Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

In Vitro Wedge Slice Voorbereiding voor het nabootsen van in Vivo Neuronal Circuit Connectiviteit

Published: August 18, 2020 doi: 10.3791/61664

Summary

Integratie van diverse synaptische ingangen naar neuronen wordt het best gemeten in een preparaat dat alle pre-synaptische kernen voor natuurlijke timing en circuit plasticiteit behoudt, maar hersenen plakjes meestal verbreken veel verbindingen. We ontwikkelden een gemodificeerde hersenen slice na te bootsen in vivo circuit activiteit met behoud van in vitro experimentatie vermogen.

Abstract

In vitro slice elektrofysiologie technieken meten eencellige activiteit met nauwkeurige elektrische en temporele resolutie. Hersenen plakjes moeten relatief dun zijn om goed te visualiseren en toegang neuronen voor patch-clamping of imaging, en in vitro onderzoek van de hersenen circuits is beperkt tot alleen wat fysiek aanwezig is in de acute slice. Om de voordelen van in vitro slice experimenten te behouden met behoud van een groter deel van de presynaptische kernen, ontwikkelden we een nieuwe slice voorbereiding. Deze "wedge slice" is ontworpen voor patch-clamp elektrofysiologie opnames om de diverse monaurale, geluid-gedreven ingangen te middenn olivocochleaire (MOC) neuronen in de hersenstam te karakteriseren. Deze neuronen ontvangen hun primaire afferent excitatory en remmende ingangen van neuronen geactiveerd door stimuli in het contralaterale oor en overeenkomstige cochleaire kern (CN). Een asymmetrische hersenen slice werd ontworpen die het dikst is in de rostro-caudal domein aan de zijdelingse rand van een halfrond en vervolgens dunt naar de laterale rand van het andere halfrond. Dit segment bevat, aan de dikke kant, de auditieve zenuwwortel die informatie over auditieve stimuli naar de hersenen brengt, de intrinsieke CN-circuits, en zowel de disynaptische excitatory als trisynaptische remmende afferentepaden die samenkomen op contralaterale MOC-neuronen. Opname wordt uitgevoerd van MOC neuronen aan de dunne kant van het segment, waar ze worden gevisualiseerd met behulp van DIC optica voor typische patch-clamp experimenten. Directe stimulatie van de gehoorzenuw wordt uitgevoerd als het in de auditieve hersenstam, waardoor voor intrinsieke CN circuit activiteit en synaptische plasticiteit optreden bij synapsen stroomopwaarts van MOC neuronen. Met deze techniek kan men in vivo circuitactivering zo dicht mogelijk binnen het segment nabootsen. Deze wig slice voorbereiding is van toepassing op andere hersencircuits waar circuit analyses zouden profiteren van het behoud van upstream connectiviteit en lange afstand ingangen, in combinatie met de technische voordelen van in vitro slice fysiologie.

Introduction

Observatie van de activiteit van neurale circuits wordt idealiter uitgevoerd met native zintuiglijke ingangen en feedback, en intacte connectiviteit tussen hersengebieden, in vivo. Echter, het uitvoeren van experimenten die eencellige resolutie van neurale circuit functie te geven is nog steeds beperkt door technische uitdagingen in de intacte hersenen. Terwijl in vivo extracellulaire elektrofysiologie of multifoton beeldvormingsmethoden kunnen worden gebruikt voor het onderzoeken van activiteit in intacte zenuwstelsels, blijft het moeilijk om te interpreteren hoe verschillende ingangen integreren of subthreshold synaptische ingangen meten. In vivo hele cel opnames overwinnen deze beperkingen, maar zijn uitdagend uit te voeren, zelfs in hersengebieden die gemakkelijk toegankelijk zijn. Technische uitdagingen van eencellige resolutie experimenten worden verder versterkt in bepaalde neuron populaties die zich diep in de hersenen, of in ruimtelijk diffuse populaties die ofwel genetische instrumenten nodig om cellen te lokaliseren in vivo (bijvoorbeeld genetische expressie van channelrhodopsine in combinatie met optrode opname) of post-hoc histochemische identificatie na opname site etikettering (bijvoorbeeld met neurotransmissie-specifieke markers). Wordt diffuus gelegen in de buurt van het ventrale oppervlak van de hersenstam, mediale olivocochlear (MOC) neuronen lijden aan de bovenstaande beperkingen1, waardoor ze zeer moeilijk te bereiken voor in vivo experimenten.

Hersensegmenten (~100-500 μm dikte) zijn al lang gebruikt om hersencircuits te bestuderen, inclusief auditieve hersenstamcircuits, vanwege de fysieke segregatie van verbonden neuronen die zich in hetzelfde segment2,3,4,5,6,7,8,9bevinden. Experimenten met veel dikkere plakjes (>1 mm) zijn in andere laboratoria gebruikt om te begrijpen hoe bilaterale ingangen integreren in gebieden van het superieure olivarycomplex (SOC), waaronder de mediale superieure olijf10,11. Deze plakjes werden zodanig bereid dat axonen van de gehoorzenuw (AN) intact bleven in de slice en werden elektrisch gestimuleerd om synaptische neurotransmitter release in de CN te starten, het nabootsen van activiteit van de eerste orde auditieve neuronen als ze zouden reageren op geluid. Een groot nadeel van deze dikke plakjes is de zichtbaarheid van neuronen voor patch-clamp elektrofysiologische opnames ("patching"). Patchen wordt steeds moeilijker als de vele axonen in dit gebied worden myelinated met de leeftijdvan 12,13,14,15, waardoor het weefsel optisch dicht en verduisterend neuronen, zelfs in een typische, dunne hersenen slice. Ons doel is om in vitro preparaten te creëren die meer lijken op de circuitconnectiviteit van in vivo opnames, maar met de hoge doorvoer en hoge-resolutie opnamemogelijkheden van visueel geleide patch-clamp elektrofysiologie in hersensegmenten.

Ons lab onderzoekt de fysiologie van neuronen van het auditieve efferentsysteem, waaronder MOC-neuronen. Deze cholinerge neuronen geven efferent feedback aan het slakkenplaat door de activiteit van buitenste haarcellen (OHC's)16,17,18,19,20te moduleren . Eerdere studies hebben aangetoond dat deze modulatie een rol speelt bij het verkrijgen van controle in het slakkenmiddel21,22,23,24,25,26 en bescherming tegen akoestisch trauma27,28,29,30,31,32,33. Bij muizen bevinden MOC-neuronen zich diffuus in de ventrale kern van het trapeziumlichaam (VNTB) in de auditieve hersenstam1. Onze groep heeft gebruik gemaakt van de ChAT-IRES-Cre muislijn gekruist met de tdTomato reporter muislijn te richten MOC neuronen in hersenstam plakjes onder epifluorescente verlichting. We toonden aan dat MOC-neuronen afferente-remmende input ontvangen van de ipsilaterale mediale kern van het trapeziumlichaam (MNTB), dat op zijn beurt wordt opgewekt door axonen van bolvormige bossige cellen (GBC) in de contralaterale cochleaire kern (CN)34,35,36,37,38. Bovendien ontvangen MOC-neuronen waarschijnlijk hun excitatory input van T-stellate cellen in de contralaterale GN39,40,41. Samen tonen deze studies aan dat MOC-neuronen zowel excitatory als remmende ingangen ontvangen die zijn afgeleid van hetzelfde (contralaterale) oor. Echter, de presynaptische neuronen, en hun axonen convergerende op MOC neuronen, zijn niet helemaal dicht genoeg bij elkaar om volledig intact in een typische coronale slice voorbereiding. Om te onderzoeken hoe de integratie van synaptische ingangen naar MOC-neuronen hun actiepotentieel beïnvloedt, met een focus op nieuw beschreven remming, ontwikkelden we een preparaat waarin we de diverse afferents naar MOC-neuronen vanuit één oor konden stimuleren op de meest fysiologisch realistische manier mogelijk, maar met de technische voordelen van in vitro brain slice-experimenten.

De wig slice is een gemodificeerde dikke slice voorbereiding ontworpen voor onderzoek van circuit integratie in MOC neuronen (schematized in figuur 1A). Aan de dikke kant van de plak, de wig bevat de afgehakte axonen van de gehoorzenuw (hierna "auditieve zenuwwortel" genoemd) als ze de hersenstam van de periferie en synaps in de CN binnendijzen. De gehoorzenuwwortel kan elektrisch worden gestimuleerd om neurotransmitter-release en synaptische activering van cellen van de volledig intacte GN42,43,44,45,46op te roepen . Dit stimulatieformaat heeft verschillende voordelen voor circuitanalyse. Ten eerste, in plaats van het direct stimuleren van de T-stellate en GBC axonen die afferent input te leveren aan de MOC neuronen, stimuleren we de AN om activering van intrinsieke circuits overvloedig in de CN mogelijk te maken. Deze circuits moduleren de output van CN-neuronen naar hun doelen in de hersenen, waaronder MOC-neuronen46,47,48,49,50,51. Ten tweede, de polysynaptische activering van afferent circuits van de AN via de CN stroomopwaarts van MOC neuronen zorgt voor meer natuurlijke activering timing en voor plasticiteit optreden bij deze synapsen als ze in vivo zou tijdens auditieve stimulatie. Ten derde kunnen we onze stimulatiepatronen variëren om EEN activiteit na te bootsen. Ten slotte zijn zowel excitatory als remmende monaurale projecties voor MOC-neuronen intact in de wigschijf, en hun integratie kan worden gemeten in een MOC-neuron met de precisie van patch-clamp elektrofysiologie. Als geheel, dit activeringsschema biedt een meer intact circuit aan de MOC neuronen in vergelijking met een typische hersenen slice voorbereiding. Deze hersenstam wig slice kan ook worden gebruikt om andere auditieve gebieden die remmende input ontvangen van ipsilaterale MNTB met inbegrip van de laterale superieure olijf, superieure olivary kern en mediale superieure olijf10,11,52,53,54,55,56te onderzoeken . Naast onze specifieke voorbereiding kan deze snijmethode worden gebruikt of aangepast om andere systemen te evalueren met de voordelen van het behoud van connectiviteit van lange-afstandsingangen en het verbeteren van de visualisatie van neuronen voor een verscheidenheid aan eencellige resolutie elektrofysiologie of beeldvormingstechnieken.

Dit protocol vereist het gebruik van een vibratome stage of platform dat ongeveer 15° kan worden gekanteld. Hier gebruiken we een commercieel beschikbare 2-delige magnetische fase waar de "fase" is een metalen schijf met een gebogen bodem geplaatst in een holle magnetische "stage base." Het stadium kan vervolgens worden verschoven om de segmenthoek aan te passen. Concentrische cirkels op de podiumbasis worden gebruikt om de hoek reproduceerbaar te schatten. Het podium en de trapbasis worden in de snijkamer geplaatst, waar ook de magnetische trapbasis kan worden gedraaid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle experimentele procedures werden goedgekeurd door het National Institute of Neurological Disorders and Stroke / National Institute on Doofness and Other Communication Disorders Animal Care and Use Committee.

1. Experimentele preparaten

OPMERKING: Details met betrekking tot de bereiding van de slice, waaronder snijoplossing, snijtemperatuur, segment incubatietemperatuur en apparatuur (enz.) zijn specifiek voor de voorbereiding van de hersenstam die in dit experiment wordt uitgevoerd. Segment incubatiedetails kunnen per laboratoriumervaring worden gewijzigd.

  1. Bereid interne oplossingen voor patch-clamping.
    1. Bereid spanningsklemoplossing voor die (in mM) 76 C-methanesulfonaat bevat, 56 CsCl, 1 MgCl2, 1 CaCl2, 10 HEPES, 10 EGTA, 0.3 Na-GTP, 2 Mg-ATP, 5 Na2-fosphocreatine, 5 QX-314 en 0.01 Alexa Fluor-488 hydrazide. Pas de pH aan op 7.2 met CsOH.
    2. Bereid de huidige klemoplossing voor die (in mM) 125 K-gluconaat, 5 KCl, 1 MgCl2, 0.1 CaCl2, 10 HEPES, 1 EGTA, 0.3 Na-GTP, 2 Mg-ATP, 1 Na2-fosfocreatine en 0.01 Alexa Fluor-488 hydrazide. Pas de pH aan op 7,2 met KOH.
  2. Bereid 100 mL van 4% agar door het toevoegen van 4 g agar tot 100 mL heet (in de buurt kokend) water. Plaats op verwarmde roerplaat om de temperatuur te behouden en roer tot volledig opgelost. Giet in 100 mm plastic petrischaaltjes tot ongeveer 1 cm diepte en laat afkoelen. Koel tot het nodig is.
  3. Bereid 1 L kunstmatige hersenvocht (ACSF) met in mM: 124 NaCl, 1.2 CaCl2, 1.3 MgSO4, 5 KCl, 26 NaHCO3, 1.25 KH2PO4en 10 dextrose. Bubble met carbogen (5% CO2 / 95% O2) gedurende ten minste 10 min, dan aanpassen definitieve pH tot 7,4 met 1 M NaOH indien nodig. Behoud oxygenatie en pH van de oplossing door continu borrelen met carbogen tijdens het experiment.
  4. Bereid 200 mL snijoplossing voor door 1 mM kynurenic acid toe te voegen aan ACSF. Sonicaatoplossing in een sonicerend waterbad gedurende 10 minuten tot kynurenic zuur is opgelost. Voortdurend bellen met carbogen en plaats op ijs.
    LET OP: Gebruik de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen bij het hanteren van kynurenic acid.
  5. Monteer een passend mes in het vibratome volgens de instructies van de fabrikant. Chill vibratome snijden kamer door het omringen met ijs.

2. Hersenverwijdering met intacte gehoorzenuwwortel voor stimulatie

OPMERKING: Muizen voor deze experimenten werden verkregen door het kruisen van ChAT-IRES-Cre transgene muizen op een C57BL/6J achtergrond met tdTomato reporter muizen (Ai14). Muizen die werden gebruikt voor histologie en elektrofysiologie waren post-hearing begin (P14-P23), dat is ongeveer P12 bij muizen. Neuronen die tdTomato uitdrukken in de ventrale kern van het trapeziumlichaam (VNTB) werden eerder gekenmerkt als MOC-neuronen in deze muislijn57.

  1. Euthanaseren (bijvoorbeeld CO 2-verstikking) en onthoofden het dier volgens goedgekeurde institutionele procedures.
  2. Met behulp van een scheermesje, snijd de huid op de middellijn van de schedel van de neus naar de achterkant van de nek. Schil de huid terug om de schedel bloot te leggen.
  3. Met behulp van kleine schaar, maak een incisie in de schedel via de middellijn vanaf de basis (caudal einde in de buurt van het ruggenmerg) van de schedel en verder naar de neus.
  4. Bij de lambda hechting, maak snijwonden in de schedel van de middellijn, laterale naar het oor aan beide zijden. Pel de schedel terug om de hersenen bloot te leggen.
  5. Beginnend bij het rostrale uiteinde, til voorzichtig de hersenen weg van de schedel met een kleine lab spatel of stompe tangen. Snijd de oogzenuw en blijven zachtjes werken de hersenen naar achteren, het blootstellen van de ventrale oppervlak.
  6. Snijd de trigeminuszenuwen door ze te knijpen met fijne tangen in de buurt van het ventrale oppervlak van de hersenstam.
    LET OP: Doe dit zorgvuldig als de vestibulocochlear zenuw ligt net onder deze en moet intact zijn voor eventuele stimulatie.
  7. Plaats de bereiding in een glazen petrischaal gevuld met koude snijoplossing. Plaats de schotel onder een ontledenmicroscoop. Zachtjes bellen met carbogen.
  8. Trim de gezichtszenuw dicht bij de hersenstam en bloot de vestibulocochlear zenuw.
  9. Met behulp van fijne tangen, duw de tips in de foramina waar de vestibulocochlear zenuw verlaat de schedel zo ver mogelijk en knijp de zenuw om het te verbreken, waardoor de zenuwwortel verbonden aan de hersenstam. Herhaal dit aan de andere kant.
  10. Zodra beide zenuwwortels vrij zijn, verwijder de hersenvliezen en vasculatuur van het ventrale oppervlak van de hersenstam in de buurt van het trapeziumlichaam.
  11. Bevrijd de hersenen volledig van de schedel door knijpen de resterende craniale zenuwen en bindweefsel zorgen voor het resterende ruggenmerg te behouden indien mogelijk.

3. Blokkeren en monteren van hersenen op het podium (magnetische schijf)

  1. Bereid het oppervlak van de hersenen vast te stellen aan het stadium door het blokkeren van de hersenen op het niveau van de optische chiasm.
    1. Met het ventrale oppervlak omhoog, stabiliseer de hersenen met behulp van een stomp gereedschap om het ruggenmerg zachtjes te immobiliseren, zodat de hersenen niet kantelen tijdens de volgende stap.
    2. Op het niveau van de optische chiasm, gebruik open tangen om het vliegtuig te maken voor het blokkeren van de hersenen door het invoegen door de hersenen naar de onderkant van de schotel. Plaats de tangen onder een hoek van ongeveer 20° van verticaal, zodat de uiteinden het dorsale oppervlak van de hersenen caudal naar de optische chiasm verlaten.
    3. Snijd langs de tang met behulp van het scheermesje.
  2. Lijm de hersenen aan het oppervlak van het podium.
    1. Bereid een klein blok (~ 1 cm3) van 4% agar voor de ondersteuning van de hersenen.
    2. Plaats een kleine druppel lijm op het podium en verspreid het in een rechthoek, zodat zowel de hersenen en agar blok kan worden gelijmd.
    3. Met behulp van tangen, voorzichtig til de hersenen en zachtjes deppen van de overtollige vloeistof met behulp van de rand van een papieren handdoek. Plaats het geblokkeerde oppervlak op de lijm, ventrale oppervlak zal worden naar het blad tijdens het snijden.
    4. Duw de agar blok zachtjes tegen het dorsale oppervlak van de hersenen om het te ondersteunen tijdens het snijden en om een goede positionering van de hersenen (dat wil zeggen, hoek) te garanderen.

4. Slice hersenen om wig slice te maken

OPMERKING: Bereid een hersenschijfje voor met behulp van vibratome met de cochleaire zenuwwortel aan de dikke kant en mediale olivocochleaire (MOC) neuronen en de mediale kern van het trapeziumlichaam (MNTB) aan de dunne kant.

  1. Plaats de magnetische schijf met bijgevoegde hersenen op de podiumbasis en plaats deze in de snijkamer met het ventrale oppervlak van de hersenen gericht op het blad.
  2. Vul de kamer met ijskoude snijoplossing en bel met carbogen.
  3. Laat het mes in de oplossing zakken en snijd plakjes caudal naar het gebied van belang om ervoor te zorgen dat de plakjes symmetrisch zijn. Als de segmenten asymmetrisch lijken, kantelt u het podium iets om symmetrie te verkrijgen.
    OPMERKING: Bladsnelheden tussen 0,05-0,10 mm/s waren effectief voor het snijden van gezonde plakjes en kunnen variëren afhankelijk van de leeftijd van de dieren en het hersengebied.
  4. Zodra de plakjes symmetrisch zijn, verschuift het stadium ~15° (overeenkomend met ongeveer 3 concentrische ringen op de podiumbasis) naar één kant.
    OPMERKING: Verleg het stadium weg van de gehoorzenuwwortel die u in het segment wilt behouden.
  5. Blijf zorgvuldig snijden totdat de gehoorzenuwwortel aan de ene kant dicht bij het oppervlak ligt en de gezichtszenuw aan het oppervlak van de andere kant kan worden gezien.
  6. Verplaats het podium 15° naar de oorspronkelijke positie.
  7. Beweeg het mes uit de buurt van het weefsel en draai de trapbasis 90° zodat de zijdelingse rand van de dunne zijde naar het blad wordt gericht. Laat het mes enkele honderden micron zakken en breng het mes dan langzaam dicht bij de rand van het weefsel. Herhaal dit totdat het mes de zijdelingse rand raakt. Laat het blad zakken tot de gewenste dikte van de dunne rand van het plakje, hier nog eens tweehonderd micron.
    OPMERKING: De resulterende slice is idealiter ~ 300 mm dik op het niveau van de ventrale kern van het trapeziumlichaam (VNTB) aan de kant waar patchklemmen zal plaatsvinden.
  8. Beweeg het mes terug uit de buurt van het weefsel en draai de trapbasis terug, zodat het ventrale oppervlak naar het hoofd gericht is.
  9. Maak de snede die het rostrale oppervlak van de wigschijf aanwijst. Breng het segment naar beneden op een stuk interfacepapier(1 cm 2). Verplaats het segment naar de incubatiekamer of een ander geschikt incubatieapparaat voor terugwinning (30 min bij 35 °C).
    OPMERKING: De gezichtszenuw moet zichtbaar zijn op beide hemisferen van het segment op het rostrale oppervlak (zie figuur 1B).

5. Opzetten en opnemen van elektrofysiologie

  1. Plaats het wigsegment in de opnamekamer en bevestig het segment met een harp of stabilisatiesysteem. Doorsnee het weefsel continu met een snelheid van 7-10 mL/min met warme (35 °C) ACSF borrelde met carbogen.
  2. Identificeer genetisch gelabelde MOC-neuronen in de VNTB met behulp van epifluorescentie met 561 nm emissiefilters voor patch-clamp opnames. Flip slice als er geen potentieel patchbare cellen.
  3. Met behulp van DIC optica, richten op de gehoorzenuwwortel op de dikke kant van de plak en gebruik een micromanipulator om de bipolaire wolfraam stimulerende elektrode naar beneden te verplaatsen naar de gehoorzenuwwortel en zachtjes in het oppervlak van het weefsel.
    OPMERKING: Zuigelektroden zijn gebruikt in auditieve zenuwstimulatie experimenten in andere laboratoria. Theta glas elektroden, of optische stimulatie methoden kunnen worden gebruikt indien van toepassing op andere specifieke preparaten.
  4. Verplaats het gezichtsveld terug naar de VNTB om een MOC-neuron te kiezen om te targeten voor patchklem elektrofysiologie.
  5. Vul een opnamepipet met de juiste interne oplossing voor het voorgestelde experiment.
  6. Patch en record van de MOC neuron in de hele cel configuratie. Compenseer membraancapaciteit en serieweerstand indien nodig.
  7. Pas de elektrische stimulatieamplitude van de gehoorzenuwwortel aan om consistente postsynaptische gebeurtenissen in het MOC-neuron te verkrijgen.
    LET OP: Het kan nodig zijn om de stimulatieelektrode te verplaatsen.
  8. Voer geschikte stimulatieprotocollen uit om opgeroepen synaptische stromen in MOC (spanningsklem) of actiepotentieelpatronen (huidige klem) te observeren.
    OPMERKING: De wig slice voorbereiding kan worden gebruikt met een typische patch-clamp tools zoals losse patch opnames, farmacologie, optogenetica, calcium imaging, neurotransmitter uncaging, enz.

6. Histologische bevestiging van hersenstamkernen

LET OP: Dit wordt gedaan met cresyl violet kleuring, in vaste, opnieuw doorsneden wig schijf. Deze methode maakt visualisatie van kernen die zijn opgenomen in het segment.

  1. Na het voorbereiden van een wig slice, dompel slice in fixative (4% PFA in PBS) 's nachts. Spoel het plakje 3x gedurende 10 minuten in PBS (kamertemperatuur op een shaker) en plaats vervolgens vervolgens 30% sacharose in PBS 's nachts bij 4 °C om cryoprotect te krijgen.
  2. Re-sectie van de plak op een bevriezing microtome (40-70 mm) en het verzamelen van seriële secties in een 24 put plaat in PBS.
  3. Monteer secties op gelatine gecoate glijbanen en laat volledig drogen. Plaats dia's in diawagen.
  4. Cresyl violet oplossingen voorbereiden
    1. Bereid 1% cresyl violet acetaat door het mengen van 5 g cresyl violet acetaat in 500 mL dH2O
    2. Bereid acetaatbuffer voor door eerst 90 mL-oplossing A (540 mL glaciale azijnzuur + 89,46 mL dH2O) en 10 mL-oplossing B (136 mg natriumacetaat in 10 mL dH2O) voor te bereiden. Combineer oplossing A en oplossing B die de acetaatbuffer oplevert.
    3. Combineer 1% cresyl violet acetaat met de acetaatbuffer 1:1 voor 0,5% cresylviolet in acetaatbuffer. Filter voor gebruik.
    4. Bereid 95% en 70% ethanol door 100% ethanol te verdunnen met de juiste hoeveelheden dH2O
  5. Voer cresyl violet kleuring protocol. Verplaats de schuifwagen door oplossingsbakken, blotting overtollige oplossing op een papieren handdoek tussen trays: xyleen – 5 min; 95% ethanol – 3 min; 70% ethanol – 3 min; dH2O – 3 min; 0,5% cresyl violette oplossing – 8-14 min monitoring vaak totdat nucleaire kleuring donker paars wordt; dH2O – 3 min; 70% ethanol – 3 min; 95% ethanol – 1-2 min; 100% ethanol – dip dia's tweemaal; xyleen – 5 min; xyleen: 25 min tot de montage wordt uitgevoerd.
    LET OP: Gebruik xylenes alleen onder een rookkap.
  6. Verwijder dia's één voor één uit xyleen en plaats onmiddellijk afdekslips op dia's met behulp van montagemedium. Laat montagemedium te drogen ('s nachts).
  7. Afbeeldingssecties.

7. Biocytine-etikettering voor anterograde tracering van axonen in levend, niet-vast weefsel

  1. Maak een wig slice zoals hierboven (Stappen 2-4).
  2. Breng het segment over op interfacepapier (~1 cm2). Zoek onder een ontledenmicroscoop de CN aan de dikke kant van het plakje.
  3. Verwijder voorzichtig overtollige ACSF uit het gebied rond de plak door een hoek van een tissuepapier te draaien om de ACSF uit de buurt van het weefsel te trekken. Dit voorkomt dat de biocytine zich verspreidt naar omliggende gebieden van de slice die kunnen leiden tot opname in cellen buiten de CN.
  4. Selecteer met fijne tangen een klein kristal biocytine en plaats het op het oppervlak van de CN. Druk het kristal voorzichtig in het weefsel om contact met neuronen en de daaropvolgende opname in somata te bevorderen. Herhaal deze stap om de gewenste regio van belang te dekken, in dit geval CN-regio's met T-stellate en GBC neuronen.
  5. Plaats het segment in een incubatiekamer. Laat het segment 2-4 uur bij 35 °C uitbroeden om de opname en het transport van de biocytine mogelijk te maken. Na incubatie spoel je het plakje in ACSF af om biocytinedeeltjes te verwijderen.
  6. Plaats slice in fixative (4% PFA in PBS) 's nachts. Spoel 3x gedurende 10 minuten in PBS.
  7. Cryoprotect slice in 30% sacharose in PBS 's nachts bij 4 °C of totdat de slice zinkt.
  8. Resect het weefsel om dwarse delen te produceren op een ijskoude microtome op 70-100 mm.
  9. Procesweefsel met behulp van standaard immunohistochemische methoden met een fluorescerend geconjugeerd streptavidin.
    OPMERKING: Aanvullende immunohistochemie kan worden uitgevoerd op de secties als nuttig voor het labelen van presynaptische cellichamen, axonen, receptoren of andere synaptische moleculen die belangrijk zijn voor circuitvisualisatie (d.w.z. primaire antilichaamstappen mogen geen negatieve invloed hebben op de secundaire visualisatie van biocytine).
  10. Beeld het weefsel in.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Histologisch onderzoek van wigschijf
Voor ons onderzoek van auditieve hersenstam neuron functie, de wig slice voorbereiding is ontworpen om de auditieve zenuwwortel en CN contralaterale bevatten met de MOC neuronen gericht op opnames (voorbeeld slice weergegeven in figuur 1B). Eerste histologische onderzoek van het preparaat is belangrijk om te bevestigen dat de slice bevat de kernen die nodig zijn voor circuit activering en dat axonale projecties intact zijn. Twee celtypen binnen de CN geven geluidsinformatie aan MOC-neuronen. T-stellate cellen worden verondersteld om de excitatory input te bieden aan MOC neuronen39,40,41,58. Bolvormige borstelcellen (GBC) prikkelen MNTB-neuronen in de contralaterale hemisfeer (via de gespecialiseerde kelk van Held synaps)34,36,37,38,59,60 die op hun beurt remmende input geven aan MOC-neuronen57 (schematisch figuur 1A). Om de aanwezigheid van zowel T-stellate cellen als GBCs te bevestigen, hebben we een wigschijf opnieuw geneed (tot 50 μm) die door onderdompeling in 4% PFA werd bevestigd en cresylvioleting heeft uitgevoerd om somata te labelen. In de dikke kant van de wig slice (Figuur 2, linker hersenhelft), de CN was aanwezig in bijna zijn volledige rostro-caudal omvang. Bovendien waren de onderverdelingen rug- en ventrale van de GN intact (figuur 2; pijl en pijlpunt in S19). T-stellate neuronen en GBCs clusteren in de ventrale cochleaire kern in de buurt van waar de gehoorzenuw (figuur 2; pijl in S17) de GN61,62,63,64,65binnenkomt . De wig slice bevat ook neuronen van de MNTB ipsilaterale naar MOC neuronen van waaruit opnames worden uitgevoerd (dunne hemisfeer van de oorspronkelijke wig slice, rechterkant in figuur 2). Dit bevestigt dat ten minste een deel van de remmende input voor MOC-neuronen intact is(figuur 2, plakjes 1-15, gemarkeerd door gestippelde ovalen in S11).

In afzonderlijke experimenten bevestigden we dat de axonen en presynaptische terminals van CN-neuronen intact waren in de wigschijf met behulp van anterograde-etikettering met biocytine. Eerst werd de live wedge slice bereid en op interfacepapier geplaatst. Onmiddellijk na de voorbereiding van de wig slice, biocytine kristallen werden geplaatst in de CN die opname en anterograde vervoer langs axonen toegestaan tijdens een incubatietijd. Vervolgens werd het weefsel (70 mm secties) vastgesteld en opnieuw doorsneden. Kleuring van secties met fluorescerend gelabeld streptavidin werd uitgevoerd om axonen gelabeld met de biocytine visualiseren. Confocale beelden van deze secties tonen heldere etikettering in de CN waar de kristallen werden geplaatst en opgenomen in cellichamen (Figuur 3A, linker hersenhelft, onderbroken gebied). Axons verlaten van de CN langs de ventrale akoestische stria (Figuur 3A, witte pijlpunten) waren duidelijk gelabeld en kon worden gevolgd tot hun beëindiging punten. Biocytine-positieve puncta rond contralaterale MOC neuronen suggereren dat onze voorbereiding synaptische contacten van de GN(figuur 3B)behoudt. Evenzo, gelabeld calyces van Held in de contralaterale MNTB geven axonen projecteren van GBCs naar MNTB neuronen worden bewaard in de wig slice (Figuur 3C). Deze histologische onderzoeken bevestigen dat onze wigschijf zowel de cellichamen als de axonale projecties van de afferente-inputcircuits bevat voor MOC-neuronen, waardoor we postynaptische reacties kunnen meten die worden opgeroepen door stimulatie van de gehoorzenuw en de daaropvolgende voortplanting van activiteit door oplopende circuits.

Synaptische fysiologie in wigsegment
Integratie van excitatory en remmende synaptische ingangen vormt kritisch neuronale activiteit. We hebben onlangs beschreven remmende ingangen naar MOC neuronen van neuronen van de MNTB57, maar het effect van de integratie van deze ingangen met excitatory inputs op MOC neuron activiteit is onbekend. In een wig segment van een ChAT-IRES-Cre x tdTomato muis, spanning-klem opnames werden uitgevoerd van een MOC neuron. Stroom werd toegepast via een bipolaire wolfraam stimulerende elektrode aangedreven door een stimulus isolatie-eenheid op te roepen neurotransmitter release van presynaptische axonen. Eerst werd de ventrale akoestische stria (VAS) aan de middellijn elektrisch gestimuleerd om T-stellate axonen direct te activeren en MNTB-neuronen via GBC axon-stimulatie(figuur 4A),om de latentie te meten op postsynaptische reacties in een opnameconfiguratie die typische dunne-slice-experimenten nabootst(Figuur 4B), voorbeeldsporen, grijs, met potentieel -60 mV). In afzonderlijke experimenten werd de auditieve zenuwwortel gestimuleerd om monaurale opgaande circuits te activeren en werden postsynaptische reacties gemeten bij MOC-neuronen zoals hierboven beschreven. Elektrische stimulatie op beide locaties riep een snel elektrisch artefact op, gevolgd door multipeaked huidige reacties (voorbeeldreacties van AN-stimulatie in figuur 4C, zwarte sporen, met potentieel -60 mV). We vergeleken begin latentie maatregelen van de eerste postsynaptische stroom (PSC) opgeroepen met directe stimulatie van de VAS met die opgeroepen met auditieve zenuwstimulatie en vond een aanzienlijk langere latentie om een stimulatie gebeurtenissen. Dit werd toegeschreven aan de synaps van AN/CN (AN stimulatie: 5,27 ± 0,43 ms, mediaan ± mediane absolute afwijking (MAD), bereik 4.26-5,93 ms, n = 8; VAS-stimulatie: 1,98 ± 0,28 ms, mediaan ± MAD, bereik 0,75-3,46 ms, n = 17; Wilcoxon Ondertekend Rangen Test, p = 0,014, Figuur 4D). Deze resultaten bevestigen dat stimulatie van de auditieve zenuwwortel resulteert in synaptische activering van CN-neuronen en latere circuitactiviteit, die in vivo nauwer vertegenwoordigt – zoals timing dan directe stimulatie van T-stellate of GBC/MNTB-axonen.

Met onze cesium gebaseerde, hoge [Cl-] interne oplossing gebruikt in spanning klem, excitatory (glutamatergic) en remmende (GABA en glycinergic) PSC's zijn zowel naar binnen bij rust membraan potentieel (-60 mV) en dus niet te onderscheiden. Terwijl we circuitactiviteit in de AN-stimulerende configuratie oproepen, isoleerden we elektrisch de veronderstelde remmende input door het bedrijfpotentieel te verschuiven naar 0 mV, het geschatte omkeringspotentieel voor AMPA bemiddelde glutamatergic stromen. In ons voorbeeld neuron, naar buiten huidige reacties werden waargenomen op 0 mV(Figuur 4Ci, rode sporen) indicatief voor chloride geleidingen. Dit zijn waarschijnlijk GABA- of glycinergic synaptische reacties. Deze gegevens tonen het nut van de wig slice te activeren zowel excitatory en remmende ingangen naar MOC neuronen door het stimuleren van de auditieve zenuwwortel, met activering van de daaropvolgende afferent circuits. Verder werden diverse patronen van postsynaptische reacties opgeroepen door AN-stimulatie, wat suggereert dat zelfs onder omstandigheden van identieke stimulatie van AN axonen, de activiteit van het hele circuit dynamisch en complex is. Dit experimentele paradigma maakt een gedetailleerde analyse mogelijk van hoe complexe auditieve stimuli zich verspreiden door de hersenstam en integreren bij MOC-neuronen, waarbij de output van het MOC-efferentsysteem en de uiteindelijke impact op het slakkenstelsel worden bepaald.

Figure 1
Figuur 1: Segmentschema en voorbeeldafbeelding van segmenten. (A) Schematisch van het mediale olivocochleaire feedbackcircuit. Blauwe pijlen geven de afferent oplopende route naar MOC neuronen en zwarte pijlen geven de dalende feedback route van MOC neuronen naar de basis van buitenste haarcellen (OHC). (B) Brightfield beeld van een wig slice met etiketten van de gehoorzenuwwortel (ANR) en cochleaire kern (stippelde omtrek) aan de dikke kant. Sterretje geeft de geschatte locatie aan van de ventrale kern van het trapeziumlichaam waar MOC-neuronen zijn gericht op patch-klemmen aan de dunne kant van de wigschijf. Gestippelde zwarte lijnen geven de gezichtszenuwen aan die in beide hemisferen van de plak op het rostraloppervlak te zien zijn. IHC - binnenhaarcel, GBC - bolvormige borstelige cel, SPN - superieure paraolivary kern, MNTB - mediale kern van het trapeziumlichaam, VNTB - ventrale kern van het trapeziumlichaam, LSO - laterale superieure olijf. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Cresyl violet gekleurde delen van een wig segment dat werd opnieuw doorsneden op 50 μm. Elke andere sectie werd afgebeeld. Secties zijn genummerd rostral --> caudal. Wigsegmenten bevatten meestal het geheel van de cochleaire kern (CN), waaronder zowel de dorsale GN (pijl in S19) als de ventrale CN (pijlpunt in S19), auditieve zenuwwortel (open pijlpunt in S17) en een groot deel van de MNTB (donker gebied in de buurt van het ventrale oppervlak in S3-S15, gemarkeerd met streepjes ovaals in S11). D en V op schaal bar vertegenwoordigen rug en ventrale in slice oriëntatie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Axons van opgaande input voor MOC-neuronen uit de contralaterale cochleaire kern blijven intact in de wigschijf. (A) De rostral-meest sectie uit een wig segment genomen uit een P23 ChAT-IRES-Cre x tdTomato (rode fluorescentie) muis die opnieuw werd geneed (70 μm) en verwerkt voor biocytine visualisatie. Confocale afbeelding is een betegelde, maximale intensiteit projectie z-stack. Axons in de ventrale akoestische stria worden gemarkeerd door witte pijlpunten. Gestreend overzicht geeft het kleine gedeelte van de cochleaire kern aan dat in dit rostral-meest segment overblijft. Schaalbalk 500 μm. (B) Confocale afbeelding van een ChAT-IRES-Cre x tdTomato positief neuron in de VNTB met biocytine positieve puncta in de omliggende neuropil. Schaalbalk 50 μm. (C) Biocytine gelabeld axonen getoond kruising van de middellijn en termineren in de contralaterale MNTB als calyces van Held. Verticale stippellijn vertegenwoordigt de middellijn van het segment. Schaalbalk 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Elektrische stimulatie van afferent-ingangen in spanningsklem levert multipiekpostenynaptische stromen op in MOC-neuronen. (A) Schematisch van wigschijf met opnameopzet voor zowel ventrale akoestische stria (VAS) stimulatie (grijs stimulerende elektrode) als auditieve zenuw (AN) stimulatie (zwart stimulerende elektrode) van afferent ingangen aan MOC. (B) Voorbeelden van postsynaptische stromen (PSC's) van een individuele P17 neuron opgeroepen met een enkele elektrische stimulus in de buurt van de middellijn op -60 mV. (C)PSC's opgeroepen tijdens AN stimulatie bij -60 mV in een P15 neuron. (Ci) Voorbeeld PSC's in dezelfde cel als C opgeroepen op 0 mV holding potentieel (de geschatte omkering potentieel voor AMPA bemiddelde stromingen in onze opname setup, red). (D) Bevolkingsgegevens voor kwantificering van latentie aan eerst PSC voor VAS en AN stimulatie. Dozen: kwartielen, lijn inzet: mediaan, vierkante inzet: gemiddelde, snorharen: mediane absolute afwijking. * p < 0,05. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De snijden procedure hier beschreven genoemd een wig slice is krachtig voor het behoud van intacte presynaptische neuronale circuits, maar met de toegankelijkheid van de hersenen slice experimenten voor analyse van neuronale functie. Grote zorg moet worden genomen in een aantal eerste stappen om het nut van de voorbereiding voor circuit analyse te maximaliseren. De afmetingen van de wig moeten worden bevestigd aan de hand van histologisch onderzoek, dat integraal is voor de bevestiging dat zowel presynaptische kernen als hun axonale projecties zich in de voorbereide wigschijf bevinden. Slice geometrie kan wijziging vereisen als projecties worden doorgesneden of enkele axonen de doelkernen bereiken. Meer in het algemeen is de afwerking snede op de vibratome voor de wig slice is van cruciaal belang. Optimale wig slice voorbereiding vereist een combinatie van consistent gebruik van vibratome configuraties met inbegrip van het gebruik van concentrische cirkel markeringen op het podium basis, samen met aanpassing van de instellingen op basis van bekende hersenen oriëntatiepunten. Na optimalisatie van slice geometrie, registreerden we consistente PSC's in MOC neuronen opgeroepen door het elektrisch stimuleren van de auditieve zenuwwortel in 8 van de 18 wig plakjes. In ons vorige werk waren we in staat om remmende PSC's op te roepen via directe stimulatie van MNTB axonen in ongeveer 60% van de MOC-neuronen57,wat suggereert dat ons slagingspercentage hier slechts een bescheiden vermindering is gezien de lange waaier van de ingangen en noodzaak voor polysynaptische circuitactivering. Bij de voorbereiding van de slice, is het raadzaam om zich te vergissen op de dikkere kant als een afname van de zichtbaarheid als gevolg van een dikkere plak is gunstig over een onbruikbare sectie die onvolledig is of mist circuit connectiviteit. Elke slice configuratie of afmetingen kunnen worden gebruikt, zolang het segment past onder de opname microscoop doelstelling, is toegankelijk door patch en het stimuleren van elektroden (of andere sondes of apparatuur), en is dun genoeg voor optisch gebaseerde patch-klemmen op de postsynaptische cel van belang. Snelle, zachte dissectie en de juiste incubatie- en herstelomstandigheden zijn ook belangrijk om de levensvatbaarheid van het circuit te behouden voor patch-clamp experimenten. Specifiek voor onze auditieve hersenstam voorbereiding, de hersenen moeten zeer zorgvuldig worden verwijderd uit de schedel om intacte en functionele auditieve zenuwwortels te behouden. Stretching of scheuren van de zenuw zal invloed hebben op de mogelijkheid om de vezels te stimuleren en uitlokken activiteit in auditieve neuronen. Door het grotere volume weefsel in de plak kunnen modificatie van traditionele snijoplossingen, temperaturen, incubatiedetails en perfusiesystemen de gezondheid van het segment verbeteren. Hier maken we gebruik van kleine wijzigingen aan onze normale slice voorbereiding. Deze omvatten kortere herstel incubatietijden (30 minuten vs. 60 minuten) en snellere stroomsnelheden in de slice kamer perfusie systeem.

Zodra de segmentafmetingen en incubatiedetails zijn bepaald, moeten de functie en connectiviteit van verschillende componenten van circuits in het segment worden aangetoond. In onze voorbereiding zorgen we ervoor dat zowel excitatory als remmende ingangen, verondersteld om afkomstig te zijn uit de cochleaire kern met T-stellate en GBC (via de MNTB), aanwezig zijn zoals verwacht. Alternatieve stimulatie methoden zoals zuigelektroden voor de gehoorzenuw, of optische stimulatie methoden zoals optogenetica of focale neurotransmitter uncaging kan ook verhogen circuit activering of zorgen voor cel-type specifieke activering in combinatie met genetische targeting van cel subtypes.

Hoewel deze snijmethode hopelijk nuttig zal zijn voor veel systemen en circuits, zijn enkele van de beperkingen van standaard dunne segmentsecties ook relevant voor deze voorbereiding. Over het algemeen kan het moeilijk zijn om circuits te behouden met minder vlakke projectiepatronen, omdat axonen waarschijnlijk zouden worden doorgesneden. Het activeren van het circuit op de schedelzenuwen, zoals hier gedaan om auditieve ingangen na te bootsen, is mogelijk niet haalbaar in veel circuits. Net als bij andere slicepreparaten moet rekening worden gehouden met de netwerkeffecten van elke farmacologie. Bijvoorbeeld, bad toepassing van glutamaat receptor blokkers te isoleren remmende (GABA- of glycinergic) of andere wijzen van transmissie kan niet worden gebruikt met polysynaptische circuit activering wanneer glutamaat nodig is voor activering van neuronen stroomopwaarts van de gepatchte doelneuron. Dit geldt in ons geval als zowel AN / CN en GBC / MNTB synapsen zijn glutamatergic, daarom zou alle transmissie worden geëlimineerd bij MOC neuronen met bad toepassing van glutamaat receptor blokkers. Bovendien, de toepassing van GABA of glycine receptor blokkers om MNTB-MOC synaptische reacties te elimineren zou het onbedoelde gevolg van het elimineren van intrinsieke remmende connectiviteit binnen de CN die de patronen van afferent ingangen aan MOC neuronen kan vormen. Focale toepassing van receptorblokkers, met drukuitwerping of ionforenese, kan worden gebruikt om de farmacologische functie te beperken.

Ten slotte is de belangrijkste beperking hiervan, en elke in vitro-techniek, dat, hoewel deze voorbereiding de activering van monaurale opgaande auditieve circuits maximaliseert, de rest van het zenuwstelsel, inclusief perifere receptoren die stimuli coderen, afwezig is. Dit geldt ook voor het slakkenmiddel zelf, excitatory inputs from the other ear66, commissural CN connections67,68,69,70, and descending cortictic71,72,73,74 and collicular75,76 projections and modulatory inputs77,78,79,80 known to influence activity of CN and SOC nuclei. Hoewel het mogelijk is dat een deel van de dalende IC-projecties wordt gehandhaafd, zou het onmogelijk zijn om zowel corticale projecties als commissurale CN-projecties op te nemen als gevolg van de segmentgeometrie. Daarom richten we ons met de huidige experimenten op de opgaande auditieve circuits uit het slakkenkastje. De minimale dikte van de plak aan de dunne kant vermindert ook de mogelijkheid om binaurale polysynaptische circuit analyses uit te voeren, wat een voordeel is van symmetrische dikke slice preparaten10,11. Bovendien zijn we niet in staat om de gehoorzenuw te stimuleren met geluid om natuurlijke patronen van circuitactiviteit op te roepen. Gehoorzenuwreacties zijn tonotopisch gevarieerd, zenuwachtig en plastic81,82,83,84, waardoor het moeilijk is om perfect te simuleren met onze elektrische stimulatiemethode. Dit is een groot nadeel van in vitro experimenten in het auditieve systeem. Tonotopische beperking van onze stimulatie is niet mogelijk omdat het stimuleren van de gehele AN-wortel zal uitlokken spiking in AN vezels over de tonotopische gradiënt. Het nauwkeurig nabootsen van de diversiteit van AN fiber reacties (d.w.z. lage versus hoge spontane tariefvezels) aan een elektrisch stimuluspatroon is ook niet mogelijk. Het is ook moeilijk om precies overeenkomen met de dynamische intensiteit codering van meerdere AN vezels op de CN. We zijn echter in staat om onze elektrofysiologiesoftware te gebruiken om een verscheidenheid aan stimulatiepatronen te produceren die gericht zijn op het nabootsen van de juiste auditieve zenuwoutput tijdens verschillende akoestische stimuli (bijvoorbeeld korte, luide geluiden, stille, langdurige geluiden of geluiden in achtergrondgeluid) door de stimulusfrequentie te variëren tussen elektrische stimulusprotocollen en ook binnen een individueel protocol om gecombineerde AN-ingangen (gemodelleerd in ref.85)te benaderen. Monitoring MOC output tijdens deze experimenten zal testen onze hypothesen met betrekking tot welke stimulus patronen kunnen remmende of opwinding gunst bij MOC neuronen.

Ondanks de hierboven beschreven beperkingen, een wig slice voorbereiding methode heeft voordelen in vergelijking met in vivo en typische in vitro slice fysiologie methoden en kan worden gebruikt om in vivo circuit activering zo dicht mogelijk in het segment voor cellen die moeilijk toegankelijk zijn aanpak. In vivo hele cel opnames in de auditieve hersenstam zijn zeldzaam als gevolg van problemen bij de toegang tot dit gebied chirurgisch86. In plaats daarvan was de slice bereid om oplopende ingangen op te nemen voor MOC-neuronen die beginnen met de gehoorzenuw, die direct wordt gestimuleerd om het hele monaurale opgaande circuit te activeren. We tonen activering van zowel excitatory als remmende synaptische ingangen, en reacties op deze ingangen bieden waardevolle informatie over de timing van synaptische ingangen als ze de MOC-neuronen bereiken. Dit biedt een platform voor experimenten met hoge doorvoer waar we een groot repertoire van in vitro elektrofysiologie tools zoals calcium of voltage imaging, neurotransmitter uncaging, en zowel intracellulaire (via de patch pipet) en extracellulaire (via bad applicatie of iontophoresis) farmacologie. Het preparaat moet ook een toename van de doorvoer over dikke slice preparaten als gevolg van een betere zichtbaarheid van doelneuronen met behulp van DIC optica, die vervagen met verhoogde weefseldikte, vooral in de ventrale hersenstam. Over het algemeen biedt deze techniek verbeteringen in targeting en doorvoer over in vivo methoden, en betere mogelijkheden voor circuitanalyse dan traditionele segmentfysiologiemethoden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit onderzoek werd ondersteund door het Intramurale Onderzoeksprogramma van het NIH, NIDCD, Z01 DC000091 (CJCW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Experimental Preparations
Agar, powder Fisher Scientific BP1423500 4% agar block used to stabilize brain tissue during vibratome sectioning
AlexaFluor Hydrazide 488 Invitrogen A10436 Fluorophore used in internal solution to confirm successful MOC neuron patch
Analytical Balance Geneses Scientific (Intramalls) AV114 Weighing chemicals
Double edged razor blade Ted Pella 121-6 Vibratome cutting blade
Kynurenic acid (5g) Sigma Aldrich K3375-5G Slicing ACSF additive used to reduce neuron activity during dissection and slicing in order to improve tissue health for patch clamping
pH Meter Fisher Scientific (Intramalls) 13-620-451 Solution pH tester
Plastic petri dishes 100mm dia X 20mm Fisher Scientific (Intramalls) 12-556-002 4% Agar Prep
Stirring Hotplate Fisher Scientific (Intramalls) 11-500-150 Heating for 4% Agar preparation
Dissection and Slicing
Biocytin Sigma Aldrich B4261-250MG Chemical used for axonal tracing (conjugated to Streptavidin 488)
Dissecting Microscope Amscope SM-1BN For precision dissection during brain removal
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20 Fine forceps dissection tool
Economy tweezers #3 WPI 501976 Forceps dissection tool
Glass Petri Dish 150mm dia x 15mm H Fisher Scientific (Intramalls) 08-747E Dissection dish
Interface paper (203 X 254mm PCTE Membrane 10um) Thomas Scientific 1220823 Slice incubation/biocytin application
Leica VT1200S Vibratome Leica 1491200S001 Vibratome for wedge slice sectioning
Mayo scissors Roboz RS-6872 Dissection tool
Single-edged carbon steel blades Fisher Scientific (Intramalls) 12-640 Razor blade for dissection
Specimen disc, orienting Leica 14048142068 Specialized vibratome stage for reproducible tilting
Spoonula FisherSci 14-375-10 Dissection tool
Super Glue Newegg 15187 Used for glueing tissue to vibratome stage
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 91500-09 Dissection tool
Electrophysiology
A1R Upright Confocal Microscope Nikon Instruments Electrophysiology and imaging microscope, can be any microscope compatible with electrophysiology
Electrode Borosilicate glass w/ Filament OD 1.5mm, ID 1.1mm, 10 cm long Sutter Instrument BF150-110-10 Patch clamping pipette glass
Electrode Filler MicroFil WPI CMF20G Patch electrode pipette filler
In-line solution heater Warner Instruments (GSAdvantage) SH-27B Slice perfusion system heater
Multi-Micromanipulator Systems Sutter Intruments MPC-200 with MP285 Micromanipulators for patch clamp and stimulation electrode placement
P-1000 horizontal pipette puller for glass micropipettes Sutter instruments FG-P1000 Patch clamp pipetter puller
Patch-clamp amplifier and Software HEKA EPC-10 / Patchmaster Next Can be any amplifier/software
Recording Chamber Warner Instruments RC26G Slice "bath" during recording
Recording Chamber Harp Warner Instruments 640253 Stablizes slice during electrophysiology recording
Slice Incubation Chamber Custom Build Heated, oxygenated holding chamber for slices during recovery after slicing
Stimulus isolation unit A.M.P.I. Iso-Flex Stimulus isolation unit for electrophysiology
Syringe 60CC Fischer Scientific (Intramalls) 14-820-11 Electrophysiology perfusion fluid handling
Temperature controller Warner Instruments (GSAdvantage) TC-324C Slice perfusion system temperature controller
Tubing 1/8 OD 1/16 ID Fischer Scientific (Intramalls) 14-171-129 Electrophysiology perfusion fluid handling
Tugsten concentric bipolar microelectrode WPI TM33CCINS Stimulating electrode for electrophysiology
Histology
24 well Plate Fisher Scientific (Intramalls) 12-556006 Histology slice collection and immunostaining
Alexa Fluor 488 Streptavidin Jackson Immuno labs 016-540-084 Secondary antibody for biocytin visualization
Corning Orbital Shaker Sigma CLS6780FP Shaker for immunohistochemistry agitation
Cresyl Violet Acetate Sigma Aldrich (Intramalls) C5042-10G Cellular stain for histology
Disposable Microtome Blades Fisher Scientific 22-210-052 Sliding microtome blade
Filter-syringe Nalgene 4mm Cellulose Acetate 0.2um Fisher Scientific (Intramalls) 09-740-34A Syringe filter for filling recording pipettes with internal solution
Fluoromount-G Slide Mounting Medium Fisher Scientific OB100-01 Immunohistochemistry fluorescence mounting medium
glass slide staining dish with rack Fisher Scientific (Intramalls) 08-812 Cresyl Violet staining chamber
Microm HM450 Sliding Microtome ThermoFisher 910020 Freezing microtome for histology
Microscope Cover Glasses: Rectangles 50mm X 24mm Fisher Scientific (Intramalls) 12-543D Histochemistry slide cover glass
Permount mounting medium Fisher Scientific SP15-100 Cresyl violet section mounting medium
Superfrost Slides Fisher Scientific 22-034980 Histology slides

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Campbell, J. P., Henson, M. M. Olivocochlear neurons in the brainstem of the mouse. Hearing Research. 35 (2-3), 271-274 (1988).
  2. Grothe, B., Sanes, D. H. Synaptic inhibition influences the temporal coding properties of medial superior olivary neurons: An in vitro study. Journal of Neuroscience. 14, 1701-1709 (1994).
  3. Kotak, V. C., Sanes, D. H. Long-lasting inhibitory synaptic depression is age- and calcium-dependent. Journal of Neuroscience. 20 (15), 5820-5826 (2000).
  4. Smith, A. J., Owens, S., Forsythe, I. D. Characterisation of inhibitory and excitatory postsynaptic currents of the rat medial superior olive. The Journal of Physiology. 529 (3), 681-698 (2000).
  5. Scott, L. L., Mathews, P. J., Golding, N. L. Posthearing developmental refinement of temporal processing in principal neurons of the medial superior olive. Journal of Neuroscience. 25 (35), 7887-7895 (2005).
  6. Fischl, M. J., Combs, T. D., Klug, A., Grothe, B., Burger, R. M. Modulation of synaptic input by GABAB receptors improves coincidence detection for computation of sound location. Journal of Physiology. 590 (13), 3047-3066 (2012).
  7. Clause, A., et al. The Precise Temporal Pattern of Prehearing Spontaneous Activity Is Necessary for Tonotopic Map Refinement. Neuron. 82 (4), 822-835 (2014).
  8. Oertel, D. Use of brain slices in the study of the auditory system: Spatial and temporal summation of synaptic inputs in cells in the anteroventral cochlear nucleus of the mouse. Journal of the Acoustical Society of America. 78 (1), 328-333 (1985).
  9. Hermann, J., Pecka, M., Von Gersdorff, H., Grothe, B., Klug, A. Synaptic transmission at the calyx of held under in vivo-like activity levels. Journal of Neurophysiology. 98 (2), 807-820 (2007).
  10. Jercog, P. E., Svirskis, G., Kotak, V. C., Sanes, D. H., Rinzel, J. Asymmetric excitatory synaptic dynamics underlie interaural time difference processing in the auditory system. PLoS Biology. 8 (6), 1000406 (2010).
  11. Roberts, M. T., Seeman, S. C., Golding, N. L. A mechanistic understanding of the role of feedforward inhibition in the mammalian sound localization circuitry. Neuron. 78 (5), 923-935 (2013).
  12. Sinclair, J. L., et al. Sound-evoked activity influences myelination of brainstem axons in the trapezoid body. Journal of Neuroscience. 37 (34), 8239-8255 (2017).
  13. Wang, J., et al. Myelination of the postnatal mouse cochlear nerve at the peripheral-central nervous system transitional zone. Frontiers in Pediatrics. 1, 5-8 (2013).
  14. Long, P., Wan, G., Roberts, M. T., Corfas, G. Myelin development, plasticity, and pathology in the auditory system. Developmental Neurobiology. 78 (2), 80-92 (2018).
  15. Leão, R. M., et al. Presynaptic Na+ channels: Locus, development, and recovery from inactivation at a high-fidelity synapse. Journal of Neuroscience. 25 (14), 3724-3738 (2005).
  16. Fex, J. Efferent Inhibition in the Cochlea Related to Hair-Cell dc Activity: Study of Postsynaptic Activity of the Crossed Olivocochlear Fibres in the Cat. The Journal of the Acoustical Society of America. 41 (3), 666-675 (1967).
  17. Mountain, D. C. Changes in endolymphatic potential and crossed olivocochlear bundle stimulation alter cochlear mechanics. Science. 210 (4465), 71-72 (1980).
  18. Siegel, J. H., Kim, D. O. Efferent neural control of cochlear mechanics? Olivocochlear bundle stimulation affects cochlear biomechanical nonlinearity. Hearing Research. 6 (2), 171-182 (1982).
  19. Guinan, J. J. Cochlear efferent innervation and function. Current Opinion in Otolaryngology & Head and Neck Surgery. 18 (5), 447-453 (2010).
  20. Elgoyhen, A. B., Katz, E. The efferent medial olivocochlear-hair cell synapse. Journal of Physiology-Paris. 106 (1-2), 47-56 (2012).
  21. Galambos, R. Suppression of auditory nerve activity by stimulation of efferent fibers to cochlea. Journal of Neurophysiology. 19 (5), 424-437 (1956).
  22. Desmedt, J. E. Auditory-Evoked Potentials from Cochlea to Cortex as Influenced by Activation of the Efferent OlivoCochlear Bundle. Journal of the Acoustical Society of America. 34 (9), 1478-1496 (1962).
  23. Wiederhold, M. L., Kiang, N. Y. S. Effects of Electric Stimulation of the Crossed Olivocochlear Bundle on Single Auditory-Nerve Fibers in the Cat. The Journal of the Acoustical Society of America. 48 (4), 950-965 (1970).
  24. Wiederhold, M. L., Peake, W. T. Efferent Inhibition of Auditory-Nerve Responses: Dependence on Acoustic-Stimulus Parameters. Journal of the Acoustical Society of America. 40 (6), 1427-1430 (1966).
  25. Geisler, D. C. Hypothesis on the function of the crossed olivocochlear bundle. Journal of the Acoustical Society of America. 56 (6), 1908-1909 (1974).
  26. Guinan, J. J., Gifford, M. L. Effects of electrical stimulation of efferent olivocochlear neurons on cat auditory-nerve fibers. III. Tuning curves and thresholds at CF. Hearing Research. 37 (1), 29-45 (1988).
  27. Rajan, R. Involvement of cochlear efferent pathways in protective effects elicited with binaural loud sound exposure in cats. Journal of Neurophysiology. 74 (2), 582-597 (1995).
  28. Rajan, R. Effect of electrical stimulation of the crossed olivocochlear bundle on temporary threshold shifts in auditory sensitivity. II. Dependence on the level of temporary threshold shifts. Journal of Neurophysiology. 60 (2), 569-579 (1988).
  29. Reiter, E. R., Liberman, M. C. Efferent-mediated protection from acoustic overexposure: Relation to slow effects of olivocochlear stimulation. Journal of Neurophysiology. 73 (2), 506-514 (1995).
  30. Taranda, J., et al. A point mutation in the hair cell nicotinic cholinergic receptor prolongs cochlear inhibition and enhances noise protection. PLoS Biology. 7 (1), 1000018 (2009).
  31. Maison, S. F., Usubuchi, H., Liberman, C. M. Efferent feedback minimizes cochlear neuropathy from moderate noise exposure. Journal of Neuroscience. 33 (13), 5542-5552 (2013).
  32. Tong, H., et al. Protection from noise-induced hearing loss by Kv2. 2 potassium currents in the central medial olivocochlear system. Journal of Neuroscience. 33 (21), 9113-9121 (2013).
  33. Boero, L. E., et al. Enhancement of the medial olivocochlear system prevents hidden hearing loss. Journal of Neuroscience. 38 (34), 7440-7451 (2018).
  34. Spirou, G. A., Brownell, W. E., Zidanic, M. Recordings from cat trapezoid body and HRP labeling of globular bushy cell axons. Journal of Neurophysiology. 63 (5), 1169-1190 (1990).
  35. von Gersdorff, H., Borst, J. G. G. Short-term plasticity at the calyx of held. Nature Reviews Neuroscience. 3 (1), 53-64 (2002).
  36. Smith, P. H., Joris, P. X., Carney, L. H., Yin, T. C. T. Projections of physiologically characterized globular bushy cell axons from the cochlear nucleus of the cat. Journal of Comparative Neurology. 304 (3), 387-407 (1991).
  37. Kuwabara, N., DiCaprio, R. A., Zook, J. M. Afferents to the medial nucleus of the trapezoid body and their collateral projections. Journal of Comparative Neurology. 314 (4), 684-706 (1991).
  38. Friauf, E., Ostwald, J. Divergent projections of physiologically characterized rat ventral cochlear nucleus neurons as shown by intra-axonal injection of horseradish peroxidase. Experimental Brain Research. 73 (2), 263-284 (1988).
  39. De Venecia, R. K., Liberman, M. C., Guinan, J. J., Brown, M. C. Medial olivocochlear reflex interneurons are located in the posteroventral cochlear nucleus: A kainic acid lesion study in guinea pigs. Journal of Comparative Neurology. 487 (4), 345-360 (2005).
  40. Darrow, K. N., Benson, T. E., Brown, M. C. Planar multipolar cells in the cochlear nucleus project to medial olivocochlear neurons in mouse. Journal of Comparative Neurology. 520 (7), 1365-1375 (2012).
  41. Brown, M. C., De Venecia, R. K., Guinan, J. J. Responses of medial olivocochlear neurons: Specifying the central pathways of the medial olivocochlear reflex. Experimental Brain Research. 153 (4), 491-498 (2003).
  42. Wang, Y., Manis, P. B. Synaptic transmission at the cochlear nucleus endbulb synapse during age-related hearing loss in mice. Journal of Neurophysiology. 94 (3), 1814-1824 (2005).
  43. Golding, N. L., Robertson, D., Oertel, D. Recordings from slices indicate that octopus cells of the cochlear nucleus detect coincident firing of auditory nerve fibers with temporal precision. Journal of Neuroscience. 15 (4), 3138-3153 (1995).
  44. Ferragamo, M. J., Golding, N. L., Oertel, D. Synaptic inputs to stellate cells in the ventral cochlear nucleus. Journal of Neurophysiology. 79 (1), 51-63 (1998).
  45. Oertel, D. Synaptic responses and electrical properties of cells in brain slices of the mouse anteroventral cochlear nucleus. Journal of Neuroscience. 3 (10), 2043-2053 (1983).
  46. Xie, R., Manis, P. B. Radiate and planar multipolar neurons of the mouse anteroventral cochlear nucleus: Intrinsic excitability and characterization of their auditory nerve input. Frontiers in Neural Circuits. 11, 1-17 (2017).
  47. Wu, S., Oertel, D. Inhibitory circuitry in the ventral cochlear nucleus is probably mediated by glycine. The Journal of Neuroscience. 6 (9), 2691-2706 (1986).
  48. Xie, R., Manis, P. B. Target-specific IPSC kinetics promote temporal processing in auditory parallel pathways. Journal of Neuroscience. 33 (4), 1598-1614 (2013).
  49. Wickesberg, R. E., Oertel, D. Delayed, frequency-specific inhibition in the cochlear nuclei of mice: A mechanism for monaural echo suppression. Journal of Neuroscience. 10 (6), 1762-1768 (1990).
  50. Campagnola, L., Manis, P. B. A map of functional synaptic connectivity in the mouse anteroventral cochlear nucleus. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2214-2230 (2014).
  51. Doucet, J. R., Ryugo, D. K. Projections from the ventral cochlear nucleus to the dorsal cochlear nucleus in rats. Journal of Comparative Neurology. 385 (2), 245-264 (1997).
  52. Kopp-Scheinpflug, C., et al. The sound of silence: Ionic mechanisms encoding sound termination. Neuron. 71 (5), 911-925 (2011).
  53. Alamilla, J., Gillespie, D. C. Maturation of Calcium-Dependent GABA, Glycine, and Glutamate Release in the Glycinergic MNTB-LSO Pathway. PLoS One. 8 (9), 0075688 (2013).
  54. Spangler, K. M., Warr, W. B., Henkel, C. K. The projections of principal cells of the medial nucleus of the trapezoid body in the cat. Journal of Comparative Neurology. 238 (3), 249-262 (1985).
  55. Kramer, F., et al. Inhibitory glycinergic neurotransmission in the mammalian auditory brainstem upon prolonged stimulation: Short-term plasticity and synaptic reliability. Frontiers in Neural Circuits. 8, 1-22 (2014).
  56. Roberts, M. T., Seeman, S. C., Golding, N. L. The relative contributions of MNTB and LNTB neurons to inhibition in the medial superior olive assessed through single and paired recordings. Frontiers in Neural Circuits. 8, 1-14 (2014).
  57. Torres Cadenas, L., Fischl, M. J., Weisz, C. J. C. Synaptic Inhibition of Medial Olivocochlear Efferent Neurons by Neurons of the Medial Nucleus of the Trapezoid Body. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 40 (3), 509-525 (2020).
  58. Brown, M. C., Mukerji, S., Drottar, M., Windsor, A. M., Lee, D. J. Identification of inputs to olivocochlear neurons using transneuronal labeling with pseudorabies virus (PRV). JARO - Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 14 (5), 703-717 (2013).
  59. Morest, D. K. The collateral system of the medial nucleus of the trapezoid body of the cat, its neuronal architecture and relation to the olivo-cochlear bundle. Brain Research. 9 (2), 288-311 (1968).
  60. Warr, B. W. Fiber degeneration following lesions in the multipolar and globular cell areas in the ventral cochlear nucleus of the cat. Brain Research. 40 (2), 247-270 (1972).
  61. Osen, K. K. Cytoarchitecture of the cochlear nuclei in the cat. Journal of Comparative Neurology. 136 (4), 453-483 (1969).
  62. Cant, N. B., Morest, D. K. The bushy cells in the anteroventral cochlear nucleus of the cat. A study with the electron microscope. Neuroscience. 4 (12), 1925-1945 (1979).
  63. Cant, N. B., Morest, D. K. Organization of the neurons in the anterior division of the anteroventral cochlear nucleus of the cat. Light-microscopic observations. Neuroscience. 4 (12), 1909-1923 (1979).
  64. Lauer, A. M., Connelly, C. J., Graham, H., Ryugo, D. K. Morphological Characterization of Bushy Cells and Their Inputs in the Laboratory Mouse (Mus musculus) Anteroventral Cochlear Nucleus. PLoS One. 8 (8), 1-16 (2013).
  65. Harrison, J. M., Warr, W. B. A study of the cochlear nuclei and ascending auditory pathways of the medulla. Journal of Comparative Neurology. 119 (3), 341-379 (1962).
  66. Robertson, D., Gummer, M. Physiological and morphological characterization of efferent neurones in the guinea pig cochlea. Hearing Research. 20 (1), 63-77 (1985).
  67. Bledsoe, S. C., et al. Ventral cochlear nucleus responses to contralateral sound are mediated by commissural and olivocochlear pathways. Journal of Neurophysiology. 102 (2), 886-900 (2009).
  68. Zhou, J., Zeng, C., Cui, Y., Shore, S. Vesicular glutamate transporter 2 is associated with the cochlear nucleus commissural pathway. JARO - Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 11 (4), 675-687 (2010).
  69. Kuenzel, T. Modulatory influences on time-coding neurons in the ventral cochlear nucleus. Hearing Research. 384, 107824 (2019).
  70. Cant, N. B., Gaston, K. C. Pathways connecting the right and left cochlear nuclei. Journal of Comparative Neurology. 212 (3), 313-326 (1982).
  71. Feliciano, M., Saldana, E., Mugnaini, E. Direct projections from the rat primary auditory neocortex to nucleus sagulum, paralemniscal regions, superior olivary complex and cochlear nuclei. Auditory Neuroscience. 1 (3), 287-308 (1995).
  72. Mulders, W. H. A. M., Robertson, D. Evidence for direct cortical innervation of medial olivocochlear neurones in rats. Hearing Research. 144 (1-2), 65-72 (2000).
  73. Schofield, B. R., Coomes, D. L. Pathways from auditory cortex to the cochlear nucleus in guinea pigs. Hearing Research. 216-217 (1-2), 81-89 (2006).
  74. Meltzer, N. E., Ryugo, D. K. Projections from auditory cortex to cochlear nucleus: A comparative analysis of rat and mouse. Anatomical Record - Part A Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 288 (4), 397-408 (2006).
  75. Schofield, B. R., Cant, N. B. Descending auditory pathways: Projections from the inferior colliculus contact superior olivary cells that project bilaterally to the cochlear nuclei. Journal of Comparative Neurology. 409 (2), 210-223 (1999).
  76. Thompson, A. M., Schofield, B. R. Afferent projections of the superior olivary complex. Microscopy Research and Technique. 51 (4), 330-354 (2000).
  77. Woods, C. I., Azeredo, W. J. Noradrenergic and serotonergic projections to the superior olive: Potential for modulation of olivocochlear neurons. Brain Research. 836 (1-2), 9-18 (1999).
  78. Mulders, W. H. A. M., Robertson, D. Morphological relationships of peptidergic and noradrenergic nerve terminals to olivocochlear neurones in the rat. Hearing Research. 144 (1-2), 53-64 (2000).
  79. Thompson, A. M., Thompson, G. C. Light microscopic evidence of serotoninergic projections to olivocochlear neurons in the bush baby (Otolemur garnettii). Brain Research. 695 (2), 263-266 (1995).
  80. Wang, X., Robertson, D. Substance P-induced inward current in identified auditory efferent neurons in rat brain stem slices. Journal of Neurophysiology. 80 (1), 218-229 (1998).
  81. Taberner, A. M., Liberman, M. C. Response properties of single auditory nerve fibers in the mouse. Journal of Neurophysiology. 93 (1), 557-569 (2005).
  82. Galambos, R., Davis, H. The response of single auditory-nerve stimulation. Journal of Neurophysiology. 6 (1), 39-57 (1943).
  83. Sachs, M. B., Abbas, P. J. Rate versus level functions for auditory-nerve fibers in cats: Tone-burst stimuli. Journal of the Acoustical Society of America. 56 (6), 1835-1847 (1974).
  84. Zhang, X., Heinz, M. G., Bruce, I. C., Carney, L. H. A phenomenological model for the responses of auditory-nerve fibers: I. Nonlinear tuning with compression and suppression. The Journal of the Acoustical Society of America. 109 (2), 648-670 (2001).
  85. Zilany, M. S. A., Bruce, I. C., Carney, L. H. Updated parameters and expanded simulation options for a model of the auditory periphery. The Journal of the Acoustical Society of America. 135 (1), 283-286 (2014).
  86. Franken, T. P., Smith, P. H., Joris, P. X. In vivo whole-cell recordings combined with electron microscopy reveal unexpected morphological and physiological properties in the lateral nucleus of the trapezoid body in the auditory brainstem. Frontiers in Neural Circuits. 10, 1-20 (2016).

Tags

Neurowetenschappen mediale olivocochlear neuronen in vitro slice elektrofysiologie synaptische integratie gehoorzenuw auditieve hersenstam cochleaire kern remmende transmissie
In Vitro Wedge Slice Voorbereiding voor het nabootsen van in Vivo Neuronal Circuit Connectiviteit
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fischl, M. J., Weisz, C. J. C. InMore

Fischl, M. J., Weisz, C. J. C. In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity. J. Vis. Exp. (162), e61664, doi:10.3791/61664 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter