Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

הדגמה של קומפלקסים הטרולוגיים שנוצרו על ידי חלבוני קרום מסוג III של תושב גולגי באמצעות בדיקת השלמה פיצול לוציפראז

Published: September 10, 2020 doi: 10.3791/61669

Summary

הפרוטוקול המוצג כאן נועד להדגים את התרחשותן של אינטראקציות הטרולוגיות בין חלבוני קרום מסוג III מסוג גולגי עם N- ו / או C-termini שנחשפו באופן ציטופלזמי בתאי יונקים חיים באמצעות הגרסה העדכנית ביותר של בדיקת המשלים לוציפראז מפוצלת.

Abstract

מטרת פרוטוקול זה היא לחקור את הישימות של הגרסה האחרונה של השלמת לוציפראז מפוצל להדגמת מתחמים הטרולוגיים שנוצרו על ידי מובילי סוכר נוקלאוטידים (NSTs). חלבונים רב-תכליתיים אלה, התושבים בחדר המיון ובגולגי, נושאים את הסוכרים הנוקלאוטידים המסונתזים מבחינה ציטופלסמית על פני ממברנות האברונים כדי לספק אנזימים המתווכים גליקוזילציה עם המצעים שלהם. NSTs קיימים כמו דימרים ו / או אוליגומרים גבוהים יותר. כמו כן דווח על אינטראקציות הטרולוגיות בין NSTs שונים. כדי לוודא אם הטכניקה מתאימה לחקר התופעה של הטרומריזציה של NST, בדקנו אותה מול שילוב של שני NSTs תושב גולגי שהוכחו בעבר כמקשרים במספר אמצעים אחרים. בדיקת ההשלמה של לוציפראז נראית מתאימה במיוחד לחקר אינטראקציות בין חלבוני ממברנה תושבי גולגי, שכן היא אינה דורשת רמות הבעה גבוהות, אשר לעתים קרובות לעורר מיקום שגוי של חלבון ולהגדיל את הסיכון של חיובי שווא.

Introduction

כתב יד זה מתאר פרוטוקול שלב אחר שלב כדי לבדוק את נוכחותם של אינטראקציות הטרולוגיות בין חלבוני קרום מסוג III תושב גולגי בתאים אנושיים שהודבקו באופן חולף באמצעות הגרסה העדכנית ביותר של בדיקת השלמת לוציפראז פיצול. ההליך נבדק בהרחבה ביותר נגד מובילי סוכר נוקלאוטידים (NSTs) אבל הצלחנו גם להשיג תוצאות חיוביות עבור חלבונים אחרים מסוג גולגי סוג III ממברנה אשר N- ו / או C-termini עומדים בפני הציטופלסמה.

קבוצת המחקר שלנו בוחנת את תפקידם של NSTs בגליקוזילציה של מקרומולקולות. NSTs הם חלבוני ממברנה מסוג III מסוג Golgi ו/או ER עם N- ו- C-termini הפונים לצד הציטופלסמי של הממברנה האורגנית1. NSTs נחשבים לשאת סוכרים המופעלים נוקלאוטידים על פני ממברנות אברונים כדי לספק גליקוסילטרפרנספראזס עם המצעים שלהם. NSTs יוצרים דימרים ו/או אוליגומרים גבוהים יותר2,3,4,5,6,7,8,9,10. יתר על כן, אינטראקציות הטרולוגיות בין NSTs שונים דווחו גם 6,11. NSTs הוכחו גם כדי ליצור קומפלקסים עם אנזימי גליקוסילציה הקשורים פונקציונלית12,13,14. חיפשנו אלטרנטיבה לטכניקה הנמצאת בשימוש כיום, הדמיה לכל החיים פלואורסצנטית (FLIM) מבוססת גישת FRET, לחקר אינטראקציות של NSTs וחלבונים הקשורים לגולגי הקשורים לתפקוד, ולכן החלטנו לבדוק את בדיקת ההשלמה של לוציפראז הפיצול. זה איפשר לנו לזהות אינטראקציה חדשנית בין NST ואנזים גליקוזילציה הקשורים לתפקודית9.

השינוי האחרון של בדיקת ההשלמה פיצול לוציפראז, NanoBiT, משמש בפרוטוקול המוצג כאן15. הוא מסתמך על שחזור של האנזים לוציפראז (למשל, NanoLuc) משני השברים - הגדול, המכונה BiT גדול או LgBiT, חלבון 17.6 kDa, ואת הקטן, המורכב רק 11 חומצות אמינו, המכונה BiT קטן או SmBiT. שני החלבונים המעניינים מותכים עם השברים המשלימים ומתבטאים באופן חולף בקו תאים אנושי. אם שני חלבוני ההיתוך מתקשרים, אור נוצר במקום עם תוספת של מצע חדיר לתא. שני שברים אלה עברו אופטימיזציה כך שהם מתרועעים עם זיקה מינימלית אלא אם כן הם מובאים יחד על ידי אינטראקציה בין חלבוני העניין שהם מותכים.

באופן כללי, לשיטות מבוססות ביולומינציה יש כמה יתרונות על פני אלה המבוססים על פלואורסצנטיות. לאותות ביו-זוהרים יש יחס אות-לרעש גבוה יותר מכיוון שהאור ברקע זניח בהשוואה לאות שמקורו בלוציפראז16. לעומת זאת, גישות מבוססות פלואורסצנטיות סובלות בדרך כלל מרקע גבוה יחסית הנגרם על ידי תופעת ההפלורציה האוטומטית. חוץ מזה, ביולומינציה פחות מזיקה לתאים המנותחים מאשר פלואורסצנטיות, כמו במקרה הקודם אין צורך לרגש את המדגם. מסיבות אלה גישות ביו-זוהרות לחקר PPIs ב- vivo עולות על השיטות הפלואורסצנטיות הנפוצות כמו העברת אנרגיה תהודה של Förster (FRET) או השלמה פלואורסצנטית דו-מולקולרית (BiFC).

הפרוטוקול שלנו מסתמך על הפניית אור המתקבל עבור שילוב החלבון של עניין לאור המתקבל עבור שילוב הבקרה. האחרון כולל את אחד החלבונים שנבדקו אשר מותך עם שבר גדול יותר חלבון בקרה (למשל, HaloTag), התמזג עם שבר קטן יותר. האחרון הוא חלבון ממוצא חיידקי שאינו צפוי לקיים אינטראקציה עם אף אחד מחלבוני היונקים. שימוש בחלבון זה כבקרה מציב מגבלות לטופולוגיה של זוגות החלבונים של תושבי גולגי שיש לנתח. מאז בתאי יונקים חלבון זה מסונתז בציטופלסמה, שני החלבונים של עניין צריך להיות לפחות זנב ציטופלסמי אחד.

גישה זו יכולה להיות שימושית במיוחד להקרנה ראשונית של ממשקי PPIs. זה עשוי להיות שיטת הבחירה כאשר חלבוני ההיתוך של עניין באים לידי ביטוי ברמות כי הם פשוט לא מספיק עבור גישות אחרות להיות מיושם. באופן דומה, הבדיקה המשלימה לוציפראז פיצול יכול להיות האפשרות הטובה ביותר אם החלבונים של עניין באים לידי ביטוי ברמות גבוהות, אבל זה משפיע לרעה על לוקליזציה תת תאית שלהם או ידוע לכפות אינטראקציות לא ספציפיות. מאז שבר קטן יותר יש רק 11 חומצות אמינו, בדיקת ההשלמה לוציפראז לפצל ניתן ליישם בעת שימוש בתגים גדולים יותר הוא בלתי אפשרי. לבסוף, ניתן להשתמש בו כדי לאשר עוד יותר נתונים שהושגו באמצעות טכניקות אחרות, כמו במקרה המוצג כאן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. דור הפלסמידים של הביטוי

  1. בחן את טופולוגיית הממברנה של החלבונים המעניינים באמצעות כלי חיזוי טופולוגיה.
  2. תכנן את אסטרטגיית השיבוט כך שהשברים הגדולים והקטנים יותר יעמדו בפני הציטופלסמה ברגע שחלבוני ההיתוך הוכנסו לקרומי גולגי. אם, כמו במקרה המוצג כאן, הן N והן C-termini של חלבונים מעניינים מכוונים ציטופלסמית, תייג את החלבונים בשמונה דרכים אפשריות (ראה איור 1B). אם N- או C-terminus של אחד או שניהם חלבונים של עניין הוא מכוון זוהר, אל תכלול אותו תיוג.
  3. Subclone את הגנים של עניין לתוך וקטורים ביטוי מתאים (ראה רשימת חומרים) על ידי ביצוע פרוטוקולי שיבוט סטנדרטיים.
    הערה: מומלץ לבדוק את כל הכיוונים האפשריים, מכיוון שאפשרויות תיוג מסוימות עשויות שלא לפעול עקב קרבה לא מספקת, כיוון תת-אופטימלי או אילוצים מרחביים.

2. טרנספקטיבה חולפת של הביטוי פלסמידים לתאים

  1. לקצור את תרבית התא HEK293T דבק על ידי טריפסיניזציה ו resuspend התאים במדיום צמיחה מלא ייעודי. צלחת התאים (2 x 104/100 μL / טוב) על צלחת תחתית ברורה, צד לבן 96-well. התאם את המספר הכולל של הבארות כך שיתאימו לכל השילובים והפקדים שנבדקו, כולל עותקים משוכפלים.
    הערה: נסו להשתמש רק ב-60 הבארות הפנימיות של הצלחת כדי למזער את השינויים התרמיים ולהימנע מאידוי בן לילה. שימוש בלוחות מצופים פולי-D-ליזין מומלץ מאוד כגון אלה המצוינים בטבלת החומרים, אחרת תאים עשויים להתנתק במהלך שלבי הכביסה הבאים.
  2. תרבית את התאים לילה בתנאים סטנדרטיים (37 °C (37 °C (5° C (5% CO2).
  3. למחרת להעביר את התאים עם השילובים הרצויים של plasmids ביטוי המתקבל בנקודה 1.1.
    1. מדלל פלסמידים ביטוי במדיום ללא סרום (ראה טבלת חומרים) ל 6.25 ng/μL עבור כל מבנה.
    2. הוסף את ריאגנט transfection מבוסס שומנים בדם ביחס מתאים שומנים ל- DNA ודגור על פי הוראת היצרן.
    3. הוסף 8 μL של שומנים בדם: תערובת DNA לבארות ייעודיות. מערבבים את תכולת הצלחת על ידי סיבוב עדין. התוצאה היא טרנספקטציה של שני מבני הביטוי ב 50 ng / טוב.
  4. תרבית את התאים עבור 20-24 שעות בתנאים סטנדרטיים (37 °C (37 °C (5% CO2).
    הערה: Culturing התאים במשך זמן רב יותר עלול לגרום לרמות גבוהות יותר של ביטוי חלבון היתוך, אשר עשוי לקדם קשר לא ספציפי בין השברים.

3. החלפה בינונית

  1. למחרת להחליף את המדיום המותנה עם 100 μL של מדיום ללא סרום בכל באר. ודא שהתאים לא התנתקו בעת חילופים בינוניים.
    הערה: שלב זה צריך להיעשות 2-3 שעות לפני הוספת פתרון העבודה furimazine. נסיגת סרום ממזערת את הרקע הנגרם על ידי autoluminescence של furimazine.

4. הכנת פתרון עבודה פורימזין

  1. רגע לפני המדידה, יש לערבב נפח אחד של furimazine עם 19 כרכים של מאגר דילול (דילול של פי 20).
    הערה: הנפח הכולל של פתרון העבודה furimazine להיות מוכן תלוי במספר בארות בודדות שיש לנתח (פתרון העבודה furimazine מתווסף למדיום תרבית התא ביחס 1:5, ולכן, לכל היטב בעבר מלא עם 100 μL של מדיום ללא סרום 25 μL של פתרון העבודה furimazine יש להוסיף).
  2. מוסיפים את פתרון העבודה furimazine לבארות ייעודיות (25 μL / טוב). מערבבים בעדינות את הצלחת ביד או באמצעות שייקר מסלולית (למשל, 15 שניות ב-300-500 סל"ד).

5. מדידת זוהר

  1. הכנס את הצלחת לקורא מיקרו-לוחית זוהר.
    1. עבור ניסויים כי הם להתבצע ב 37 °C (50 °F) שיווי משקל הצלחת במשך 10-15 דקות בטמפרטורה שצוינה.
  2. בחר את הבארות שיש לנתח.
  3. קרא את הזוהר עם זמן אינטגרציה של 0.3 שניות. המשך לעקוב אחר זוהר עד 2 שעות בעת הצורך.

6. ניתוח נתונים

  1. חשב ערכים ממוצעים וחריגות תקן עבור כל השילובים שנבדקו ושלטו.
  2. נתח נתונים באמצעות ANOVA חד-כיווני עם השוואות מרובות.
  3. חשב ערכי שינוי קיפול על-ידי חלוקת אור ממוצע המתקבל עבור שילובים של עניין על-ידי אור ממוצע המתקבל עבור הפקדים השליליים המתאימים. הערך את התוצאות.
    הערה: הגישה לניתוח נתונים המוצעת כאן מניחה כי ניתן לתבוע את האינטראקציה אם האור המתקבל עבור השילוב שנבדק גבוה סטטיסטית באופן סטטיסטית מהאור המתקבל עבור שילוב הבקרה המתאים, ובמקביל, היחס בין שני ערכים אלה עולה על 10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי להשיג את הנתונים האמינים ביותר בגישה זו יש לבדוק את כל השילובים האפשריים (ראו איור 1). במקביל, יש לכלול פקדים חיוביים ושליליים. השליטה החיובית צריכה להיות מורכבת משני החלבונים הידועים כאינטראקציה, מתוכם אחד מותך עם השבר הגדול יותר והשני מותך עם השבר הקטן יותר. השליטה השלילית באופן אידיאלי צריכה להיות מורכבת משני חלבוני קרום מסוג III שאינם אינטראקציה מתויגים באופן דומה. עם זאת, הקמת שליטה כזו עשויה להיות מאתגרת, שכן חוסר האינטראקציה של שני חלבוני הבקרה צריך להיות מאושר ביסודיות באמצעות מספר גישות חלופיות. לכן, ניתן להשתמש בחלבון ציטוסולי ממקור לא אנושי שאינו צפוי לקיים אינטראקציה עם חלבון אנושי כלשהו (למשל, HaloTag) כבקרה שלילית, אם N- ו / או C-termini של החלבונים, אשר האינטראקציה שלהם היא להיקבע, נחשפים ציטופלסמית כמו במקרה המוצג כאן. אנו ממליצים בחום על אימות נוסף של התוצאות שהושגו באמצעות סוג זה של שליטה על ידי ביטוי משותף של וריאנטים לא מתויגים של אחד החלבונים של עניין בשילוב עם titration של plasmids המתאים. אם שני החלבונים אינטראקציה ספציפית, עותק נוסף של כל אחד מהם חסר שבר לוציפראז צריך לגרום לירידה ספציפית של זוהר.

ערכי יחידות תאורה יחסית (RLU) האופייניים לשילובים חיוביים ושליליים מפורטים בטבלה 1. התוצאות הושגו עבור שני NSTs, SLC35A2 ו SLC35A3, אשר הוכחו לשייך על ידי שיתוף immunoprecipitation ו FLIM-FRET6, כמו גם באתר קרבה קשירת קשירה assay11. גם SLC35A2 וגם SLC35A3 הם חלבונים מסוג III מסוג גולגי עם N ו-C-termini מול הציטופלסמה (איור 1A). לכן, קיימות שמונה אפשרויות תיוג אפשריות וניתן להגדיר את חלבוני ההיתוך המתקבלים יחד גם בשמונה דרכים אפשריות (איור 1B). ערכי RLU ממוצעים התואמים לכל שילובי הבקרה שנבדקו ומתוארים באיור 2A. הפקד החיובי כלול גם הוא. דרישה ראשונית עבור תוצאה שנבחרה תיחשב כמעידה על אינטראקציה היא שערך ה- RLU המתקבל עבור שילוב הריבית גבוה סטטיסטית באופן משמעותי מערך ה- RLU המתקבל עבור שילוב הפקדים המתאים. באיור 2A נראים שלושה שילובים כאלה (LgBiT-SLC35A2 + SLC35A3-SmBiT, SmBiT-SLC35A2 + LgBiT-SLC35A3 ו-SLC35A2-SmBiT + LgBiT-SLC35A3). השלב הבא בניתוח התוצאות כרוך בהשגת ערכי יחס עבור שילובי העניין על ידי חלוקת ערכי RLU המתאימים לפי ערכי RLU שהושגו עבור הפקדים המתאימים. תוצאות ניתוח כזה מוצגות באיור 2B. על פי הצעות היצרן, היחסים בין 10 ל 1000 מעידים מאוד על אינטראקציות ספציפיות. ישנם שני שילובים העונים על קריטריונים אלה (SmBiT-SLC35A2 + LgBiT-SLC35A3 ו- SLC35A2-SmBiT + LgBiT-SLC35A3) ותומכים ברעיון ש- SLC35A2 ו- SLC35A3 מקיימים אינטראקציה. עם זאת, העובדה כי ששת השילובים האחרים הם שליליים לא אומר כי אין אינטראקציות בכלל בין חלבוני ההיתוך בהתאמה, אלא מרמז כי אסטרטגיית התיוג לא הייתה אופטימלית במקרים אלה. דוגמה זו מראה עד כמה חשוב לבדוק את כל השילובים האפשריים.

הנתונים המוצגים באיור 2 אושרו בנוסף על ידי הביטוי המשותף של SLC35A2 או SLC35A3 שתויג על ידי HA עם השילוב שהביא לתנופה היחסית הגבוהה ביותר, כלומר SLC35A2-LgBiT + SmBiT-SLC35A3. כמויות משתנות של פלסמידים קידוד HA-מתויג NST וריאנטים שימשו עבור שיתוף-transfection. התוצאה הייתה ירידה מובהקת סטטיסטית ותלוית במינון בערכי RLU (איור 3). שיבוש ספציפי ותלוי במינון של האינטראקציה בין SLC35A2-LgBiT ו- SmBiT-SLC35A3 על ידי הביטוי המשותף בו זמנית של וריאנטים NST מתויגים HA מוצג בטבלה 2.

הבעיה הנפוצה ביותר הקשורה לשיטה המוצגת כאן היא היעילות הירודה של טרנספקטיבה. כדי לוודא אם זהו הגורם לתוצאות תת-אופטימליות, כלול שליטה חיובית בכל הניסויים. השליטה החיובית שהשתמשנו בה כדי להשיג את הנתונים המוצגים כאן מורכבת משני חלבוני היתוך אינטראקציה: חלבון תלוי cAPM קינאז קטליטי אלפא (PRKACA) התמזג עם שבר קטן יותר וחלבון קינאז תלוי cAPM סוג II-אלפא רגולטורי subunit (PRKAR2A) התמזג עם שבר גדול יותר. בידיים שלנו, ערך RLU המתאים הגיע ~ 6 x 105. ירידה משמעותית (2-3 סדרי גודל) במספר זה עשויה להצביע על היעילות התת-אופטימלית של הטרנספקטיה המבוצעת. במקרה כזה אנו ממליצים לבדוק את רווחתם של התאים בתרבית ולוודא כי המספר המתאים של תאים הוא להיות מצופה עבור transfection.

Figure 1
איור 1: שרטוטים של טופולוגיית ממברנה ותיוג. (A) טופולוגיית ממברנה של חלבוני SLC35A2 ו- SLC35A3. (B) אפשרויות לתיוג חלבונים SLC35A2 ו- SLC35A3 עם שברי בדיקת ההשלמה המפוצלים של לוציפראז ושילוב חלבוני ההיתוך המתקבלים עבור הבדיקה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: תוצאות בדיקת ההשלמה המפוצלת של לוציפראז המבוצעת בתאי HEK293T עבור שילובי החלבון שנבחרו והפקדים השליליים המתאימים (נתונים מעובדים). (A) ערכי RLU שהושגו עבור שילובי החלבון שנבחרו והפקדים השליליים המתאימים. שלילי, HaloTag מתויג עם SmBiT; PRKAR2A, חלבון תלוי cAPM קינאז סוג II-אלפא רגולטורי subunit; PRKACA, חלבון תלוי cAPM קינאז קטליטי תת-יחידה אלפא. הנתונים נותחו באמצעות ANOVA חד-כיווני עם השוואות מרובות והם מוצגים כסטיית תקן ± ממוצעת (SD) משלושה משוכפלים טכניים. p < 0.1 *, p < 0.05 **, p < 0.01 ***. (B) קיפול שינויים מחושבים על ידי חלוקת אור ממוצע המתקבל עבור השילוב שנבדק (מדגם RLU) על ידי זוהר ממוצע המתקבל עבור הפקד השלילי המתאים (בקרת RLU). ערך הסף הנחשב המעיד על אינטראקציה הוגדר כ- 10. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: הפרעה ספציפית ותלוית מינון של האינטראקציה בין SLC35A2-LgBiT ו- SmBiT-SLC35A3 על ידי ביטוי משותף סימולטני של וריאנטים מתויגים של HA NSTתאי HEK293T הועברו עם פלסמידים המקודדים SLC35A2-LgBiT ו- SmBiT-SLC35A3, ובנוסף, או עם פלסמיד pSelect ריק (מדומה) או עם כמויות הולכות וגדלות של פלסמידים pSelect קידוד HA-מתויג SLC35A2 (לוח שמאל) ו SLC35A3 (לוח ימני). הנתונים נותחו באמצעות ANOVA חד-כיווני עם השוואות מרובות והם מוצגים כסטיית תקן ± ממוצעת (SD) משלושה משוכפלים טכניים. p < 0.05 **, p < 0.001 ****. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: תוצאות הבדיקה המבוצעת בתאי HEK293T עבור שילובי החלבון שנבחרו והפקדים השליליים המתאימים (נתונים גולמיים). ערכי RLU לא מעובדים המתקבלים עבור שילובי החלבון שנבחרו והפקדים השליליים המתאימים מוצגים. שלילי, HaloTag מתויג עם SmBiT; PRKAR2A, חלבון תלוי cAPM קינאז סוג II-אלפא רגולטורי subunit; PRKACA, חלבון תלוי cAPM קינאז קטליטי תת יחידה אלפא, TR, שכפול טכני. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 2: הפרעה ספציפית ותלוית מינון של האינטראקציה בין SLC35A2-LgBiT ו- SmBiT-SLC35A3 על ידי ביטוי משותף סימולטני של וריאנטים מתויגים של HA NST (נתונים גולמיים). ערכי RLU לא מעובדים המתקבלים עבור שילובי החלבון שנבחרו מוצגים. מדומה, תאים המבטאים SLC35A2-LgBiT ו- SmBiT-SLC35A3 שותפים עם וקטור pSelect ריק; HA-SLC35A2, תאים המבטאים SLC35A2-LgBiT ו- SmBiT-SLC35A3 שהודבקו בשיתוף עם הכמויות המצוינות של קידוד פלסמיד pSelect SLC35A2 מתויג עם אפיטופ HA בטרמינל N; HA-SLC35A3, תאים המבטאים SLC35A2-LgBiT ו- SmBiT-SLC35A3 שהודבקו בשיתוף עם הכמויות המצוינות של קידוד פלסמיד pSelect SLC35A3 מתויג עם אפיטופ HA בטרמינל N; טי-אר, שכפול טכני. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט המאפשר הדגמה של מתחמים הטרולוגיים שנוצרו בין חלבוני קרום מסוג III תושב גולגי, כגון NSTs, באמצעות בדיקת השלמת לוציפראז פיצול. הגישה המוצעת לניתוח נתונים ופרשנות כרוכה בהתייחסות לאור המתקבל עבור שילוב החלבון של עניין לאור המתקבל עבור שילוב השליטה המתאים, המורכב מאחד החלבונים של עניין התמזגו עם השבר הגדול יותר ואת חלבון הבקרה של מקור חיידקי התמזג עם שבר קטן יותר. האחרון בא לידי ביטוי בציטופלסמה של תאי יונקים; לכן, שימוש בו כהפניה דורש כי N- ו / או C-termini של החלבונים, אשר האינטראקציה שלהם היא להיות מנותח, נמצאים בצד הציטופלסמי של קרום גולגי.

השלבים הקריטיים בפרוטוקול הם עיצוב פלסמיד, ציפוי התאים להיות transfected, transfection עצמו, חילופי בינוני, הכנת פתרון עובד furimazine והוספתו לתאים. עיצוב הפלסמיד צריך להתבצע באופן כזה ששני שברי הלוציפראז פונים לציטופלסמה, אחרת שילובי בקרה לא יעבדו וערכי RLU הייחוס יהיו חסרים. תאים שיש לעבור יש לצפות כפי שצוין בפרוטוקול, אחרת יעילות הטרנספקטיה עשויה להיות תת-אופטימלית. אנו ממליצים להשתמש בלוחות multiwell עם המשטח מצופה פולי-L-ליזין כדי לתמוך מצורף תא בזמן המדיום מוחלף. לבסוף, פתרון העבודה furimazine צריך להיות מוכן טרי מיד הוסיף לתאים. לאחר הוספתו, יש לבצע את הקריאה בהקדם האפשרי.

כדי להימנע מתוצאות לא חד משמעיות, תמיד יש לכלול פקדים חיוביים ושליליים. השליטה החיובית צריכה להיות תמיד מועסקת כך יעילות transfection מנוטרת. חשוב מאוד כי כל חלבוני ההיתוך האפשריים התואמים טופולוגית זה לזה, כמו גם עם פקד שלילי מבוסס HaloTag נוצרים ומשולבים. במידת האפשר, יש להשתמש בשליטה השלילית המורכבת מחלבון ממברנה שאינו מקיים אינטראקציה עם כל אחד מהחלבונים המעניינים. כאן, לא השתמשנו בשליטה כזו, שכן הפיתוח שלה עדיין בדרך. במקום זאת, כפינו פירוק ספציפי של מתחמי העניין על ידי הבעת עותק נוסף ולא מתויג של אחד החלבונים המנותחים. וקטורי הביטוי בהם השתמשנו נושאים את מקדם הרפס סימפלקס החלש יחסית של וירוס-תימידין קינאז (HSV-TK), המבטיח רמות ביטוי נמוכות שהן אופטימליות להשגת תוצאה ספציפית. עם זאת, במקרה של תוצאות תת-אופטימליות זה עשוי להיות מועיל להשתמש וקטורים מבוססי CMV או, לחלופין, אופטימיזציה של כמות פלסמידים המשמשים עבור transfection.

לשיטה המוצגת, למרות שהיא עוצמתית ונוחה, יש כמה מגבלות. ראשית, שיטה זו אינה מאפשרת להסיק אם המתחמים המזוהים תואמים לדימרים או לאוליגומרים מסדר גבוה יותר. חוץ מזה, לוקליזציה תת תאית של חלבוני אינטראקציה לא ניתן לפקח. זה, עם זאת, אפשרי עם הרחבת הפרוטוקול הבסיסי עם הדמיה ביולומינסנטית, אם כי רזולוציה מרחבית של תמונות כאלה יהיה נמוך משמעותית בהשוואה לגישות מבוססות פלואורסצנטיות.

השיטה המוצגת מהירה ויעילה מאוד (המדידה אורכת עד מספר דקות והנתונים מתקבלים מאלפי תאים). עיבוד נתונים ופרשנות הוא גם פשוט יחסית. יש צורך באופטימיזציה מועטה או ללא אופטימיזציה של הפרוטוקול הבסיסי. הציוד הספציפי היחיד הנדרש הוא לומינומטר. בדיקת ההשלמה של לוציפראז המפוצל ו- BiFC עובדים על אותו עיקרון חיוני, כלומר, שחזור של חלבון פונקציונלי מהשברים הלא פונקציונליים שלו. היתרונות הכלליים של גישות מבוססות ביו-לומינציה על פני אלה המבוססות על פלואורסצנטיות כבר נרשמו במבוא. יתרון ספציפי של בדיקת ההשלמה של לוציפראז הפיצול על פני BiFC הוא שהראשון הוא הפיך לחלוטין15. ב- BiFC, ברגע שחלבון פלואורסצנטי מתחדש, הוא לא יתנתק בחזרה לרסיסים הלא פלואורסצנטיים המתאימים17. לעומת זאת, ההרכבה של יחידות המשנה NanoLuc היא הפיכה, מה שיוצר הזדמנות ייחודית ללמוד את הדינמיקה של PPIs. לבסוף, הרגישות יוצאת הדופן של השיטה המוצגת מאפשרת להניח כי גישה זו צריכה לעבוד גם עם קווי התא שקשה להעביר.

הפרוטוקול המוצג כאן מאפשר לקבוע אם שני חלבוני הממברנה מסוג III של תושב גולגי מקיימים אינטראקציה. כאמור, ההתקנה הבסיסית של השיטה יכולה להיות משולבת עם הדמיה bioluminescence כדי לאשר את לוקליזציה תת תאית של PPI של עניין. הפיך של זה פיצול לוציפראז משלים הבדיקה מאפשר ללמוד את הדינמיקה של PPIs בזמן אמת. האות הזוהר הנגזר מפורימזין נמשך כשעתיים. עם זאת, מצעים עבור בדיקת ההשלמה לוציפראז פיצול להבטיח משך זמן ארוך יותר באופן משמעותי (שעות עד ימים) של האות המתקבל זמינים גם. שיטה זו מאפשרת זיהוי של הגורמים המפעילים או מונעים את מדד המחירים לצרכן של הריבית. חלק מהדוגמאות האחרונות של היישום שלה כוללים מחקרים על אינטראקציות בין חלבוני G קולטנים G-חלבון מצמיד18, שינויים קונפורמציה חלבון19, חלבון בכל מקום20, הפנמה של קולטני פני התא21, וזיהוי של גורמים לווסת PPIs22,23. לכן, שיטה זו נראית ככלי רב-תכליתי עם פוטנציאל גבוה להגשים אפילו מטרות ניסיוניות מאתגרות מאוד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מס ' 2016/23/D/NZ3/01314 מהמרכז הלאומי למדע (NCN), קרקוב, פולין.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin-EDTA solution
Adherent mammalian cell line
BioCoat Poly-D-Lysine 96-well White/Clear Flat Bottom TC-treated Microplate, with Lid Corning 356651
Cell culture centrifuge
Cell culture supplements (heat-inactivated fetal bovine serum, L-glutamine, penicillin, streptamycin)
CO2 incubator
Expression plasmids encoding protein(s) of interest not tagged with NanoBiT fragments
FuGENE HD Transfection Reagent Promega E2311
GloMax Discover Microplate Reader (or a different luminescence microplate reader) Promega GM3000
Growth medium dedicated to the cell line used
Materials and reagents for standard molecular cloning (bacteria, thermostable polymerase, restriction enzymes, DNA ligase, materials and reagents for nucleic acid purification)
NanoBiT MCS Starter System Promega N2014 This kit contains vectors enabling tagging of the proteins of interest with NanoBiT fragments at different orientations as well as the control plasmid encoding HaloTag protein fused with SmBiT and a positive control plasmid pair.
Nano-Glo Live Cell Assay System Promega N2011 This kit contains furimazine, which is a substrate enabling detection of the NanoLuc activity in living cells, and a dedicated dilution buffer.
Opti-MEM I Reduced Serum Medium, no phenol red Gibco 11058021
Oribital shaker
Software for data analysis (e.g. GraphPad Prism)
Thermocycler

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hadley, B., et al. Structure and function of nucleotide sugar transporters: Current progress. Computational and Structural Biotechnology Journal. 10 (16), 23-32 (2014).
  2. Puglielli, L., Hirschberg, C. B. Reconstitution, identification, and purification of the rat liver Golgi membrane GDP-fucose transporter. Journal of Biological Chemistry. 274 (50), 35596-35600 (1999).
  3. Puglielli, L., Mandon, E. C., Rancour, D. M., Menon, A. K., Hirschberg, C. B. Identification and purification of the rat liver Golgi membrane UDP-N-acetylgalactosamine transporter. Journal of Biological Chemistry. 274 (7), 4474-4479 (1999).
  4. Gao, X., Dean, N. Distinct protein domains of the yeast Golgi GDP-mannose transporter mediate oligomer assembly and export from the endoplasmic reticulum. Journal of Biological Chemistry. 275 (23), 17718-17727 (2000).
  5. Olczak, M., Guillen, E. Characterization of a mutation and an alternative splicing of UDP-galactose transporter in MDCK-RCAr cell line. Biochimica et Biophysica Acta. 1763 (1), 82-92 (2006).
  6. Maszczak-Seneczko, D., Sosicka, P., Majkowski, M., Olczak, T., Olczak, M. UDP-N-acetylglucosamine transporter and UDP-galactose transporter form heterologous complexes in the Golgi membrane. FEBS Letters. 586 (23), 4082-4087 (2012).
  7. Nji, E., Gulati, A., Qureshi, A. A., Coincon, M., Drew, D. Structural basis for the delivery of activated sialic acid into Golgi for sialyation. Nature Structural and Molecular Biology. 26 (6), 415-423 (2019).
  8. Parker, J. L., Corey, R. A., Stansfeld, P. J., Newstead, S. Structural basis for substrate specificity and regulation of nucleotide sugar transporters in the lipid bilayer. Nature Communications. 10 (1), 4657 (2019).
  9. Wiertelak, W., Sosicka, P., Olczak, M., Maszczak-Seneczko, D. Analysis of homologous and heterologous interactions between UDP-galactose transporter and beta-1,4-galactosyltransferase 1 using NanoBiT. Analytical Biochemistry. 593, 113599 (2020).
  10. Hong, K., Ma, D., Beverley, S. M., Turco, S. J. The Leishmania GDP-mannose transporter is an autonomous, multi-specific, hexameric complex of LPG2 subunits. Biochemistry. 39 (8), 2013-2022 (2000).
  11. Sosicka, P., et al. An insight into the orphan nucleotide sugar transporter SLC35A4. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1864 (5), 825-838 (2017).
  12. Sprong, H., et al. Association of the Golgi UDP-galactose transporter with UDP-galactose:ceramide galactosyltransferase allows UDP-galactose import in the endoplasmic reticulum. Molecular Biology of the Cell. 14 (8), 3482-3493 (2003).
  13. Maszczak-Seneczko, D., et al. UDP-galactose (SLC35A2) and UDP-N-acetylglucosamine (SLC35A3) Transporters Form Glycosylation-related Complexes with Mannoside Acetylglucosaminyltransferases (Mgats). Journal of Biological Chemistry. 290 (25), 15475-15486 (2015).
  14. Khoder-Agha, F., et al. N-acetylglucosaminyltransferases and nucleotide sugar transporters form multi-enzyme-multi-transporter assemblies in golgi membranes in vivo. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (9), 1821-1832 (2019).
  15. Dixon, A. S., et al. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).
  16. Tung, J. K., Berglund, K., Gutekunst, C. -A., Hochgeschwender, U., Gross, R. E. Bioluminescence imaging in live cells and animals. Neurophotonics. 3 (2), 025001 (2016).
  17. Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Molecular Cell. 9 (4), 789-798 (2002).
  18. Inoue, A., et al. Illuminating G-Protein-Coupling Selectivity of GPCRs. Cell. 177 (7), 1933-1947 (2019).
  19. White, C. W., Caspar, B., Vanyai, H. K., Pfleger, K. D. G., Hill, S. J. CRISPR-Mediated Protein Tagging with Nanoluciferase to Investigate Native Chemokine Receptor Function and Conformational Changes. Cell Chemical Biology. 27, 499-510 (2020).
  20. Akinjiyan, F. A., et al. A Novel Luminescence-Based High-Throuput Approach for Cellular Resolution of Protein Ubiquitination using Tandem Ubiquitin Binding Entities (TUBEs). SLAS Discovery. 25 (4), 350-360 (2020).
  21. Soave, M., Kellam, B., Woolard, J., Briddson, S. J., Hill, S. J. NanoBiT Complemetation to Monitor Agonist-Induced Adenosine A1 Receptor Internalization. SLAS Discovery. 25 (2), 186-194 (2020).
  22. Crowley, E., Leung, E., Reynisson, J., Richardson, A. Rapid changes in the ATG5-ATG16L1 complex following nutrient deprivation measured using NanoLuc Binary Technlology (NanoBiT). FEBS Journal. , 15275 (2020).
  23. Shetty, S. K., Walzem, R. L., Davies, B. S. J. A novel NanoBiT-based assay monitors the interaction between lipoprotein lipase and GPIHBP1 in real time. Journal of Lipid Research. 61 (4), 546-559 (2020).

Tags

ביולוגיה גיליון 163 בדיקת השלמת לוציפראז מפוצלת אינטראקציות חלבון-חלבון PPIs אור אור ביולומינציה קומפלקסים הטרולוגיים מנגנון גולגי חלבוני קרום מסוג III מובילי סוכר נוקלאוטידים NSTs ארעיה חולפת
הדגמה של קומפלקסים הטרולוגיים שנוצרו על ידי חלבוני קרום מסוג III של תושב גולגי באמצעות בדיקת השלמה פיצול לוציפראז
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wiertelak, W., Olczak, M.,More

Wiertelak, W., Olczak, M., Maszczak-Seneczko, D. Demonstration of Heterologous Complexes formed by Golgi-Resident Type III Membrane Proteins using Split Luciferase Complementation Assay. J. Vis. Exp. (163), e61669, doi:10.3791/61669 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter