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Neuroscience

Preparação de fatia de cunha in vitro para imitar conectividade do circuito neuronal vivo

Published: August 18, 2020 doi: 10.3791/61664
Automatic Translation
1, 1
1Section on Neuronal Circuitry, National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, NIH

Summary

A integração de diversas entradas sinápticas aos neurônios é melhor medida em uma preparação que preserva todos os núcleos pré-sinápticos para o tempo natural e a plasticidade do circuito, mas as fatias cerebrais normalmente cortam muitas conexões. Desenvolvemos uma fatia cerebral modificada para imitar a atividade do circuito in vivo, mantendo a capacidade de experimentação in vitro.

Abstract

Técnicas de eletrofisiologia de fatias in vitro medem a atividade unicelular com resolução elétrica e temporal precisa. As fatias cerebrais devem ser relativamente finas para visualizar adequadamente e acessar neurônios para fixação de patches ou imagens, e o exame in vitro dos circuitos cerebrais é limitado apenas ao que está fisicamente presente na fatia aguda. Para manter os benefícios da experimentação de fatias in vitro, preservando uma porção maior de núcleos pré-sinápticos, desenvolvemos uma nova preparação de fatias. Esta "fatia de cunha" foi projetada para gravações de eletrofisiologia de grampos para caracterizar as diversas entradas monaurais, orientadas ao som para neurônios olivococlear medial (MOC) no tronco cerebral. Esses neurônios recebem suas entradas excitatórias e inibitórias primárias de neurônios ativados por estímulos no ouvido contralateral e núcleo coclear correspondente (CN). Uma fatia cerebral assimétrica foi projetada que é mais espessa no domínio rostro-caudal na borda lateral de um hemisfério e, em seguida, se inclina em direção à borda lateral do hemisfério oposto. Esta fatia contém, no lado grosso, a raiz nervosa auditiva transmitindo informações sobre estímulos auditivos para o cérebro, os circuitos intrínsecos de CN, e tanto o inibidor excitatório e trissináptico aferentes caminhos que convergem em neurônios MOC contralaterais. A gravação é realizada a partir de neurônios MOC no lado fino da fatia, onde são visualizados usando óptica DIC para experimentos típicos de grampo de remendo. A estimulação direta do nervo auditivo é realizada à medida que entra no tronco cerebral auditivo, permitindo que a atividade intrínseca do circuito CN e a plasticidade sináptica ocorram em sinapses a montante dos neurônios MOC. Com essa técnica, pode-se imitar a ativação do circuito in vivo o mais próximo possível dentro da fatia. Esta preparação de fatia de cunha é aplicável a outros circuitos cerebrais onde as análises de circuitos se beneficiariam da preservação da conectividade upstream e de entradas de longo alcance, em combinação com as vantagens técnicas da fisiologia de fatias in vitro.

Introduction

A observação da atividade dos circuitos neurais é idealmente realizada com entradas sensoriais nativas e feedback, e conectividade intacta entre regiões cerebrais, in vivo. No entanto, a realização de experimentos que dão resolução unicelular da função do circuito neural ainda é limitada por desafios técnicos no cérebro intacto. Enquanto métodos de eletrofisiologia extracelular in vivo ou imagens multifotográficas podem ser usados para investigar a atividade em sistemas nervosos intactos, interpretar como diferentes insumos se integram ou medem entradas sinápticas subestresis permanecem difíceis. Gravações in vivo de células inteiras superam essas limitações, mas são desafiadoras de realizar, mesmo em regiões cerebrais que são facilmente acessadas. Os desafios técnicos dos experimentos de resolução unicelular são ainda mais amplificados em certas populações de neurônios que estão localizadas nas profundezas do cérebro, ou em populações espacialmente difusas que requerem ferramentas genéticas para localizar células in vivo (por exemplo, expressão genética de channelrhodopsin emparelhada com gravação optrode) ou identificação histoquímica pós-hoc após a gravação do local (por exemplo, com marcadores específicos de neurotransmissão). Estando localizados difusamente perto da superfície ventral do tronco cerebral, os neurônios olivococleares medial (MOC) sofrem das limitações acima1, tornando-os extremamente difíceis de acessar para experimentação in vivo.

As fatias cerebrais (~100-500 μm de espessura) têm sido usadas há muito tempo para estudar circuitos cerebrais, incluindo circuitos de tronco cerebral auditivo, devido à segregação física de neurônios conectados que estão contidos dentro da mesma fatia2,3,4,5,6,7,8,9. Experimentos com fatias muito mais grossas (>1 mm) têm sido empregados em outros laboratórios para entender como os insumos bilaterais se integram em áreas do complexo olivary superior (SOC), incluindo a azeitona superior medial10,11. Estas fatias foram preparadas de tal forma que os axônios do nervo auditivo (AN) permaneceram intactos dentro da fatia e foram eletricamente estimulados a iniciar a liberação de neurotransmissores sinápticos no CN, imitando a atividade dos neurônios auditivos de primeira ordem como eles responderiam ao som. Uma grande desvantagem dessas fatias grossas é a visibilidade dos neurônios para gravações eletrofisiológicas de grampo de remendo ("patching"). A remenda torna-se cada vez mais difícil à medida que os numerosos axônios nesta área tornam-se mieliados com12,13,14,15anos, tornando o tecido opticamente denso e obscurecendo neurônios mesmo em uma típica fatia cerebral fina. Nosso objetivo é criar preparações in vitro que se assemelham mais à conectividade do circuito de gravações in vivo, mas com as habilidades de gravação de alta produtividade e alta resolução da eletrofisiologia de grampos visualmente guiados em fatias cerebrais.

Nosso laboratório investiga a fisiologia dos neurônios do sistema auditivo e diferente, incluindo neurônios MOC. Estes neurônios colinérgicos fornecem feedback eferente à cóclea, modulando a atividade das células ciliares externas (OHCs)16,17,18,19,20. Estudos anteriores mostraram que essa modulação desempenha um papel no controle de ganhos na cóclea21,22,23,24,25,26 e proteção contra trauma acústico27,28,29,30,31,32,33. Em camundongos, os neurônios MOC estão divididos no núcleo ventral do corpo trapezoide (VNTB) no tronco cerebral auditivo1. Nosso grupo utilizou a linha de mouse ChAT-IRES-Cre cruzada com a linha de rato repórter tdTomato para atingir neurônios MOC em fatias de tronco cerebral sob iluminação epifluorescente. Mostramos que os neurônios MOC recebem uma entrada inibitória diferente do núcleo medial ipsilateral do corpo trapezoide (MNTB), que é animado, por sua vez, por axônios de células espessas globulares (GBC) no núcleo coclear contralateral (CN)34,35,36,37,38. Além disso, os neurônios MOC provavelmente recebem sua entrada excitatória de células T-estelares no CN39,40,41. Juntos, esses estudos mostram que os neurônios MOC recebem insumos excitatórios e inibitórios derivados do mesmo ouvido (contralateral). No entanto, os neurônios pré-sinápticos, e seus axônios convergindo em neurônios MOC, não são suficientemente próximos um do outro para estarem totalmente intactos em uma típica preparação de fatias coronais. Para investigar como a integração de entradas sinápticas aos neurônios MOC afeta seus padrões potenciais de ação, com foco na inibição recém-descrita, desenvolvemos uma preparação na qual poderíamos estimular os diversos afferents aos neurônios MOC de um ouvido da maneira mais fisiologicamente realista possível, mas com os benefícios técnicos de experimentos in vitro de fatias cerebrais.

A fatia de cunha é uma preparação de fatia grossa modificada projetada para a investigação da integração do circuito em neurônios MOC (esquematizado na Figura 1A). No lado grosso da fatia, a cunha contém os axônios decepados do nervo auditivo (denominado "raiz nervosa auditiva" daqui em diante) à medida que entram no tronco cerebral da periferia e da sinapse no CN. A raiz nervosa auditiva pode ser estimulada eletricamente para evocar a liberação de neurotransmissores e a ativação sináptica das células do CN42,43,44,45,46. Este formato de estimulação tem vários benefícios para a análise do circuito. Primeiro, em vez de estimular diretamente os axônios T-stellate e GBC que fornecem uma entrada diferente aos neurônios MOC, estimulamos o AN para permitir a ativação de circuitos intrínsecos abundantes no CN. Esses circuitos modulam a saída de neurônios CN para seus alvos em todo o cérebro, incluindo neurônios MOC46,47,48,49,50,51. Em segundo lugar, a ativação polissináptica de circuitos diferentes do AN através do a montante CN dos neurônios MOC permite que um tempo de ativação mais natural e para a plasticidade ocorra nessas sinapses como ocorreriam in vivo durante a estimulação auditiva. Terceiro, podemos variar nossos padrões de estimulação para imitar uma atividade. Finalmente, tanto as projeções monaural excitatórias quanto inibitórias para os neurônios MOC estão intactas na fatia da cunha, e sua integração pode ser medida em um neurônio MOC com a precisão da eletrofisiologia de grampo de remendo. Como um todo, este esquema de ativação fornece um circuito mais intacto para os neurônios MOC em comparação com uma preparação típica de fatia cerebral. Esta fatia de cunha do tronco cerebral também pode ser usada para investigar outras áreas auditivas que recebem insumos inibitórios do MNTB ipsilateral, incluindo a azeitona superior lateral, o núcleo olivary superior e a azeitona superior medial10,11,52,53,54,55,56. Além de nossa preparação específica, este método de corte pode ser usado ou modificado para avaliar outros sistemas com os benefícios de manter a conectividade de entradas de longo alcance e melhorar a visualização de neurônios para uma variedade de técnicas de eletrofisiologia de resolução unicelular ou de imagem.

Este protocolo requer o uso de um estágio ou plataforma vibratome que pode ser inclinado aproximadamente 15°. Aqui usamos um estágio magnético de 2 peças comercialmente disponível onde o "palco" é um disco de metal com um fundo curvo colocado em uma "base de estágio" magnética côncava. O estágio pode então ser deslocado para ajustar o ângulo da fatia. Círculos concêntricos na base do palco são usados para estimar o ângulo de forma reprodutível. O estágio e a base do palco são colocados na câmara de corte, onde a base do estágio magnético também pode ser girada.

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Protocol

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e AVC/Instituto Nacional de Surdez e Outros Transtornos de Comunicação Do Comitê de Cuidado e Uso de Animais.

1. Preparações experimentais

NOTA: Detalhes sobre a preparação de fatias, incluindo solução de corte, temperatura de corte, temperatura de incubação de fatias e aparelhos (etc.) são específicos para a preparação do tronco cerebral realizada neste experimento. Os detalhes da incubação da fatia podem ser alterados por experiência de laboratório.

  1. Prepare soluções internas para fixação de correção.
    1. Prepare a solução de grampo de tensão contendo (em mM) 76 Cs-metanosulfonato, 56 CsCl, 1 MgCl2, 1 CaCl2, 10 HEPES, 10 EGTA, 0.3 Na-GTP, 2 Mg-ATP, 5 Na2-fosphocreatine, 5 QX-314, e 0,01 Alexa Fluor-488 hydrazide. Ajuste o pH para 7.2 com CsOH.
    2. Prepare a solução de grampo atual contendo (em mM) 125 K-gluconato, 5 KCl, 1 MgCl2, 0.1 CaCl2, 10 HEPES, 1 EGTA, 0.3 Na-GTP, 2 Mg-ATP, 1 Na2-phosphocreatine e 0.01 Alexa Fluor-488 hydrazide. Ajuste o pH para 7.2 com KOH.
  2. Prepare 100 mL de 4% de ágar adicionando 4 g de ágar a 100 mL de água quente (perto de ferver). Coloque na placa de mexida aquecida para manter a temperatura e mexa até dissolver completamente. Despeje em pratos de Petri de plástico de 100 mm até aproximadamente 1 cm de profundidade e deixe esfriar. Leve à geladeira até que seja necessário.
  3. Prepare 1 L fluido cerebrospinal artificial (ACSF) contendo em mM: 124 NaCl, 1.2 CaCl2, 1.3 MgSO4, 5 KCl, 26 NaHCO3, 1.25 KH2PO4, e 10 dextrose. Bolha com carbogen (5% CO2 / 95% O2) por pelo menos 10 min, depois ajuste o pH final para 7,4 com 1 M NaOH se necessário. Mantenha a oxigenação e pH de solução borbulhando continuamente com carbogen durante todo o experimento.
  4. Prepare a solução de fatiamento de 200 mL adicionando ácido kynurenic de 1 mM ao ACSF. Solução sonicate em um banho de água sonicating por 10 minutos até que o ácido kynurnic seja dissolvido. Bolha contínua com carbogen e coloque no gelo.
    ATENÇÃO: Utilize equipamentos de proteção individual adequados ao manusear ácido kynurnic.
  5. Monte uma lâmina apropriada no vibratome seguindo as instruções do fabricante. Frio vibratome cortando câmara cercando-a com gelo.

2. Remoção cerebral com raiz nervosa auditiva intacta para estimulação

NOTA: Os ratos para esses experimentos foram obtidos cruzando camundongos transgênicos ChAT-IRES-Cre em um fundo C57BL/6J com ratos repórteres tdTomato (Ai14). Camundongos usados para histologia e eletrofisiologia foram início pós-audição (P14-P23), que é em torno de P12 em camundongos. Neurônios que expressam tdTomato no núcleo ventral do corpo trapezoid (VNTB) têm sido previamente caracterizados como neurônios MOC nesta linha de camundongos57.

  1. Eutanize (por exemplo, asfixia por CO2) e decapite o animal utilizando procedimentos institucionais aprovados.
  2. Usando uma lâmina de barbear, corte a pele na linha média do crânio do nariz para a parte de trás do pescoço. Descasque a pele para expor o crânio.
  3. Usando uma tesoura pequena, faça uma incisão no crânio através da linha média começando na base (extremidade caudal perto da medula espinhal) do crânio e continuando em direção ao nariz.
  4. Na sutura lambda, faça cortes no crânio a partir da linha média, lateral em direção à orelha em ambos os lados. Descasque o crânio para expor o cérebro.
  5. Começando na extremidade rostral, levante suavemente o cérebro do crânio com uma pequena espátula de laboratório ou fórceps contundentes. Corte o nervo óptico e continue a trabalhar suavemente o cérebro para trás, expondo a superfície ventral.
  6. Corte os nervos trigêmeos beliscando-os com fórceps finos perto da superfície ventral do tronco cerebral.
    NOTA: Faça isso cuidadosamente, pois o nervo vestibulococochlear está logo abaixo disso e precisa estar intacto para uma eventual estimulação.
  7. Coloque a preparação em uma placa de vidro Petri cheia de solução de corte frio. Coloque o prato sob um microscópio dissecando. Bolha suavemente com carbogen.
  8. Corte o nervo facial perto do tronco cerebral e exponha o nervo vestibulocochlear.
  9. Usando fórceps finos, empurre as pontas para a foramina onde o nervo vestibulocochlear sai do crânio o mais longe possível e belisque o nervo para cortá-lo, deixando a raiz nervosa presa ao tronco cerebral. Repita isso do outro lado.
  10. Uma vez que ambas as raízes nervosas estejam livres, remova as meninges e vasculatura da superfície ventral do tronco cerebral perto do corpo trapezoide.
  11. Liberte o cérebro completamente do crânio beliscando os nervos cranianos restantes e o tecido conjuntivo tomando cuidado para preservar a medula espinhal restante, se possível.

3. Bloqueie e monte o cérebro no palco (disco magnético)

  1. Prepare a superfície do cérebro para se fixar no estágio bloqueando o cérebro ao nível do quiasma óptico.
    1. Com a superfície ventral para cima, estabilize o cérebro usando uma ferramenta contundente para imobilizar suavemente a medula espinhal para que o cérebro não se incline durante a etapa seguinte.
    2. Ao nível do quiasmo óptico, use fórceps abertos para criar o plano para bloquear o cérebro inserindo através do cérebro até o fundo do prato. Insira as fórceps em um ângulo de aproximadamente 20° da vertical para que as pontas saiam da superfície dorsal do cérebro caudal para o quiasmo óptico.
    3. Corte ao longo dos fórceps usando a lâmina de barbear.
  2. Cole o cérebro à superfície do palco.
    1. Prepare um pequeno bloco (~1 cm3) de 4% de ágar para suportar o cérebro.
    2. Coloque uma pequena gota de cola no palco e espalhe-a em um retângulo para que o cérebro e o bloco de ágar possam ser colados.
    3. Usando fórceps, levante cuidadosamente o cérebro e dobre suavemente o excesso de líquido usando a borda de uma toalha de papel. Coloque a superfície bloqueada sobre a cola, a superfície ventral será em direção à lâmina durante o corte.
    4. Empurre o bloco de ágar suavemente contra a superfície dorsal do cérebro para apoiá-lo durante o corte e para garantir o posicionamento cerebral adequado (ou seja, ângulo).

4. Corte o cérebro para criar fatia de cunha

NOTA: Prepare uma fatia cerebral usando vibratome que tenha a raiz nervosa coclear no lado grosso e neurônios olivococlear medial (MOC) e o núcleo medial do corpo trapezoide (MNTB) no lado fino.

  1. Coloque o disco magnético com cérebro preso na base do palco e coloque-o na câmara de corte com a superfície ventral do cérebro orientada para a lâmina.
  2. Encha a câmara com solução de corte gelado e bolha com carbogen.
  3. Abaixe a lâmina na solução e corte fatias caudais para a região de interesse para garantir que as fatias sejam simétricas. Se as fatias parecerem assimétricas, incline o palco ligeiramente para obter simetria.
    NOTA: As velocidades da lâmina entre 0,05-0,10 mm/s foram eficazes para cortar fatias saudáveis e podem variar dependendo da idade animal e região cerebral.
  4. Uma vez que as fatias sejam simétricas, mude o palco ~15° (correspondente a aproximadamente 3 anéis concêntricos na base do palco) para um lado.
    NOTA: Desperte o palco da raiz nervosa auditiva que você deseja preservar na fatia.
  5. Continue cortando cuidadosamente até que a raiz nervosa auditiva esteja perto da superfície de um lado, e o nervo facial possa ser visto na superfície do outro lado.
  6. Mude o palco 15° para a posição original.
  7. Mova a lâmina para longe do tecido e gire a base do palco 90° para que a borda lateral do lado fino esteja voltada para a lâmina. Abaixe a lâmina várias centenas de mícrons e, em seguida, lentamente traga a lâmina perto da borda do tecido. Repita isso até que a lâmina toque a borda lateral. Abaixe a lâmina para a espessura desejada da borda fina da fatia, aqui mais 200 mícrons.
    NOTA: A fatia resultante tem idealmente ~300 mm de espessura ao nível do núcleo ventral do corpo trapezoid (VNTB) no lado onde ocorrerá a fixação do patch.
  8. Mova a lâmina para trás do tecido e gire a base do palco para trás para que a superfície ventral esteja voltada para ela.
  9. Faça o corte que designa a superfície rostral da fatia da cunha. Transfira a fatia para um pedaço de papel de interface (1 cm2) superfície caudal para baixo. Mova a fatia para a câmara de incubação ou outro aparelho de incubação adequado para recuperação (30 min a 35 °C).
    NOTA: O nervo facial deve ser visível em ambos os hemisférios da fatia na superfície rostral (ver Figura 1B).

5. Configuração e gravação de eletrofisiologia

  1. Coloque a fatia da cunha na câmara de gravação e fixe a fatia com uma harpa ou sistema estabilizador. Perfunda o tecido continuamente a uma taxa de 7-10 mL/min com ACSF quente (35 °C) borbulhado com carbogen.
  2. Identifique neurônios MOC geneticamente rotulados no VNTB usando epifluorescência com filtros de emissão de 561 nm para gravações de grampos de remendo. Vire fatia se não houver células potencialmente remendáveis.
  3. Usando óptica DIC, concentre-se na raiz nervosa auditiva no lado grosso da fatia e use um micromanipulador para mover o eletrodo estimulante de tungstênio bipolar até a raiz nervosa auditiva e suavemente para a superfície do tecido.
    NOTA: Eletrodos de sucção têm sido usados em experimentos auditivos de estimulação nervosa em outros laboratórios. Eletrodos de vidro de ou métodos de estimulação óptica podem ser empregados se aplicável a outras preparações específicas.
  4. Mova o campo de visão de volta para o VNTB para escolher um neurônio MOC para atingir a eletrofisiologia do grampo de remendo.
  5. Encha uma pipeta de gravação com solução interna apropriada para o experimento proposto.
  6. Remendar e gravar do neurônio MOC na configuração de células inteiras. Compense a capacitância da membrana e a resistência da série, se necessário.
  7. Ajuste a amplitude de estimulação elétrica da raiz nervosa auditiva para obter eventos postsináspticos consistentes no neurônio MOC.
    NOTA: Pode ser necessário mover o eletrodo de estimulação.
  8. Execute protocolos de estimulação adequados para observar correntes sinápticas evocadas em MOC (grampo de tensão) ou padrões potenciais de ação (grampo de corrente).
    NOTA: A preparação da fatia de cunha pode ser usada com quaisquer ferramentas típicas de grampo de remendo, como gravações de remendo soltos, farmacologia, optogenética, imagem de cálcio, neurotransmissor sem corte, etc.

6. Confirmação histológica dos núcleos do tronco cerebral

NOTA: Isso é feito com coloração violeta de cresito, em fatia de cunha fixa e re-seccionada. Este método permite a visualização de núcleos que estão contidos na fatia.

  1. Depois de preparar uma fatia de cunha, submergir fatia em fixação (4% PFA em PBS) durante a noite. Enxágüe a fatia 3x por 10 min em PBS (temperatura ambiente em um shaker), depois coloque em 30% de sacarose na PBS durante a noite a 4 °C para crioprotetor.
  2. Remendo a fatia em um microtome congelante (40-70 mm) e colete seções seriais em uma placa de 24 poços em PBS.
  3. Monte seções em lâminas revestidas de gelatina e deixe secar completamente. Coloque slides no vagão de slides.
  4. Prepare soluções violetas de cresyl
    1. Prepare acetato violeta de 1% de cresílico misturando acetato violeta de 5 g em 500 mL dH2O
    2. Prepare o tampão de acetato preparando pela primeira vez a solução A de 90 mL (ácido acético glacial de 540 mL + 89,46 mL dH2O) e 10 mL solução B (acetato de sódio de 136 mg em 10 mL dH2O). Combine a solução A e a solução B que produz o tampão de acetato.
    3. Combine 1% de acetato violeta de crestil com o tampão de acetato 1:1 para 0,5% de violeta de crestil no tampão de acetato. Filtrar antes de usar.
    4. Prepare 95% e 70% de etanol diluindo 100% etanol com volumes apropriados de dH2O
  5. Execute o protocolo de coloração violeta cresyl. Mova o carro de slides através de bandejas de solução, manchando a solução em excesso em uma toalha de papel entre as bandejas: xileno – 5 min; 95% etanol – 3 min; 70% etanol – 3 min; dH2O – 3 min; Solução violeta de 0,5% cresyl – monitoramento de 8 a 14 min com frequência até que a coloração nuclear fique roxa escura; dH2O – 3 min; 70% etanol – 3 min; 95% etanol – 1-2 min; 100% etanol – deslizamentos de mergulho duas vezes; xileno – 5 min; xileno: 25 min até que a montagem seja realizada.
    ATENÇÃO: Use xileno apenas sob um capô de fumaça.
  6. Remova slides do xileno um de cada vez e coloque imediatamente os deslizamentos de cobertura em slides usando meio de montagem. Permitir a montagem de meio a seco (durante a noite).
  7. Seções de imagem.

7. Rotulagem de biocittina para rastreamento anterograde de axônios em tecido vivo e não fixado

  1. Prepare uma fatia de cunha como acima (Passos 2-4).
  2. Transfira a fatia para papel de interface (~1 cm2). Sob um microscópio dissecando, localize o CN no lado grosso da fatia.
  3. Remova cuidadosamente o excesso de ACSF da área ao redor da fatia torcendo um canto de um papel de tecido para retirar o ACSF do tecido. Isso evita que a biocittina se espalhe para áreas circundantes da fatia que poderiam levar à absorção em células fora do CN.
  4. Com fórceps finos, selecione um pequeno cristal de biocitna e coloque-o na superfície do CN. Pressione suavemente o cristal no tecido para promover o contato com os neurônios e posterior absorção em somata. Repita esta etapa para cobrir a região de interesse desejada, neste caso regiões CN contendo neurônios T-stellate e GBC.
  5. Coloque a fatia em uma câmara de incubação. Deixe a fatia incubar por 2-4 h a 35 °C para permitir a absorção e o transporte da biocittina. Após a incubação, enxágue a fatia em ACSF para remover quaisquer partículas de biocittina.
  6. Coloque a fatia em fixação (4% PFA em PBS) durante a noite. Enxágüe 3x por 10 min em PBS.
  7. Corte crioproteto em 30% de sacarose em PBS durante a noite a 4 °C ou até que a fatia afunde.
  8. Ressectar o tecido para produzir seções transversais em um microtome congelante a 70-100 mm.
  9. Tecido de processo usando métodos imunohistoquímicos padrão com um streptavidin fluorescentemente conjugado.
    NOTA: A imunohistoquímica adicional pode ser realizada nas seções se útil para rotular corpos de células pré-sinápticas, axônios, receptores ou outras moléculas sinápticas importantes para a visualização do circuito (ou seja, as etapas primárias de anticorpos não devem afetar negativamente a visualização secundária da biocittina).
  10. Imagem do tecido.

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Representative Results

Exame histológico da fatia de cunha
Para nossa investigação da função auditiva do neurônio brainstem, a preparação da fatia de cunha foi projetada para conter a raiz nervosa auditiva e o contralateral CN aos neurônios MOC destinados às gravações (exemplo de fatia mostrada na Figura 1B). O exame histológico inicial da preparação é importante para confirmar que a fatia contém os núcleos necessários para a ativação do circuito e que as projeções axonais estão intactas. Dois tipos de células dentro do CN fornecem informações sonoras aos neurônios MOC. As células T-stellate são hipóteses para fornecer a entrada excitatória aos neurônios MOC39,40,41,58. As células espessas globulares (GBC) excitam os neurônios MNTB no hemisfério contralateral (através do calyx especializado da sinapse held)34,36,37,38,59,60 que, por sua vez, fornecem entrada inibitória aos neurônios MOC57 (Figura esquemática 1A). Para confirmar a presença de células T-estelares e GBCs, re-seccionamos (para 50 μm) uma fatia de cunha que foi fixada por submersão em 4% pfa e realizou coloração violeta cresyl para rotular somata. No lado grosso da fatia da cunha (Figura 2, hemisfério esquerdo), o CN estava presente em quase sua extensão rostro-caudal completa. Além disso, as subdivisões dorsal e ventral do CN estavam intactas (Figura 2; seta e ponta de flecha em S19). Os neurônios t-estelares e GBCs se aglomeram no núcleo coclear ventral perto de onde o nervo auditivo(Figura 2; seta em S17) entra na CN61,62,63,64,65. A fatia de cunha também contém neurônios do ipsilateral MNTB para neurônios MOC dos quais são realizadas gravações (hemisfério fino da fatia original da cunha, lado direito na Figura 2). Isso confirma que pelo menos parte da entrada inibitória para os neurônios MOC está intacta(Figura 2, fatias 1-15, destacadas por ovais tracejados em S11).

Em experimentos separados, confirmamos que os axônios e terminais pré-sinápticos de neurônios CN estavam intactos na fatia da cunha usando rotulagem anterograda com biocittina. Primeiro, a fatia de cunha ao vivo foi preparada e colocada em papel de interface. Imediatamente após o preparo da fatia da cunha, cristais de biocitada foram colocados no CN, o que permitiu a absorção e o transporte de anterograde ao longo dos axônios durante um período de incubação. Em seguida, foi realizada a fixação e ressarção do tecido (seções de 70 mm). A coloração de seções com streptavidina fluorescente foi realizada para visualizar axônios rotulados com biocittina. Imagens confocal dessas seções mostram rotulagem brilhante no CN onde os cristais foram colocados e levados para corpos celulares(Figura 3A, hemisfério esquerdo, área tracejada). Os axônios que saem da CN ao longo da estria acústica ventral (Figura 3A, pontas de flecha branca) foram claramente rotulados e poderiam ser seguidos até seus pontos de rescisão. Puncta biocytina-positiva em torno de neurônios MOC contralaterais sugerem que nossa preparação preserva contatos sinápticos originários da CN (Figura 3B). Da mesma forma, os calyces rotulados de Held no MNTB contralateral indicam que os axônios que projetam de GBCs para neurônios MNTB são preservados na fatia de cunha(Figura 3C). Estes exames histológicos confirmam que nossa fatia de cunha contém tanto os corpos celulares quanto as projeções axonais dos circuitos de entrada aferentes aos neurônios MOC, o que, portanto, nos permite medir respostas pós-sinápticas evocadas pela estimulação do nervo auditivo e posterior propagação da atividade através de circuitos ascendentes.

Fisiologia sináptica na fatia de cunha
A integração das entradas sinápticas excitatórias e inibitórias molda criticamente a atividade neuronal. Recentemente, descrevemos insumos inibitórios para neurônios MOC a partir de neurônios do MNTB57,mas o efeito da integração desses insumos com entradas excitatórias na atividade do neurônio MOC é desconhecido. Em uma fatia de cunha de um rato ChAT-IRES-Cre x tdTomato, foram realizadas gravações de grampo de tensão a partir de um neurônio MOC. A corrente foi aplicada através de um eletrodo estimulante de tungstênio bipolar impulsionado por uma unidade de isolamento de estímulo para evocar a liberação de neurotransmissores de axônios pré-sinápticos. Primeiro, a estria acústica ventral (VAS) na linha média foi estimulada eletricamente para ativar os axônios T-stellate diretamente e os neurônios MNTB via estimulação de axônio GBC(Figura 4A),para medir a latência às respostas pós-sinápticas em uma configuração de gravação que imita experimentos típicos de fatia fina(Figura 4B),traços de exemplo, cinza, mantendo potencial -60 mV). Em experimentos separados, a raiz nervosa auditiva foi estimulada a ativar circuitos ascendentes monaural e respostas pós-sinápticas foram medidas em neurônios MOC como descrito acima. A estimulação elétrica em ambos os locais evocou um artefato elétrico rápido seguido de respostas correntes multipeadas (respostas de exemplo de estimulação an na Figura 4C, traços negros, mantendo potencial -60 mV). Comparamos as medidas de latência de início da primeira corrente não sináptica (PSC) evocada com estimulação direta do VAS com aquelas evocadas com estimulação nervosa auditiva e encontramos uma latência significativamente maior aos eventos de estimulação de AN. Isso foi atribuído ao atraso sináptico incorrido na sinapse AN/CN (Estimulação AN: 5,27 ± 0,43 ms, mediana ± desvio absoluto mediano (MAD), faixa de 4,26-5,93 ms, n = 8; Estimulação vas: 1,98 ± 0,28 ms, mediana ± MAD, faixa 0,75-3,46 ms, n = 17; Teste de classificação assinado por Wilcoxon, p = 0,014, Figura 4D). Esses resultados confirmam que a estimulação da raiz nervosa auditiva resulta na ativação sináptica dos neurônios CN e na atividade subsequente do circuito, representando mais de perto in vivo – como o tempo do que a estimulação direta de axônios T-stellate ou GBC/MNTB.

Com nossa solução interna baseada em césio, alta [Cl-] usada em grampo de tensão, excitatório (glutamatergic) e inibidor (GABA e glicocinérgico) os PSCs são ambos internos no potencial da membrana de repouso (-60 mV) e, portanto, indistinguíveis. Ao evocar a atividade do circuito na configuração estimulante de AN, isolamos eletricamente a entrada inibitória presumida, deslocando o potencial de exploração para 0 mV, o potencial de reversão aproximada para correntes glutamatergicas mediadas pela AMPA. Em nosso exemplo, as respostas de corrente externa foram observadas a 0 mV(Figura 4Ci, traços vermelhos) indicativos de conduances de cloreto. Estes são provavelmente respostas sinapáticas GABA ou glicocinérgicas. Esses dados demonstram a utilidade da fatia da cunha para ativar entradas excitatórias e inibitórias aos neurônios MOC, estimulando a raiz nervosa auditiva, com ativação de circuitos aferentes subsequentes. Além disso, diversos padrões de respostas pós-sinápticas foram evocados pela estimulação an, sugerindo que mesmo sob condições de estimulação idêntica de axônios AN, a atividade de todo o circuito é dinâmica e complexa. Este paradigma experimental permite uma análise detalhada de como os estímulos auditivos complexos se propagam através do tronco cerebral e se integram aos neurônios MOC, determinando a saída do sistema eferente MOC e o eventual impacto na cóclea.

Figure 1
Figura 1: Esquema de fatia de cunha e imagem de exemplo. (A) Esquema do circuito de feedback olivocochlear medial. Setas azuis indicam o caminho ascendente diferente para neurônios MOC e setas negras indicam a via de retorno descendente dos neurônios MOC para a base das células ciliares externas (OHC). (B) Imagem brightfield de uma fatia de cunha com rótulos da raiz nervosa auditiva (ANR) e núcleo coclear (contorno tracejado) no lado grosso. O asterisco indica a localização aproximada do núcleo ventral do corpo trapezoide onde os neurônios MOC são alvo para fixação de remendos no lado fino da fatia da cunha. Linhas pretas tracejadas indicam os nervos faciais que podem ser vistos em ambos os hemisférios da fatia na superfície rostral. IHC - célula ciliada interna, GBC - célula espessa globular, SPN - núcleo paraolivary superior, MNTB - núcleo medial do corpo trapezoid, VNTB - núcleo ventral do corpo trapezoide, LSO - azeitona superior lateral. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Seções manchadas de violeta cresyl de uma fatia de cunha que foi re-seccionada a 50 μm. Todas as outras seções foram imagens. As seções são rostral numeradas -> caudal. As fatias de cunha tendem a conter a totalidade do núcleo coclear (CN) incluindo tanto a CN dorsal (seta em S19) quanto a CN ventral (ponta de flecha em S19), raiz nervosa auditiva (ponta de flecha aberta em S17) e grande parte do MNTB (área escura perto da superfície ventral em S3-S15, destacada com ovais tracejados em S11). D e V na barra de escala representam dorsal e ventral na orientação de fatias. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Axônios de entrada ascendente aos neurônios MOC do núcleo coclear contralateral permanecem intactos na fatia da cunha. (A) A seção rostral-mais de uma fatia de cunha retirada de um rato P23 ChAT-IRES-Cre x tdTomato (fluorescência vermelha) que foi re-seccionada (70 μm) e processada para visualização de biocitina. A imagem confocal é uma pilha z de projeção de intensidade máxima. Axons na estria acústica ventral são destacados por pontas de flechabra. O contorno tracejado indica a pequena porção do núcleo coclear que permanece nesta fatia rostral-most. Barra de escala 500 μm. (B) Imagem confocal de um neurônio positivo ChAT-IRES-Cre x tdTomato no VNTB com puncta positiva biocytina no neuropil circundante. Barra de escala 50 μm. (C) Axônios rotulados de biocytina mostrados cruzando a linha média e terminando no MNTB contralateral como calyces de Held. A linha tracejada vertical representa a linha média da fatia. Barra de escala 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Estimulação elétrica de insumos diferentes no grampo de tensão produz correntes postinas multipeak em neurônios MOC. (A) Esquemático de fatia de cunha com configuração de gravação tanto para a estimulação acústica ventral (VAS) estimulação (eletrodo estimulante cinza) quanto para estimulação do nervo auditivo (AN) (eletrodo estimulante preto) de entradas aferentes para MOC. (B) Exemplos de correntes postsinásticas (PSCs) de um neurônio P17 individual evocado com um único estímulo elétrico perto da linha média a -60 mV. (C) PSCs evocados durante uma estimulação a -60 mV em um neurônio P15. (Ci) Exemplo de PSCs na mesma célula que C evocado em 0 mV de potencial de retenção (o potencial de reversão aproximada para correntes mediadas ampa em nossa configuração de gravação, vermelho). (D) Dados populacionais para quantificação da latência ao primeiro PSC para estimulação de VAS e AN. Caixas: quartis, entrada de linha: mediana, entrada quadrada: média, bigodes: desvio absoluto mediano. * p < 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

O procedimento de corte descrito aqui chamado de fatia de cunha é poderoso para manter circuitos neuronais pré-sinápticos intactos, mas com a acessibilidade da experimentação de fatias cerebrais para análise da função neuronal. Deve-se tomar muito cuidado em várias etapas iniciais, a fim de maximizar a utilidade da preparação para a análise do circuito. As dimensões da cunha devem ser confirmadas por meio do exame histológico, que é essencial para a confirmação de que tanto os núcleos pré-sinápticos quanto suas projeções axonais estão contidos na fatia da cunha preparada. A geometria da fatia pode exigir modificações se as projeções forem cortadas ou alguns axônios atingirem os núcleos-alvo. De forma mais geral, o corte de acabamento no vibratome para a fatia da cunha é extremamente importante. A preparação ideal da fatia de cunha exigirá uma combinação de uso consistente de configurações de vibratome, incluindo o uso de marcas de círculo concêntrico na base do palco, juntamente com o ajuste de configurações baseadas em marcos cerebrais conhecidos. Após a otimização da geometria da fatia, registramos PSCs consistentes em neurônios MOC evocados pelo estímulo eletricamente da raiz nervosa auditiva em 8 de 18 fatias de cunha. Em nosso trabalho anterior, conseguimos evocar PSCs inibitórios através da estimulação direta de axônios MNTB em aproximadamente 60% dos neurônios MOC57,sugerindo que nossa taxa de sucesso aqui é apenas uma redução modesta dada a longa gama de insumos e a necessidade de ativação do circuito polissináptico. Ao preparar a fatia, é aconselhável errar no lado mais grosso, pois uma diminuição da visibilidade devido a uma fatia mais grossa é favorável sobre uma seção inutilizável que é incompleta ou não tem conectividade de circuito. Qualquer configuração ou dimensões de fatia pode ser usada, desde que a fatia se encaixe sob o objetivo do microscópio de gravação, seja acessível por patches e eletrodos estimulantes (ou outros testes ou equipamentos), e seja fino o suficiente para fixação de patches baseada em óptica na célula de interesse postsinásptica. Dissecção rápida, suave e condições adequadas de incubação e recuperação também são importantes para manter a viabilidade do circuito para experimentos de grampo de remendo. Específico para nossa preparação auditiva do tronco cerebral, o cérebro deve ser removido com muito cuidado do crânio, a fim de preservar raízes nervosas auditivas intactas e funcionais. Esticar ou rasgar o nervo afetará a capacidade de estimular as fibras e provocar atividade em neurônios auditivos. Devido ao maior volume de tecido na fatia, a modificação das soluções tradicionais de corte, temperaturas, detalhes de incubação e sistemas de perfusão podem melhorar a saúde da fatia. Aqui nós empregamos pequenas modificações em nossa preparação normal de fatias. Estes incluem tempos de incubação de recuperação mais curtos (30 minutos vs. 60 minutos) e taxas de fluxo mais rápidas no sistema de perfusão da câmara de corte.

Uma vez determinadas as dimensões da fatia e os detalhes da incubação, a função e a conectividade de diferentes componentes dos circuitos dentro da fatia devem ser demonstradas. Em nossa preparação, garantimos que tanto os insumos excitatórios quanto os inibidores, hipóteses de originarem-se no núcleo coclear com T-stellate e GBC (via MNTB), estejam presentes como esperado. Métodos alternativos de estimulação, como eletrodos de sucção para o nervo auditivo, ou métodos de estimulação óptica, como optogenética ou neurotransmissor focal, também podem aumentar a ativação do circuito ou permitir a ativação específica do tipo celular quando emparelhados com o direcionamento genético de subtipos celulares.

Embora este método de corte seja útil para muitos sistemas e circuitos, algumas das limitações das seções padrão de fatia fina também são relevantes para esta preparação. Geralmente, pode ser difícil preservar circuitos com padrões de projeção menos planares, já que os axônios provavelmente seriam cortados. Ativar o circuito nos nervos cranianos, como feito aqui para imitar entradas auditivas, pode não ser viável em muitos circuitos. Como em outras preparações de fatias, os efeitos de rede de qualquer farmacologia devem ser considerados. Por exemplo, a aplicação de banho de bloqueadores receptores de glutamato para isolar inibitórios (GABA- ou glicocinérgico) ou outros modos de transmissão não podem ser usados com ativação de circuito polissináptico quando o glutamato é necessário para a ativação de neurônios a montante do neurônio alvo remendado. Isso é verdade no nosso caso, pois tanto as sinapses AN/CN quanto a GBC/MNTB são glutamatergicas, portanto, toda a transmissão seria eliminada em neurônios MOC com aplicação de banho de bloqueadores receptores de glutamato. Além disso, a aplicação de bloqueadores de receptores GABA ou glicacina para eliminar respostas sinápticas MNTB-MOC teria a consequência não intencional de eliminar conectividade intrínseco inibitória dentro do CN que pode moldar os padrões de entradas diferentes aos neurônios MOC. A aplicação focal de bloqueadores receptores, com ejeção de pressão ou iontopforese, poderia ser usada para restringir a função farmacológica.

Finalmente, a principal limitação desta técnica in vitro é que, embora essa preparação maximize a ativação de circuitos auditivos ascendentes monaural, o resto do sistema nervoso, incluindo receptores periféricos que codificam estímulos, está ausente. Isso inclui a própria cóclea, insumos excitatórios do outro ouvido66, conexões CN comissural67,68,69,70, e cortical descendente71,72,73,74 e coloicular75,76 projeções e insumos modulatórios77,78,79,80 conhecidos por influenciar a atividade dos núcleos CN e SOC. Embora seja possível que uma parte das projeções descendentes de IC sejam mantidas, seria impossível incluir tanto projeções corticais quanto projeções de CN comissural devido à geometria de fatias. Assim, focamos nos circuitos auditivos ascendentes da cóclea com os experimentos atuais. A espessura mínima da fatia no lado fino também reduz a capacidade de realizar análises de circuito polissináptico binaural, o que é uma vantagem das preparações de fatias simétricas grossas10,11. Além disso, não podemos estimular o nervo auditivo com som para evocar padrões naturais de atividade do circuito. As respostas nervosas auditivas são tonototicamente variadas, nervosas e plásticas81,82,83,84, dificultando a simulação perfeita com nosso método de estimulação elétrica. Esta é uma grande desvantagem da experimentação in vitro no sistema auditivo. A restrição tonotópica de nossa estimulação não é possível, uma vez que estimular toda a raiz AN provocará o espiar em fibras AN através do gradiente tonotópico. Imitar com precisão a diversidade de respostas de fibras AN (ou seja, fibras de baixa versus alta taxa espontânea) a um padrão de estímulo elétrico também não é possível. Também é difícil combinar com precisão a codificação de intensidade dinâmica de múltiplas fibras AN no CN. No entanto, somos capazes de usar nosso software de eletrofisiologia para produzir uma variedade de padrões de estimulação destinados a imitar a saída nervosa auditiva apropriada durante diferentes estímulos acústicos (por exemplo, sons curtos, altos, sons silenciosos, sons prolongados ou sons em ruído de fundo) variando a frequência de estímulos tanto entre protocolos de estímulo elétrico quanto dentro de um protocolo individual para aproximar entradas combinadas de AN (modeladas em ref.85). O monitoramento da produção de MOC durante esses experimentos testará nossas hipóteses sobre quais padrões de estímulo podem favorecer a inibição ou excitação nos neurônios MOC.

Apesar das limitações descritas acima, um método de preparação de fatia de cunha tem benefícios em comparação com métodos de fisiologia in vivo e típicos de fatia in vitro e pode ser usado para abordar a ativação do circuito in vivo o mais próximo possível na fatia para células de difícil acesso. Gravações in vivo de células inteiras no tronco cerebral auditivo têm sido raras devido a dificuldades de acesso a esta área cirurgicamente86. Em vez disso, a fatia foi preparada para incluir entradas ascendentes aos neurônios MOC começando com o nervo auditivo, que é estimulado diretamente para ativar todo o circuito ascendente monaural. Demonstramos a ativação de entradas sinápticas excitatórias e inibitórias, e as respostas a esses insumos fornecem informações valiosas sobre o tempo das entradas sinápticas à medida que chegam aos neurônios MOC. Isso fornece uma plataforma para experimentação de alto rendimento onde podemos empregar um grande repertório de ferramentas de eletrofisiologia in vitro, como imagem de cálcio ou tensão, neurotransmissor uncaging, e tanto intracelular (via pipeta de remendo) quanto extracelular (via aplicação de banho ou farmacologia) A preparação também deve oferecer um aumento no rendimento sobre as preparações de fatias grossas devido à melhor visibilidade dos neurônios-alvo usando óptica DIC, que embaçam com maior espessura tecidual, especialmente no tronco cerebral ventral. No geral, essa técnica proporciona melhorias na segmentação e throughput sobre métodos in vivo, e melhores oportunidades de análise de circuitos do que os métodos tradicionais de fisiologia de fatias.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa de Pesquisa Intramuros do NIH, NIDCD, Z01 DC0000091 (CJCW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Experimental Preparations
Agar, powder Fisher Scientific BP1423500 4% agar block used to stabilize brain tissue during vibratome sectioning
AlexaFluor Hydrazide 488 Invitrogen A10436 Fluorophore used in internal solution to confirm successful MOC neuron patch
Analytical Balance Geneses Scientific (Intramalls) AV114 Weighing chemicals
Double edged razor blade Ted Pella 121-6 Vibratome cutting blade
Kynurenic acid (5g) Sigma Aldrich K3375-5G Slicing ACSF additive used to reduce neuron activity during dissection and slicing in order to improve tissue health for patch clamping
pH Meter Fisher Scientific (Intramalls) 13-620-451 Solution pH tester
Plastic petri dishes 100mm dia X 20mm Fisher Scientific (Intramalls) 12-556-002 4% Agar Prep
Stirring Hotplate Fisher Scientific (Intramalls) 11-500-150 Heating for 4% Agar preparation
Dissection and Slicing
Biocytin Sigma Aldrich B4261-250MG Chemical used for axonal tracing (conjugated to Streptavidin 488)
Dissecting Microscope Amscope SM-1BN For precision dissection during brain removal
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20 Fine forceps dissection tool
Economy tweezers #3 WPI 501976 Forceps dissection tool
Glass Petri Dish 150mm dia x 15mm H Fisher Scientific (Intramalls) 08-747E Dissection dish
Interface paper (203 X 254mm PCTE Membrane 10um) Thomas Scientific 1220823 Slice incubation/biocytin application
Leica VT1200S Vibratome Leica 1491200S001 Vibratome for wedge slice sectioning
Mayo scissors Roboz RS-6872 Dissection tool
Single-edged carbon steel blades Fisher Scientific (Intramalls) 12-640 Razor blade for dissection
Specimen disc, orienting Leica 14048142068 Specialized vibratome stage for reproducible tilting
Spoonula FisherSci 14-375-10 Dissection tool
Super Glue Newegg 15187 Used for glueing tissue to vibratome stage
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 91500-09 Dissection tool
Electrophysiology
A1R Upright Confocal Microscope Nikon Instruments Electrophysiology and imaging microscope, can be any microscope compatible with electrophysiology
Electrode Borosilicate glass w/ Filament OD 1.5mm, ID 1.1mm, 10 cm long Sutter Instrument BF150-110-10 Patch clamping pipette glass
Electrode Filler MicroFil WPI CMF20G Patch electrode pipette filler
In-line solution heater Warner Instruments (GSAdvantage) SH-27B Slice perfusion system heater
Multi-Micromanipulator Systems Sutter Intruments MPC-200 with MP285 Micromanipulators for patch clamp and stimulation electrode placement
P-1000 horizontal pipette puller for glass micropipettes Sutter instruments FG-P1000 Patch clamp pipetter puller
Patch-clamp amplifier and Software HEKA EPC-10 / Patchmaster Next Can be any amplifier/software
Recording Chamber Warner Instruments RC26G Slice "bath" during recording
Recording Chamber Harp Warner Instruments 640253 Stablizes slice during electrophysiology recording
Slice Incubation Chamber Custom Build Heated, oxygenated holding chamber for slices during recovery after slicing
Stimulus isolation unit A.M.P.I. Iso-Flex Stimulus isolation unit for electrophysiology
Syringe 60CC Fischer Scientific (Intramalls) 14-820-11 Electrophysiology perfusion fluid handling
Temperature controller Warner Instruments (GSAdvantage) TC-324C Slice perfusion system temperature controller
Tubing 1/8 OD 1/16 ID Fischer Scientific (Intramalls) 14-171-129 Electrophysiology perfusion fluid handling
Tugsten concentric bipolar microelectrode WPI TM33CCINS Stimulating electrode for electrophysiology
Histology
24 well Plate Fisher Scientific (Intramalls) 12-556006 Histology slice collection and immunostaining
Alexa Fluor 488 Streptavidin Jackson Immuno labs 016-540-084 Secondary antibody for biocytin visualization
Corning Orbital Shaker Sigma CLS6780FP Shaker for immunohistochemistry agitation
Cresyl Violet Acetate Sigma Aldrich (Intramalls) C5042-10G Cellular stain for histology
Disposable Microtome Blades Fisher Scientific 22-210-052 Sliding microtome blade
Filter-syringe Nalgene 4mm Cellulose Acetate 0.2um Fisher Scientific (Intramalls) 09-740-34A Syringe filter for filling recording pipettes with internal solution
Fluoromount-G Slide Mounting Medium Fisher Scientific OB100-01 Immunohistochemistry fluorescence mounting medium
glass slide staining dish with rack Fisher Scientific (Intramalls) 08-812 Cresyl Violet staining chamber
Microm HM450 Sliding Microtome ThermoFisher 910020 Freezing microtome for histology
Microscope Cover Glasses: Rectangles 50mm X 24mm Fisher Scientific (Intramalls) 12-543D Histochemistry slide cover glass
Permount mounting medium Fisher Scientific SP15-100 Cresyl violet section mounting medium
Superfrost Slides Fisher Scientific 22-034980 Histology slides

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Preparação de fatia de cunha in vitro para imitar conectividade do circuito neuronal vivo
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Fischl, M. J., Weisz, C. J. C. In… More

Fischl, M. J., Weisz, C. J. C. In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity. J. Vis. Exp. (162), e61664, doi:10.3791/61664 (2020).

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