Summary
この研究は、CRISPR-Cas9ゲノム編集技術を使用して内因性遺伝子 OsABCG15 をノックアウトし、続いて修飾 されたアグロバクテリウム媒介変換プロトコルを使用して、米中に安定な男性滅菌ラインを生成することを説明する。
Abstract
男性の無菌性は、通常、男性の生殖器官/配偶体の機能的欠陥によって特徴付けられるハイブリッド種子生産のための重要な農学形質である。CRISPR-Cas9ゲノム編集技術の最近の進歩により、特定の部位における内因性候補遺伝子の高い編集効果とタイムセービングノックアウト突然変異が可能になります。さらに、米のアグロバクテリウム媒介性遺伝子改変は、多くの公的および民間の研究所で広く採用されている遺伝子改変のための重要な方法でもあります。本研究では、CRISPR-Cas9ゲノム編集ツールを用いて、JaPONICa品種におけるOsABCG15の標的ゲノム編集により、3つの男性無菌変異株の生成に成功した。我々は、米中のハイブリッド種子生産のための遺伝的発育の優れた手段を提供することができる改変されたアグロバクテリウム媒介米変換法を使用した。トランスジェニック植物は2~3ヶ月以内に得ることができ、ホモ接合形質転換体はPCR増幅とサンガーシーケンシングを用いた遺伝子型入力によりスクリーニングされた。男性の無菌ホモ接合系の基本的な表現型特徴付けは、米雄生殖器官の顕微鏡観察によって行われ、ヨウ素カリウム(I2-KI)を開発するアンサーの半薄い断面2染色による花粉生存率解析を行った。
Introduction
米は、特に発展途上国で最も重要な食糧作物であり、世界人口の半分以上の主食です。全体として、米穀物の需要は増加しており、2030年には50%、2050年には100%増加1,すると予測されている。今後の米産出量の改善は、米を単一植物研究の優れたモデルにする多様な分子および遺伝的資源を活用する必要があります。これらには、効率的な変換システム、高度な分子地図、および長年にわたって生成された表現されたシーケンスタグの一般にアクセス可能なデータベースが含まれます。作物の収量を改善するための1つの戦略は、ハイブリッド種子生産5、その中心的な要素は、男性の生殖能力を操作する能力です。穀物作物における男性の生殖能力の分子制御を理解することは、ハイブリッド種子生産を改善し、作物の生産性を高めるために実用的な技術に重要な知識を翻訳するのに役立ちます6,,7.
遺伝子変換は、作物植物における外来遺伝子の導入や内因性遺伝子の操作を可能にし、遺伝子組み換えラインの生成を可能にするため、基礎研究および商業農業のための重要なツールです。適切な変換プロトコルは、遺伝子調節の基本的な理解のための遺伝的および分子生物学研究を加速するのに役立ちます 8.細菌では、遺伝的変換は自然に起こります。しかし、植物では、分子生物学の技術99,1010を用いて人工的に行われる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスは、T-DNA(T-DNA)を植物性プラスミドの領域であるT-DNAをIV型分泌系11,12,12を介して植物細胞に移すことによって植物のクラウン胆汁病を引き起こす土壌媒介のグラム陰性細菌である。植物において、A.トゥメファシアン-媒介性変換は、T-DNAのホストゲノム13への安定かつ低コピー数の統合をもたらすため、遺伝子改変のための広範な方法と考えられている。トランスジェニック米は、1990年代半ばにジャポニカ品種14でアグロバクテリウム媒介遺伝子変換を経て初めて生成された。このプロトコルを使用して、トランスジェニックラインを4ヶ月以内に得られ、変換効率は10%~30%であった。この研究は、成熟した種子からの胚起源のカルスの誘導であり、もう1つは植物14、15,15の変換効率を高くすることを可能にする共培養中の細菌培養にフェノール性化合物であるアセトシリンゴンの添加である。このプロトコル,は、japonica,,16、17、18、19だけでなく、17,18インディカ191620、21、22、23および熱帯ジャポニカ22212324、25,25などの他の品種でマイナーな変更で広く使用されています。20,実際、米の変容を説明する記事の80%以上は、ツール13としてアグロバクテリウム媒介遺伝子変換を使用する。現在までに、カルス誘導16、17、18、19,17,18の出発物質として、米の種を用いていくつかの遺伝的変換プロトコルが19開発されてきた。しかし、カルス生産の外植者としての若い花序についてはほとんど知られていない。全体的に、機能性ゲノミクスの迅速で再現性のある効率的な遺伝子変換と再生プロトコルの確立と作物の改善に関する研究が重要です。
近年、CRISPR-Cas9技術の進歩により、遺伝子機能を理解し、植物飼育26,27,27に対する農業学的に重要な改善を提供する精密なゲノム編集機構が生まれています。CRISPRはまた、男性の生殖の発達とハイブリッド生産の操作のためのかなりの約束を提供しています。本研究では、CRISPR-Cas9技術を用いた遺伝子ノックアウトシステムを活用し、若い花序を外植体として効率的な米遺伝子変換プロトコルに結合し、生殖発達の研究に安定した男性の滅菌ラインを作製した。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. sgRNA-CAS9 植物発現ベクター構造と アグロバクテリウム媒介性変換
- 公表された文献28に従って、オスの無菌遺伝子OsABCG15を米にターゲットとする。
- OsABCG15の第2のエキソンで106-125 bpの間に位置する標的部位のsgRNAを設計する(図1)。
- T4ポリヌクレオチドキナーゼを使用してsgRNAオリゴを合成します(sgR-OsABCG15-F:5'TGGCAAGATTCAAGGGGATAT3' および 5'sgR-OsABCG15-R: AAACATCCCCTGTGTGTGTGTTT')。
- エンドヌクレアーゼBbsIを使用して、psgR-Cas9バックボーンベクトル29を消化します。
- メーカーのプロトコルに従ってT4リガーゼを使用して、リニア化されたpsgR-Cas9バックボーンで合成されたsgRNAオリゴをリゲートします。
- HindIII/EcoRIを使用して、ステップ1.5からsgRNAカセットを消化し、サブクローンをpCAMBIA1300バイナリベクターのHindIII/EcoRIサイトに分けて安定した変換29を行う。
- 酵素消化とシーケンシングにより構築されたプラスミドを確認します。その後、バイナリ構造を アグロバクテリウム・トゥメファシエンス 株EHA105に変換し、28°CのKan/Rif選択プレートで2〜3日間成長させます。
2. 米の遺伝子変容と植物組織培養
- カルスの誘導と再生
注意:新鮮な若い米の花序を出発材料として使用して、カルスを誘導します(図2)。- 小花長1.6~4.8mm(図2A)29で決定された、水田や緑の家から小花出を集める。米の花序が葉の鞘で覆われていることを確認します。70%のアルコール綿棒で各花序を拭き、切断する前に乾燥させます。
- 清潔な無菌ベンチに花序を持って来なさい。滅菌したはさみで小さく切り(小さいほど良い)に切り、挿し木をNBD2培地を含むペトリプレートに移す(図2B、表1)。
- カルスを誘導するために、26°Cの暗闇の中でプレートを約10〜14日間インキュベートする(図3A)。
注:新たに形成されたア グロバクテリウム 浸潤(ステップ2.2.7)用のカルスを直接使用するか、新しいNBD2培地でもう一度再調整してカルスを増やしてください。8~10日ごとに新しいNBD2媒体にカルスを移します。
- 変革と共耕作
- 変換には、ステップ1.6からバイナリプラスミドを含む A.トゥメファシエンス 細菌を使用してください。 A.トゥメファシエンス 株をYEB培地(表1)に50%グリセロールを-80°Cで保存し、さらに使用してください。
- ストリーク A.ツメファシエン スは、-80°Cグリセロールストックから選択的抗生物質を含むYEB寒天培地(表1)まで、25〜28°Cで48〜72時間成長し、コロニーが出現することを可能にする。
- 選択性抗生物質を用いてYEBプレートから単一コロニーを5mLの選択的抗生物質を含む液体YEB培地(表1)に接種し、50 mLの円錐型滅菌試験管に入る。250 x gの軌道シェーカーで、細菌が 0.5 の OD600 に成長するまで 25 ~ 28 °C で振ります。
- 250 mL円錐フラスコで同じ選択的抗生物質を用いて100mLのYEB培地(表1)に1mLの細菌懸濁液を加xえ、28°Cで28°Cで軌道シェーカーで振る。
- 4,000 x g で、室温で 10 分間遠心分離機を使用して、細菌を採取します。上清を捨てます。
- 細菌ペレットをAAM-AS培地(表1)で再懸濁し、その懸濁液をOD600= 0.4に希釈する。
注:細菌懸濁液の完璧なODは、効率的な変換のために重要です。これは、カルス上の過剰な細菌の成長を排除するのに役立ちます. - ステップ2.1.3から150 mLの無菌フラスコに約150の健康な成長する薄黄色の脆弱な胚発生カリを収集します。ステップ2.2.6から50〜75 mLの細菌細胞懸濁液を無菌フラスコに加え、10〜25 mLの新鮮なAAM-AS培地を加えて、時折揺れ動いて10〜20分間カリを浸します。
- フラスコから細菌懸濁液を慎重に注ぎ、滅菌濾紙#1またはティッシュペーパーを使用して、カルスから余分な細菌懸濁液を乾燥させます。次に、無菌フィルター紙で覆われたNBD-AS培地(表1)のペトリ皿の上に置#1。暗闇の中で25~28°Cで3日間インキュベートし、細菌の過剰増殖を確認します。
- 抵抗性カルスの選択
- 共同栽培の3日後、滅菌濾紙で滅菌ペトリ皿にカリを移します。
- クリーンベンチで2時間のカリを空気乾燥させます。カルスがフィルタ用紙に付着していないことを確認します。
- 滅菌用トゥイーザーを使用して呼び出しを一次選択培地NBD2(40 mg/Lハイグロマイシンおよび250mg/Lインテンチンを用いて)に均等に移す(表1)。暗い中で25~28°Cで2週間の文化カリ。
- 2週間後、新しい選択培地NBD2(40mg/Lハイグロマイシンおよび250mg/Lインテンチンを含む)を含む新しいプレートにカリーを均等に移す(表1)。暗闇の中で25〜28°Cでさらに2週間カリを培養する。
- カルス分化
- 新鮮なMS培地にカルスを移す(25mg/Lハイグロマイシンおよび150mg/Lインティンを用いて) (表1)。25~28°Cの光の下での文化を約2週間培養。
- ステップ 2.4.1 をもう一度繰り返します。
- より多くの芽を増殖させるために新しいMS培地(10 mg / Lハイグロマイシン)にシュート芽を移します。
- ルート誘導
- 新しいシュートを1/2 MS培地に移します (表1)。25°C~28°Cでの光下での培養 形質転換された植物は2週間以内に根を作り出す。
- 1週間後、植物を清潔にして植物を覆うポットに移し、脱水を防ぎます。
3. 遺伝子型識別
- 新たに生成した植物から若い葉を採取し、セチルトリメチルアンモニウム臭化アンモニウム(CTAB)法31を用いて全DNA抽出を行う。
- ゲノムDNAをテンプレートとして使用し、ハイグロマイシン領域にあるプライマー(ハイグロマイシン-F:5' GATGTTGGCGAccTCGTATT3'およびハイグロマイシン-R:5' CGAAGAATCTCGTGTTTCA 3')を選択して、トランスジーン鎖反応(PCR)を実施し、トランスジーンおよびインテグレーション周波数を検証する(4)以下の PCR 条件: 94 °C 5 分間;36サイクル(30sの94°C;30sのための56°C;1分のための72°C);72°C 7分間。成功した PCR 反応は 604 bp アンプリコンを得る。
- 特異的なプライマー(OsABCG15-ID-F:5'GTCTCATTGCTCACAGTTTCT 3'およびOsABCG15-ID-R:5'TTGGTGTTTAAACATTTAT 3')を使用してCRISPR標的部位を取り巻くゲノム領域を増幅するために別のPCRを行い、トランスタントの遺伝子型を同定する。PCR条件は、ステップ3.2と同じです。
- ステップ 3.3 の PCR フラグメントを直接サンガー シーケンシングに使用して、変異を特定します。
4. 変異体の基本的表現型を観察する
- I2-KI溶液を調製する:10mLの蒸留水にKI(ヨウ化カリウム)の2gを溶解し、その中に0.2gのI2( ヨウ素再昇華)を加える。混合後、全容を蒸留水で100mLにします。
- FAA溶液(63%無水エタノール、5%氷酢酸、5%ホルムアルデヒド、27%水)を調製し、使用する前に混合します。
- 0.5%トルイジンブルー染色液を調製する:蒸留水の100mLに0.5gのトルイジンブルーを溶解する。
- デジタルカメラで植物全体をイメージングすることにより、栄養的な触言観察を行います。
- 生殖表現型観察を行い、花とレンマを小花から取り除く。実体顕微鏡で全アンサーの写真を撮る。
- ヨウ素染色で花粉の生存率を観察する。
- 花のアテシスの前に成熟した米の小穂を選び、古い花とレンマを取り除いてアンサーを放出します。
- 6アンサーを取り、ガラスのスライドの上に置きます。蒸留水を1滴加え、ピンセットでアリザーをうまくつぶして花粉粒を放出し、I2-KI溶液を2~3滴加えます。カバースリップで覆います。
- 低倍率顕微鏡で観察します。黒く染めた花粉粒はより活発な生存率を示し、色や黄褐色の染色はスタントまたは退化していない。
- 米のアンサーの半薄い部分を実行します
- 異なる発達段階の米の花をFAA溶液に固定します。材料がコレクションボトルの底に沈むまで固定剤が組織に浸透できるように、4°C(一般的に15分)で材料を真空します。
- 翌日、新しいFAAソリューションで交換してください。材料が底に沈んだら、70%エタノールに交換し、長期使用のために4°Cで保存します。
- 異なる勾配のエタノール(70%、80%、95%)を30分間、100%エタノールで2時間、100%エタノールを少し含む2時間のサフラニン染料を脱水する。
注:サフラニン染料を2番目の100%エタノールに少し加えて、後で簡単に切り離すためにアンサーを着色します。 - メーカーの指示に従って埋め込みを行います(資料表)。その後、60°Cのオーブンで48時間焼いてから切り離します。
- ミクロトームを使用して、サンプルを2μmの厚さに切り離します。グラススライドに水を一滴追加します。次に、鉗子でアンテルブロックを含む薄い部分を拾い、スライド上の水滴の表面に置きます。
- 50°Cの水浴にスライドを置き、セクションを完全に広げてスライドにしっかりと付着させます。
- 0.5%トルイジンブルー溶液を使用して、スライドを30分間染色します。その後、水ですすい、ヒュームフードで乾燥させます。ニュートラルツリー接着剤でシール。スライドにカバースリップをそっと置き、ヒュームフードで乾かします。
- 顕微鏡で試料を観察し、撮影します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ここで実証されているのは、遺伝子編集技術を用いて、米中のアグロバクテリウム媒介性遺伝子変換による将来の研究のための男性の無菌ラインを作成することです。osabcg15の男性の無菌ラインを作成するために、CRISPR-CAS9媒介性突然変異誘発は、バイナリベクター構築のために使用された。sgRNAはOsU3プロモーターによって駆動され、hSpCas9の発現カセットはダブル35Sプロモーターによって駆動され、中間ベクトルはアグロバクテリウムに対して設計された単一のバイナリベクター pCAMBIA1300で組み立てられた- 米の安定な変換を仲介した。CRISPR/Cas9媒介性米の変異生成に使用された構造のグラフィカルな表現を図1Aに示します。
図2と図3は、米トランスジーン生産の全手順を表しています。若い花序を外植として選び、NBD2培地に接種してから14日以内に可聴性胚原性カルス(FEC)を誘導した(図3A)。胚性のカリをアグロバクテリウム媒介性変換(図3C)またはサブ培養のために直接使用し、さらなる感染のためにより多くのカリを得た(図3B)。暗い条件下でNBD2-AS培地上で48時間の共同培養を行った後(図3D)、そのカリを第2の選択媒体にシフトした。10~14日後、形質転換されたcalliは母カリの周囲に小さな新しく形成されたマイクロカリを見せ、未変換のカリの色は茶色に変わり、最終的に死んだ(図3E,F)。その後、健康でクリーミーな色のカリを再生培地に2回移した。この段階では、変換された呼び出しは徐々に緑色の斑点(芽を撃つ)を示した(図3G,H)。これらの新たに生成された緑斑を、再生培地を含む無菌のプラスチックボトルで培養し、芽増殖を可能にし(図3I)、次いで(新鮮な芽として)1/2MS培地に移して根を誘導した。その後、よく発達した根を持つ、健康で活発な芽が収穫された(図3J)。
合計で21種の再生苗が得られた。ハイグロマイシン領域に対するPCR増幅は、21個中18個が対応するバンドを増幅できることを示し、これらの線がトランスジェニックであることを示す(図4)、対応する変換周波数は約85.71%である(表2)。この形質転換体は、PCRアンプリコンおよびサンガーシーケンシングによって標的領域にまたがるプライマーを使用してsgRNA標的部位の突然変異を同定するために遺伝子型化され、18のT0トランスジェニック植物のうち、8つのヘテロ接合基線および3つのホモ接合線がCRISPR-Cas9陽性であり、対応する突然変異頻度は61.11%であった(図1B、表2)。
ホモ接合ノックアウト変異体は、基本的な男性の生殖器官の観察によって検証された(図5)。osabcg15のアンサーは、野生型(図5A,D)のアンサーよりも小さく、青ざめ、成熟した花粉粒を欠いていた(図5B,E)。横断断面顕微鏡は、野生型と比較してosabcg15におけるアンサー形態学的欠陥を調べるため行った。ステージ10では、野生型マイクロスポアは丸い形状になり、濃い青色に染まったエキシンで空いた(図5C)。対照的に、osabcg15マイクロスポは崩壊して分解し、脱退した微小胞の破片のみがアンテルロキュアに存在する(図5F)。
図1: OsABCG15の CRISPR/Cas9 システムおよび標的変異生成の情報を構築する。(A) SgRNAはOsU3プロモーターによって駆動されたが、hSpCas9の発現カセットはダブル35Sプロモーターによって駆動された。真ん中のベクトルは、米のアグロバクテリウム媒介安定形化のために設計された単一のバイナリベクトルで組み立てられた。(B) OsABCG15遺伝子の第2のエキソンに位置する配列(5'-AAGCACATCCTCAAGGGGAT-3')をsgRNAの標的部位として選択した。CRISPR-Cas9によってジャポニカ品種9522バックグラウンドで生成された3種類のホモ接合性変異イベントと、CRISPR-Cas9誘導突然変異部位のサンガーシーケンシングクロマトグラムが示されている。9522行osabcg15-1は、一ヌクレオチド(1-nt)'A'挿入を有する。行9522osabcg15-2は、一ヌクレオチド(1-nt)'G'挿入を有する。9522行osabcg15-3は、一ヌクレオチド(1-nt)'G'欠失を有する。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:カルスを誘発するための出発材料。(A)米の若い花序が、meiosisの段階で起き上がった。(B) NBD2培地上で成長する若い花序を解剖した。バー = 2 cm in (A). この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:アグロバクテリウム媒介変換によるトランスジェニックラインの製造手順(A)若い花序から生み出された米の呼び(B) カリのサブカルチャー。(C)タメファシエンスとのカリのインキュベーション(D) タメファシエンスとのカリの共同栽培(( E) ハイグロマイシン(40 mg/L)の存在下での変換されたカリの最初の選択サイクル。(F)ハイグロマイシン(40mg/L)の存在下での変換されたカリの第2選択サイクル。(G) 変換された可換の最初の再生。(H)変換されたカリの第二の再生、培養プレート内の緑のシュートポイントを示す。(I)シュート誘導文化。(J) ルート誘導。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4 再生米苗の変換頻度の解析1.5%アガロースゲル電気泳動後に604bp断片(1-8、10-14、16-20)を示す増幅PCR産物は、トランスジェニック陽性ラインを示します。フラグメントを欠いた線は、ワイルドタイプ(WT)コントロールと同様に、変換されません(9、15、21)。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:野生型(9522)および変異型9522osabcg15-1の基本的な表現型観察。(A)野生型(9522)花と(D)9522 osabcg15-1レンマと古いの除去後の変異花。Dgl, グラム;fi, フィラメント;ロ、ロディキュア;パイ、ピスティル;st,stamen.(B)I2-野生型(9522)と(E)9522osabcg15-1ラインからの成熟した花粉粒のKI染色。E 9522(C)横断線観察による野生型(9522)および(F)9522Fosabcg15-1変異体におけるアンサーの発達の解析。 9522DMsp、退化した微小胞子;E、表皮;エン、内皮;Msp、微小胞T、タペタム。バー = 2 mm in(A)と (D), 100 μm で (B) と (E), 50 μm in (C) および (F) 。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
表1:米の変容のためのメディア構成こちらの表をダウンロードしてください。
表2:T0生成におけるCRISPR-Cas9により生成されたOsABCG15の変異体の形質転換および遺伝子0編集効率。こちらの表をダウンロードしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
人工原発性男性の生殖不能変異体は、伝統的にランダムな物理的、化学的、または生物学的突然変異によって生成される。これらは強力な技術ですが、そのランダムな性質は、分子育種32のカスタマイズされた改善を提供する可能性を秘めた膨大な量の現代のゲノム知識を活用することができません。CRISPR-Cas9システムは、DNA29、33を操作し、33編集するためのシンプルで手頃な手段のために植物で広く使用されています。従来の突然変異誘発法と比較して時間を節約する可能性があります。
ここでは、若い花序をカルス誘導の外植植物として用いた便利なアグ ロバクテリウム媒介変換系を開発した。トランスジーン手順には、時間を節約するために省略できる手順がいくつかあります。若い花序を出発材料として使用することは、外植として種子を使用するのと比較して、カルス誘導の全体的な持続時間を最小限に抑えるのに適しています。また、若い花序から得られるカリにおいて、細胞分化および再生能力が非常に強い。このプロセスでは、米カリのサブカルチャーを避けることができるので、最終的には時間を節約し、細菌や真菌汚染のリスクを低減します。さらに、クエンチンはカルベニシリンの代わりに抗生物質として使用され、これは細菌を阻害するのにより効果的である。
この研究と、米における男性の生殖発達の基本的な現象観察のためのプロトコルの導入は、植物の生殖生物学に興味を持つ学部生や大学院生にとって有用である。この便利なプロトコルは、その後の研究で使用するために把握し、再現するために迅速にする必要があります。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
なし。
Acknowledgments
著者らは、若い米の花序と米組織培養培地の製造支援を提供したXiaofei Chenを認めたい。この研究は中国国立自然科学財団(31900611)によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Naphthaleneacetic acid | Sigma-Aldrich | N0640 | |
| 2, 4-Dichlorophenoxyacetic Acid | Sigma-Aldrich | D7299 | |
| 6-Benzylaminopurine (6-BA) | Sigma-Aldrich | B3408 | |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| Agar | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10000561 | |
| Ammonium sulfate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10002918 | |
| Aneurine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T4625 | |
| Anhydrous ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10009218 | |
| Bacteriological peptone | Sangon Biotech | A100636 | |
| Beef extract | Sangon Biotech | A600114 | |
| Boric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10004808 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 20011160 | |
| Casein acid hydrolysate | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | C184 | |
| Cobalt(II) chloride hexahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10007216 | |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10008218 | |
| D(+)-Glucose anhydrous | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 63005518 | |
| D-sorbitol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 63011037 | |
| EDTA, Disodium Salt, Dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| EOS Digital SLR and Compact System Cameras | Canon | EOS 700D | |
| Formaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010018 | |
| Fully Automated Rotary Microtome | Leica Biosystems | Leica RM 2265 | |
| Glacial acetic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10000208 | |
| Glycine | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 62011516 | |
| Hygromycin | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | H370 | |
| Inositol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 63007738 | |
| Iodine | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10011517 | |
| Iron(II) sulfate heptahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10012116 | |
| Kanamycine | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | K378 | |
| Kinetin | Sigma-Aldrich | K0753 | |
| L-Arginine | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 62004034 | |
| L-Aspartic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 62004736 | |
| L-Glutamine | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | G229 | |
| L-proline | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | P698 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10013018 | |
| Manganese sulfate monohydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10013418 | |
| Microscopes | NIKON | Eclipse 80i | |
| MS | Phytotech | M519 | |
| Nicotinic acid | Sigma-Aldrich | N0765 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| Potassium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10016308 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10017608 | |
| Potassium iodide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10017160 | |
| Potassium nitrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 1001721933 | |
| Pyridoxine Hydrochloride (B6) | Sigma-Aldrich | 47862 | |
| Rifampicin | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | R501 | |
| Sodium hydroxide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019718 | |
| Sodium molybdate dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019816 | |
| Stereo microscopes | Leica Microsystems | Leica M205 A | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10021418 | |
| Technovit embedding Kits 7100 | Heraeus Teknovi, Germany | 14653 | |
| Timentin | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | T869 | |
| Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Water bath for paraffin sections | Leica Biosystems | Leica HI1210 | |
| Yeast extract | Sangon Biotech | A515245 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10024018 |
References
- FAO. FAO statistical yearbook, World Food and Agriculture. Rome. ISBN 978-92-5-107396-4. , Available from: http://www.fao.org/3/i3107e/i3107e.pdf (2013).
- FAO. The future of food and agriculture: Trends and challenges. Rome. ISBN 978-92-5-109551-5. , Available from: http://www.fao.org/3/a-i6583e.pdf 109551-109555 (2017).
- Izawa, T., Shimamoto, K. Becoming a model plant: The importance of rice to plant science. Trends in Plant Science. 1 (3), 95-99 (1996).
- Shimamoto, K., Kyozuka, J. Rice as a model for comparative genomics of plants. Annual Review of Plant Biology. 53 (1), 399-419 (2002).
- Selva, C., et al. Hybrid breeding in wheat: how shaping floral biology can offer new perspectives. Functional Plant Biology. 47 (8), 675-694 (2020).
- Lippman, Z. B., Zamir, D. Heterosis: revisiting the magic. Trends in Genetics. 23 (2), 60-66 (2007).
- Zhang, D., Liang, W. Improving food security: using male fertility for hybrid seed breeding. Science. , 45-48 (2016).
- Masters, A., et al. Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes. Journal of Visualized Experiments. (156), e60782 (2020).
- Laurenceau, R., et al. A type IV pilus mediates DNA binding during natural transformation in Streptococcus pneumoniae. PLoS Pathogens. 9 (6), 1003473 (2013).
- Tzfira, T., Citovsky, V. Agrobacterium-mediated genetic transformation of plants: biology and biotechnology. Current Opinion in Biotechnology. 17 (2), 147-154 (2006).
- Gelvin, S. B. Agrobacterium in the genomics age. Plant Physiology. 150 (4), 1665-1676 (2009).
- Lacroix, B., Citovsky, V. The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation. International Journal of Developmental Biology. 57, 467-481 (2013).
- Hiei, Y., Komari, T. Agrobacterium-mediated transformation of rice using immature embryos or calli induced from mature seed. Nature Protocols. 3 (5), 824 (2008).
- Hiei, Y., Ohta, S., Komari, T., Kumashiro, T. Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. The Plant Journal. 6 (2), 271-282 (1994).
- Hiei, Y., Komari, T., Kubo, T. Transformation of rice mediated by Agrobacterium tumefaciens. Plant Molecular Biology. 35 (1-2), 205-218 (1997).
- Nishimura, A., Aichi, I., Matsuoka, M. A protocol for Agrobacterium-mediated transformation in rice. Nature Protocols. 1 (6), 2796 (2006).
- Yara, A., et al. Production of transgenic japonica rice (Oryza sativa) cultivar, Taichung 65, by the Agrobacterium-mediated method. Plant Biotechnology. 18 (4), 305-310 (2001).
- Cho, S. K., et al. Efficient transformation of Korean rice cultivars (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens. Journal of Plant Biology. 41 (4), 262-268 (1998).
- Toki, S. Rapid and efficient Agrobacterium-mediated transformation in rice. Plant Molecular Biology Reporter. 15, 16-21 (1997).
- Zhang, J., Xu, R. j, Elliott, M. C., Chen, D. F. Agrobacterium-mediated transformation of elite indica and japonica rice cultivars. Molecular Biotechnology. 8 (3), 223-231 (1997).
- Aldemita, R. R., Hodges, T. K. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of japonica and indica rice varieties. Planta. 199 (4), 612-617 (1996).
- Rashid, H., Yokoi, S., Toriyama, K., Hinata, K. Transgenic plant production mediated by Agrobacterium in indica rice. Plant Cell Reports. 15 (10), 727-730 (1996).
- Sahoo, K. K., Tripathi, A. K., Pareek, A., Sopory, S. K., Singla-Pareek, S. L. An improved protocol for efficient transformation and regeneration of diverse indica rice cultivars. Plant Methods. 7 (1), 49 (2011).
- Rachmawati, D., Hosaka, T., Inoue, E., Anzai, H. Agrobacterium-mediated transformation of Javanica rice cv. Rojolele. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 68 (6), 1193-1200 (2004).
- Dong, J., Teng, W., Buchholz, W. G., Hall, T. C. Agrobacterium-mediated transformation of Javanica rice. Molecular Breeding. 2 (3), 267-276 (1996).
- Bortesi, L., Fischer, R. The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond. Biotechnology Advances. 33 (1), 41-52 (2015).
- Li, Q., et al. Development of japonica photo-sensitive genic male sterile rice lines by editing carbon starved anther using CRISPR/Cas9. Journal of Genetics and Genomics. 43 (6), 415 (2016).
- Qin, P., et al. ABCG15 encodes an ABC transporter protein, and is essential for Post-Meiotic anther and pollen exine development in rice. Plant and Cell Physiology. 54, (2013).
- Mao, Y., et al. Application of the CRISPR-Cas system for efficient genome engineering in plants. Molecular Plant. 6 (6), 2008-2011 (2013).
- Itoh, J. I., et al. Rice plant development: from zygote to spikelet. Plant and Cell Physiology. 46 (1), 23-47 (2005).
- Gawel, N. J., Jarret, R. L. A modified CTAB DNA extraction procedure forMusa andIpomoea. Plant Molecular Biology Reporter. 9 (3), 262-266 (1991).
- Wei, F. J., Droc, G., Guiderdoni, E., Hsing, Y. iC. International Consortium of Rice Mutagenesis: resources and beyond. Rice. 6 (1), 39 (2013).
- Feng, Z., et al. Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system. Cell Research. 23 (10), 1229 (2013).
