Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

In Vitro Kama Dilimi In Vivo Nöronal Devre Bağlantısı Nın TaklitI Için Hazırlık

Published: August 18, 2020 doi: 10.3791/61664
Automatic Translation
1, 1
1Section on Neuronal Circuitry, National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, NIH

Summary

Nöronlar için çeşitli sinaptik girdilerin entegrasyonu en iyi doğal zamanlama ve devre plastisite için tüm pre-sinaptik çekirdekleri koruyan bir hazırlık ölçülür, ancak beyin dilimleri genellikle birçok bağlantıları sever. In vitro deney yeteneğini korurken in vivo devre aktivitesini taklit etmek için değiştirilmiş bir beyin dilimi geliştirdik.

Abstract

In vitro dilim elektrofizyoloji teknikleri hassas elektriksel ve zamansal çözünürlük ile tek hücreli aktiviteölçmek. Beyin dilimleri düzgün görselleştirmek ve yama-kelepçeleme veya görüntüleme için nöronlar erişmek için nispeten ince olmalıdır, ve beyin devrelerinin in vitro muayene sadece fiziksel olarak akut dilim mevcut ne sınırlıdır. Presinaptik çekirdeklerin daha büyük bir kısmını korurken in vitro dilim denemenin faydalarını korumak için yeni bir dilim hazırlığı geliştirdik. Bu "kama dilimi" beyin sapındaki medial olivocochlear (MOC) nöronlara çeşitli monaural, ses odaklı girdileri karakterize etmek için yama-kelepçe elektrofizyoloji kayıtları için tasarlanmıştır. Bu nöronlar kontralateral kulak ve buna karşılık gelen koklear çekirdek (CN) uyaranlarla aktive nöronlardan birincil afferent uyarıcı ve inhibitör girdileri alırsınız. Asimetrik bir beyin dilimi, bir yarımkürenin lateral kenarında ki rostro-kaudal etki alanında en kalın olan ve daha sonra karşı yarımkürenin lateral kenarına doğru incelen tasarlanmıştır. Bu dilim içerir, kalın tarafında, işitsel sinir kökü beyne işitsel uyaranlar hakkında bilgi iletiyor, içsel CN devre, ve hem disynaptic uyarıcı ve trisinaptik inhibitör arayolları kontralateral MOC nöronlar üzerinde yakınsama. Kayıt, dilimin ince tarafındaki MOC nöronlarından gerçekleştirilir ve burada tipik yama-kıskaç deneyleri için DIC optikleri kullanılarak görselleştirilir. İşitsel sinirin doğrudan uyarılması, işitsel beyin sapına girerken yapılır, içsel CN devre aktivitesi ve sinaptik plastisite için MOC nöronların sinapsupstream meydana izin. Bu teknikle in vivo devre aktivasyonunu dilim içinde mümkün olduğunca yakından taklit edebilirsiniz. Bu kama dilimi hazırlığı, devre analizlerinin in vitro dilim fizyolojisinin teknik avantajlarıyla birlikte yukarı akım bağlantısının ve uzun menzilli girdilerin korunmasından yararlanacağı diğer beyin devreleri için geçerlidir.

Introduction

Nöral devrelerin aktivitesinin gözlemi ideal olarak doğal duyusal girişler ve geri bildirimler ile gerçekleştirilir, ve beyin bölgeleri arasında sağlam bağlantı, in vivo. Ancak, nöral devre fonksiyonunun tek hücreli çözünürlüğü veren deneylerin gerçekleştirilmesi, bozulmamış beyindeki teknik zorluklarla sınırlıdır. In vivo hücre dışı elektrofizyoloji veya multifoton görüntüleme yöntemleri bozulmamış sinir sistemlerindeki aktiviteyi araştırmak için kullanılabilirken, farklı girdilerin nasıl entegre olduğunu yorumlamak veya eşik altı sinaptik girdileri ölçmek zor olmaya devam etmektedir. In vivo bütün hücre kayıtları bu sınırlamaların üstesinden gelmek ama gerçekleştirmek için zor, kolayca erişilebilen beyin bölgelerinde bile. Tek hücreli çözümlü deneylerin teknik zorlukları, beynin derinliklerinde bulunan bazı nöron popülasyonlarında veya canlı hücreleri bulmak için genetik araçlar gerektiren mekansal olarak dağınık popülasyonlarda (örn. optrode kaydı yla eşleştirilmiş kanaloidofinin genetik ekspresyonu) veya site etiketlemesinden sonra post-hoc histokimyasal tanımlamada (örn. nörotransmisyona özgü belirteçlerle) daha da artırılır. Beyin sapı ventral yüzeyine yakın diffüz bulunan olmak, medial olivocochlear (MOC) nöronlar yukarıdaki sınırlamalar muzdarip1, onları in vivo deney için erişim son derece zor hale.

Beyin dilimleri (~ 100-500 μm kalınlığı) uzun beyin devreleri çalışmak için kullanılmıştır, işitsel beyin sapı devredahil, aynı dilim içinde bulunan bağlı nöronların fiziksel ayrımı nedeniyle2,3,4,5,6,7,8,9. Çok daha kalın dilimler (>1 mm) kullanarak deneyler, ikili girdilerin medial superior zeytin10,11dahil olmak üzere üstün olivary kompleksi (SOC) alanlarında nasıl entegre olduğunu anlamak için diğer laboratuvarlarda kullanılmıştır. Bu dilimler, işitsel sinirin aksonlari (AN) dilim içinde bozulmadan kaldı ve cn sinaptik nörotransmitter salınımını başlatmak için elektriksel olarak uyarıldı, ilk derecede işitsel nöronların aktivitesini taklit olarak sese tepki verecekti. Bu kalın dilimlerin en büyük dezavantajlarından biri yama-kelepçe elektrofizyolojik kayıtlar ("yama") için nöronların görünürlüğüdür. Bu alanda çok sayıda akson yaş 12 ile miyelinated hale olarak Patching giderek daha zor halegelir13,14,15, doku optik yoğun hale ve tipik bir, ince beyin dilimi bile nöronlar gizleme. Amacımız in vivo kayıtların devre bağlantısına daha çok benzeyen, ancak beyin dilimlerinde görsel güdümlü yama-kelepçe elektrofizyolojisinin yüksek verim ve yüksek çözünürlüklü kayıt yetenekleriyle in vitro preparatlar oluşturmaktır.

Laboratuvarımız, MOC nöronları da dahil olmak üzere işitsel efferent sistemin nöronların fizyolojisini araştırır. Bu kolinerjik nöronlar dış saç hücrelerinin aktivitesini modüle ederek koklea efferent geribildirim sağlamak (OHCs)16,17,18,19,20. Önceki çalışmalar da bu modülasyon koklea21,22,23,24,25,26 ve akustik travma27,28,29,30,31,32,33de kazanım kontrolü bir rol oynadığını göstermiştir . Farelerde, MOC nöronlar diffüz yamuk vücudun ventral çekirdeğinde yer almaktadır (VNTB) işitsel beyin sapı1. Grubumuz epifloresan aydınlatma altında beyin sapı dilimleri MOC nöronlar hedef tdTomato muhabiri fare hattı ile geçti ChAT-IRES-Cre fare hattı kullanmıştır. Biz MOC nöronlar trapez vücudun ipsilateral medial çekirdeğinden afferent inhibitör girdi almak gösterdi (MNTB), hangi heyecanlı, sırayla, küresel gür hücrelerden akson tarafından (GBC) kontralateral koklear çekirdeği (CN)34,35,36,37,38. Ayrıca, MOC nöronlar büyük olasılıkla kontralateral CN39,40,41T-stellat hücrelerinden uyarıcı giriş alırsınız. Birlikte ele alındığında, bu çalışmalar MOC nöronlar aynı (kontralateral) kulak tan türetilen hem uyarıcı ve inhibitör girdileri almak göstermektedir. Ancak, presinaptik nöronlar, ve MOC nöronlar üzerinde yakınsama aksonları, oldukça tipik bir koronal dilim hazırlanmasında tam olarak bozulmamış olması için birbirlerine yeterince yakın değildir. Sinaptik girdilerin MOC nöronlarına entegrasyonunun eylem potansiyeli ateşleme kalıplarını nasıl etkilediğini araştırmak için, yeni tanımlanan inhibisyona odaklanarak, bir kulaktan MOC nöronlarına kadar olan çeşitli afferentleri fizyolojik olarak en gerçekçi şekilde uyarabileceğimiz, ancak in vitro beyin dilimi deneylerinin teknik yararları ile birlikte bir hazırlık geliştirdik.

Kama dilimi, MOC nöronlarında devre entegrasyonunun araştırılması için tasarlanmış değiştirilmiş kalın bir dilim hazırlığıdır (Şekil 1A'daşematize). Dilimin kalın tarafında, kama işitsel sinir kopmuş aksonlar içerir (bundan sonra "işitsel sinir kökü" olarak adlandırılır) onlar CN çevre ve sinaps gelen beyin sapı girerken. İşitsel sinir kökü elektriksel nörotransmitter salınımı ve tamamen bozulmamış CN hücrelerinin sinaptik aktivasyon uyandırmak için uyarılmış olabilir42,43,44,45,46. Bu stimülasyon biçimi devre analizi için çeşitli faydaları vardır. İlk olarak, MOC nöronlarına afferent girdi sağlayan T-stellat ve GBC aksonları doğrudan uyarmak yerine, CN'de bol miktarda bulunan içsel devrelerin aktivasyonuna izin vermek için AN'yi uyarıyoruz. Bu devreler beyin boyunca hedeflerine CN nöronların çıkış modüle, MOC nöronlar dahil46,47,48,49,50,51. İkinci olarak, AN'den MOC nöronlarının CN upstream'ine kadar olan afferent devrelerin polisinetik aktivasyonu, işitsel stimülasyon sırasında in vivo olduğu gibi daha doğal aktivasyon zamanlaması na ve plastisitenin bu sinapslarda oluşmasına olanak sağlar. Üçüncü olarak, an aktivitesini taklit etmek için stimülasyon kalıplarımızı değiştirebiliriz. Son olarak, MOC nöronlar için hem uyarıcı ve inhibitör monaural projeksiyonlar kama dilim bozulmamış, ve bunların entegrasyonu yama-kelepçe elektrofizyoloji hassasiyeti ile bir MOC nöron ölçülebilir. Bir bütün olarak, bu aktivasyon şeması tipik bir beyin dilimi hazırlık ile karşılaştırıldığında MOC nöronlar için daha sağlam bir devre sağlar. Bu beyin sapı kama dilimi de lateral superior zeytin, üstün oliyum çekirdeği ve medial üstün zeytin10, 11,52,53,54,55,56dahil olmak üzere ipsilateral MNTB inhibitör girdi almak diğer işitsel alanları araştırmak için kullanılabilir. Bizim özel hazırlık ötesinde, bu dilimleme yöntemi kullanılabilir veya uzun menzilli girdilerin bağlantı bakımı ve tek hücreli çözünürlükte elektrofizyoloji veya görüntüleme teknikleri çeşitli nöronların görselleştirme iyileştirilmesi yararları ile diğer sistemleri değerlendirmek için değiştirilebilir.

Bu protokol yaklaşık 15 ° yatırılabilir bir vibratom sahne veya platform kullanımını gerektirir. Burada "sahne" bir içbükey manyetik "sahne tabanı yerleştirilir kavisli bir alt ile metal bir disk olduğu bir ticari olarak kullanılabilir 2 parçalı manyetik sahne kullanın." Daha sonra dilim açısını ayarlamak için aşama kaydırılabilir. Sahne tabanındaki eşmerkezli daireler açıyı tekrarlı olarak tahmin etmek için kullanılır. Sahne ve sahne tabanı dilimleme odasına yerleştirilir, burada manyetik sahne tabanı da döndürülebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm deneysel prosedürler Ulusal Nörolojik Bozukluklar Enstitüsü ve İnme/Ulusal Sağırlık ve Diğer İletişim Bozuklukları Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi Tarafından onaylandı.

1. Deneysel preparatlar

NOT: Dilimleme çözeltisi, dilimleme sıcaklığı, dilim kuluçka sıcaklığı ve aparatlar (vb.) dahil olmak üzere dilim hazırlama ile ilgili ayrıntılar bu deneyde yapılan beyin sapı hazırlığı için özeldir. Dilim kuluçka detayları laboratuvar deneyimi başına değiştirilebilir.

  1. Yama bağlama için dahili çözümler hazırlayın.
    1. (mM' de) 76 Cs-methanesulfonat, 56 CsCl, 1 MgCl2,1 CaCl2,10 HEPES, 10 EGTA, 0.3 Na-GTP, 2 Mg-ATP, 5 Na2-fosfokreatin, 5 QX-314 ve 0.01 Alexa Flor-48 8 hidraziti içeren voltaj kelepçesi çözeltisi hazırlayın. CsOH ile pH'ı 7.2'ye ayarlayın.
    2. (mM) 125 K-glukonat, 5 KCl, 1 MgCl2,0.1 CaCl2,10 HEPES, 1 EGTA, 0.3 Na-GTP, 2 Mg-ATP, 1 Na2-fosfokreatin ve 0.01 Alexa Fluor-488 hidraziyonu içeren akım kelepçe çözeltisi hazırlayın. KOH ile pH'ı 7.2'ye ayarlayın.
  2. 100 mL sıcak (kaynamaya yakın) suya 4 g agar ekleyerek %4 agar 100 mL hazırlayın. Isıtılmış karıştırın plaka üzerine yerleştirin sıcaklığını korumak ve tamamen eriyene kadar karıştırın. Yaklaşık 1 cm derinliğe 100 mm plastik Petri kapları dökün ve soğumaya bırakın. İhtiyaç duyulana kadar buzdolabında bekletin.
  3. Hazırlamak 1 L yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) mM içeren: 124 NaCl, 1.2 CaCl2, 1.3 MgSO4, 5 KCl, 26 NaHCO3, 1.25 KH2PO4, ve 10 dekstroz. En az 10 dakika karbogen (%5 CO2 / %95 O2)ile kabarcık, sonra gerekirse 1 M NaOH ile 7,4 için son pH ayarlayın. Deney boyunca karbogen ile sürekli köpürerek çözeltinin oksijenasyonunu ve pH'ını koruyun.
  4. ACSF'ye 1 mM kynurenic asit ekleyerek 200 mL dilimleme çözeltisi hazırlayın. Kinenik asit eriyene kadar 10 dakika boyunca sonicating su banyosunda sonicate çözeltisi. Sürekli karbogen ve buz üzerinde yer ile kabarcık.
    DİkKAT: Kinenik asit kullanırken uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın.
  5. Üreticinin talimatlarına uygun bir bıçağı vibratome monte edin. Buz ile çevreleyerek chill vibratom dilimleme odası.

2. Stimülasyon için sağlam işitsel sinir kökü ile beyin kaldırma

NOT: Bu deneyler için fareler, C57BL/6J arka plan üzerinde ChAT-IRES-Cre transgenik farelerin tdTomato muhabiri fareler (Ai14) ile geçerek elde edilmiştir. Histoloji ve elektrofizyoloji için kullanılan fareler, farelerde P12 civarında olan işitme sonrası başlangıçlı (P14-P23) idi. Yamuk vücudun ventral çekirdeğinde tdTomato ifade nöronlar (VNTB) daha önce bu fare hattı MOC nöronlar olarak karakterize edilmiştir57.

  1. Ötenazi (örneğin, CO2 boğulma) ve onaylanmış kurumsal prosedürleri kullanarak hayvanın kafasını kesmek.
  2. Bir jilet kullanarak, burundan boynun arkasına kafatasının orta ucundaki deriyi kesin. Kafatasını ortaya çıkarmak için derisini soy.
  3. Küçük makas kullanarak, kafatasının tabanından başlayarak (omurilik yakın kaudal uç) ve burun doğru devam orta hat üzerinden kafatasında bir kesi yapmak.
  4. Lambda sütür de, orta hattan kafatasında kesikler yapmak, her iki tarafta kulak doğru yanal. Beyni ortaya çıkarmak için kafatasını soy.
  5. Rostral ucundan başlayarak, yavaşça küçük bir laboratuvar spatula veya künt forseps ile kafatası ndan beyin kaldırın. Optik sinir ivedi ve yavaşça geriye doğru beyin çalışmaya devam, ventral yüzey açığa.
  6. Beyin sapının ventral yüzeyine yakın ince forceps ile çimdikleyerek trigeminal sinirleri kesin.
    NOT: Vestibulocochlear sinir hemen altında yatıyor ve nihai stimülasyon için bozulmamış olması gerekir gibi dikkatle bunu yapın.
  7. Soğuk dilimleme çözeltisi ile dolu bir cam Petri kabına hazırlık yerleştirin. Bir kesme mikroskobu altında çanak yerleştirin. Yavaşça carbogen ile kabarcık.
  8. Yüz sinirini beyin sapına yakın kırpın ve vestibulocochlear siniri ortaya çıkar.
  9. İnce forseps kullanarak, vestibulocochlear sinir mümkün olduğunca kafatası çıkar ve onu kesmek için sinir çimdik, beyin sapı bağlı sinir kökü bırakarak foramina içine ipuçlarıit. Bunu diğer tarafta tekrarlayın.
  10. Bir kez her iki sinir kökleri serbest, menineler ve yamuk vücut yakınındaki beyin sapı ventral yüzeyinden vaskülatür kaldırın.
  11. Kalan kranial sinirleri ve mümkünse kalan omuriliği korumak için dikkat bağlanan bağ dokusunu çimdikleyerek beyni kafatasından tamamen kurtarın.

3. Blok ve sahnede beyin monte (manyetik disk)

  1. Optik kiazma düzeyinde beyin engelleyerek sahneye düzeltmek için beyin yüzeyini hazırlayın.
    1. Ventral yüzey yukarı ile, yavaşça beyin aşağıdaki adım sırasında eğim yok, böylece omurilik hareketsiz leştirmek için künt bir araç kullanarak beyin stabilize.
    2. Optik kiazma düzeyinde, çanak altına aşağı beyin yoluyla ekleyerek beyin engelleme için düzlem oluşturmak için açık forseps kullanın. Uçların beyin kaudalinin dorsal yüzeyinden optik kiazma çıkması için uçları dikeyden yaklaşık 20° bir açıyla yerleştirin.
    3. Jilet kullanarak forceps boyunca kesin.
  2. Beyni sahnenin yüzeyine yapıştır.
    1. Beyni desteklemek için %4 agarlık küçük bir blok (~1 cm3)hazırlayın.
    2. Sahnede tutkal küçük bir damla yerleştirin ve hem beyin ve agar blok aşağı yapıştırılmış olabilir, böylece bir dikdörtgen içine yayıldı.
    3. Forseps kullanarak, dikkatle beyin kaldırın ve nazikçe bir kağıt havlu kenarı kullanarak aşırı sıvı dab. Tutkal üzerine bloke yüzey yerleştirin, ventral yüzey dilimleme sırasında bıçak doğru olacaktır.
    4. Agar bloğunu, dilimleme sırasında desteklemek ve uygun beyin konumlandırmasını sağlamak için beynin sırt yüzeyine hafifçe bastırın (yani açı).

4. Dilim beyin kama dilimi oluşturmak için

NOT: Kalın tarafında koklear sinir kökü ve medial olivokoklear (MOC) nöronlar ve ince tarafta trapez cisim (MNTB) medial çekirdeği olan vibratom kullanarak bir beyin dilimi hazırlayın.

  1. Manyetik diski bağlı beyinli bir şekilde sahne tabanına yerleştirin ve bıçağın mendil yüzeyi ile dilimleme odasına yerleştirin.
  2. Buz soğuk dilimleme çözeltisi ve karbogen ile kabarcık ile oda doldurun.
  3. Bıçağı çözeltinin içine indirin ve dilimlerin simetrik olduğundan emin olmak için ilgi çeken bölgeye dilimler kesin. Dilimler asimetrik görünüyorsa, simetri elde etmek için sahneyi hafifçe yatırın.
    NOT: 0.05-0.10 mm/s arasındaki bıçak hızları sağlıklı dilimlerin kesilmesinde etkili olup hayvan yaşına ve beyin bölgesine bağlı olarak değişiklik gösterebilir.
  4. Dilimler simetrik olduktan sonra, sahneyi ~15° (sahne tabanında yaklaşık 3 eşmerkezli halkaya karşılık gelen) bir tarafa kaydırın.
    NOT: Aşamayı dilimde korumak istediğiniz işitsel sinir kökünden uzaklaştırın.
  5. İşitsel sinir kökü bir tarafta yüzeye yakın olana kadar dikkatlice dilimleme devam, ve yüz sinir diğer tarafta yüzeyinde görülebilir.
  6. Sahneyi 15° geriye, orijinal konuma kaydırın.
  7. Bıçağı dokudan uzaklaştırın ve sahne tabanını 90° döndürün, böylece ince tarafın yanal kenarı bıçakla karşı karşıya dır. Bıçağı birkaç yüz mikron indirin ve bıçağı yavaşça dokunun kenarına yaklaştırın. Bıçak lateral kenarına değene kadar bunu tekrarlayın. Bıçağı dilimin ince kenarının istenilen kalınlığına indirin, burada iki yüz mikron daha.
    NOT: Elde edilen dilim ideal ~ 300 mm kalınlığında yamuk vücut ventral çekirdeği düzeyinde (VNTB) yama sıkma gerçekleşecek tarafında.
  8. Bıçağı dokudan geri hareket ettirin ve sahne tabanını geri döndürün, böylece ventral yüzey ona bakacak.
  9. Kama diliminin rostral yüzeyini belirleyen kesimi yapın. Dilimi bir arayüz kağıdına (1 cm2) kaudal yüzeye aktarın. Dilimi kuluçka odasına veya kurtarma için uygun diğer kuluçka cihazlarına taşıyın (35 °C'de 30 dk).
    NOT: Yüz siniri, dilimin her iki hemisferinde rostral yüzeyde görülmelidir (Bkz. Şekil 1B).

5. Elektrofizyoloji kurulumu ve kaydı

  1. Kama dilimini kayıt odasına yerleştirin ve bir arp veya sabitleme sistemi yle sabit dilim. 7-10 mL/dk hızla karbogen ile kabarmış sıcak (35 °C) ACSF ile sürekli olarak dokuyu perfüzyon.
  2. Yama kelepçesi kayıtları için 561 nm emisyon filtresi ile epifloresans kullanarak VNTB'de genetik olarak etiketlenmiş MOC nöronlarını tanımlayın. Yama lanabilir hücre yoksa dilim çevirin.
  3. DIC optik kullanarak, dilimin kalın tarafında işitsel sinir kökü odaklanmak ve bipolar tungsten uyarıcı elektrot aşağı işitsel sinir kökü ve yavaşça doku yüzeyine taşımak için bir mikromanipülatör kullanın.
    NOT: Emme elektrotları diğer laboratuvarlarda işitsel sinir stimülasyon deneylerinde kullanılmıştır. Teta cam elektrotlar, ya da optik stimülasyon yöntemleri diğer özel preparatlar için varsa uygulanabilir.
  4. Yama kıskaç elektrofizyolojisi için hedef bir MOC nöron seçmek için VNTB geri görüş alanı taşıyın.
  5. Bir kayıt pipetini önerilen deneme için uygun dahili çözümle doldurun.
  6. Tüm hücre konfigürasyonunda MOC nöronundan yama ve kayıt. Gerekirse membran kapasitansını ve seri direncini dengeler.
  7. MOC nöron tutarlı postsinaptik olaylar elde etmek için işitsel sinir kökünün elektriksel stimülasyon genliğini ayarlayın.
    NOT: Stimülasyon elektrotunu hareket ettirmek gerekebilir.
  8. MOC (voltaj kıskacı) veya etki potansiyel desenleri (akım kelepçesi) uyarılmış sinaptik akımları gözlemlemek için uygun stimülasyon protokolleri çalıştırın.
    NOT: Kama dilimi hazırlama gevşek yama kayıtları, farmakoloji, optogenetik, kalsiyum görüntüleme, nörotransmitter uncaging, vb gibi herhangi bir tipik yama-kelepçe araçları ile kullanılabilir.

6. Beyin sapı çekirdeklerinin histolojik teyidi

NOT: Bu sabit, yeniden kesitli kama dilim, cresyl menekşe boyama ile yapılır. Bu yöntem, dilimde bulunan çekirdeklerin görselleştirilmesine olanak sağlar.

  1. Bir kama dilimi hazırladıktan sonra, bir gecede dilimin fiksatife batırılmış (PBS'de %4'ü PFA). PBS 10 dakika (bir shaker üzerinde oda sıcaklığında) için dilim 3x durulayın, sonra kriyokoruma kıvrak 4 ° C'de bir gecede PBS% 30 sakaroz yerleştirin.
  2. Dilimi dondurucu bir mikrotom (40-70 mm) üzerine yeniden bölve PBS'de 24 kuyuplakasında seri bölümler toplayın.
  3. Jelatin kaplı slaytlar üzerine montaj bölümleri ve tamamen kurumasını bekleyin. Slaytları slayt taşımaya yerleştirin.
  4. Cresyl menekşe solüsyonları hazırlayın
    1. 500 mL dH2O'da 5 g cresyl violet asetat karıştırarak %1 krem menekşe asetat hazırlayın
    2. İlk olarak 90 mL çözelti A (540 mL buzul asetik asit + 89,46 mL dH2O) ve 10 mL çözelti B (10 mL dH2O'da 136 mg sodyum asetat) hazırlayarak asetat tamponu hazırlayın. A solüsyonu A ve b çözeltisini birleştirerek asetat arabelleği verir.
    3. Asetat tampon% 0.5 krem menekşe için asetat tampon 1:1 ile% 1 tere mor asetat birleştirin. Kullanmadan önce filtreuygulayın.
    4. Uygun dH2O hacimleri ile %100 etanol seyrelterek %95 ve %70 etanol hazırlayın
  5. Terezil menekşe boyama protokolü uygulayın. Slayt taşıyıcısını çözelti tepsileri arasında taşıyın, fazla çözeltiyi tepsiler arasında kağıt havlu üzerinde lekeleyin: ksilen – 5 dk; %95 etanol – 3 dk; %70 etanol – 3 dk; dH2O – 3 dk; % 0.5 krem menekşe çözeltisi – nükleer boyama koyu mor hale dönene kadar sık sık 8-14 dk izleme; dH2O – 3 dk; %70 etanol – 3 dk; %95 etanol – 1-2 dk; % 100 etanol - iki kez slaytlar daldırma; ksilen – 5 dk; ksilen: montaj yapılana kadar 25 dk.
    DİkKAT: Sadece bir duman başlık altında ksilenes kullanın.
  6. Slaytları teker teker ksilenden çıkarın ve hemen montaj ortamını kullanarak slaytlara kapak fişleri yerleştirin. Montaj ortamının kurumasını bekleyin (bir gecede).
  7. Görüntü bölümleri.

7. Canlı, sabitlenmemiş dokuda aksonun anterograd takibi için biyositin etiketleme

  1. Yukarıdaki gibi bir kama dilimi hazırlayın (Adımlar 2-4).
  2. Dilimi arayüz kağıdına aktarın (~1 cm2). Bir kesme mikroskobu altında, dilimin kalın tarafında CN yerini.
  3. ACSF'yi dokudan uzaklaştırmak için bir kağıt mendil ini bükerek dilimin çevresindeki alandaki fazla ACSF'yi dikkatlice çıkarın. Bu cn dışında hücrelere alımına yol açabilir dilimin çevre bölgelerine yayılmasını biyositin önler.
  4. İnce çerkediklerle, küçük bir biyositin kristali seçin ve CN'nin yüzeyine yerleştirin. Nazikçe nöronların temas ve somata içine sonraki alımı teşvik etmek için doku içine kristal basın. Bu durumda T-stellat ve GBC nöronlar içeren CN bölgeleri, ilgi istenilen bölgeyi kapsayacak şekilde bu adımı tekrarlayın.
  5. Dilimi kuluçka odasına yerleştirin. Biyositin alımı ve taşınması için dilimin 35 °C'de 2-4 saat kuluçkaya yatırmasını bekleyin. Kuluçkadan sonra, herhangi bir biyosit inparçacıklarını çıkarmak için acsf dilim durulamak.
  6. Bir gecede dilimi fiksatife (PBS'de %4 PFA) yerleştirin. PBS 10 dakika için 3x durula.
  7. 4 °C'de veya dilim batana kadar PBS'de %30 sakarozda kriyokoruma dilimi.
  8. 70-100 mm dondurucu bir mikrotom üzerinde enine kesitler üretmek için dokuyu rezeksiyon.
  9. Bir floresan konjuge streptavidin ile standart immünohistokimyasal yöntemler kullanarak doku süreci.
    NOT: Presinaptik hücre cisimlerinin, aksonlarin, reseptörlerin veya devre görselleştirmesi için önemli olan diğer sinaptik moleküllerin etiketlenmesinde yardımcı olunması durumunda bölümlere ek immünohistokimya yapılabilir (örn. primer antikor basamakları biyositin sekonder görüntülemesini olumsuz etkilememelidir).
  10. Dokuyu görüntüle.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kama diliminin histolojik incelemesi
İşitsel beyin sapı nöron fonksiyonunun araştırılması için, kama dilimi hazırlığı, kayıtlar için hedeflenen MOC nöronların işitsel sinir kökü ve CN kontralateralini içerecek şekilde tasarlanmıştır (Şekil 1B'degösterilen örnek dilim). Preparatın ilk histolojik incelemesi, dilimin devre aktivasyonu için gerekli çekirdekleri içerdiğini ve aksonal projeksiyonların sağlam olduğunu doğrulamak için önemlidir. CN içinde iki hücre tipleri MOC nöronlar için ses bilgisi sağlar. T-stellat hücreleri MOC nöronlar için uyarıcı giriş sağlamak için hipotez vardır39,40,41,58. Küresel gür hücreler (GBC) kontralateral hemisfer (Held sinaps özel kaliks yoluyla) MNTB nöronlar heyecanlandırmak34,36,37,38,59,60 hangi, sırayla, MOC nöronlarinhibitör giriş sağlamak 57 (şematik Şekil 1A). Hem T-stellat hücrelerinin hem de GBC'lerin varlığını doğrulamak için, %4 PFA'da daldırma ile sabitlenen ve somata etiketine cresyl violet boyama yapılan bir kama dilimini (50 μm'ye) yeniden bölümledik. Kama diliminin kalın tarafında(Şekil 2, sol hemisfer), CN neredeyse tam rostro-kaudal ölçüde mevcuttu. Ayrıca CN'nin dorsal ve ventral alt bölümleri sağlamdı(Şekil 2; S19'da ok ve ok ucu). T-stellat nöronlar ve GBCs küme ventral koklear çekirdeği yakınında nerede işitsel sinir(Şekil 2; S17 ok) CN61girer,62,63,64,65. Kama dilimi ayrıca kayıtların yapıldığı MOC nöronlarına MNTB ipsilateral nöronları içerir (orijinal kama diliminin ince yarımküresi, Şekil 2'desağ tarafı). Bu, MOC nöronların inhibitör girişinin en azından bir kısmının sağlam olduğunu doğrular(Şekil 2, dilimler 1-15, S11'de kesik ovallerle vurgulanır).

Ayrı deneylerde, CN nöronlarının aksonların ve presinaptik terminallerinin biyositinle anterograd etiketleme kullanılarak kama diliminde sağlam olduğunu doğruladık. İlk olarak, canlı kama dilimi hazırlandı ve arayüz kağıda yerleştirildi. Kama dilimihazırlandıktan hemen sonra, biocytin kristalleri cn yerleştirildi ve bu da kuluçka döneminde akson boyunca alım ve anterograd taşınmasına izin verdi. Daha sonra dokunun sabitlenmesi ve yeniden kesilmesi (70 mm kesitler) yapıldı. Biyositin ile etiketlenmiş aksonları görselleştirmek için floresan olarak etiketlenmiş streptavidin içeren kesitlerin boyanması yapıldı. Bu bölümlerin konfokal görüntüleri, kristallerin yerleştirildiği ve hücre gövdelerine götürüldüğü CN'de parlak etiketleme yi göstermektedir(Şekil 3A, sol hemisfer, kesik alan). Ventral akustik stria boyunca CN'den çıkan aksonların(Şekil 3A, beyaz ok uçları) açıkça etiketlenmiş ve sonlandırma noktalarına kadar takip edilebilmiştir. Kontralateral MOC nöronlarını çevreleyen biyositin-pozitif puncta, hazırlığımızın CN kaynaklı sinaptik kontamı koruduğunu göstermektedir (Şekil 3B). Aynı şekilde, kontralateral MNTB'de tutulan klüksin etiketlenmiş közler, GBC'lerden MNTB nöronlarına yansıtılan aksonların kama diliminde korunduğunu göstermektedir(Şekil 3C). Bu histolojik incelemeler, kama dilimimizin hem hücre cisimlerini hem de MOC nöronlarına afferent giriş devresinin aksonal projeksiyonlarını içerdiğini doğrular, bu nedenle, işitsel sinirin uyarılması ve artan devreler aracılığıyla aktivitenin daha sonra yayılması ile uyarılmış postsinaptik yanıtları ölçmemizi sağlar.

Kama diliminde sinaptik fizyoloji
Uyarıcı ve inhibitör sinaptik girdilerin entegrasyonu nöronal aktiviteyi kritik şekilde şekillendirir. Yakın zamanda MNTB57nöronlarından MOC nöronlarıninhibitör girdileri açıklanan , ancak MOC nöron aktivitesi üzerinde uyarıcı girişleri ile bu girdilerin entegrasyonunun etkisi bilinmemektedir. ChAT-IRES-Cre x tdTomato fareden bir kama diliminde, voltaj-kelepçe kayıtları bir MOC nörondan yapıldı. Akım, presinaptik aksonların nörotransmitter salınımını uyandırmak için bir uyarıcı izolasyon ünitesi tarafından yönlendirilen bipolar tungsten uyarıcı elektrot ile uygulandı. İlk olarak orta hattaki ventral akustik stria (VAS) t-stellat aksonları doğrudan aktive etmek için elektriksel olarak uyarıldı ve MNTB nöronları GBC akson stimülasyonu(Şekil 4A)ile aktive edildi, tipik ince dilim deneylerini taklit eden bir kayıt yapılandırmasında sinaptik tepkilerin gecikmesini ölçmek için(Şekil 4B),örnek izler, gri, potansiyel -60 mV tutun. Ayrı deneylerde, işitsel sinir kökü monaural artan devreleri aktive etmek için uyarılmış ve post-sinaptik yanıtları yukarıda açıklandığı gibi MOC nöronlarda ölçüldü. Her iki yerde de elektriksel stimülasyon hızlı-elektriksel bir artifakı ve ardından çok tepeli akım yanıtlarını çağrıştırdı (Şekil 4C'dekiAN stimülasyonundan alınan örnek tepkiler , siyah izler, potansiyel -60 mV' tutma). VAS'ın doğrudan uyarılmasıyla uyarılanan ilk postsinaptik akımın (PSC) başlangıç gecikme ölçümlerini, işitsel sinir stimülasyonu ile uyarılmış olanlarla karşılaştırdık ve AN stimülasyon olaylarına önemli ölçüde daha uzun bir gecikme gecikmesi bulduk. Bu, AN/CN sinaps (AN stimülasyon: 5,27 ± 0,43 ms, ortanca ± ortanca mutlak sapma (MAD), aralık 4.26-5.93 ms, n = 8; VAS stimülasyon: 1.98 ± 0.28 ms, mad ± ortanca, dağılım 0.75-3.46 ms, n = 17; Wilcoxon İmzalı Rütbeler Testi, p = 0.014, Şekil 4D). Bu sonuçlar, işitsel sinir kökünün uyarılmasının CN nöronların ve sonraki devre aktivitelerinin sinaptik aktivasyonuyla sonuçlanmasıyla sonuçlandırılmasını, in vivo'yu daha yakından temsil ettiğini – T-stellat veya GBC/MNTB aksonların doğrudan uyarılmasından daha fazla zamanlama gibi.

Bizim sezyum bazlı, yüksek [Cl-] iç solüsyon gerilim kelepçesi kullanılan, uyarıcı (glutamaterjik) ve inhibitör (GABA ve gliserin) PSC'ler hem membran potansiyeli (-60 mV) ve bu nedenle ayırt edilemez içe doğru. AN-uyarıcı yapılandırmada devre aktivitesini çağrıştırırken, ampa aracılı glutamaterjik akımlar için yaklaşık geri dönüş potansiyeli olan 0 mV'ye tutunma potansiyelini kaydırarak, tahmin edilen inhibitör girdiyi elektriksel olarak izole ettik. Örneğimizde nöron, klorür iletkenlerinin göstergesi olan 0 mV(Şekil 4Ci,kırmızı iz) dışa akım yanıtları gözlendi. Bu GABA olması muhtemeldir- veya gliserinjik sinaptik yanıtlar. Bu veriler, işitsel sinir kökünü uyararak, sonraki afferent devrelerin aktivasyonu ile, MOC nöronların hem uyarıcı hem de inhibitör girdileri etkinleştirmek için kama diliminin yarar göstermektedir. Ayrıca, post-sinaptik yanıtların çeşitli desenleri AN stimülasyon tarafından uyarılmış, AN akson aynı stimülasyon koşulları altında bile düşündüren, tüm devre aktivitesi dinamik ve karmaşık olduğunu düşündürmektedir. Bu deneysel paradigma, karmaşık işitsel uyaranların beyin sapı boyunca nasıl yayıp MOC nöronlarında entegre edildiklerinin ayrıntılı bir analizini sağlar, MOC efferent sisteminin çıktısını ve koklea üzerindeki nihai etkisini belirler.

Figure 1
Şekil 1: Kama dilimi şeması ve örnek görüntü. (A) Medial olivocochlear geri besleme devresinin şeması. Mavi oklar MOC nöronlar ve siyah oklar için afferent artan yolu gösterir dış saç hücrelerinin tabanına MOC nöronlar gelen azalan geribildirim yolu gösterir (OHC). (B) Kalın tarafında işitsel sinir kökü (ANR) ve koklear çekirdeğin (kesikli anahat) etiketleri ile bir kama dilimi brightfield görüntü. Yıldız, MOC nöronlarının kama diliminin ince tarafında yama bağlamaiçin hedeflendiği yamuk vücudun ventral çekirdeğinin yaklaşık konumunu gösterir. Kesikli siyah çizgiler, dilimin her iki yarımküresinde de görülebilen yüz sinirlerini gösterir. IHC - iç saç hücresi, GBC - küresel gür hücre, SPN - üstün paraolion çekirdeği, MNTB - yamuk vücut medial çekirdeği, VNTB - yamuk vücut ventral çekirdeği, LSO - lateral üstün zeytin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: 50 μm'de yeniden kesitlenmiş bir kama diliminden cresyl menekşe lekeli kesitler. Diğer tüm bölümler de görüntülendi. Bölümler numaralandırılır --> kaudal. Kama dilimleri hem dorsal CN (S19'da ok) hem de ventral CN (S19'da ok ucu), işitsel sinir kökü (S17'de açık ok ucu) ve MNTB'nin (S3-S15'te havalandırma yüzeyinin yakınındaki karanlık alan) dahil olmak üzere koklear çekirdeğin (CN) tamamını içerme eğilimindedir. Ölçek çubuğundaki D ve V, dilim yönlendirmesinde dorsal ve ventral temsil emzdir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Kontralateral koklear çekirdekten MOC nöronlarına artan girdiaksons kama dilim bozulmamış kalır. (A) P23 ChAT-IRES-Cre x tdTomato (kırmızı floresan) fareden alınan ve biyositin görselleştirmesi için yeniden işlenen bir kama diliminin en çok olan kesiti. Konfokal görüntü karo, maksimum yoğunluklu projeksiyon z-yığınıdır. Ventral akustik stria daki aksonlar beyaz ok uçları ile vurgulanır. Kesikli anahat, koklear çekirdeğin bu rostral-en dilimde kalan küçük bir kısmını gösterir. Ölçek çubuğu 500 μm. (B) VNTB'de bir ChAT-IRES-Cre x tdTomato pozitif nöronun konfokal görüntüsü ve çevredeki nöropilde biyositin pozitif puncta. Ölçek çubuğu 50 μm. (C) Biyositin etiketli aksonlar, kontralateral MNTB'de Held'in kalyces'i olarak sonlandırılır. Dikey kesik çizgi dilimin orta çizgisini temsil eder. Ölçek çubuğu 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Voltaj kıskacındaki afferent girdilerin elektriksel uyarılması MOC nöronlarında çok tepeli postsinaptik akımlar verir. (A) Hem ventral akustik stria (VAS) stimülasyon (gri uyarıcı elektrot) hem de işitsel sinir (AN) stimülasyon (siyah uyarıcı elektrot) için kayıt kurulumu ile kama dilimi şeması MOC afferent girişleri. (B) -60 mV'de orta hat yakınında tek bir elektriksel uyarımla uyarılmış tek bir P17 nöronundan postinaptik akım (PSC) örnekleri. (C) PsC'ler Bir P15 nöronunda -60 mV'de AN stimülasyon sırasında uyarılmış. (Ci) C ile aynı hücredeki örnek PSC'ler 0 mV tutma potansiyeline uyarılmış (kayıt kurulumumuzda AMPA aracılı akımlar için yaklaşık ters potansiyel, kırmızı). (D) VAS ve AN stimülasyonu için ilk PSC gecikmesinin nicelliği için nüfus verileri. Kutular: dörtte biri, çizgi inset: ortanca, kare inset: ortalama, bıyık: ortanca mutlak sapma. * p < 0.05. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada bir kama dilimi olarak tanımlanan dilimleme prosedürü bozulmamış presinaptik nöronal devre korumak için güçlü, ancak nöronal fonksiyonun analizi için beyin dilimi deney erişilebilirliği ile. Devre analizine hazırlık kullanımını en üst düzeye çıkarmak için birkaç ilk adımda büyük özen gerekir. Kamanın boyutları, hem presinaptik çekirdeklerin hem de aksonal projeksiyonlarının hazırlanan kama dilimi içinde yer aldığını doğrulamak için integral olan histolojik inceleme kullanılarak doğrulanmalıdır. Projeksiyonlar kesilirse veya birkaç akson hedef çekirdeğe ulaşırsa dilim geometrisi değişiklik gerektirebilir. Daha genel olarak, kama dilimi için vibratom üzerinde son kesim kritik öneme sahip. Optimal kama dilimi hazırlama sahne tabanında konsantrik daire işaretleri kullanımı da dahil olmak üzere vibratom yapılandırmaları tutarlı kullanımı bir arada gerektirir, bilinen beyin işaretleri dayalı ayarları ayarlama ile birlikte. Dilim geometrisinin optimizasyonundan sonra, 18 kama diliminin 8'inde işitsel sinir kökünü elektriksel olarak uyararak uyarılmış MOC nöronlarında tutarlı PSC'ler kaydettik. Daha önceki çalışmamızda, MOC nöronların yaklaşık %60'ında MNTB aksonların doğrudan uyarılması yoluyla inhibitör PSC'leri uyarmayı başardık57, buradaki başarı oranımızın polisinaptik devre aktivasyonu için uzun bir girdi aralığı ve gerekliliği göz önüne alındığında sadece mütevazı bir azalma olduğunu düşündürmektedir. Dilim hazırlanırken, daha kalın bir dilim nedeniyle görüş azalması eksik veya devre bağlantısı olmayan kullanışsız bir bölüm üzerinde olumlu olduğu için, daha kalın tarafta hata yapmak tavsiye edilir. Dilim kayıt mikroskobu hedefine uyduğu sürece, herhangi bir dilim yapılandırması veya boyutları kullanılabilir, yama ve uyarıcı elektrotlar (veya diğer problar veya ekipman) tarafından erişilebilir ve ilgi postsynaptic hücresinde optik tabanlı yama bağlama için yeterince ince. Hızlı, nazik diseksiyon ve uygun kuluçka ve kurtarma koşulları da yama-kelepçe deneyleri için devrecanlılığını korumak için önemlidir. İşitsel beyin sapı hazırlığımıza özgü olarak, sağlam ve fonksiyonel işitsel sinir köklerini korumak için beyin kafatasından çok dikkatli bir şekilde çıkarılmalıdır. Germe veya sinir yırtılma lifleri uyarmak ve işitsel nöronlarda aktivite ortaya çıkarmak yeteneğini etkileyecektir. Dilimdeki doku hacminin daha fazla olması nedeniyle, geleneksel dilimleme solüsyonlarının, sıcaklıkların, kuluçka sistemlerinin ve perfüzyon sistemlerinin değiştirilmesi dilimin sağlığını iyileştirebilir. Burada normal dilim hazırlığımızda ufak değişiklikler yapıyoruz. Bunlar arasında daha kısa iyileşme kuluçka süreleri (30 dakika ya da 60 dakika) ve dilim odası perfüzyon sisteminde daha hızlı akış hızları yer alır.

Dilim boyutları ve kuluçka detayları belirlendikten sonra, dilim içindeki devrenin farklı bileşenlerinin işlevi ve bağlantısı gösterilmelidir. Hazırlığımızda, t-stellate ve GBC (MNTB aracılığıyla) ile koklear çekirdekten kaynaklanan hem uyarıcı hem de inhibitör girdilerin beklendiği gibi mevcut olmasını sağlıyoruz. İşitsel sinir için emme elektrotları veya optogenetik veya fokal nörotransmitter uncaging gibi optik stimülasyon yöntemleri gibi alternatif stimülasyon yöntemleri de devre aktivasyonunu artırabilir veya hücre alt tiplerinin genetik hedeflemesi ile eşleştiğinde hücre tipi spesifik aktivasyona izin verebilir.

Bu dilimleme yöntemi umarım birçok sistem ve devreler için yararlı olacaktır, standart ince dilim bölümleri sınırlamaları bazı da bu hazırlık ile ilgilidir. Genellikle, aksonlar büyük olasılıkla kopacağı gibi, daha az düzlemsel projeksiyon desenleri ile devreleri korumak zor olabilir. İşitsel girdileri taklit etmek için burada yapıldığı gibi, kranial sinirlerde devreye alınması birçok devrede mümkün olmayabilir. Diğer dilim preparatlarında olduğu gibi, farmakolojinin ağ etkileri göz önünde bulundurulmalıdır. Örneğin, glutamat reseptör blokerlerinin banyo uygulaması inhibitör izole etmek için (GABA- veya gliserinjik) veya iletim diğer modları glutamat yamalı hedef nöronun nöron upstream aktivasyonu için gerekli olduğunda polisinaptik devre aktivasyonu ile kullanılamaz. Hem AN / CN ve GBC / MNTB sinaps glutamaterjik olduğu gibi bizim durumumuzda doğrudur, bu nedenle, tüm iletim glutamat reseptör blokerleri banyo uygulaması ile MOC nöronlarda ortadan kaldırılmış olacaktır. Ayrıca, Gaba veya glisin reseptör blokerlerinin Uygulanması MNTB-MOC sinaptik yanıtları ortadan kaldırmak için MOC nöronlar afferent girdilerin desenleri şekillendirebilir CN içinde içsel inhibitör bağlantı ortadan kaldırılması istenmeyen sonucu olurdu. Basınç ejeksiyonu veya iyontoforez ile reseptör blokerlerinin fokal uygulaması farmakolojik fonksiyonu kısıtlamak için kullanılabilir.

Son olarak, bu ana sınırlama, ve herhangi bir, in vitro tekniği bu hazırlık monaural artan işitsel devre aktivasyonu maksimize rağmen, sinir sisteminin geri kalanı, uyaranları kodlayan periferik reseptörleri de dahil olmak üzere, yok olmasıdır. Bu koklea kendisi içerir, diğer kulak tan uyarıcı girişleri66, komiser CN bağlantıları67,68,69,70, ve azalan kortikal71,72,73,74 ve collicular75,76 projeksiyonlar ve modüler girişleri77,78,79,80 CN ve SOC çekirdeklerinin aktivitesini etkilemek için bilinen. Azalan IC projeksiyonlarının bir kısmının korunması mümkün olmakla birlikte, dilim geometrisi nedeniyle hem kortikal projeksiyonları hem de komiser CN projeksiyonlarını dahil etmek imkansızdır. Bu nedenle, mevcut deneyler ile koklea artan işitsel devre odaklanmak. İnce tarafta dilimin minimal kalınlığı da simetrik kalın dilim preparatları10,11bir avantajdır binaural polisinaptik devre analizleri gerçekleştirmek için yeteneğini azaltır. Ayrıca, biz devre aktivitesidoğal desenleri uyandırmak için ses ile işitsel sinir uyarmak mümkün değildir. İşitsel sinir yanıtları tonotoik çeşitlidir, gergin, ve plastik81,82,83,84, zor mükemmel bizim elektrikstimülasyon yöntemi ile simüle yapmak. Bu işitsel sistemde in vitro deney önemli bir dezavantajı olduğunu. Tüm AN kökuyarıcı tonotopik gradyan boyunca AN lifleri spiking ortaya çıkaracaktır beri bizim stimülasyon Tonotopik kısıtlama mümkün değildir. Bir elektriksel uyarıcı desenine bir lif tepkilerinin (yani düşük ve yüksek spontan oranlı liflerin) çeşitliliğini doğru bir şekilde taklit etmek de mümkün değildir. CN'deki birden fazla AN lifinin dinamik yoğunluk kodlamasını tam olarak eşleştirmek de zordur. Ancak, farklı akustik uyaranlar sırasında uygun işitsel sinir çıkışını taklit etmeyi amaçlayan çeşitli stimülasyon desenleri üretmek için elektrofizyoloji yazılımımızı kullanabiliriz (örn. kısa, yüksek sesler, sessiz, uzun süreli sesler veya arka plan gürültüsündeki sesler) hem elektriksel uyarıcı protokolleri arasında hem de bireysel bir protokol içinde kombine AN girdilerine yaklaşık olarak görebilirsiniz (ref.85'temodellenmiştir). Bu deneyler sırasında MOC çıktılarının izlenmesi, MOC nöronlarında inhibisyon veya uyarma lehine hangi uyarıcı desenleri ile ilgili hipotezlerimizi test edecektir.

Yukarıda açıklanan sınırlamalara rağmen, bir kama dilimi hazırlama yöntemi in vivo ve tipik in vitro dilim fizyoloji yöntemlerine göre faydaları vardır ve erişilmesi zor hücreler için dilimde mümkün olduğunca yakından in vivo devre aktivasyonu yaklaşım için kullanılabilir. İşitsel beyin sapındaki in vivo bütün hücre kayıtları bu alana cerrahi olarak erişmedeki güçlükler nedeniyle nadir dir86. Bunun yerine dilim işitsel sinir ile başlayan MOC nöronlar için artan girişleri içerecek şekilde hazırlanmıştır, hangi doğrudan tüm monaural yükselen devre etkinleştirmek için uyarılır. Hem uyarıcı hem de inhibitör sinaptik girdilerin aktivasyonunu gösteriyoruz ve bu girdilere verilen yanıtlar MOC nöronlarına ulaştıklarında sinaptik girdilerin zamanlaması hakkında değerli bilgiler sağlıyor. Bu kalsiyum veya voltaj görüntüleme, nörotransmitter uncaging gibi in vitro elektrofizyoloji araçları nın büyük bir repertoire istihdam edebilirsiniz yüksek iş deneyimi deneyleri için bir platform sağlar, ve hem hücre içi (yama pipet yoluyla) ve ekstrasellüler (banyo uygulaması veya iyontoforez yoluyla) farmakoloji. Hazırlık aynı zamanda dic optik kullanarak hedef nöronların daha iyi görünürlüğü nedeniyle kalın dilim preparatları üzerinde üretim artışı sunmalıdır, hangi artan doku kalınlığı ile bulanıklık, özellikle ventral beyin sapı. Genel olarak, bu teknik in vivo metodları üzerinden hedefleme ve iş elde etmede iyileştirmeler ve geleneksel dilim fizyolojisi yöntemlerine göre devre analizi için daha iyi fırsatlar sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Bu araştırma NIH, NIDCD, Z01 DC000091 (CJCW) Intramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Experimental Preparations
Agar, powder Fisher Scientific BP1423500 4% agar block used to stabilize brain tissue during vibratome sectioning
AlexaFluor Hydrazide 488 Invitrogen A10436 Fluorophore used in internal solution to confirm successful MOC neuron patch
Analytical Balance Geneses Scientific (Intramalls) AV114 Weighing chemicals
Double edged razor blade Ted Pella 121-6 Vibratome cutting blade
Kynurenic acid (5g) Sigma Aldrich K3375-5G Slicing ACSF additive used to reduce neuron activity during dissection and slicing in order to improve tissue health for patch clamping
pH Meter Fisher Scientific (Intramalls) 13-620-451 Solution pH tester
Plastic petri dishes 100mm dia X 20mm Fisher Scientific (Intramalls) 12-556-002 4% Agar Prep
Stirring Hotplate Fisher Scientific (Intramalls) 11-500-150 Heating for 4% Agar preparation
Dissection and Slicing
Biocytin Sigma Aldrich B4261-250MG Chemical used for axonal tracing (conjugated to Streptavidin 488)
Dissecting Microscope Amscope SM-1BN For precision dissection during brain removal
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20 Fine forceps dissection tool
Economy tweezers #3 WPI 501976 Forceps dissection tool
Glass Petri Dish 150mm dia x 15mm H Fisher Scientific (Intramalls) 08-747E Dissection dish
Interface paper (203 X 254mm PCTE Membrane 10um) Thomas Scientific 1220823 Slice incubation/biocytin application
Leica VT1200S Vibratome Leica 1491200S001 Vibratome for wedge slice sectioning
Mayo scissors Roboz RS-6872 Dissection tool
Single-edged carbon steel blades Fisher Scientific (Intramalls) 12-640 Razor blade for dissection
Specimen disc, orienting Leica 14048142068 Specialized vibratome stage for reproducible tilting
Spoonula FisherSci 14-375-10 Dissection tool
Super Glue Newegg 15187 Used for glueing tissue to vibratome stage
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 91500-09 Dissection tool
Electrophysiology
A1R Upright Confocal Microscope Nikon Instruments Electrophysiology and imaging microscope, can be any microscope compatible with electrophysiology
Electrode Borosilicate glass w/ Filament OD 1.5mm, ID 1.1mm, 10 cm long Sutter Instrument BF150-110-10 Patch clamping pipette glass
Electrode Filler MicroFil WPI CMF20G Patch electrode pipette filler
In-line solution heater Warner Instruments (GSAdvantage) SH-27B Slice perfusion system heater
Multi-Micromanipulator Systems Sutter Intruments MPC-200 with MP285 Micromanipulators for patch clamp and stimulation electrode placement
P-1000 horizontal pipette puller for glass micropipettes Sutter instruments FG-P1000 Patch clamp pipetter puller
Patch-clamp amplifier and Software HEKA EPC-10 / Patchmaster Next Can be any amplifier/software
Recording Chamber Warner Instruments RC26G Slice "bath" during recording
Recording Chamber Harp Warner Instruments 640253 Stablizes slice during electrophysiology recording
Slice Incubation Chamber Custom Build Heated, oxygenated holding chamber for slices during recovery after slicing
Stimulus isolation unit A.M.P.I. Iso-Flex Stimulus isolation unit for electrophysiology
Syringe 60CC Fischer Scientific (Intramalls) 14-820-11 Electrophysiology perfusion fluid handling
Temperature controller Warner Instruments (GSAdvantage) TC-324C Slice perfusion system temperature controller
Tubing 1/8 OD 1/16 ID Fischer Scientific (Intramalls) 14-171-129 Electrophysiology perfusion fluid handling
Tugsten concentric bipolar microelectrode WPI TM33CCINS Stimulating electrode for electrophysiology
Histology
24 well Plate Fisher Scientific (Intramalls) 12-556006 Histology slice collection and immunostaining
Alexa Fluor 488 Streptavidin Jackson Immuno labs 016-540-084 Secondary antibody for biocytin visualization
Corning Orbital Shaker Sigma CLS6780FP Shaker for immunohistochemistry agitation
Cresyl Violet Acetate Sigma Aldrich (Intramalls) C5042-10G Cellular stain for histology
Disposable Microtome Blades Fisher Scientific 22-210-052 Sliding microtome blade
Filter-syringe Nalgene 4mm Cellulose Acetate 0.2um Fisher Scientific (Intramalls) 09-740-34A Syringe filter for filling recording pipettes with internal solution
Fluoromount-G Slide Mounting Medium Fisher Scientific OB100-01 Immunohistochemistry fluorescence mounting medium
glass slide staining dish with rack Fisher Scientific (Intramalls) 08-812 Cresyl Violet staining chamber
Microm HM450 Sliding Microtome ThermoFisher 910020 Freezing microtome for histology
Microscope Cover Glasses: Rectangles 50mm X 24mm Fisher Scientific (Intramalls) 12-543D Histochemistry slide cover glass
Permount mounting medium Fisher Scientific SP15-100 Cresyl violet section mounting medium
Superfrost Slides Fisher Scientific 22-034980 Histology slides

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Campbell, J. P., Henson, M. M. Olivocochlear neurons in the brainstem of the mouse. Hearing Research. 35 (2-3), 271-274 (1988).
  2. Grothe, B., Sanes, D. H. Synaptic inhibition influences the temporal coding properties of medial superior olivary neurons: An in vitro study. Journal of Neuroscience. 14, 1701-1709 (1994).
  3. Kotak, V. C., Sanes, D. H. Long-lasting inhibitory synaptic depression is age- and calcium-dependent. Journal of Neuroscience. 20 (15), 5820-5826 (2000).
  4. Smith, A. J., Owens, S., Forsythe, I. D. Characterisation of inhibitory and excitatory postsynaptic currents of the rat medial superior olive. The Journal of Physiology. 529 (3), 681-698 (2000).
  5. Scott, L. L., Mathews, P. J., Golding, N. L. Posthearing developmental refinement of temporal processing in principal neurons of the medial superior olive. Journal of Neuroscience. 25 (35), 7887-7895 (2005).
  6. Fischl, M. J., Combs, T. D., Klug, A., Grothe, B., Burger, R. M. Modulation of synaptic input by GABAB receptors improves coincidence detection for computation of sound location. Journal of Physiology. 590 (13), 3047-3066 (2012).
  7. Clause, A., et al. The Precise Temporal Pattern of Prehearing Spontaneous Activity Is Necessary for Tonotopic Map Refinement. Neuron. 82 (4), 822-835 (2014).
  8. Oertel, D. Use of brain slices in the study of the auditory system: Spatial and temporal summation of synaptic inputs in cells in the anteroventral cochlear nucleus of the mouse. Journal of the Acoustical Society of America. 78 (1), 328-333 (1985).
  9. Hermann, J., Pecka, M., Von Gersdorff, H., Grothe, B., Klug, A. Synaptic transmission at the calyx of held under in vivo-like activity levels. Journal of Neurophysiology. 98 (2), 807-820 (2007).
  10. Jercog, P. E., Svirskis, G., Kotak, V. C., Sanes, D. H., Rinzel, J. Asymmetric excitatory synaptic dynamics underlie interaural time difference processing in the auditory system. PLoS Biology. 8 (6), 1000406 (2010).
  11. Roberts, M. T., Seeman, S. C., Golding, N. L. A mechanistic understanding of the role of feedforward inhibition in the mammalian sound localization circuitry. Neuron. 78 (5), 923-935 (2013).
  12. Sinclair, J. L., et al. Sound-evoked activity influences myelination of brainstem axons in the trapezoid body. Journal of Neuroscience. 37 (34), 8239-8255 (2017).
  13. Wang, J., et al. Myelination of the postnatal mouse cochlear nerve at the peripheral-central nervous system transitional zone. Frontiers in Pediatrics. 1, 5-8 (2013).
  14. Long, P., Wan, G., Roberts, M. T., Corfas, G. Myelin development, plasticity, and pathology in the auditory system. Developmental Neurobiology. 78 (2), 80-92 (2018).
  15. Leão, R. M., et al. Presynaptic Na+ channels: Locus, development, and recovery from inactivation at a high-fidelity synapse. Journal of Neuroscience. 25 (14), 3724-3738 (2005).
  16. Fex, J. Efferent Inhibition in the Cochlea Related to Hair-Cell dc Activity: Study of Postsynaptic Activity of the Crossed Olivocochlear Fibres in the Cat. The Journal of the Acoustical Society of America. 41 (3), 666-675 (1967).
  17. Mountain, D. C. Changes in endolymphatic potential and crossed olivocochlear bundle stimulation alter cochlear mechanics. Science. 210 (4465), 71-72 (1980).
  18. Siegel, J. H., Kim, D. O. Efferent neural control of cochlear mechanics? Olivocochlear bundle stimulation affects cochlear biomechanical nonlinearity. Hearing Research. 6 (2), 171-182 (1982).
  19. Guinan, J. J. Cochlear efferent innervation and function. Current Opinion in Otolaryngology & Head and Neck Surgery. 18 (5), 447-453 (2010).
  20. Elgoyhen, A. B., Katz, E. The efferent medial olivocochlear-hair cell synapse. Journal of Physiology-Paris. 106 (1-2), 47-56 (2012).
  21. Galambos, R. Suppression of auditory nerve activity by stimulation of efferent fibers to cochlea. Journal of Neurophysiology. 19 (5), 424-437 (1956).
  22. Desmedt, J. E. Auditory-Evoked Potentials from Cochlea to Cortex as Influenced by Activation of the Efferent OlivoCochlear Bundle. Journal of the Acoustical Society of America. 34 (9), 1478-1496 (1962).
  23. Wiederhold, M. L., Kiang, N. Y. S. Effects of Electric Stimulation of the Crossed Olivocochlear Bundle on Single Auditory-Nerve Fibers in the Cat. The Journal of the Acoustical Society of America. 48 (4), 950-965 (1970).
  24. Wiederhold, M. L., Peake, W. T. Efferent Inhibition of Auditory-Nerve Responses: Dependence on Acoustic-Stimulus Parameters. Journal of the Acoustical Society of America. 40 (6), 1427-1430 (1966).
  25. Geisler, D. C. Hypothesis on the function of the crossed olivocochlear bundle. Journal of the Acoustical Society of America. 56 (6), 1908-1909 (1974).
  26. Guinan, J. J., Gifford, M. L. Effects of electrical stimulation of efferent olivocochlear neurons on cat auditory-nerve fibers. III. Tuning curves and thresholds at CF. Hearing Research. 37 (1), 29-45 (1988).
  27. Rajan, R. Involvement of cochlear efferent pathways in protective effects elicited with binaural loud sound exposure in cats. Journal of Neurophysiology. 74 (2), 582-597 (1995).
  28. Rajan, R. Effect of electrical stimulation of the crossed olivocochlear bundle on temporary threshold shifts in auditory sensitivity. II. Dependence on the level of temporary threshold shifts. Journal of Neurophysiology. 60 (2), 569-579 (1988).
  29. Reiter, E. R., Liberman, M. C. Efferent-mediated protection from acoustic overexposure: Relation to slow effects of olivocochlear stimulation. Journal of Neurophysiology. 73 (2), 506-514 (1995).
  30. Taranda, J., et al. A point mutation in the hair cell nicotinic cholinergic receptor prolongs cochlear inhibition and enhances noise protection. PLoS Biology. 7 (1), 1000018 (2009).
  31. Maison, S. F., Usubuchi, H., Liberman, C. M. Efferent feedback minimizes cochlear neuropathy from moderate noise exposure. Journal of Neuroscience. 33 (13), 5542-5552 (2013).
  32. Tong, H., et al. Protection from noise-induced hearing loss by Kv2. 2 potassium currents in the central medial olivocochlear system. Journal of Neuroscience. 33 (21), 9113-9121 (2013).
  33. Boero, L. E., et al. Enhancement of the medial olivocochlear system prevents hidden hearing loss. Journal of Neuroscience. 38 (34), 7440-7451 (2018).
  34. Spirou, G. A., Brownell, W. E., Zidanic, M. Recordings from cat trapezoid body and HRP labeling of globular bushy cell axons. Journal of Neurophysiology. 63 (5), 1169-1190 (1990).
  35. von Gersdorff, H., Borst, J. G. G. Short-term plasticity at the calyx of held. Nature Reviews Neuroscience. 3 (1), 53-64 (2002).
  36. Smith, P. H., Joris, P. X., Carney, L. H., Yin, T. C. T. Projections of physiologically characterized globular bushy cell axons from the cochlear nucleus of the cat. Journal of Comparative Neurology. 304 (3), 387-407 (1991).
  37. Kuwabara, N., DiCaprio, R. A., Zook, J. M. Afferents to the medial nucleus of the trapezoid body and their collateral projections. Journal of Comparative Neurology. 314 (4), 684-706 (1991).
  38. Friauf, E., Ostwald, J. Divergent projections of physiologically characterized rat ventral cochlear nucleus neurons as shown by intra-axonal injection of horseradish peroxidase. Experimental Brain Research. 73 (2), 263-284 (1988).
  39. De Venecia, R. K., Liberman, M. C., Guinan, J. J., Brown, M. C. Medial olivocochlear reflex interneurons are located in the posteroventral cochlear nucleus: A kainic acid lesion study in guinea pigs. Journal of Comparative Neurology. 487 (4), 345-360 (2005).
  40. Darrow, K. N., Benson, T. E., Brown, M. C. Planar multipolar cells in the cochlear nucleus project to medial olivocochlear neurons in mouse. Journal of Comparative Neurology. 520 (7), 1365-1375 (2012).
  41. Brown, M. C., De Venecia, R. K., Guinan, J. J. Responses of medial olivocochlear neurons: Specifying the central pathways of the medial olivocochlear reflex. Experimental Brain Research. 153 (4), 491-498 (2003).
  42. Wang, Y., Manis, P. B. Synaptic transmission at the cochlear nucleus endbulb synapse during age-related hearing loss in mice. Journal of Neurophysiology. 94 (3), 1814-1824 (2005).
  43. Golding, N. L., Robertson, D., Oertel, D. Recordings from slices indicate that octopus cells of the cochlear nucleus detect coincident firing of auditory nerve fibers with temporal precision. Journal of Neuroscience. 15 (4), 3138-3153 (1995).
  44. Ferragamo, M. J., Golding, N. L., Oertel, D. Synaptic inputs to stellate cells in the ventral cochlear nucleus. Journal of Neurophysiology. 79 (1), 51-63 (1998).
  45. Oertel, D. Synaptic responses and electrical properties of cells in brain slices of the mouse anteroventral cochlear nucleus. Journal of Neuroscience. 3 (10), 2043-2053 (1983).
  46. Xie, R., Manis, P. B. Radiate and planar multipolar neurons of the mouse anteroventral cochlear nucleus: Intrinsic excitability and characterization of their auditory nerve input. Frontiers in Neural Circuits. 11, 1-17 (2017).
  47. Wu, S., Oertel, D. Inhibitory circuitry in the ventral cochlear nucleus is probably mediated by glycine. The Journal of Neuroscience. 6 (9), 2691-2706 (1986).
  48. Xie, R., Manis, P. B. Target-specific IPSC kinetics promote temporal processing in auditory parallel pathways. Journal of Neuroscience. 33 (4), 1598-1614 (2013).
  49. Wickesberg, R. E., Oertel, D. Delayed, frequency-specific inhibition in the cochlear nuclei of mice: A mechanism for monaural echo suppression. Journal of Neuroscience. 10 (6), 1762-1768 (1990).
  50. Campagnola, L., Manis, P. B. A map of functional synaptic connectivity in the mouse anteroventral cochlear nucleus. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2214-2230 (2014).
  51. Doucet, J. R., Ryugo, D. K. Projections from the ventral cochlear nucleus to the dorsal cochlear nucleus in rats. Journal of Comparative Neurology. 385 (2), 245-264 (1997).
  52. Kopp-Scheinpflug, C., et al. The sound of silence: Ionic mechanisms encoding sound termination. Neuron. 71 (5), 911-925 (2011).
  53. Alamilla, J., Gillespie, D. C. Maturation of Calcium-Dependent GABA, Glycine, and Glutamate Release in the Glycinergic MNTB-LSO Pathway. PLoS One. 8 (9), 0075688 (2013).
  54. Spangler, K. M., Warr, W. B., Henkel, C. K. The projections of principal cells of the medial nucleus of the trapezoid body in the cat. Journal of Comparative Neurology. 238 (3), 249-262 (1985).
  55. Kramer, F., et al. Inhibitory glycinergic neurotransmission in the mammalian auditory brainstem upon prolonged stimulation: Short-term plasticity and synaptic reliability. Frontiers in Neural Circuits. 8, 1-22 (2014).
  56. Roberts, M. T., Seeman, S. C., Golding, N. L. The relative contributions of MNTB and LNTB neurons to inhibition in the medial superior olive assessed through single and paired recordings. Frontiers in Neural Circuits. 8, 1-14 (2014).
  57. Torres Cadenas, L., Fischl, M. J., Weisz, C. J. C. Synaptic Inhibition of Medial Olivocochlear Efferent Neurons by Neurons of the Medial Nucleus of the Trapezoid Body. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 40 (3), 509-525 (2020).
  58. Brown, M. C., Mukerji, S., Drottar, M., Windsor, A. M., Lee, D. J. Identification of inputs to olivocochlear neurons using transneuronal labeling with pseudorabies virus (PRV). JARO - Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 14 (5), 703-717 (2013).
  59. Morest, D. K. The collateral system of the medial nucleus of the trapezoid body of the cat, its neuronal architecture and relation to the olivo-cochlear bundle. Brain Research. 9 (2), 288-311 (1968).
  60. Warr, B. W. Fiber degeneration following lesions in the multipolar and globular cell areas in the ventral cochlear nucleus of the cat. Brain Research. 40 (2), 247-270 (1972).
  61. Osen, K. K. Cytoarchitecture of the cochlear nuclei in the cat. Journal of Comparative Neurology. 136 (4), 453-483 (1969).
  62. Cant, N. B., Morest, D. K. The bushy cells in the anteroventral cochlear nucleus of the cat. A study with the electron microscope. Neuroscience. 4 (12), 1925-1945 (1979).
  63. Cant, N. B., Morest, D. K. Organization of the neurons in the anterior division of the anteroventral cochlear nucleus of the cat. Light-microscopic observations. Neuroscience. 4 (12), 1909-1923 (1979).
  64. Lauer, A. M., Connelly, C. J., Graham, H., Ryugo, D. K. Morphological Characterization of Bushy Cells and Their Inputs in the Laboratory Mouse (Mus musculus) Anteroventral Cochlear Nucleus. PLoS One. 8 (8), 1-16 (2013).
  65. Harrison, J. M., Warr, W. B. A study of the cochlear nuclei and ascending auditory pathways of the medulla. Journal of Comparative Neurology. 119 (3), 341-379 (1962).
  66. Robertson, D., Gummer, M. Physiological and morphological characterization of efferent neurones in the guinea pig cochlea. Hearing Research. 20 (1), 63-77 (1985).
  67. Bledsoe, S. C., et al. Ventral cochlear nucleus responses to contralateral sound are mediated by commissural and olivocochlear pathways. Journal of Neurophysiology. 102 (2), 886-900 (2009).
  68. Zhou, J., Zeng, C., Cui, Y., Shore, S. Vesicular glutamate transporter 2 is associated with the cochlear nucleus commissural pathway. JARO - Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 11 (4), 675-687 (2010).
  69. Kuenzel, T. Modulatory influences on time-coding neurons in the ventral cochlear nucleus. Hearing Research. 384, 107824 (2019).
  70. Cant, N. B., Gaston, K. C. Pathways connecting the right and left cochlear nuclei. Journal of Comparative Neurology. 212 (3), 313-326 (1982).
  71. Feliciano, M., Saldana, E., Mugnaini, E. Direct projections from the rat primary auditory neocortex to nucleus sagulum, paralemniscal regions, superior olivary complex and cochlear nuclei. Auditory Neuroscience. 1 (3), 287-308 (1995).
  72. Mulders, W. H. A. M., Robertson, D. Evidence for direct cortical innervation of medial olivocochlear neurones in rats. Hearing Research. 144 (1-2), 65-72 (2000).
  73. Schofield, B. R., Coomes, D. L. Pathways from auditory cortex to the cochlear nucleus in guinea pigs. Hearing Research. 216-217 (1-2), 81-89 (2006).
  74. Meltzer, N. E., Ryugo, D. K. Projections from auditory cortex to cochlear nucleus: A comparative analysis of rat and mouse. Anatomical Record - Part A Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 288 (4), 397-408 (2006).
  75. Schofield, B. R., Cant, N. B. Descending auditory pathways: Projections from the inferior colliculus contact superior olivary cells that project bilaterally to the cochlear nuclei. Journal of Comparative Neurology. 409 (2), 210-223 (1999).
  76. Thompson, A. M., Schofield, B. R. Afferent projections of the superior olivary complex. Microscopy Research and Technique. 51 (4), 330-354 (2000).
  77. Woods, C. I., Azeredo, W. J. Noradrenergic and serotonergic projections to the superior olive: Potential for modulation of olivocochlear neurons. Brain Research. 836 (1-2), 9-18 (1999).
  78. Mulders, W. H. A. M., Robertson, D. Morphological relationships of peptidergic and noradrenergic nerve terminals to olivocochlear neurones in the rat. Hearing Research. 144 (1-2), 53-64 (2000).
  79. Thompson, A. M., Thompson, G. C. Light microscopic evidence of serotoninergic projections to olivocochlear neurons in the bush baby (Otolemur garnettii). Brain Research. 695 (2), 263-266 (1995).
  80. Wang, X., Robertson, D. Substance P-induced inward current in identified auditory efferent neurons in rat brain stem slices. Journal of Neurophysiology. 80 (1), 218-229 (1998).
  81. Taberner, A. M., Liberman, M. C. Response properties of single auditory nerve fibers in the mouse. Journal of Neurophysiology. 93 (1), 557-569 (2005).
  82. Galambos, R., Davis, H. The response of single auditory-nerve stimulation. Journal of Neurophysiology. 6 (1), 39-57 (1943).
  83. Sachs, M. B., Abbas, P. J. Rate versus level functions for auditory-nerve fibers in cats: Tone-burst stimuli. Journal of the Acoustical Society of America. 56 (6), 1835-1847 (1974).
  84. Zhang, X., Heinz, M. G., Bruce, I. C., Carney, L. H. A phenomenological model for the responses of auditory-nerve fibers: I. Nonlinear tuning with compression and suppression. The Journal of the Acoustical Society of America. 109 (2), 648-670 (2001).
  85. Zilany, M. S. A., Bruce, I. C., Carney, L. H. Updated parameters and expanded simulation options for a model of the auditory periphery. The Journal of the Acoustical Society of America. 135 (1), 283-286 (2014).
  86. Franken, T. P., Smith, P. H., Joris, P. X. In vivo whole-cell recordings combined with electron microscopy reveal unexpected morphological and physiological properties in the lateral nucleus of the trapezoid body in the auditory brainstem. Frontiers in Neural Circuits. 10, 1-20 (2016).

Tags

Nörobilim Sayı 162 medial olivokoklear nöronlar in vitro dilim elektrofizyolojisi sinaptik entegrasyon işitsel sinir işitsel beyin sapı koklear çekirdek inhibitör nörotransmisyon
In Vitro Kama Dilimi In Vivo Nöronal Devre Bağlantısı Nın TaklitI Için Hazırlık
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fischl, M. J., Weisz, C. J. C. In… More

Fischl, M. J., Weisz, C. J. C. In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity. J. Vis. Exp. (162), e61664, doi:10.3791/61664 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter