Summary
Эта работа описывает использование технологии редактирования генома CRISPR-Cas9 для нокаутирования эндогенного гена OsABCG15 с последующим модифицированным протоколом трансформации Agrobacterium-опосредованногодля производства стабильной мужской стерильной линии в рисе.
Abstract
Мужская стерильность является важной агрономической чертой для производства гибридных семян, которая обычно характеризуется функциональными дефектами в мужских репродуктивных органах/геймерах. Последние достижения в области технологии редактирования генома CRISPR-Cas9 позволяют обеспечить высокую эффективность редактирования и временем для мутаций эндогенных генов-кандидатов на конкретных участках. Кроме того, Agrobacterium-опосредованная генетическая трансформация риса также является ключевым методом модификации генов, который был широко принят многими государственными и частными лабораториями. В этом исследовании мы применили инструменты редактирования генома CRISPR-Cas9 и успешно создали три мужские стерильные линии мутантов путем целевого редактирования генома OsABCG15 в japonica cultivar. Мы использовали модифицированный метод преобразования риса при посредничестве Agrobacterium,который мог бы обеспечить отличные средства генетической выхолощения для производства гибридных семян риса. Трансгенные растения могут быть получены в течение 2-3 месяцев и гомозиготные трансформанты были проверены генотипированием с использованием усиления ПЦР и секвенирования Sanger. Базовая фенотипическая характеристика мужской стерильной гомозиготной линии была выполнена микроскопическим наблюдением за рисовыми мужскими репродуктивными органами, анализом жизнеспособности пыльцы йодным йодом калия (I2-KI),окрашивая полутонкое поперечное сечение развивающихся пыль.
Introduction
Рис является наиболее важной продовольственной культурой, особенно в развивающихся странах, и представляет собой основной продукт питания для более чем половины населения мира. В целом спрос на рисовое зерно растет и, по прогнозируется, увеличится на 50% к 2030 году и на 100% к 2050году 1,,2. Будущие улучшения урожайности риса должны будут извлечь выгоду из различных молекулярных и генетических ресурсов, которые делают рис отличной моделью для монокотайледонных исследований растений. К ним относятся эффективная система трансформации, передовая молекулярная карта и общедоступная база данных тегов выраженной последовательности, которые были созданыв течение многих лет 3,4. Одной из стратегий повышения урожайности является гибридноепроизводство семян 5,центральным элементом которого является способность манипулировать мужской плодовитости. Понимание молекулярного контроля мужской плодовитости зерновых культур может помочь перевести ключевые знания в практические методы для улучшения производства гибридных семян и повышенияурожайности 6,,7.
Генетическая трансформация является ключевым инструментом для фундаментальных исследований и коммерческого сельского хозяйства, поскольку она позволяет внедрение иностранных генов или манипуляции эндогенных генов в растениеводствах, и приводит к генерации генетически модифицированных линий. Соответствующий протокол преобразования может помочь ускорить генетические и молекулярные исследования биологии для фундаментального понимания регуляциигенов 8. У бактерий генетическая трансформация происходит естественным путем; однако, в растениях, это выполняется искусственно с использованием методов молекулярнойбиологии 9,10. Agrobacterium tumefaciens является почвенной, грам-негативной бактерией, которая вызывает заболевания коронного желчного пузыря у растений, передавая T-DNA, область его плазмида Ti, в клетку растений через систему секреции типа IV11,12. В растениях, A. tumefaciens-опосредованное преобразование считается широко распространенным методом для модификации генов, поскольку это приводит к стабильной и низкой интеграции числа копий Т-ДНКв геном хозяина 13. Трансгенный рис был впервые создан через Agrobacterium-опосредованноепреобразование гена в середине 1990-х годов в japonica cultivar14. С помощью этого протокола в течение 4 месяцев было получено несколько трансгенных линий с эффективностью трансформации от 10%до 30%. Исследование показало, что есть два критических шага для успешной трансформации: один является индукция эмбрионального каллуса из зрелых семян, а другой является добавление ацетосиренгона, фенольное соединение, к бактериальной культуре во время совместного выращивания, что позволяет более высокую эффективность преобразованияв растениях 14,15. Этот протокол был широко использован с незначительными изменениями в japonica16,17,18,19, а также другие сорта, такие как indica20,21,22,23 и тропические japonica24,,25. Действительно, более 80% статей, описывающих преобразование риса использовать Agrobacterium-опосредованноепреобразование генов в качестве инструмента13. На сегодняшний день разработано несколько протоколов генетической трансформации с использованием семян риса в качестве исходного материаладля индукции каллуса 16,,17,,18,,19. Тем не менее, очень мало известно о молодых соцветий, как explants для производства каллуса. В целом, важно создать быстрый, воспроизводимый и эффективный протокол преобразования генов и регенерации для функциональной геномики и исследований по улучшению урожая.
В последние годы развитие технологии CRISPR-Cas9 привело к точному механизму редактирования генома, чтобы понять функцию генов и доставить агрономически важные улучшениядля разведения растений 26,27. CRISPR также предлагает значительные перспективы для манипулирования мужским репродуктивным развитием и гибридным производством. В этом исследовании мы использовали систему генного нокаута с использованием технологии CRISPR-Cas9 и соединили ее с эффективным протоколом преобразования генов риса, используя молодые соцветия в качестве эксплантов, создавая тем самым стабильные мужские стерильные линии для изучения репродуктивного развития.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. sgRNA-CAS9 конструкция вектора выражения завода и Agrobacterium-опосредованнаятрансформация
- Целевой мужской стерильный ген OsABCG15 в рисе в соответствии с опубликованнойлитературой 28.
- Дизайн sgRNA для целевого сайта, расположенного между 106-125 bp во втором exon OsABCG15 (Рисунок 1).
- Используйте полинуклеотидную киназу T4 для синтеза sgRNA oligos (sgR-OsABCG15-F: 5'TGGCAAGCACATCCTCAAGGGGAT3' и 5'sgR-OsABCG15-R: AAACATCCCCTTGAGGATGTGCTT').
- Используйте эндонюклиз BbsI для переваривания вектора позвоночника psgR-Cas929.
- Ligate синтезированных sgRNA oligos с линейной psgR-Cas9 позвоночника с использованием T4 лигазы после протокола производителя.
- Используя HindIII/EcoRI, переварите кассету sgRNA из шага 1.5 и субклон в сайт HindIII/EcoRI двоичного вектора pCAMBIA1300 для стабильнойтрансформации 29.
- Подтвердите построенную плазмиду путем переваривания ферментов и секвенирования. Позже преобразуйте двоичную конструкцию в штамм Agrobacterium tumefaciens EHA105 и выращивайте их на пластинах выбора Kan/Rif при 28 градусов по Цельсию в течение 2-3 дней.
2. Генетическая трансформация риса и культура тканей растений
- Индукция и регенерация Каллуса
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте свежие молодые соцветия риса в качестве исходного материала, чтобы вызвать каллуса (Рисунок 2).- Соберите молодые соцветия из поля для риса или зеленого дома на стадии мейоза, определяемой длиной цветка 1,6-4,8 мм(рисунок 2A)29. Убедитесь, что соцветия риса покрыты листовой оболочкой. Протрите каждую соцветие с 70% спиртового тампона и дайте ему высохнуть перед резки.
- Довнесите соцветие до чистой стерильной скамейки. Разрежьте его на мелкие кусочки (чем меньше, тем лучше) с стерилизованными ножницами, а затем перенесите черешки на пластину Петри, содержащую NBD2средний (рисунок 2B, Таблица 1).
- Инкубировать пластину в темноте при 26 градусов по Цельсию в течение 10-14 дней, чтобы вызвать каллуса (Рисунок 3A).
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте недавно сформированный каллус для инфильтрации Agrobacterium (шаг 2.2.7) непосредственно или восстановить еще раз в свежем NBD2 среды, чтобы получить больше каллуса. Передача каллуса в новую среду NBD2 каждые 8-10 дней.
- Трансформация и совместное культивирование
- Используйте бактерии A. tumefaciens, содержащие бинарную плазмиду из шага 1.6 для преобразования. Храните штаммы A. tumefaciens в среде YEB(таблица 1) с 50% глицеролом при -80 градусов по Цельсию для дальнейшего использования.
- Полоса A. tumefaciens от -80 градусов по Цельсию глицерола запасов YEB агар среды, содержащейселективные антибиотики( Таблица 1 ) и расти на 25-28 градусов по Цельсию для 48-72 ч, чтобы колонии появляются.
- Прививка одной колонии от пластины YEB с селективными антибиотиками до 5 мл жидкой среды YEB, содержащей те же селективныеантибиотики (таблица 1), в конической стерильной пробирке 50 мл. Встряхните на орбитальном шейкере при 250 x g,при 25-28 градусов по Цельсию, пока бактерии не вырастут до OD600 из 0,5.
- Добавьте 1 мл бактериальной суспензии в 100 мл среды YEB(таблица 1) стеми же селективными антибиотиками в конической колбе 250 мл и встряхните на орбитальном шейкере при 250 x x g,при 28 градусах цельсия на 4 ч.
- Центрифуга при температуре 4000 х г в течение 10 мин при комнатной температуре для сбора бактерий. Откажитесь от супернатанта.
- Повторное производство бактериальных гранул со средним AAM-AS(таблица 1) и разбавить подвеску до OD600 и 0,4.
ПРИМЕЧАНИЕ: Идеальный OD бактериальной суспензии имеет решающее значение для эффективной трансформации. Это помогает в устранении избыточного роста бактерий на каллусе. - Соберите около 150 здоровых растущих светло-желтых хрупких эмбриональных калли из шага 2.1.3 в стерильную колбу 150 мл. Добавить 50-75 мл бактериальной клеточной суспензии от шага 2.2.6 в стерильную колбу, а затем добавить около 10-25 мл свежей AAM-AS среды, чтобы погрузить калли в течение 10-20 мин, встряхивая время от времени.
- Вылейте бактериальную суспензию из колбы тщательно и высушите избыток бактериальной суспензии из каллуса с помощью стерильной фильтровальной бумаги #1 или бумажной ткани. Затем поместите их на чашку Петри со средним NBD-AS(таблица 1), покрытые стерильной фильтровальной бумагой #1. Инкубировать при 25-28 градусов по Цельсию в темноте в течение 3 дней и проверить на бактериальный разрастание.
- Выбор для резистентного каллуса
- После 3 дней совместного выращивания перенесите калли в стерильную чашку Петри со стерильной фильтровальной бумагой.
- Воздух сухой калли на 2 ч на чистой скамейке. Убедитесь, что каллус не привязан к фильтровальной бумаге.
- Передача калли равномерно с помощью стерильного пинцета в первичную среду отбора NBD2 (с 40 мг/л гигромицина и 250 мг/л тотентина)(таблица 1). Культура калли в течение 2 недель при 25-28 градусов по Цельсию в темноте.
- Через 2 недели, передача калли равномерно на новую тарелку, содержащую свежий выбор среднего NBD2 (с 40 мг / л гигромицин и 250 мг / л тономин) (Таблица 1). Культура калли в течение еще 2 недель в 25-28 градусов по Цельсию в темноте.
- Дифференциация Каллуса
- Передача каллуса на свежий MS Medium (с 25 мг/л гигромицином и 150 мг/л тономином)(таблица 1). Культура под светом при 25-28 градусов по Цельсию в течение примерно 2 недель.
- Повторите шаг 2.4.1 еще раз.
- Передача стрелять почки на новый MS среды (с 10 мг / Л гигромицин), чтобы размножаться больше побегов.
- Корневая индукция
- Передача новых побегов в 1/2 MS среды(таблица 1). Культура под светом при 25 градусов по Цельсию - 28 градусов по Цельсию. Преобразованные растения производят корни в течение 2 недель.
- После 1 недели, передать растения для очистки горшки, покрывающие растение, чтобы предотвратить обезвоживание.
3. Идентификация генотипа
- Соберите молодые листья из новых растений для общей извлечения ДНК с помощью метода cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB)31.
- Используя геномную ДНК в качестве шаблона, выберите грунтовки (Hygromycin-F: 5' GATGTTGGCGCCTCGTATT 3' и Hygromycin-R: 5' CGAAGAATCTCGTGTTTCA 3' расположен в регионе Гигромицин) для выполнения полимеразной цепной реакции (PCR) для проверки трансгеннойинтеграции и частот (рисунок 4). Следующие условия ПЦР: 94 градуса по Цельсию в течение 5 мин; 36 циклов (94 градуса по Цельсию на 30 с; 56 градусов по Цельсию на 30 с; 72 градусов по Цельсию в течение 1 мин); 72 КК в течение 7 мин. Успешные реакции ПЦР дают 604 bp amplicon.
- Выполните еще один ПЦР, чтобы усилить геномную область вокруг целевых объектов CRISPR с помощью конкретных праймеров (OsABCG15-ID-F: 5' GTCTCATTGCTCAGTTTCTCT 3' и OsABCG15-ID-R: 5' TTGGTGTTTAAACATTGCTAT 3') для определения генотипа трансформаторов. Условия ПЦР такие же, как и в шаге 3.2.
- Используйте фрагменты ПЦР из шага 3.3 непосредственно для секвенирования Sanger для выявления мутаций.
4. Наблюдайте за основным фенотипом мутанта
- Приготовьте раствор I2-KI:растворите 2 г KI (йодида калия) в 10 мл дистиллированной воды, а затем добавьте в него 0,2 г I2 (повторно починили йодом). После смешивания довнесите общий объем до 100 мл с дистиллированной водой.
- Приготовьте раствор FAA (63% ангидроус этанола, 5% ледниковой уксусной кислоты, 5% формальдегида и 27% воды) и перемешайте перед использованием.
- Приготовьте 0,5% раствора голубого окрашивания Толуйдина: растворите 0,5 г толуйдина в 100 мл дистиллированной воды.
- Выполните вегетативное фенотипическое наблюдение, с помощью визуализации целых растений с помощью цифровой камеры.
- Выполните наблюдение репродуктивного фенотипа, удалите палею и лемму из цветка. Сфот фотографируй целые пыльцы под стереомикроскопом.
- Наблюдайте за жизнеспособностью пыльцы при окрашивание йодом.
- Выберите зрелые рисовые шипы перед цветочным антезом, удалите палеа и лемму, чтобы освободить пыльники.
- Возьмите 6 пыль и поместите их на стеклянную горку. Добавить 1 каплю дистиллированной воды, раздавить пыль на пыль хорошо пинцетом, чтобы освободить пыльцу зерна, а затем добавить 2-3 капли I2-KI раствор. Обложка с крышкой.
- Наблюдайте под микроскопом низкого увеличения. Пыльца зерна окрашены в черный цвет показывают более энергичную жизнеспособность, не цвет или желто-коричневый окрашенные отстают или вырождаются.
- Выполните полутонкий раздел рисового пыльного пыль
- Зафиксните рисовые цветы на разных стадиях развития в раствор FAA. Вакуумные материалы при 4 градусов по Цельсию (как правило, 15 мин), чтобы позволить фиксатору проникать в ткани до тех пор, пока материал не утонет на дно бутылки коллекции.
- Замените новое решение FAA на следующий день. После того, как материал опускается на дно, заменить 70% этанола и хранить при 4 градусов по Цельсию для долгосрочного использования.
- Обезвоживать материалы с различными градиентами этанола (70%, 80%, 95% каждый раз в течение 30 мин, 100% этанола на 2 ч, 100% этанола, содержащего немного сафранина красителя в течение 2 ч).
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавить немного красителя Сафранина во второй 100% этанола, чтобы цвет пыль для облегчения секции потом. - Выполните встраивание, следуя инструкции производителя (Таблица материалов). Затем выпекать в духовке при температуре 60 градусов по Цельсию в течение 48 ч перед секцией.
- Раздел образца толщиной 2 мкм с помощью микротома. Добавьте каплю воды на стеклянную горку. Затем возьмите тонкие секции, содержащие антерные блоки типсами, и положите их на поверхность капли воды на горках.
- Поместите горки на водяной бане при 50 градусов по Цельсию, чтобы полностью распределить секции, чтобы она прочно прилиплась к слайду.
- Используйте 0,5% толуидин синий раствор пятно слайды в течение 30 мин. Затем промыть водой и высушить в дымовой капот. Печать с нейтральным клеем дерева. Аккуратно поместите крышку на слайд и высушите в дымовой капот.
- Наблюдайте и фотографуйте образец под микроскопом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Здесь демонстрируется использование технологии редактирования генов для создания мужской стерильной линии для будущих исследований Agrobacterium-опосредованной генетической трансформации риса. Для создания мужской стерильной линии osabcg15, CRISPR-CAS9-опосредованного мутагенеза был использован для двоичного векторного строительства. SgRNA был обусловлен Промоутер OsU3, в то время как выражение кассеты hSpCas9 был обусловлен двойной 35S промоутер, и средний вектор был собран в одном двоичном векторе pCAMBIA1300 предназначен для Agrobacterium-опосредованнойстабильной трансформации риса. Графическое изображение конструкции, которая использовалась для CRISPR/Cas9-опосредованного мутагенеза риса, представлено на рисунке 1A.
Рисунок 2 и рисунок 3 представляют всю процедуру производства рисовых трансгенов. Молодые соцветия были выбраны в качестве эксплантов(рисунок 2) и индуцированных рыхлый эмбриональный каллус (FEC) в течение 14 дней после прививки на NBD2 среды (Рисунок 3A). Эмбриональные калли были непосредственно использованы для Agrobacterium-опосредованныепреобразования (Рисунок 3C) или субкультуры для распространения, чтобы получить больше калли для дальнейшей инфекции (Рисунок 3B). После совместного культивирования в течение 48 ч на NBD2-AS среды втемных условиях (рисунок 3D), калли были перенесены на второй раунд отбора среды. После 10-14 дней, преобразованный калли показал некоторые небольшие вновь образованные микрокалли на периферии матери Калли, в то время как цвет непереформированных калли превратился в коричневый и умер в конце концов (Рисунок 3E, F). Позже, здоровые и сливочного цвета калли были переведены в регенерации среды в два раза. На этом этапе трансформировал калли постепенно показали зеленые пятна (стрелять почки) (Рисунок 3G,H). Эти вновь созданные зеленые пятна были отобразованы в стерильной пластиковой бутылке, содержащей регенерацию среды, чтобы стрелять роста (Рисунок 3I), а затем смещается (как свежие побеги) в 1 / 2 MS среды, чтобы вызвать корни. Позже были собраны здоровые и энергичные растущие побеги с хорошо развитымикорнями (рисунок 3J).
Всего было получено 21 регенерированная рассада. Усиление ПЦР для области гигромицина показало, что 18 из 21 могут усилить соответствующую полосу, указывая, что эти линии трансгенны(рисунок 4),а соответствующая частота трансформации составляет около 85,71%(таблица 2). Трансформанты были генотипированы для идентификации мутаций на целевом участке sgRNA (ы) с помощью грунтовок, охватывающих целевую область с помощью секвенирования ПЦР ампликонаи Сэнгера, среди 18 трансгенных растений T 0 восемь гетерозиготных линий и три однообразные линии были CRISPR-Cas9 положительными, с соответствующими частотами мутации 61,11%(рисунок 1B, Таблица 2).
Гомозиготные нокаут-мутанты были подтверждены основным наблюдением за мужскими репродуктивными органами(рисунок 5). Пыль osabcg15 были меньше и бледнее, чем у дикого типа(рисунок 5A,D), и не хватало зрелых зерен пыльцы (Рисунок 5B,E). Поперечная секционая микроскопия была проведена для исследования антер морфологических дефектов в osabcg15 по сравнению с диким типом. На стадии 10, дикого типа микроспоры стали круглой формы и vacuolated с темно-сине-окрашенные exine (Рисунок 5C). В отличие от этого, osabcg15 микроспоры рухнули и деградировали, только обломки вырожденных микроспор существуют в anther locule (Рисунок 5F).
Рисунок 1: Создать информацию для системы CRISPR/Cas9 и целевого мутагенеза OsABCG15. (A) sgRNA был обусловлен Промоутер OsU3, в то время как выражение кассеты hSpCas9 был обусловлен двойной промоутер 35S; средний вектор был собран в единый бинарный вектор, предназначенный для Agrobacterium-опосредованная стабильная трансформация риса. (B ) Последовательность (5'-AAGCACATCCTCAAGGGGAT-3'), расположенная во втором экзоне гена OsABCG15, была выбрана в качестве целевого участка sgRNA.B Три типа гомозиготных мутаций были созданы CRISPR-Cas9 в japonica cultivar 9522 фон, и Сэнгер секвенирования хроматограммы CRISPR-Cas9 индуцированных мутаций сайтов показаны. Линия 9522osabcg15-1 имеет одноядеротидную (1-nt) вставку 'A'; линия 9522osabcg15-2 имеет одноядеротидную (1-nt) вставку 'G'; и линия 9522osabcg15-3 имеет одноядеротидное (1-nt) 'G' удаление. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Стартовые материалы для индуцирования каллуса. (A)Молодые соцветия риса на стадии мейоза. (B) Расчлененные молодые соцветия, растущие на среде NBD2. Бар No 2 см в (A). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Процедура производства трансгенных линий Agrobacterium - опосредованнаятрансформация. (A)Райс калли генерируется из молодых соцветий. (B)Субкультура калли. (C) Инкубация калли с A. tumefaciens. ( D )Совместноевыращивание калли с A. tumefaciens. (E) Первый цикл отбора преобразованных калли в присутствии гигромицина (40 мг/л). (F)Второй цикл отбора преобразованных калли в присутствии гигромицина (40 мг/л). (G)Первая регенерация преобразованных калли. (H) Вторая регенерация преобразованных калли, отметить зеленый стрелять точки в культуре пластины. (I) Стрелять индукционной культуры. (J)Корневая индукция. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Анализ частот трансформации регенерированных саженцев риса. Усиленные продукты ПЦР, которые показывают фрагмент 604 bp (1-8, 10-14, 16-20) после 1,5% агарозного геля электрофорез указывают на трансгенные положительные линии. Линии, в которые отсутствует фрагмент, нетрансформированы (9, 15, 21), подобно элементу управления дикого типа (WT). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Основные фенотипические наблюдения дикого типа (9522) и мутанта 9522osabcg15-1. (A) Цветок дикого типа (9522)и( D ) 9522osabcg15-1 цветок-мутант после удаления леммы и палеа. gl, glume; фи, нить; ло, лодикуле; пи, пистиль; ул, стамен. (B) I2-KI окрашивание зрелых зерен пыльцы из дикого типа (9522) и (E) 9522osabcg15-1 линии. (C) Анализ развития пыльного пылью в диком типе (9522) и (F) 9522osabcg15-1 мутанта путем трансграничного наблюдения раздела. DMsp, вырожденные микроспоры; E, эпидермис; En, эндотеция; Msp, микроспор; T, лента. Бары 2 мм в (A) и (D), 100 мкм в (B) и (E, 50 мкм в (C) и (F). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Таблица 1: Медиа композиции для преобразования риса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 2: Трансформация и эффективность редактирования генов мутантов OsABCG15, генерируемых CRISPR-Cas9 в поколении T0. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Искусственные генные мужские стерильные мутанты традиционно генерируются случайным физическим, химическим или биологическим мутагенезом. Хотя это мощные методы, их случайный характер не может извлечь выгоду из огромного количества современных геномных знаний, которые имеют потенциал для доставки индивидуальных улучшений в молекулярномразведении 32. Система CRISPR-Cas9 широко используется в растениях благодаря простым и доступным средствам для управления и редактированияДНК 29,33; он имеет потенциал, чтобы сэкономить время по сравнению с традиционными методами мутагенеза.
Здесь мы разработали удобную систему трансформации Agrobacterium- опосредованную, используя молодые соцветия в качестве эксплантов для индукции каллуса. Есть несколько шагов в процедуре трансгена, которые могут быть опущены, чтобы сэкономить время. Использование молодых соцветий в качестве исходного материала является хорошим выбором, чтобы свести к минимуму общую продолжительность индукции каллуса по сравнению с использованием семян в качестве explants. Кроме того, дифференциация клеток и способность к регенерации очень сильны в калли, полученных от молодых соцветий. В этом процессе, субкультуры риса калли можно избежать, что в конечном итоге экономит время, а также снижает риск бактериального и грибкового загрязнения. Кроме того, хюнтин был использован в качестве антибиотика вместо карбенициллина, который является более эффективным в ингибировании бактерий.
Исследование и введенный протокол для базового фенотипического наблюдения мужского репродуктивного развития риса полезен для студентов и аспирантов, которые заинтересованы в растительной репродуктивной биологии. Этот удобный протокол должен быть быстрым для понимания и воспроизводиться для использования в последующих исследованиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ни один.
Acknowledgments
Авторы хотели бы отметить Xiaofei Чэнь для предоставления молодых соцветий риса и помощь в создании рисовой ткани культуры среды. Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (31900611).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Naphthaleneacetic acid | Sigma-Aldrich | N0640 | |
| 2, 4-Dichlorophenoxyacetic Acid | Sigma-Aldrich | D7299 | |
| 6-Benzylaminopurine (6-BA) | Sigma-Aldrich | B3408 | |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| Agar | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10000561 | |
| Ammonium sulfate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10002918 | |
| Aneurine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T4625 | |
| Anhydrous ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10009218 | |
| Bacteriological peptone | Sangon Biotech | A100636 | |
| Beef extract | Sangon Biotech | A600114 | |
| Boric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10004808 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 20011160 | |
| Casein acid hydrolysate | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | C184 | |
| Cobalt(II) chloride hexahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10007216 | |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10008218 | |
| D(+)-Glucose anhydrous | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 63005518 | |
| D-sorbitol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 63011037 | |
| EDTA, Disodium Salt, Dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| EOS Digital SLR and Compact System Cameras | Canon | EOS 700D | |
| Formaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010018 | |
| Fully Automated Rotary Microtome | Leica Biosystems | Leica RM 2265 | |
| Glacial acetic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10000208 | |
| Glycine | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 62011516 | |
| Hygromycin | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | H370 | |
| Inositol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 63007738 | |
| Iodine | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10011517 | |
| Iron(II) sulfate heptahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10012116 | |
| Kanamycine | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | K378 | |
| Kinetin | Sigma-Aldrich | K0753 | |
| L-Arginine | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 62004034 | |
| L-Aspartic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 62004736 | |
| L-Glutamine | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | G229 | |
| L-proline | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | P698 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10013018 | |
| Manganese sulfate monohydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10013418 | |
| Microscopes | NIKON | Eclipse 80i | |
| MS | Phytotech | M519 | |
| Nicotinic acid | Sigma-Aldrich | N0765 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| Potassium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10016308 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10017608 | |
| Potassium iodide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10017160 | |
| Potassium nitrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 1001721933 | |
| Pyridoxine Hydrochloride (B6) | Sigma-Aldrich | 47862 | |
| Rifampicin | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | R501 | |
| Sodium hydroxide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019718 | |
| Sodium molybdate dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019816 | |
| Stereo microscopes | Leica Microsystems | Leica M205 A | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10021418 | |
| Technovit embedding Kits 7100 | Heraeus Teknovi, Germany | 14653 | |
| Timentin | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | T869 | |
| Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Water bath for paraffin sections | Leica Biosystems | Leica HI1210 | |
| Yeast extract | Sangon Biotech | A515245 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10024018 |
References
- FAO. FAO statistical yearbook, World Food and Agriculture. Rome. ISBN 978-92-5-107396-4. , Available from: http://www.fao.org/3/i3107e/i3107e.pdf (2013).
- FAO. The future of food and agriculture: Trends and challenges. Rome. ISBN 978-92-5-109551-5. , Available from: http://www.fao.org/3/a-i6583e.pdf 109551-109555 (2017).
- Izawa, T., Shimamoto, K. Becoming a model plant: The importance of rice to plant science. Trends in Plant Science. 1 (3), 95-99 (1996).
- Shimamoto, K., Kyozuka, J. Rice as a model for comparative genomics of plants. Annual Review of Plant Biology. 53 (1), 399-419 (2002).
- Selva, C., et al. Hybrid breeding in wheat: how shaping floral biology can offer new perspectives. Functional Plant Biology. 47 (8), 675-694 (2020).
- Lippman, Z. B., Zamir, D. Heterosis: revisiting the magic. Trends in Genetics. 23 (2), 60-66 (2007).
- Zhang, D., Liang, W. Improving food security: using male fertility for hybrid seed breeding. Science. , 45-48 (2016).
- Masters, A., et al. Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes. Journal of Visualized Experiments. (156), e60782 (2020).
- Laurenceau, R., et al. A type IV pilus mediates DNA binding during natural transformation in Streptococcus pneumoniae. PLoS Pathogens. 9 (6), 1003473 (2013).
- Tzfira, T., Citovsky, V. Agrobacterium-mediated genetic transformation of plants: biology and biotechnology. Current Opinion in Biotechnology. 17 (2), 147-154 (2006).
- Gelvin, S. B. Agrobacterium in the genomics age. Plant Physiology. 150 (4), 1665-1676 (2009).
- Lacroix, B., Citovsky, V. The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation. International Journal of Developmental Biology. 57, 467-481 (2013).
- Hiei, Y., Komari, T. Agrobacterium-mediated transformation of rice using immature embryos or calli induced from mature seed. Nature Protocols. 3 (5), 824 (2008).
- Hiei, Y., Ohta, S., Komari, T., Kumashiro, T. Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. The Plant Journal. 6 (2), 271-282 (1994).
- Hiei, Y., Komari, T., Kubo, T. Transformation of rice mediated by Agrobacterium tumefaciens. Plant Molecular Biology. 35 (1-2), 205-218 (1997).
- Nishimura, A., Aichi, I., Matsuoka, M. A protocol for Agrobacterium-mediated transformation in rice. Nature Protocols. 1 (6), 2796 (2006).
- Yara, A., et al. Production of transgenic japonica rice (Oryza sativa) cultivar, Taichung 65, by the Agrobacterium-mediated method. Plant Biotechnology. 18 (4), 305-310 (2001).
- Cho, S. K., et al. Efficient transformation of Korean rice cultivars (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens. Journal of Plant Biology. 41 (4), 262-268 (1998).
- Toki, S. Rapid and efficient Agrobacterium-mediated transformation in rice. Plant Molecular Biology Reporter. 15, 16-21 (1997).
- Zhang, J., Xu, R. j, Elliott, M. C., Chen, D. F. Agrobacterium-mediated transformation of elite indica and japonica rice cultivars. Molecular Biotechnology. 8 (3), 223-231 (1997).
- Aldemita, R. R., Hodges, T. K. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of japonica and indica rice varieties. Planta. 199 (4), 612-617 (1996).
- Rashid, H., Yokoi, S., Toriyama, K., Hinata, K. Transgenic plant production mediated by Agrobacterium in indica rice. Plant Cell Reports. 15 (10), 727-730 (1996).
- Sahoo, K. K., Tripathi, A. K., Pareek, A., Sopory, S. K., Singla-Pareek, S. L. An improved protocol for efficient transformation and regeneration of diverse indica rice cultivars. Plant Methods. 7 (1), 49 (2011).
- Rachmawati, D., Hosaka, T., Inoue, E., Anzai, H. Agrobacterium-mediated transformation of Javanica rice cv. Rojolele. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 68 (6), 1193-1200 (2004).
- Dong, J., Teng, W., Buchholz, W. G., Hall, T. C. Agrobacterium-mediated transformation of Javanica rice. Molecular Breeding. 2 (3), 267-276 (1996).
- Bortesi, L., Fischer, R. The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond. Biotechnology Advances. 33 (1), 41-52 (2015).
- Li, Q., et al. Development of japonica photo-sensitive genic male sterile rice lines by editing carbon starved anther using CRISPR/Cas9. Journal of Genetics and Genomics. 43 (6), 415 (2016).
- Qin, P., et al. ABCG15 encodes an ABC transporter protein, and is essential for Post-Meiotic anther and pollen exine development in rice. Plant and Cell Physiology. 54, (2013).
- Mao, Y., et al. Application of the CRISPR-Cas system for efficient genome engineering in plants. Molecular Plant. 6 (6), 2008-2011 (2013).
- Itoh, J. I., et al. Rice plant development: from zygote to spikelet. Plant and Cell Physiology. 46 (1), 23-47 (2005).
- Gawel, N. J., Jarret, R. L. A modified CTAB DNA extraction procedure forMusa andIpomoea. Plant Molecular Biology Reporter. 9 (3), 262-266 (1991).
- Wei, F. J., Droc, G., Guiderdoni, E., Hsing, Y. iC. International Consortium of Rice Mutagenesis: resources and beyond. Rice. 6 (1), 39 (2013).
- Feng, Z., et al. Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system. Cell Research. 23 (10), 1229 (2013).
