Summary
يهدف البروتوكول المعروض هنا إلى إثبات حدوث تفاعلات غير متجانسة بين بروتينات الغشاء من النوع الثالث المقيمة في غولجي مع N- و / أو C-termini المعرضة للسيتوبلازما في خلايا الثدييات الحية باستخدام أحدث متغير من فحص تكملة luciferase المنقسمة.
Abstract
الهدف من هذا البروتوكول هو استكشاف إمكانية تطبيق أحدث متغير من تكملة لوسيفيراز المنقسمة لإظهار المجمعات غير المتجانسة التي شكلتها ناقلات السكر النيوكليوتيدات (NSTs). تحمل هذه البروتينات متعددة الأغشية المقيمة في ER- و Golgi سكريات النيوكليوتيد المركبة من السيتوبلازم عبر أغشية العضيات لتزويد الإنزيمات التي تتوسط في الغليكوزيل مع ركائزها. توجد NSTs كدايمرات و / أو أوليغومرات أعلى. كما تم الإبلاغ عن تفاعلات غير متجانسة بين NSTs المختلفة. للتحقق مما إذا كانت هذه التقنية مناسبة لدراسة ظاهرة التباين NST ، اختبرناها مقابل مزيج من NSTs المقيمين في Golgi والتي ثبت سابقا أنها مرتبطة بعدة وسائل أخرى. يبدو أن اختبار تكملة luciferase مناسب بشكل خاص لدراسة التفاعلات بين بروتينات الغشاء المقيمة في Golgi ، لأنه لا يتطلب مستويات تعبير عالية ، والتي غالبا ما تؤدي إلى سوء توطين البروتين وتزيد من خطر الإيجابيات الكاذبة.
Introduction
تصف هذه المخطوطة بروتوكولا خطوة بخطوة للتحقق من وجود تفاعلات غير متجانسة بين بروتينات الغشاء من النوع الثالث المقيمة في غولجي في الخلايا البشرية المنقولة بشكل عابر باستخدام أحدث متغير من فحص تكملة لوسيفيراز المنقسمة. تم اختبار الإجراء على نطاق واسع ضد ناقلات السكر النيوكليوتيدات (NSTs) ولكننا تمكنا أيضا من الحصول على نتائج إيجابية لبروتينات الغشاء الأخرى من النوع الثالث المقيمة في غولجي والتي تواجه N- و / أو C-termini السيتوبلازم.
تستكشف مجموعتنا البحثية دور NSTs في غليكوزيل الجزيئات الكبيرة. NSTs هي بروتينات غشائية من النوع الثالث من Golgi و / أو ER مع N- و C-termini تواجه الجانب السيتوبلازمي من الغشاء العضوي 1. يعتقد أن NSTs تحمل السكريات المنشطة بالنيوكليوتيدات عبر أغشية العضيات لتزويد الجليكوسيل ترانسفيراز بركائزها. تشكل NSTs dimers و / أو oligomers أعلى 2,3,4,5,6,7,8,9,10. علاوة على ذلك ، تم الإبلاغ أيضا عن تفاعلات غير متجانسة بين NSTs المختلفة 6,11. كما ثبت أن NSTs تشكل مجمعات مع إنزيمات غليكوزيل ذات صلة وظيفية12،13،14. بحثنا عن بديل للتقنية المستخدمة حاليا ، نهج FRET القائم على التصوير الفلوري مدى الحياة (FLIM) ، لدراسة تفاعلات NSTs والبروتينات المقيمة في Golgi ذات الصلة وظيفيا ، لذلك قررنا اختبار اختبار اختبار اختبار تكامل luciferase المنقسم. سمح لنا بتحديد تفاعل جديد بين NST وإنزيم غليكوزيل مرتبط وظيفيا9.
ويستخدم أحدث تعديل لفحص تكملة لوسيفيراز المنقسمة، NanoBiT، في البروتوكول المعروض هنا15. وهو يعتمد على إعادة تكوين إنزيم لوسيفيراز (على سبيل المثال ، نانولوك) من الشظيتين - الجزء الكبير ، الذي يطلق عليه اسم BiT أو LgBiT الكبير ، وهو بروتين 17.6 kDa ، والصغير ، الذي يتكون من 11 حمضا أمينيا فقط ، يطلق عليه اسم BiT الصغير أو SmBiT. يتم دمج البروتينين المهمين مع الشظايا التكميلية ويتم التعبير عنهما بشكل عابر في خط خلية بشرية. إذا تفاعل البروتينان الانصهاري ، يتم إنتاج لمعان في الموقع عند إضافة ركيزة نفاذة للخلية. تم تحسين هذين الشظيتين بحيث يرتبطان بالحد الأدنى من التقارب ما لم يتم جمعهما معا من خلال التفاعل بين البروتينات ذات الأهمية التي يتم دمجها فيها.
بشكل عام ، تتمتع الطرق القائمة على التلألؤ الحيوي ببعض المزايا على الطرق القائمة على التألق. تحتوي إشارات اللمعان الحيوي على نسبة إشارة إلى ضوضاء أعلى لأن لمعان الخلفية لا يكاد يذكر مقارنة بالإشارة المشتقة من luciferase16. في المقابل ، عادة ما تعاني النهج القائمة على التألق من خلفية عالية نسبيا ناجمة عن ظاهرة التألق الذاتي. إلى جانب ذلك ، فإن التلألؤ الحيوي أقل ضررا على الخلايا التي تم تحليلها من التألق ، كما هو الحال في الحالة الأولى ليست هناك حاجة لإثارة العينة. لهذه الأسباب ، تتفوق مناهج اللمعان الحيوي لدراسة PPIs في الجسم الحي على طرق الفلورسنت الشائعة الاستخدام مثل Förster Resonance Energy Transfer (FRET) أو Molecular Fluorescence Complementation (BiFC).
يعتمد بروتوكولنا على إحالة التلألؤ الذي تم الحصول عليه لمزيج البروتين ذي الأهمية إلى التلألؤ الذي تم الحصول عليه لمجموعة التحكم. ويشمل هذا الأخير أحد البروتينات التي تم اختبارها والتي يتم دمجها مع جزء أكبر وبروتين تحكم (على سبيل المثال ، HaloTag) ، يندمج مع جزء أصغر. هذا الأخير هو بروتين من أصل بكتيري لا يتوقع أن يتفاعل مع أي من بروتينات الثدييات. استخدام هذا البروتين كعنصر تحكم يضع قيودا على طوبولوجيا أزواج البروتينات المقيمة في غولجي المراد تحليلها. نظرا لأنه في خلايا الثدييات يتم تصنيع هذا البروتين في السيتوبلازم ، يجب أن يكون لكل من البروتينين محل الاهتمام ذيل سيتوبلازمي واحد على الأقل.
ويمكن أن يكون هذا النهج مفيدا بشكل خاص للفحص الأولي لمؤشرات أسعار المنتجين. قد تصبح الطريقة المفضلة عندما يتم التعبير عن بروتينات الاندماج ذات الأهمية عند مستويات غير كافية ببساطة لتطبيق نهج أخرى. وبالمثل ، يمكن أن يكون اختبار تكملة luciferase المجزأة هو الخيار الأفضل إذا تم التعبير عن البروتينات ذات الأهمية بمستويات عالية ، ولكن هذا يؤثر سلبا على توطينها تحت الخلوي أو من المعروف أنه يفرض تفاعلات غير محددة. نظرا لأن الجزء الأصغر يحتوي على 11 حمضا أمينيا فقط ، يمكن تطبيق اختبار تكملة luciferase المنقسم عند استخدام علامات أكبر أمر مستحيل. وأخيرا، يمكن استخدامه لزيادة تأكيد البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام تقنيات أخرى، كما هو الحال في الحالة المعروضة هنا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. توليد بلازميدات التعبير
- فحص طوبولوجيا الغشاء للبروتينات ذات الأهمية باستخدام أداة التنبؤ الطوبولوجية.
- صمم استراتيجية الاستنساخ بحيث تواجه الشظايا الأكبر والأصغر السيتوبلازم بمجرد إدخال بروتينات الاندماج في أغشية غولجي. إذا كان كل من N- و C-termini من البروتينات ذات الأهمية ، كما هو الحال في الحالة المعروضة هنا ، موجها نحو السيتوبلازم ، فقم بوضع علامة على البروتينات بثماني طرق ممكنة (انظر الشكل 1B). إذا كانت المحطة N أو C لأحد البروتينات ذات الأهمية أو كليهما موجهة بشكل مضيء ، فاستبعدها من وضع العلامات.
- قم باستنساخ الجينات ذات الأهمية إلى ناقلات تعبير مناسبة (انظر جدول المواد) باتباع بروتوكولات الاستنساخ القياسية.
ملاحظة: يوصى باختبار جميع الاتجاهات الممكنة، نظرا لأن بعض خيارات وضع العلامات قد لا تعمل بسبب عدم كفاية القرب أو الاتجاه دون المستوى الأمثل أو القيود المكانية.
2. النقل العابر للبلازميدات التعبير إلى الخلايا
- حصاد مزرعة الخلايا HEK293T الملتصقة عن طريق التربسين وإعادة تعليق الخلايا في وسط نمو كامل مخصص. قم بلوحة الخلايا (2 × 104/100 ميكرولتر / بئر) على قاع شفاف ، لوحة ذات جانب أبيض 96 بئرا. اضبط العدد الإجمالي للآبار لاستيعاب جميع المجموعات وعناصر التحكم التي تم اختبارها بما في ذلك النسخ المتماثلة.
ملاحظة: حاول استخدام 60 بئرا داخلية فقط من اللوحة لتقليل التحولات الحرارية وتجنب التبخر بين عشية وضحاها. يوصى بشدة باستخدام الألواح المطلية بالبولي دي ليسين مثل تلك المشار إليها في جدول المواد ، وإلا فقد تنفصل الخلايا أثناء خطوات الغسيل اللاحقة. - استزرع الخلايا بين عشية وضحاها في الظروف القياسية (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2).
- في اليوم التالي ، قم بنقل الخلايا باستخدام المجموعات المطلوبة من بلازميدات التعبير التي تم الحصول عليها في النقطة 1.1.
- تمييع بلازميدات التعبير في وسط خال من المصل (انظر جدول المواد) إلى 6.25 نانوغرام/ميكرولتر لكل بناء.
- أضف كاشف النقل القائم على الدهون بنسبة مناسبة من الدهون إلى الحمض النووي واحتضنه وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- أضف 8 ميكرولتر من الدهون:خليط الحمض النووي إلى الآبار المعينة. امزج محتوى اللوحة عن طريق الدوران اللطيف. وهذا يؤدي إلى نقل كلا من بنيات التعبير عند 50 نانوغرام/بئر.
- زراعة الخلايا لمدة 20-24 ساعة في الظروف القياسية (37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO2).
ملاحظة: قد يؤدي استزراع الخلايا لفترة أطول إلى مستويات أعلى من التعبير عن بروتين الانصهار ، مما قد يعزز ارتباطا غير محدد بين الشظايا.
3. تبادل المتوسطة
- في اليوم التالي ، استبدل الوسط المشروط ب 100 ميكرولتر من وسط خال من المصل في كل بئر. تأكد من أن الخلايا لم تنفصل عند التبادل المتوسط.
ملاحظة: يجب أن تتم هذه الخطوة قبل 2-3 ساعات من إضافة حل عمل الفوريمازين. سحب المصل يقلل من الخلفية الناجمة عن التلألؤ الذاتي للفوريمازين.
4. إعداد حل عمل الفوريمازين
- قبل القياس مباشرة ، امزج 1 حجم من الفوريمازين مع 19 مجلدا من مخزن مؤقت للتخفيف (تخفيف 20 ضعفا).
ملاحظة: يعتمد الحجم الإجمالي لمحلول عمل الفوريمازين الذي سيتم إعداده على عدد الآبار الفردية التي سيتم تحليلها (يضاف محلول عمل الفوريمازين إلى وسط زراعة الخلايا بنسبة 1:5 ، وبالتالي ، إلى كل بئر مملوء سابقا ب 100 ميكرولتر من وسط خال من المصل يجب إضافة 25 ميكرولتر من محلول عمل الفوريمازين). - أضف محلول عمل الفوريمازين إلى الآبار المعينة (25 ميكرولتر / بئر). امزج الصفيحة برفق باليد أو باستخدام شاكر مداري (على سبيل المثال، 15 ثانية عند 300-500 دورة في الدقيقة).
5. قياس التلألؤ
- أدخل اللوحة في قارئ لوحة صغيرة مضيئة.
- بالنسبة للتجارب التي سيتم إجراؤها عند 37 درجة مئوية ، قم بموازنة اللوحة لمدة 10-15 دقيقة عند درجة الحرارة المحددة.
- حدد الآبار المراد تحليلها.
- قراءة التلألؤ مع وقت التكامل من 0.3 ثانية. استمر في مراقبة التلألؤ لمدة تصل إلى 2 ساعة عند الحاجة.
6. تحليل البيانات
- حساب القيم المتوسطة والانحرافات المعيارية لجميع مجموعات الاختبار والتحكم.
- تحليل البيانات باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه مع مقارنات متعددة.
- احسب قيم تغيير الطية بقسمة متوسط اللمعان الذي تم الحصول عليه لمجموعات الاهتمام على متوسط اللمعان الذي تم الحصول عليه للعناصر الضوابط السلبية المقابلة. تقييم النتائج.
ملاحظة: يفترض نهج تحليل البيانات المقترح هنا أنه يمكن المطالبة بالتفاعل إذا كان التلألؤ الذي تم الحصول عليه للتركيبة المختبرة أعلى إحصائيا من التلألؤ الذي تم الحصول عليه لمجموعة التحكم المقابلة ، وفي الوقت نفسه ، تتجاوز نسبة هاتين القيمتين 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
للحصول على البيانات الأكثر موثوقية في هذا النهج ، يجب اختبار جميع المجموعات الممكنة (انظر الشكل 1). وبالتوازي مع ذلك، ينبغي إدراج ضوابط إيجابية وسلبية. يجب أن يتكون التحكم الإيجابي من البروتينين المعروفين بتفاعلهما ، أحدهما يندمج مع الجزء الأكبر والآخر يندمج مع الجزء الأصغر. من الناحية المثالية ، يجب أن يتكون التحكم السلبي من بروتينين غشائيين من النوع الثالث غير متفاعلين موسومين بالمثل. ومع ذلك ، قد يكون إنشاء مثل هذا التحكم تحديا ، حيث يجب تأكيد عدم تفاعل بروتيني التحكم بدقة باستخدام عدة طرق بديلة. لذلك ، يمكن للمرء أن يستخدم بروتينا خلويا من أصل غير بشري لا يتوقع أن يتفاعل مع أي بروتين بشري (على سبيل المثال ، HaloTag) كعنصر تحكم سلبي ، إذا تم الكشف عن N- و / أو C-termini من البروتينات ، التي سيتم تحديد تفاعلها ، سيتوبلازما كما في الحالة المعروضة هنا. نوصي بشدة بإجراء تحقق إضافي من النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام هذا النوع من التحكم عن طريق التعبير المشترك عن المتغيرات غير الموسومة لأي من البروتينات ذات الأهمية جنبا إلى جنب مع معايرة البلازميدات المقابلة. إذا تفاعل البروتينان على وجه التحديد ، فيجب أن تؤدي نسخة إضافية من أي منهما تفتقر إلى جزء luciferase إلى انخفاض محدد في اللمعان.
وترد في الجدول 1 قيم وحدات التلألؤ النسبية (RLU) النموذجية للتركيبات الموجبة والسالبة. تم الحصول على النتائج لاثنين من NSTs ، SLC35A2 و SLC35A3 ، التي تبين أنها مرتبطة بالترسيب المناعي المشترك و FLIM-FRET6 وكذلك في فحص ربط القرب في الموقع11. كل من SLC35A2 و SLC35A3 هما بروتينات غشائية من النوع الثالث مقيمة في غولجي مع N- و C-termini تواجه السيتوبلازم (الشكل 1A). لذلك ، هناك ثمانية خيارات ممكنة لوضع العلامات ويمكن تجميع بروتينات الاندماج الناتجة معا أيضا بثماني طرق ممكنة (الشكل 1B). ويبين الشكل 2 ألف متوسط قيم RLU المقابلة لجميع مجموعات الاختبار والتحكم. يتم تضمين التحكم الإيجابي أيضا. ومن المتطلبات الأولية لاعتبار نتيجة مختارة مؤشرا على التفاعل أن قيمة RLU التي تم الحصول عليها لمزيج من المصالح أعلى بكثير إحصائيا من قيمة RLU التي تم الحصول عليها لمجموعة التحكم المقابلة. في الشكل 2A ، تظهر ثلاث مجموعات من هذا القبيل (LgBiT-SLC35A2 + SLC35A3-SmBiT و SmBiT-SLC35A2 + LgBiT-SLC35A3 و SLC35A2-SmBiT + LgBiT-SLC35A3). تتضمن الخطوة التالية في تحليل النتائج الحصول على قيم نسب لمجموعات المصالح عن طريق قسمة قيم RLU المقابلة على قيم RLU التي تم الحصول عليها للعناصر التحكم المعنية. وترد نتائج هذا التحليل في الشكل 2 باء. وفقا لاقتراحات الشركة المصنعة ، فإن النسب بين 10 و 1000 تشير بشكل كبير إلى تفاعلات محددة. هناك مجموعتان تستوفيان هذه المعايير (SmBiT-SLC35A2 + LgBiT-SLC35A3 و SLC35A2-SmBiT + LgBiT-SLC35A3) وتدعم فكرة تفاعل SLC35A2 و SLC35A3. ومع ذلك ، فإن حقيقة أن المجموعات الست الأخرى سلبية لا تعني أنه لا توجد تفاعلات على الإطلاق بين بروتينات الاندماج المعنية ، ولكنها تشير إلى أن استراتيجية وضع العلامات لم تكن مثالية في هذه الحالات. يوضح هذا المثال مدى أهمية اختبار جميع المجموعات الممكنة.
كما تم تأكيد البيانات المقدمة في الشكل 2 من خلال التعبير المشترك عن SLC35A2 أو SLC35A3 الموسومة بعلامة HA مع الجمع الذي أدى إلى أعلى لمعان نسبي ، وهو SLC35A2-LgBiT + SmBiT-SLC35A3. تم استخدام كميات متفاوتة من البلازميدات التي تشفر متغيرات NST الموسومة ب HA للنقل المشترك. وأدى ذلك إلى انخفاض ذي دلالة إحصائية يعتمد على الجرعة في قيم RLU (الشكل 3). ويبين الجدول 2 الاضطراب المحدد والمعتمد على الجرعة للتفاعل بين SLC35A2-LgBiT وSmBiT-SLC35A3 عن طريق التعبير المشترك المتزامن لمتغيرات NST الموسومة ب HA.
المشكلة الأكثر شيوعا المرتبطة بالطريقة المعروضة هنا هي ضعف كفاءة النقل. للتحقق مما إذا كان هذا هو سبب النتائج دون المستوى الأمثل ، قم بتضمين التحكم الإيجابي في جميع التجارب. يتكون التحكم الإيجابي الذي استخدمناه للحصول على البيانات المعروضة هنا من بروتينين اندماجيين متفاعلين: الوحدة الفرعية التحفيزية للبروتين كيناز المعتمد على cAPM ألفا (PRKACA) المنصهرة مع الجزء الأصغر والوحدة الفرعية التنظيمية للبروتين المعتمد على cAPM من النوع II-alpha (PRKAR2A) المنصهرة مع الجزء الأكبر. في أيدينا ، وصلت قيمة RLU المقابلة إلى ~ 6 × 105. قد يكون الانخفاض الكبير (2-3 أوامر من الحجم) في هذا العدد مؤشرا على الكفاءة دون المستوى الأمثل للنقل المنجز. في مثل هذه الحالة ، نوصي بالتحقق من صحة الخلايا المستزرعة والتأكد من أن العدد المناسب من الخلايا يتم طلاؤه للنقل.
الشكل 1: مخططات طوبولوجيا الأغشية ووضع العلامات. (أ) طوبولوجيا غشاء بروتينات SLC35A2 و SLC35A3. (ب) إمكانيات وضع علامات على بروتينات SLC35A2 وSLC35A3 مع شظايا فحص تكملة لوسيفيراز المنقسمة والجمع بين بروتينات الاندماج الناتجة للفحص. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: نتائج فحص تكملة لوسيفيراز المنقسم الذي أجري في خلايا HEK293T لتركيبات البروتين المختارة والضوابط السلبية المقابلة (البيانات المعالجة). (أ) قيم RLU التي تم الحصول عليها لمجموعات البروتين المختارة والضوابط السلبية المقابلة. سلبي, HaloTag الموسومة ب SmBiT; PRKAR2A ، وحدة فرعية تنظيمية تعتمد على بروتين كيناز من النوع الثاني ألفا من نوع cAPM ؛ PRKACA، وحدة فرعية محفزة للبروتين كيناز تعتمد على cAPM ألفا. تم تحليل البيانات باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه مع مقارنات متعددة ويتم تقديمها كمتوسط ± الانحراف المعياري (SD) من ثلاث نسخ متماثلة تقنية. ص < 0.1 *، ص < 0.05 **، ص < 0.01 ***. (ب) تغيرات الطي المحسوبة بقسمة متوسط اللمعان الذي تم الحصول عليه للتركيبة المختبرة (RLU SAMPLE) على متوسط لمعان تم الحصول عليه للتحكم السلبي المقابل (RLU CONTROL). تم تعيين قيمة العتبة التي تعتبر مؤشرا على التفاعل عند 10. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: اضطراب محدد ومعتمد على الجرعة للتفاعل بين SLC35A2-LgBiT و SmBiT-SLC35A3 عن طريق التعبير المشترك المتزامن عن متغيرات NST الموسومة ب HA. تم نقل خلايا HEK293T باستخدام بلازميدات تشفر SLC35A2-LgBiT و SmBiT-SLC35A3 ، بالإضافة إلى ذلك ، إما باستخدام بلازميد pSelect فارغ (وهمي) أو بكميات متزايدة من بلازميدات pSelect التي تشفر SLC35A2 الموسومة ب HA (اللوحة اليسرى) و SLC35A3 (اللوحة اليمنى). تم تحليل البيانات باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه مع مقارنات متعددة ويتم تقديمها كمتوسط ± الانحراف المعياري (SD) من ثلاث نسخ متماثلة تقنية. ص < 0.05 **، ص < 0.001 ****. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1: نتائج الفحص الذي أجري في خلايا HEK293T لمجموعات البروتين المختارة والضوابط السلبية المقابلة (البيانات الخام). يتم عرض قيم RLU غير المعالجة التي تم الحصول عليها لمجموعات البروتين المحددة والضوابط السلبية المقابلة. سلبي, HaloTag الموسومة ب SmBiT; PRKAR2A ، وحدة فرعية تنظيمية تعتمد على بروتين كيناز من النوع الثاني ألفا من نوع cAPM ؛ PRKACA، وحدة فرعية محفزة تعتمد على بروتين كيناز cAPM ألفا، TR، تكرار تقني. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 2: الاضطراب المحدد والمعتمد على الجرعة للتفاعل بين SLC35A2-LgBiT و SmBiT-SLC35A3 عن طريق التعبير المشترك المتزامن عن متغيرات NST الموسومة ب HA (البيانات الأولية). يتم عرض قيم RLU غير المعالجة التي تم الحصول عليها لمجموعات البروتين المحددة. خلايا وهمية تعبر عن SLC35A2-LgBiT و SmBiT-SLC35A3 يتم نقلها بشكل مشترك مع متجه pSelect فارغ ؛ HA-SLC35A2 ، الخلايا التي تعبر عن SLC35A2-LgBiT و SmBiT-SLC35A3 يتم نقلها بشكل مشترك مع الكميات المشار إليها من ترميز البلازميد pSelect SLC35A2 الموسومة ب epitope HA في المحطة N ؛ HA-SLC35A3 ، الخلايا التي تعبر عن SLC35A2-LgBiT و SmBiT-SLC35A3 يتم نقلها بشكل مشترك مع الكميات المشار إليها من ترميز البلازميد pSelect SLC35A3 الموسومة ب HA epitope في المحطة N ؛ TR ، النسخ المتماثل التقني. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا نقدم بروتوكولا مفصلا يتيح عرض المجمعات غير المتجانسة التي تشكلت بين بروتينات الغشاء من النوع الثالث المقيمة في غولجي ، مثل NSTs ، باستخدام فحص تكملة luciferase المنقسمة. يتضمن النهج المقترح لتحليل البيانات وتفسيرها ربط التلألؤ الذي تم الحصول عليه لمزيج البروتين ذي الأهمية بالتلألؤ الذي تم الحصول عليه لمزيج التحكم المقابل ، والذي يتكون من أحد البروتينات ذات الأهمية المنصهرة مع الجزء الأكبر وبروتين التحكم من أصل بكتيري المنصهر مع الجزء الأصغر. يتم التعبير عن هذا الأخير في السيتوبلازم من خلايا الثدييات. لذلك ، يتطلب استخدامه كمرجع أن يكون N- و / أو C-termini من البروتينات ، التي سيتم تحليل تفاعلها ، على الجانب السيتوبلازمي من غشاء غولجي.
الخطوات الحاسمة في البروتوكول هي تصميم البلازميد ، وطلاء الخلايا المراد نقلها ، والنقل نفسه ، والتبادل المتوسط ، وإعداد محلول عمل الفوريمازين وإضافته إلى الخلايا. يجب أن يتم تصميم البلازميد بطريقة تواجه كل من شظايا luciferase السيتوبلازم ، وإلا فلن تعمل مجموعات التحكم وستكون قيم RLU المرجعية مفقودة. يجب أن تكون الخلايا المراد نقلها مطلية على النحو المحدد في البروتوكول ، وإلا فقد تكون كفاءة النقل دون المستوى الأمثل. نوصي باستخدام ألواح متعددة الآبار مع السطح المطلي بالبولي إل-ليسين لدعم تعلق الخلية أثناء تبادل الوسط. أخيرا ، يجب تحضير محلول عمل الفوريمازين طازجا وإضافته على الفور إلى الخلايا. بمجرد إضافته ، يجب إجراء القراءة في أقرب وقت ممكن.
لتجنب النتائج غير الحاسمة ، يجب دائما تضمين الضوابط الإيجابية والسلبية. وينبغي دائما استخدام التحكم الإيجابي بحيث يتم رصد كفاءة النقل. من المهم جدا أن يتم إنشاء ودمج جميع بروتينات الاندماج المحتملة المتوافقة طوبولوجيا مع بعضها البعض وكذلك مع التحكم السلبي القائم على HaloTag. إذا كان ذلك ممكنا ، يجب استخدام التحكم السلبي الذي يتكون من بروتين غشاء لا يتفاعل مع أي من البروتينات ذات الاهتمام. هنا ، لم نستخدم مثل هذه السيطرة ، لأن تطويرها لا يزال في الطريق. بدلا من ذلك ، فرضنا تفكيكا محددا للمجمعات ذات الأهمية من خلال المشاركة في التعبير عن نسخة إضافية غير موسومة من أحد البروتينات التي تم تحليلها. تحمل ناقلات التعبير التي استخدمناها مروج فيروس الهربس البسيط الضعيف نسبيا - ثيميدين كيناز (HSV-TK) ، والذي يضمن مستويات تعبير منخفضة مثالية للحصول على نتائج محددة. ومع ذلك ، في حالة النتائج دون المستوى الأمثل ، قد يكون من المفيد استخدام المتجهات القائمة على CMV أو ، بدلا من ذلك ، تحسين كمية البلازميدات المستخدمة في النقل.
الطريقة المقدمة ، على الرغم من قوتها ومريحة ، لديها بعض القيود. أولا ، لا تسمح هذه الطريقة باستنتاج ما إذا كانت المجمعات المحددة تتوافق مع dimers أو oligomers ذات الترتيب الأعلى. إلى جانب ذلك ، لا يمكن مراقبة التوطين تحت الخلوي للبروتينات المتفاعلة. غير أن ذلك ممكن عند توسيع نطاق البروتوكول الأساسي بالتصوير بالإنارة الأحيائية، على الرغم من أن الاستبانة المكانية لهذه الصور ستكون أقل بكثير عند مقارنتها بالنهج القائمة على التألق.
الطريقة المقدمة سريعة وفعالة للغاية (يستغرق القياس ما يصل إلى عدة دقائق ويتم الحصول على البيانات من آلاف الخلايا). كما أن معالجة البيانات وتفسيرها واضحة نسبيا. هناك حاجة إلى القليل من التحسين أو لا شيء للبروتوكول الأساسي. المعدات المحددة الوحيدة المطلوبة هي مقياس اللمعان. يعمل اختبار تكملة luciferase المنقسم و BiFC على نفس المبدأ الأساسي ، أي إعادة تكوين البروتين الوظيفي من شظاياه غير الوظيفية. وقد أدرجت بالفعل في المقدمة المزايا العامة للنهج القائمة على التلألؤ الأحيائي مقارنة بالنهج القائمة على التألق. ومن المزايا المحددة لفحص تكملة لوسيفيراز المنقسم على BiFC أن الأول قابل للعكس تماما15. في BiFC ، بمجرد إعادة تكوين بروتين الفلورسنت ، لن ينفصل مرة أخرى إلى الأجزاء غير الفلورية المقابلة17. في المقابل ، فإن تجميع الوحدات الفرعية NanoLuc قابل للانعكاس ، مما يخلق فرصة فريدة لدراسة ديناميكيات PPIs. أخيرا ، تسمح الحساسية الاستثنائية للطريقة المقدمة بافتراض أن هذا النهج يجب أن يعمل حتى مع خطوط الخلايا التي يصعب نقلها.
يسمح البروتوكول المعروض هنا بتحديد ما إذا كان البروتينان الغشائيان من النوع الثالث المقيمان في غولجي يتفاعلان. كما ذكرنا سابقا ، يمكن أن يقترن الإعداد الأساسي للطريقة بتصوير التلألؤ الحيوي لتأكيد التوطين تحت الخلوي ل PPI محل الاهتمام. تسمح إمكانية عكس هذا الفحص المتكامل لللوسيفيراز المنقسم بدراسة ديناميكيات PPIs في الوقت الفعلي. يتم الحفاظ على إشارة مضيئة مشتقة من فوريمازين لمدة 2 ساعة تقريبا. ومع ذلك ، تتوفر أيضا ركائز لفحص تكملة luciferase المجزأة التي تضمن مدة أطول بكثير (من ساعات إلى أيام) للإشارة الناتجة. تسمح هذه الطريقة بتحديد العوامل التي تؤدي إلى أو تمنع مؤشر أسعار المنتجين ذي الأهمية. وتشمل بعض أحدث الأمثلة على تطبيقه دراسات حول التفاعلات بين بروتينات G والمستقبلات المقترنة بالبروتين G18 ، والتغيرات التوافقية للبروتين 19 ، وانتشار البروتين في كل مكان20 ، واستيعاب مستقبلات سطح الخلية 21 ، وتحديد العوامل التي تعدل PPIs22,23. لذلك ، يبدو أن هذه الطريقة أداة متعددة الاستخدامات ذات إمكانات عالية لتحقيق أهداف تجريبية صعبة للغاية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من خلال المنحة رقم 2016/23/D/NZ3/01314 من المركز الوطني للعلوم (NCN) ، كراكوف ، بولندا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin-EDTA solution | |||
| Adherent mammalian cell line | |||
| BioCoat Poly-D-Lysine 96-well White/Clear Flat Bottom TC-treated Microplate, with Lid | Corning | 356651 | |
| Cell culture centrifuge | |||
| Cell culture supplements (heat-inactivated fetal bovine serum, L-glutamine, penicillin, streptamycin) | |||
| CO2 incubator | |||
| Expression plasmids encoding protein(s) of interest not tagged with NanoBiT fragments | |||
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| GloMax Discover Microplate Reader (or a different luminescence microplate reader) | Promega | GM3000 | |
| Growth medium dedicated to the cell line used | |||
| Materials and reagents for standard molecular cloning (bacteria, thermostable polymerase, restriction enzymes, DNA ligase, materials and reagents for nucleic acid purification) | |||
| NanoBiT MCS Starter System | Promega | N2014 | This kit contains vectors enabling tagging of the proteins of interest with NanoBiT fragments at different orientations as well as the control plasmid encoding HaloTag protein fused with SmBiT and a positive control plasmid pair. |
| Nano-Glo Live Cell Assay System | Promega | N2011 | This kit contains furimazine, which is a substrate enabling detection of the NanoLuc activity in living cells, and a dedicated dilution buffer. |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium, no phenol red | Gibco | 11058021 | |
| Oribital shaker | |||
| Software for data analysis (e.g. GraphPad Prism) | |||
| Thermocycler |
References
- Hadley, B., et al. Structure and function of nucleotide sugar transporters: Current progress. Computational and Structural Biotechnology Journal. 10 (16), 23-32 (2014).
- Puglielli, L., Hirschberg, C. B. Reconstitution, identification, and purification of the rat liver Golgi membrane GDP-fucose transporter. Journal of Biological Chemistry. 274 (50), 35596-35600 (1999).
- Puglielli, L., Mandon, E. C., Rancour, D. M., Menon, A. K., Hirschberg, C. B. Identification and purification of the rat liver Golgi membrane UDP-N-acetylgalactosamine transporter. Journal of Biological Chemistry. 274 (7), 4474-4479 (1999).
- Gao, X., Dean, N. Distinct protein domains of the yeast Golgi GDP-mannose transporter mediate oligomer assembly and export from the endoplasmic reticulum. Journal of Biological Chemistry. 275 (23), 17718-17727 (2000).
- Olczak, M., Guillen, E. Characterization of a mutation and an alternative splicing of UDP-galactose transporter in MDCK-RCAr cell line. Biochimica et Biophysica Acta. 1763 (1), 82-92 (2006).
- Maszczak-Seneczko, D., Sosicka, P., Majkowski, M., Olczak, T., Olczak, M. UDP-N-acetylglucosamine transporter and UDP-galactose transporter form heterologous complexes in the Golgi membrane. FEBS Letters. 586 (23), 4082-4087 (2012).
- Nji, E., Gulati, A., Qureshi, A. A., Coincon, M., Drew, D. Structural basis for the delivery of activated sialic acid into Golgi for sialyation. Nature Structural and Molecular Biology. 26 (6), 415-423 (2019).
- Parker, J. L., Corey, R. A., Stansfeld, P. J., Newstead, S. Structural basis for substrate specificity and regulation of nucleotide sugar transporters in the lipid bilayer. Nature Communications. 10 (1), 4657 (2019).
- Wiertelak, W., Sosicka, P., Olczak, M., Maszczak-Seneczko, D. Analysis of homologous and heterologous interactions between UDP-galactose transporter and beta-1,4-galactosyltransferase 1 using NanoBiT. Analytical Biochemistry. 593, 113599 (2020).
- Hong, K., Ma, D., Beverley, S. M., Turco, S. J. The Leishmania GDP-mannose transporter is an autonomous, multi-specific, hexameric complex of LPG2 subunits. Biochemistry. 39 (8), 2013-2022 (2000).
- Sosicka, P., et al. An insight into the orphan nucleotide sugar transporter SLC35A4. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1864 (5), 825-838 (2017).
- Sprong, H., et al. Association of the Golgi UDP-galactose transporter with UDP-galactose:ceramide galactosyltransferase allows UDP-galactose import in the endoplasmic reticulum. Molecular Biology of the Cell. 14 (8), 3482-3493 (2003).
- Maszczak-Seneczko, D., et al. UDP-galactose (SLC35A2) and UDP-N-acetylglucosamine (SLC35A3) Transporters Form Glycosylation-related Complexes with Mannoside Acetylglucosaminyltransferases (Mgats). Journal of Biological Chemistry. 290 (25), 15475-15486 (2015).
- Khoder-Agha, F., et al. N-acetylglucosaminyltransferases and nucleotide sugar transporters form multi-enzyme-multi-transporter assemblies in golgi membranes in vivo. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (9), 1821-1832 (2019).
- Dixon, A. S., et al. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).
- Tung, J. K., Berglund, K., Gutekunst, C. -A., Hochgeschwender, U., Gross, R. E. Bioluminescence imaging in live cells and animals. Neurophotonics. 3 (2), 025001 (2016).
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Molecular Cell. 9 (4), 789-798 (2002).
- Inoue, A., et al. Illuminating G-Protein-Coupling Selectivity of GPCRs. Cell. 177 (7), 1933-1947 (2019).
- White, C. W., Caspar, B., Vanyai, H. K., Pfleger, K. D. G., Hill, S. J. CRISPR-Mediated Protein Tagging with Nanoluciferase to Investigate Native Chemokine Receptor Function and Conformational Changes. Cell Chemical Biology. 27, 499-510 (2020).
- Akinjiyan, F. A., et al. A Novel Luminescence-Based High-Throuput Approach for Cellular Resolution of Protein Ubiquitination using Tandem Ubiquitin Binding Entities (TUBEs). SLAS Discovery. 25 (4), 350-360 (2020).
- Soave, M., Kellam, B., Woolard, J., Briddson, S. J., Hill, S. J. NanoBiT Complemetation to Monitor Agonist-Induced Adenosine A1 Receptor Internalization. SLAS Discovery. 25 (2), 186-194 (2020).
- Crowley, E., Leung, E., Reynisson, J., Richardson, A. Rapid changes in the ATG5-ATG16L1 complex following nutrient deprivation measured using NanoLuc Binary Technlology (NanoBiT). FEBS Journal. , 15275 (2020).
- Shetty, S. K., Walzem, R. L., Davies, B. S. J. A novel NanoBiT-based assay monitors the interaction between lipoprotein lipase and GPIHBP1 in real time. Journal of Lipid Research. 61 (4), 546-559 (2020).
