Summary
Представленный здесь протокол предназначен для демонстрации возникновения гетерологичных взаимодействий между мембранными белками гольджи-резидентного типа III с цитоплазматически экспонированными N- и/или C-терминами в живых клетках млекопитающих с использованием самого последнего варианта анализа комплементации расщепленной люциферазы.
Abstract
Целью данного протокола является изучение применимости самого последнего варианта комплементации расщепленной люциферазы для демонстрации гетерологичных комплексов, образованных нуклеотидными сахарными транспортерами (НСТ). Эти ER- и гольджи-резидентные мультитрансмембранные белки переносят цитоплазматически синтезированные нуклеотидные сахара через мембраны органелл для снабжения ферментами, которые опосредуют гликозилирование с их субстратами. НСТ существуют в виде димеров и/или более высоких олигомеров. Сообщалось также о гетерологичных взаимодействиях между различными НСТ. Чтобы проверить, подходит ли метод для изучения явления гетеромеризации NST, мы протестировали его на комбинации двух НСТ Гольджи, которые, как было ранее показано, связываются несколькими другими способами. Анализ комплементации люциферазы, по-видимому, особенно подходит для изучения взаимодействий между мембранными белками-резидентами Гольджи, поскольку он не требует высоких уровней экспрессии, которые часто вызывают неправильную локализацию белка и увеличивают риск ложных срабатываний.
Introduction
В этой рукописи описывается пошаговый протокол проверки наличия гетерологичных взаимодействий между мембранными белками типа III гольджи в транзиторно трансфектированных клетках человека с использованием самого последнего варианта анализа комплементации расщепленной люциферазы. Процедура была наиболее широко протестирована против нуклеотидных сахарных транспортеров (NST), но мы также смогли получить положительные результаты для других мембранных белков типа III, резидентные по Гольджи, чьи N- и / или C-термины обращены к цитоплазме.
Наша исследовательская группа исследует роль НСТ в гликозилировании макромолекул. NST представляют собой гольджи- и/или ER-резидентные мембранные белки типа III с N- и C-терминами, обращенными к цитоплазматической стороне органеллярной мембраны1. Считается, что NST переносят нуклеотид-активированные сахара через мембраны органелл для снабжения гликозилтрансферазами с их субстратами. НСТ образуют димеры и/или более высокие олигомеры2,3,4,5,6,7,8,9,10. Кроме того, сообщалось также о гетерологичных взаимодействиях между различными НСТ6,11. Также было продемонстрировано, что НСТ образуют комплексы с функционально родственными ферментами гликозилирования12,13,14. Мы искали альтернативу используемому в настоящее время методу, подходу FRET на основе флуоресцентной визуализации (FLIM) для изучения взаимодействий NST и функционально связанных белков-резидентов Гольджи, поэтому мы решили протестировать анализ комплементации расщепленной люциферазы. Это позволило нам идентифицировать новое взаимодействие между NST и функционально связанным ферментом гликозилирования9.
Самая последняя модификация анализа комплементации расщепленной люциферазы, NanoBiT, используется в протоколе, представленном здесь15. Он опирается на восстановление фермента люциферазы (например, NanoLuc) из двух фрагментов - большого, называемого большим BiT или LgBiT, белка 17,6 кДа, и маленького, состоящего только из 11 аминокислот, называемого малым BiT или SmBiT. Два интересующих белка сливаются с комплементарными фрагментами и временно экспрессируются в клеточной линии человека. Если два синтезированных белка взаимодействуют, люминесценция образуется in situ при добавлении клеточного проницаемого субстрата. Эти два фрагмента были оптимизированы таким образом, чтобы они ассоциировались с минимальным сродством, если они не были объединены взаимодействием между белками, представляющими интерес, с которыми они слиты.
В целом, методы, основанные на биолюминесценции, имеют некоторые преимущества перед методами, основанными на флуоресценции. Биолюминесцентные сигналы имеют более высокое отношение сигнал/шум, поскольку фоновая люминесценция незначительна по сравнению с сигналом, полученным из люциферазы16. Напротив, подходы, основанные на флуоресценции, обычно страдают от относительно высокого фона, вызванного явлением автофлуоресценции. Кроме того, биолюминесценция менее вредна для анализируемых клеток, чем флуоресценция, так как в первом случае нет необходимости возбуждать образец. По этим причинам биолюминесцентные подходы к изучению ИПП in vivo превосходят широко используемые флуоресцентные методы, такие как резонансный перенос энергии Фёрстера (FRET) или бимолекулярное флуоресцентное комплементирование (BiFC).
Наш протокол основан на отсылке люминесценции, полученной для комбинации белков, представляющей интерес, к люминесценции, полученной для контрольной комбинации. Последний включает в себя один из испытуемых белков, который сливается с более крупным фрагментом, и контрольный белок (например, HaloTag), слитый с меньшим фрагментом. Последний представляет собой белок бактериального происхождения, который, как ожидается, не будет взаимодействовать ни с одним из белков млекопитающих. Использование этого белка в качестве контроля создает ограничения для топологии пар белков Гольджи-резидентов, подлежащих анализу. Поскольку в клетках млекопитающих этот белок синтезируется в цитоплазме, оба интересующих белка должны иметь хотя бы один цитоплазматический хвост.
Этот подход может быть особенно полезен для первоначального скрининга ИПП. Это может стать методом выбора, когда интересующие белки слияния выражены на уровнях, которые просто недостаточны для применения других подходов. Аналогичным образом, анализ комплементации расщепленной люциферазы может быть лучшим вариантом, если интересующие белки экспрессируются на высоких уровнях, но это отрицательно влияет на их субклеточную локализацию или, как известно, вызывает неспецифические взаимодействия. Поскольку меньший фрагмент содержит только 11 аминокислот, анализ комплементации расщепленной люциферазы может быть применен при использовании более крупных меток невозможно. Наконец, он может быть использован для дальнейшего подтверждения данных, полученных с использованием других методов, как в случае, представленном здесь.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Генерация экспрессии плазмид
- Изучите мембранную топологию интересующих белков с помощью инструмента прогнозирования топологии.
- Разработайте стратегию клонирования таким образом, чтобы большие и меньшие фрагменты сталкивались с цитоплазмой после того, как белки слияния были вставлены в мембраны Гольджи. Если, как в случае, представленном здесь, как N-, так и C-конечные части интересующих белков цитоплазматически ориентированы, пометьте белки восемью возможными способами (см. Рисунок 1B). Если N- или С-конец одного или обоих интересующих белков ориентирован на свет, исключите его из маркировки.
- Субклонируйте интересующие гены в соответствующие векторы экспрессии (см. Таблицу материалов), следуя стандартным протоколам клонирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется тестировать все возможные ориентации, так как некоторые параметры тегирования могут не работать из-за недостаточной близости, неоптимальной ориентации или пространственных ограничений.
2. Транзиторная трансфекция экспрессии плазмид в клетки
- Соберите адгезивную культуру клеток HEK293T путем трипсинизации и повторно суспендируйте клетки в специальной полной питательной среде. Нанесите ячейки (2 x 104/100 мкл/лунка) на чистую нижнюю, белую боковую 96-луночную пластину. Отрегулируйте общее количество скважин для размещения всех испытанных комбинаций и элементов управления, включая реплики.
ПРИМЕЧАНИЕ: Старайтесь использовать только внутренние 60 колодцев плиты, чтобы свести к минимуму тепловые сдвиги и избежать ночного испарения. Настоятельно рекомендуется использовать пластины с поли-D-лизином, такие как те, которые указаны в Таблице материалов, в противном случае ячейки могут отсоединиться во время последующих этапов промывки. - Культивируйте клетки на ночь в стандартных условиях (37 °C, 5% CO2).
- На следующий день трансфектируют клетки с желаемыми комбинациями экспрессии плазмид, полученными в точке 1.1.
- Разбавляют экспрессию плазмид в среде, свободной от сыворотки (см. Таблицу материалов) до 6,25 нг/мкл для каждой конструкции.
- Добавьте трансфекционный реагент на основе липидов с соответствующим соотношением липидов к ДНК и инкубируйте в соответствии с инструкцией производителя.
- Добавьте 8 мкл смеси липидов: ДНК в назначенные колодцы. Перемешайте содержимое тарелки мягким вращением. Это приводит к трансфекции обеих конструкций выражений при 50 нг/лунку.
- Культивировать клетки в течение 20-24 ч в стандартных условиях (37 °C, 5% CO2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Культивирование клеток в течение более длительного времени может привести к более высоким уровням экспрессии белка слияния, что может способствовать неспецифической ассоциации между фрагментами.
3. Средний обмен
- На следующий день замените кондиционированную среду 100 мкл безсыворочной среды в каждой лунке. Убедитесь, что клетки не отделились при среднем обмене.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап следует сделать за 2-3 ч до добавления рабочего раствора фуримазина. Сывороточная абстиненция минимизирует фон, вызванный автолюминесценцией фуримазина.
4. Приготовление рабочего раствора фуримазина
- Непосредственно перед измерением смешайте 1 объем фуримазина с 19 объемами буфера разбавления (20-кратное разведение).
ПРИМЕЧАНИЕ: Общий объем готовимого рабочего раствора фуримазина зависит от количества отдельных анализируемых скважин (рабочий раствор фуримазина добавляют в среду для культивирования клеток в соотношении 1:5, поэтому к каждой скважине, предварительно заполненной 100 мкл безсыворочной среды, следует добавить 25 мкл рабочего раствора фуримазина). - Добавьте рабочий раствор фуримазина в назначенные скважины (25 мкл/лунку). Аккуратно перемешайте пластину вручную или с помощью орбитального шейкера (например, 15 с при 300-500 об/мин).
5. Измерение люминесценции
- Вставьте пластину в считыватель люминесцентных микропластин.
- Для экспериментов, которые должны проводиться при 37 °C, уравновешивайте пластину в течение 10-15 мин при указанной температуре.
- Выберите скважины для анализа.
- Считывание люминесценции со временем интеграции 0,3 с. Продолжайте контролировать люминесценцию в течение 2 ч, когда это необходимо.
6. Анализ данных
- Рассчитайте средние значения и стандартные отклонения для всех протестированных и контрольных комбинаций.
- Анализируйте данные с помощью одностороннего ANOVA с помощью нескольких сравнений.
- Вычисление значений изменения складки путем деления средней люминесценции, полученной для интересующих комбинаций, на среднюю люминесценцию, полученную для соответствующих отрицательных элементов управления. Оцените результаты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Предложенный здесь подход к анализу данных предполагает, что взаимодействие может быть заявлено, если люминесценция, полученная для испытуемой комбинации, статистически значимо выше люминесценции, полученной для соответствующей контрольной комбинации, и, в то же время, отношение этих двух значений превышает 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для получения наиболее достоверных данных при таком подходе следует протестировать все возможные комбинации (см. рисунок 1). Параллельно следует включать позитивный и отрицательный контроль. Положительный контроль должен состоять из двух белков, которые, как известно, взаимодействуют, из которых один сливается с более крупным фрагментом, а другой сливается с меньшим фрагментом. Отрицательный контроль в идеале должен состоять из двух невзаимодействующих мембранных белков типа III, помеченных аналогичным образом. Однако установление такого контроля может быть сложной задачей, так как отсутствие взаимодействия двух контрольных белков должно быть тщательно подтверждено с использованием нескольких альтернативных подходов. Поэтому можно использовать цитозольный белок нечеловеческого происхождения, который, как ожидается, не будет взаимодействовать с каким-либо человеческим белком (например, HaloTag) в качестве отрицательного контроля, если N- и/или C-термины белков, взаимодействие которых должно быть определено, цитоплазматическо подвергаются воздействию, как в случае, представленном здесь. Мы настоятельно рекомендуем дополнительную проверку результатов, полученных с использованием этого типа контроля путем коэкспрессии непомеченных вариантов любого из интересующих белков в сочетании с титрованием соответствующих плазмид. Если два белка специфически взаимодействуют, дополнительная копия любого из них, лишенная фрагмента люциферазы, должна привести к специфическому снижению люминесценции.
Значения относительных единиц люминесценции (RLU), типичные для положительных и отрицательных комбинаций, приведены в таблице 1. Результаты были получены для двух NST, SLC35A2 и SLC35A3, которые, как было показано, связываются путем коиммунопреципитации и FLIM-FRET6, а также анализа in situ proximityligation11. И SLC35A2, и SLC35A3 являются мембранными белками типа III гольджи с N- и C-концами, обращенными к цитоплазме (рисунок 1A). Таким образом, существует восемь возможных вариантов маркировки, и результирующие белки слияния могут быть установлены вместе также восемью возможными способами (рисунок 1B). Средние значения RLU, соответствующие всем тестируемым и контрольным комбинациям, показаны на рисунке 2A. Положительный контроль также включен. Первоначальное требование к выбранному результату, которое должно считаться показателем взаимодействия, заключается в том, что значение RLU, полученное для интересующей комбинации, статистически значимо выше, чем значение RLU, полученное для соответствующей контрольной комбинации. На рисунке 2A показаны три такие комбинации (LgBiT-SLC35A2 + SLC35A3-SmBiT, SmBiT-SLC35A2 + LgBiT-SLC35A3 и SLC35A2-SmBiT + LgBiT-SLC35A3). Следующий шаг в анализе результатов включает получение значений соотношения для интересующих комбинаций путем деления соответствующих значений RLU на значения RLU, полученные для соответствующих элементов управления. Результаты такого анализа показаны на рисунке 2В. Согласно предложениям производителя, соотношения между 10 и 1000 очень показательны для конкретных взаимодействий. Существуют две комбинации, которые соответствуют этим критериям (SmBiT-SLC35A2 + LgBiT-SLC35A3 и SLC35A2-SmBiT + LgBiT-SLC35A3) и поддерживают идею о том, что SLC35A2 и SLC35A3 взаимодействуют. Однако тот факт, что остальные шесть комбинаций являются отрицательными, не означает, что между соответствующими белками слияния вообще нет взаимодействий, а скорее предполагает, что стратегия маркировки не была оптимальной в этих случаях. Этот пример показывает, насколько важно тестировать все возможные комбинации.
Данные, представленные на фиг.2 , были дополнительно подтверждены совместной экспрессией SLC35A2 или SLC35A3 с комбинацией, которая привела к самой высокой относительной люминесценции, а именно SLC35A2-LgBiT + SmBiT-SLC35A3. Для котрансфекции использовались различные количества плазмид, кодирующих ГК-помеченные варианты NST. Это привело к статистически значимому, дозозависимому снижению значений RLU (рисунок 3). Специфическое и дозозависимое нарушение взаимодействия между SLC35A2-LgBiT и SmBiT-SLC35A3 путем одновременной коэкспрессии HA-меченых вариантов NST показано в таблице 2.
Наиболее распространенной проблемой, связанной с представленным здесь методом, является низкая эффективность трансфекции. Чтобы проверить, является ли это причиной неоптимальных результатов, включите положительный контроль во все эксперименты. Положительный контроль, который мы использовали для получения данных, представленных здесь, состоит из двух взаимодействующих белков слияния: cAPM-зависимой протеинкиназы каталитической субъединицы альфа (PRKACA), слитой с меньшим фрагментом, и cAPM-зависимой протеинкиназы типа II-альфа регуляторной субъединицы (PRKAR2A), слитой с более крупным фрагментом. В наших руках соответствующее значение RLU достигало ~6 x 105. Значительное (на 2-3 порядка) падение этого числа может свидетельствовать о неоптимальной эффективности выполненной трансфекции. В таком случае мы рекомендуем проверить самочувствие культивируемых клеток и убедиться, что соответствующее количество клеток покрыто для трансфекции.
Рисунок 1: Схемы мембранной топологии и маркировки. (A) Мембранная топология белков SLC35A2 и SLC35A3. (B) Возможности маркировки белков SLC35A2 и SLC35A3 фрагментами анализа комплементации расщепленной люциферазы и объединения полученных белков слияния для анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Результаты анализа комплементации расщепленной люциферазы, выполненного в клетках HEK293T для выбранных белковых комбинаций и соответствующих отрицательных контрольных элементов (обработанные данные). (A) Значения RLU, полученные для выбранных белковых комбинаций и соответствующих отрицательных контрольных элементов. Отрицательный, HaloTag с тегами SmBiT; PRKAR2A, cAPM-зависимая протеинкиназа типа II-альфа-регуляторная субъединица; PRKACA, cAPM-зависимая протеинкиназа каталитическая субъединица альфа. Данные были проанализированы с использованием одностороннего ANOVA с несколькими сравнениями и представлены в виде среднего ± стандартного отклонения (SD) от трех технических реплик. p < 0,1 *, p < 0,05 **, p < 0,01 ***. (B) Изменения сгиба рассчитываются путем деления средней люминесценции, полученной для испытанной комбинации (RLU SAMPLE), на среднюю люминесценцию, полученную для соответствующего отрицательного контроля (RLU CONTROL). Пороговое значение, считающееся ориентировочным для взаимодействия, было установлено на уровне 10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Специфическое и дозозависимое нарушение взаимодействия между SLC35A2-LgBiT и SmBiT-SLC35A3 путем одновременной совместной экспрессии HA-меченых вариантов NST. Клетки HEK293T трансфектировали плазмидами, кодирующими SLC35A2-LgBiT и SmBiT-SLC35A3 и, кроме того, либо пустой плазмидой pSelect (макет), либо увеличивающимся количеством плазмид pSelect, кодирующих HA-метки SLC35A2 (левая панель) и SLC35A3 (правая панель). Данные были проанализированы с использованием одностороннего ANOVA с несколькими сравнениями и представлены в виде среднего ± стандартного отклонения (SD) от трех технических реплик. p < 0,05 **, p < 0,001 ****. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Таблица 1: Результаты анализа, выполненного в клетках HEK293T для выбранных белковых комбинаций и соответствующих отрицательных контрольных групп (необработанные данные). Показаны необработанные значения RLU, полученные для выбранных белковых комбинаций и соответствующих отрицательных контролей. Отрицательный, HaloTag с тегами SmBiT; PRKAR2A, cAPM-зависимая протеинкиназа типа II-альфа-регуляторная субъединица; PRKACA, cAPM-зависимая протеинкиназа каталитическая субъединица альфа, TR, техническая репликация. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 2: Удельное и дозозависимое нарушение взаимодействия между SLC35A2-LgBiT и SmBiT-SLC35A3 путем одновременной коэкспрессии HA-меченых вариантов NST (необработанные данные). Показаны необработанные значения RLU, полученные для выбранных белковых комбинаций. Макет, клетки, экспрессирующие SLC35A2-LgBiT и SmBiT-SLC35A3, совместно трансфектированные пустым вектором pSelect; HA-SLC35A2, клетки, экспрессирующие SLC35A2-LgBiT и SmBiT-SLC35A3, котрансфектированные указанными количествами плазмиды pSelect, кодирующей SLC35A2, помеченной эпитопом ГК на N-конце; HA-SLC35A3, клетки, экспрессирующие SLC35A2-LgBiT и SmBiT-SLC35A3, котрансфектированные указанными количествами плазмиды pSelect, кодирующей SLC35A3, помеченной эпитопом ГК на N-конце; ТР, техническая реплика. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы предоставляем подробный протокол, позволяющий продемонстрировать гетерологичные комплексы, образующиеся между мембранными белками типа III Гольджи, такими как NST, с использованием анализа комплементации расщепленной люциферазы. Предлагаемый подход к анализу и интерпретации данных предполагает соотнесение люминесценции, полученной для белковой комбинации, представляющей интерес, с люминесценцией, полученной для соответствующей контрольной комбинации, которая состоит из одного из интересующих белков, слитых с более крупным фрагментом, и контрольного белка бактериального происхождения, слитого с меньшим фрагментом. Последний экспрессируется в цитоплазме клеток млекопитающих; поэтому использование его в качестве эталона требует, чтобы N- и/или C-конечные точки белков, взаимодействие которых подлежит анализу, находились на цитоплазматической стороне мембраны Гольджи.
Критическими этапами в протоколе являются дизайн плазмиды, покрытие клеток, подлежащих трансфекции, сама трансфекция, обмен среды, приготовление рабочего раствора фуримазина и добавление его к клеткам. Конструкция плазмиды должна быть выполнена таким образом, чтобы оба фрагмента люциферазы были обращены к цитоплазме, иначе контрольные комбинации не будут работать и опорные значения RLU будут отсутствовать. Клетки, подлежащие трансфекции, должны быть покрыты, как указано в протоколе, в противном случае эффективность трансфекции может быть неоптимальной. Мы рекомендуем использовать многоскважинные пластины с поверхностью, покрытой поли-L-лизином, для поддержки прикрепления клеток во время обмена средой. Наконец, рабочий раствор фуримазина следует свежеприготовить и сразу же добавить в клетки. После его добавления считывание должно быть выполнено как можно скорее.
Чтобы избежать неубедительных результатов, всегда следует включать положительный и отрицательный контроль. Положительный контроль должен всегда использоваться, чтобы контролировать эффективность трансфекции. Очень важно, чтобы все возможные белки слияния, которые топологически совместимы друг с другом, а также с отрицательным контролем на основе HaloTag, генерировались и комбинировались. Если возможно, следует использовать отрицательный контроль, состоящий из мембранного белка, не взаимодействующего ни с одним из интересующих белков. Здесь мы не применили такой контроль, так как его развитие все еще идет своим чередом. Вместо этого мы заставили провести специфическую разборку интересующих комплексов путем совместной экспрессии дополнительной, непомеченной копии одного из проанализированных белков. Векторы экспрессии, которые мы использовали, несут относительно слабый промотор вируса простого герпеса-тимидинкиназы (ВПГ-ТК), который обеспечивает низкие уровни экспрессии, оптимальные для получения конкретного результата. Однако в случае неоптимальных результатов может быть полезно использовать векторы на основе ЦМВ или, в качестве альтернативы, оптимизировать количество плазмид, используемых для трансфекции.
Представленный метод, хотя и мощный и удобный, имеет некоторые ограничения. Во-первых, этот метод не позволяет сделать вывод, соответствуют ли идентифицированные комплексы димерам или олигомерам более высокого порядка. Кроме того, субклеточную локализацию взаимодействующих белков контролировать нельзя. Это, однако, возможно после расширения базового протокола с биолюминесцентной визуализацией, хотя пространственное разрешение таких изображений будет значительно ниже по сравнению с подходами, основанными на флуоресценции.
Представленный метод очень быстрый и эффективный (измерение занимает до нескольких минут, а данные получаются из тысяч клеток). Обработка и интерпретация данных также относительно просты. Практически не требуется оптимизация базового протокола. Единственным необходимым специальным оборудованием является люминометр. Анализ комплементации расщепленной люциферазы и BiFC работают по одному и тому же существенному принципу, то есть восстановлению функционального белка из его нефункциональных фрагментов. Общие преимущества подходов, основанных на биолюминесценции, перед подходами, основанными на флуоресценции, уже были перечислены во Введении. Конкретным преимуществом анализа комплементации расщепленной люциферазы по сравнению с BiFC является то, что первый является полностью обратимым15. В BiFC, как только флуоресцентный белок восстанавливается, он не будет диссоциировать обратно в соответствующие нефлуоресцентные фрагменты17. Напротив, сборка субъединиц NanoLuc является обратимой, что создает уникальную возможность для изучения динамики ИПП. Наконец, исключительная чувствительность представленного метода позволяет предположить, что такой подход должен работать даже с клеточными линиями, которые трудно трансфектировать.
Представленный здесь протокол позволяет определить, взаимодействуют ли два мембранных белка гольджи-резидента типа III. Как уже упоминалось, базовая настройка метода может быть соединена с биолюминесцентной визуализацией для подтверждения субклеточной локализации интересующего ИЦП. Обратимость этого анализа комплементации расщепленной люциферазы позволяет изучать динамику ИПП в режиме реального времени. Люминесцентный сигнал, полученный от фуримазина, поддерживается в течение примерно 2 часов. Однако также доступны субстраты для анализа комплементации расщепленной люциферазы, обеспечивающие значительно более длительную (от нескольких часов до дней) продолжительность результирующего сигнала. Этот метод позволяет определить факторы, которые вызывают или предотвращают интересующий ИЦП. Некоторые из самых последних примеров его применения включают исследования взаимодействий между G-белками и рецепторами, связанными с G-белком18, конформационные изменения белка19, убиквитинацию белка20, интернализацию рецепторов клеточной поверхности21 и идентификацию факторов, модулирующих PPI22,23. Таким образом, этот метод представляется универсальным инструментом с высоким потенциалом для выполнения даже очень сложных экспериментальных целей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантом No 2016/23/D/NZ3/01314 от Национального научного центра (NCN), Краков, Польша.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin-EDTA solution | |||
| Adherent mammalian cell line | |||
| BioCoat Poly-D-Lysine 96-well White/Clear Flat Bottom TC-treated Microplate, with Lid | Corning | 356651 | |
| Cell culture centrifuge | |||
| Cell culture supplements (heat-inactivated fetal bovine serum, L-glutamine, penicillin, streptamycin) | |||
| CO2 incubator | |||
| Expression plasmids encoding protein(s) of interest not tagged with NanoBiT fragments | |||
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| GloMax Discover Microplate Reader (or a different luminescence microplate reader) | Promega | GM3000 | |
| Growth medium dedicated to the cell line used | |||
| Materials and reagents for standard molecular cloning (bacteria, thermostable polymerase, restriction enzymes, DNA ligase, materials and reagents for nucleic acid purification) | |||
| NanoBiT MCS Starter System | Promega | N2014 | This kit contains vectors enabling tagging of the proteins of interest with NanoBiT fragments at different orientations as well as the control plasmid encoding HaloTag protein fused with SmBiT and a positive control plasmid pair. |
| Nano-Glo Live Cell Assay System | Promega | N2011 | This kit contains furimazine, which is a substrate enabling detection of the NanoLuc activity in living cells, and a dedicated dilution buffer. |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium, no phenol red | Gibco | 11058021 | |
| Oribital shaker | |||
| Software for data analysis (e.g. GraphPad Prism) | |||
| Thermocycler |
References
- Hadley, B., et al. Structure and function of nucleotide sugar transporters: Current progress. Computational and Structural Biotechnology Journal. 10 (16), 23-32 (2014).
- Puglielli, L., Hirschberg, C. B. Reconstitution, identification, and purification of the rat liver Golgi membrane GDP-fucose transporter. Journal of Biological Chemistry. 274 (50), 35596-35600 (1999).
- Puglielli, L., Mandon, E. C., Rancour, D. M., Menon, A. K., Hirschberg, C. B. Identification and purification of the rat liver Golgi membrane UDP-N-acetylgalactosamine transporter. Journal of Biological Chemistry. 274 (7), 4474-4479 (1999).
- Gao, X., Dean, N. Distinct protein domains of the yeast Golgi GDP-mannose transporter mediate oligomer assembly and export from the endoplasmic reticulum. Journal of Biological Chemistry. 275 (23), 17718-17727 (2000).
- Olczak, M., Guillen, E. Characterization of a mutation and an alternative splicing of UDP-galactose transporter in MDCK-RCAr cell line. Biochimica et Biophysica Acta. 1763 (1), 82-92 (2006).
- Maszczak-Seneczko, D., Sosicka, P., Majkowski, M., Olczak, T., Olczak, M. UDP-N-acetylglucosamine transporter and UDP-galactose transporter form heterologous complexes in the Golgi membrane. FEBS Letters. 586 (23), 4082-4087 (2012).
- Nji, E., Gulati, A., Qureshi, A. A., Coincon, M., Drew, D. Structural basis for the delivery of activated sialic acid into Golgi for sialyation. Nature Structural and Molecular Biology. 26 (6), 415-423 (2019).
- Parker, J. L., Corey, R. A., Stansfeld, P. J., Newstead, S. Structural basis for substrate specificity and regulation of nucleotide sugar transporters in the lipid bilayer. Nature Communications. 10 (1), 4657 (2019).
- Wiertelak, W., Sosicka, P., Olczak, M., Maszczak-Seneczko, D. Analysis of homologous and heterologous interactions between UDP-galactose transporter and beta-1,4-galactosyltransferase 1 using NanoBiT. Analytical Biochemistry. 593, 113599 (2020).
- Hong, K., Ma, D., Beverley, S. M., Turco, S. J. The Leishmania GDP-mannose transporter is an autonomous, multi-specific, hexameric complex of LPG2 subunits. Biochemistry. 39 (8), 2013-2022 (2000).
- Sosicka, P., et al. An insight into the orphan nucleotide sugar transporter SLC35A4. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1864 (5), 825-838 (2017).
- Sprong, H., et al. Association of the Golgi UDP-galactose transporter with UDP-galactose:ceramide galactosyltransferase allows UDP-galactose import in the endoplasmic reticulum. Molecular Biology of the Cell. 14 (8), 3482-3493 (2003).
- Maszczak-Seneczko, D., et al. UDP-galactose (SLC35A2) and UDP-N-acetylglucosamine (SLC35A3) Transporters Form Glycosylation-related Complexes with Mannoside Acetylglucosaminyltransferases (Mgats). Journal of Biological Chemistry. 290 (25), 15475-15486 (2015).
- Khoder-Agha, F., et al. N-acetylglucosaminyltransferases and nucleotide sugar transporters form multi-enzyme-multi-transporter assemblies in golgi membranes in vivo. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (9), 1821-1832 (2019).
- Dixon, A. S., et al. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).
- Tung, J. K., Berglund, K., Gutekunst, C. -A., Hochgeschwender, U., Gross, R. E. Bioluminescence imaging in live cells and animals. Neurophotonics. 3 (2), 025001 (2016).
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Molecular Cell. 9 (4), 789-798 (2002).
- Inoue, A., et al. Illuminating G-Protein-Coupling Selectivity of GPCRs. Cell. 177 (7), 1933-1947 (2019).
- White, C. W., Caspar, B., Vanyai, H. K., Pfleger, K. D. G., Hill, S. J. CRISPR-Mediated Protein Tagging with Nanoluciferase to Investigate Native Chemokine Receptor Function and Conformational Changes. Cell Chemical Biology. 27, 499-510 (2020).
- Akinjiyan, F. A., et al. A Novel Luminescence-Based High-Throuput Approach for Cellular Resolution of Protein Ubiquitination using Tandem Ubiquitin Binding Entities (TUBEs). SLAS Discovery. 25 (4), 350-360 (2020).
- Soave, M., Kellam, B., Woolard, J., Briddson, S. J., Hill, S. J. NanoBiT Complemetation to Monitor Agonist-Induced Adenosine A1 Receptor Internalization. SLAS Discovery. 25 (2), 186-194 (2020).
- Crowley, E., Leung, E., Reynisson, J., Richardson, A. Rapid changes in the ATG5-ATG16L1 complex following nutrient deprivation measured using NanoLuc Binary Technlology (NanoBiT). FEBS Journal. , 15275 (2020).
- Shetty, S. K., Walzem, R. L., Davies, B. S. J. A novel NanoBiT-based assay monitors the interaction between lipoprotein lipase and GPIHBP1 in real time. Journal of Lipid Research. 61 (4), 546-559 (2020).
