. Kuwabara, N., DiCaprio, R. A., Zook, J. M. Afferents to the medial nucleus of the trapezoid body and their collateral projections. Journal of Comparative Neurology. 314 (4), 684-706 (1991).
  38. Friauf, E., Ostwald, J. Divergent projections of physiologically characterized rat ventral cochlear nucleus neurons as shown by intra-axonal injection of horseradish peroxidase. Experimental Brain Research. 73 (2), 263-284 (1988).
  39. De Venecia, R. K., Liberman, M. C., Guinan, J. J., Brown, M. C. Medial olivocochlear reflex interneurons are located in the posteroventral cochlear nucleus: A kainic acid lesion study in guinea pigs. Journal of Comparative Neurology. 487 (4), 345-360 (2005).
  40. Darrow, K. N., Benson, T. E., Brown, M. C. Planar multipolar cells in the cochlear nucleus project to medial olivocochlear neurons in mouse. Journal of Comparative Neurology. 520 (7), 1365-1375 (2012).
  41. Brown, M. C., De Venecia, R. K., Guinan, J. J. Responses of medial olivocochlear neurons: Specifying the central pathways of the medial olivocochlear reflex. Experimental Brain Research. 153 (4), 491-498 (2003).
  42. Wang, Y., Manis, P. B. Synaptic transmission at the cochlear nucleus endbulb synapse during age-related hearing loss in mice. Journal of Neurophysiology. 94 (3), 1814-1824 (2005).
  43. Golding, N. L., Robertson, D., Oertel, D. Recordings from slices indicate that octopus cells of the cochlear nucleus detect coincident firing of auditory nerve fibers with temporal precision. Journal of Neuroscience. 15 (4), 3138-3153 (1995).
  44. Ferragamo, M. J., Golding, N. L., Oertel, D. Synaptic inputs to stellate cells in the ventral cochlear nucleus. Journal of Neurophysiology. 79 (1), 51-63 (1998).
  45. Oertel, D. Synaptic responses and electrical properties of cells in brain slices of the mouse anteroventral cochlear nucleus. Journal of Neuroscience. 3 (10), 2043-2053 (1983).
  46. Xie, R., Manis, P. B. Radiate and planar multipolar neurons of the mouse anteroventral cochlear nucleus: Intrinsic excitability and characterization of their auditory nerve input. Frontiers in Neural Circuits. 11, 1-17 (2017).
  47. Wu, S., Oertel, D. Inhibitory circuitry in the ventral cochlear nucleus is probably mediated by glycine. The Journal of Neuroscience. 6 (9), 2691-2706 (1986).
  48. Xie, R., Manis, P. B. Target-specific IPSC kinetics promote temporal processing in auditory parallel pathways. Journal of Neuroscience. 33 (4), 1598-1614 (2013).
  49. Wickesberg, R. E., Oertel, D. Delayed, frequency-specific inhibition in the cochlear nuclei of mice: A mechanism for monaural echo suppression. Journal of Neuroscience. 10 (6), 1762-1768 (1990).
  50. Campagnola, L., Manis, P. B. A map of functional synaptic connectivity in the mouse anteroventral cochlear nucleus. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2214-2230 (2014).
  51. Doucet, J. R., Ryugo, D. K. Projections from the ventral cochlear nucleus to the dorsal cochlear nucleus in rats. Journal of Comparative Neurology. 385 (2), 245-264 (1997).
  52. Kopp-Scheinpflug, C., et al. The sound of silence: Ionic mechanisms encoding sound termination. Neuron. 71 (5), 911-925 (2011).
  53. Alamilla, J., Gillespie, D. C. Maturation of Calcium-Dependent GABA, Glycine, and Glutamate Release in the Glycinergic MNTB-LSO Pathway. PLoS One. 8 (9), 0075688 (2013).
  54. Spangler, K. M., Warr, W. B., Henkel, C. K. The projections of principal cells of the medial nucleus of the trapezoid body in the cat. Journal of Comparative Neurology. 238 (3), 249-262 (1985).
  55. Kramer, F., et al. Inhibitory glycinergic neurotransmission in the mammalian auditory brainstem upon prolonged stimulation: Short-term plasticity and synaptic reliability. Frontiers in Neural Circuits. 8, 1-22 (2014).
  56. Roberts, M. T., Seeman, S. C., Golding, N. L. The relative contributions of MNTB and LNTB neurons to inhibition in the medial superior olive assessed through single and paired recordings. Frontiers in Neural Circuits. 8, 1-14 (2014).
  57. Torres Cadenas, L., Fischl, M. J., Weisz, C. J. C. Synaptic Inhibition of Medial Olivocochlear Efferent Neurons by Neurons of the Medial Nucleus of the Trapezoid Body. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 40 (3), 509-525 (2020).
  58. Brown, M. C., Mukerji, S., Drottar, M., Windsor, A. M., Lee, D. J. Identification of inputs to olivocochlear neurons using transneuronal labeling with pseudorabies virus (PRV). JARO - Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 14 (5), 703-717 (2013).
  59. Morest, D. K. The collateral system of the medial nucleus of the trapezoid body of the cat, its neuronal architecture and relation to the olivo-cochlear bundle. Brain Research. 9 (2), 288-311 (1968).
  60. Warr, B. W. Fiber degeneration following lesions in the multipolar and globular cell areas in the ventral cochlear nucleus of the cat. Brain Research. 40 (2), 247-270 (1972).
  61. Osen, K. K. Cytoarchitecture of the cochlear nuclei in the cat. Journal of Comparative Neurology. 136 (4), 453-483 (1969).
  62. Cant, N. B., Morest, D. K. The bushy cells in the anteroventral cochlear nucleus of the cat. A study with the electron microscope. Neuroscience. 4 (12), 1925-1945 (1979).
  63. Cant, N. B., Morest, D. K. Organization of the neurons in the anterior division of the anteroventral cochlear nucleus of the cat. Light-microscopic observations. Neuroscience. 4 (12), 1909-1923 (1979).
  64. Lauer, A. M., Connelly, C. J., Graham, H., Ryugo, D. K. Morphological Characterization of Bushy Cells and Their Inputs in the Laboratory Mouse (Mus musculus) Anteroventral Cochlear Nucleus. PLoS One. 8 (8), 1-16 (2013).
  65. Harrison, J. M., Warr, W. B. A study of the cochlear nuclei and ascending auditory pathways of the medulla. Journal of Comparative Neurology. 119 (3), 341-379 (1962).
  66. Robertson, D., Gummer, M. Physiological and morphological characterization of efferent neurones in the guinea pig cochlea. Hearing Research. 20 (1), 63-77 (1985).
  67. Bledsoe, S. C., et al. Ventral cochlear nucleus responses to contralateral sound are mediated by commissural and olivocochlear pathways. Journal of Neurophysiology. 102 (2), 886-900 (2009).
  68. Zhou, J., Zeng, C., Cui, Y., Shore, S. Vesicular glutamate transporter 2 is associated with the cochlear nucleus commissural pathway. JARO - Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 11 (4), 675-687 (2010).
  69. Kuenzel, T. Modulatory influences on time-coding neurons in the ventral cochlear nucleus. Hearing Research. 384, 107824 (2019).
  70. Cant, N. B., Gaston, K. C. Pathways connecting the right and left cochlear nuclei. Journal of Comparative Neurology. 212 (3), 313-326 (1982).
  71. Feliciano, M., Saldana, E., Mugnaini, E. Direct projections from the rat primary auditory neocortex to nucleus sagulum, paralemniscal regions, superior olivary complex and cochlear nuclei. Auditory Neuroscience. 1 (3), 287-308 (1995).
  72. Mulders, W. H. A. M., Robertson, D. Evidence for direct cortical innervation of medial olivocochlear neurones in rats. Hearing Research. 144 (1-2), 65-72 (2000).
  73. Schofield, B. R., Coomes, D. L. Pathways from auditory cortex to the cochlear nucleus in guinea pigs. Hearing Research. 216-217 (1-2), 81-89 (2006).
  74. Meltzer, N. E., Ryugo, D. K. Projections from auditory cortex to cochlear nucleus: A comparative analysis of rat and mouse. Anatomical Record - Part A Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 288 (4), 397-408 (2006).
  75. Schofield, B. R., Cant, N. B. Descending auditory pathways: Projections from the inferior colliculus contact superior olivary cells that project bilaterally to the cochlear nuclei. Journal of Comparative Neurology. 409 (2), 210-223 (1999).
  76. Thompson, A. M., Schofield, B. R. Afferent projections of the superior olivary complex. Microscopy Research and Technique. 51 (4), 330-354 (2000).
  77. Woods, C. I., Azeredo, W. J. Noradrenergic and serotonergic projections to the superior olive: Potential for modulation of olivocochlear neurons. Brain Research. 836 (1-2), 9-18 (1999).
  78. Mulders, W. H. A. M., Robertson, D. Morphological relationships of peptidergic and noradrenergic nerve terminals to olivocochlear neurones in the rat. Hearing Research. 144 (1-2), 53-64 (2000).
  79. Thompson, A. M., Thompson, G. C. Light microscopic evidence of serotoninergic projections to olivocochlear neurons in the bush baby (Otolemur garnettii). Brain Research. 695 (2), 263-266 (1995).
  80. Wang, X., Robertson, D. Substance P-induced inward current in identified auditory efferent neurons in rat brain stem slices. Journal of Neurophysiology. 80 (1), 218-229 (1998).
  81. Taberner, A. M., Liberman, M. C. Response properties of single auditory nerve fibers in the mouse. Journal of Neurophysiology. 93 (1), 557-569 (2005).
  82. Galambos, R., Davis, H. The response of single auditory-nerve stimulation. Journal of Neurophysiology. 6 (1), 39-57 (1943).
  83. Sachs, M. B., Abbas, P. J. Rate versus level functions for auditory-nerve fibers in cats: Tone-burst stimuli. Journal of the Acoustical Society of America. 56 (6), 1835-1847 (1974).
  84. Zhang, X., Heinz, M. G., Bruce, I. C., Carney, L. H. A phenomenological model for the responses of auditory-nerve fibers: I. Nonlinear tuning with compression and suppression. The Journal of the Acoustical Society of America. 109 (2), 648-670 (2001).
  85. Zilany, M. S. A., Bruce, I. C., Carney, L. H. Updated parameters and expanded simulation options for a model of the auditory periphery. The Journal of the Acoustical Society of America. 135 (1), 283-286 (2014).
  86. Franken, T. P., Smith, P. H., Joris, P. X. In vivo whole-cell recordings combined with electron microscopy reveal unexpected morphological and physiological properties in the lateral nucleus of the trapezoid body in the auditory brainstem. Frontiers in Neural Circuits. 10, 1-20 (2016).

Tags

Нейронаука выпуск 162 медиальные оливокохлеарный нейроны электрофизиология в пробирке синаптическая интеграция слуховой нерв слуховой ствол мозга кохлеарное ядро ингибирующая нейротрансмиссия
In Vitro Клин Фрагмент Подготовка для имитации In Vivo Нейрональной цепи подключения
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fischl, M. J., Weisz, C. J. C. In… More

Fischl, M. J., Weisz, C. J. C. In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity. J. Vis. Exp. (162), e61664, doi:10.3791/61664 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter