Summary
Protokollet som presenteras här är avsett att visa förekomsten av heterologa interaktioner mellan Golgi-resident typ III membran proteiner med cytoplasmiskt exponerade N- och/eller C-termini i levande däggdjursceller med den senaste varianten av den delade luciferas komplementering assay.
Abstract
Målet med detta protokoll är att utforska tillämpligheten av den senaste varianten av split luciferas komplementering för att demonstrera heterologa komplex som bildas av nukleotid sockertransportörer (NSTs). Dessa ER- och Golgi-bosatta multitransmembranproteiner bär de cytoplasmiskt syntetiserade nukleotidsocker över organellmembran för att leverera enzymer som förmedlar glykosylering med sina substrat. NST finns som dimers och/eller högre oligomerer. Heterologous interaktioner mellan olika NSTs har också rapporterats. För att verifiera om tekniken är lämplig för att studera fenomenet NST heteromerization, testade vi den mot en kombination av de två Golgi-bosatta NSTs som tidigare har visat sig associera på flera andra sätt. Luciferas komplementeringsanalysen verkar vara särskilt lämplig för att studera interaktioner mellan Golgi-bosatta membranproteiner, eftersom det inte kräver höga uttrycksnivåer, vilket ofta utlöser proteinfellokalisering och ökar risken för falska positiva identifieringar.
Introduction
Detta manuskript beskriver ett steg-för-steg protokoll för att kontrollera förekomsten av heterologa interaktioner mellan Golgi-bosatta typ III membran proteiner i transientt transfected mänskliga celler med den senaste varianten av den delade luciferas komplementering assay. Förfarandet har testats mest mot nukleotidsockertransportörer (NSTs) men vi kunde också få positiva resultat för andra Golgi-bosatta typ III-membranproteiner vars N- och/eller C-termini står inför cytoplasma.
Vår forskargrupp undersöker NST:s roll i glykosylering av makromolekyler. NSTs är Golgi- och/eller ER-resident typ III membranproteiner med N- och C-termini som vetter mot den cytoplasmiska sidan av organellarmembranet1. NSTs tros bära nukleotidaktiverade sockerarter över organellmembran för att förse glykosyltransferaser med sina substrat. NSTs bildar dimers och/eller högre oligomerer2,3,4,5,6,7,8,9,10. Dessutom har heterologa interaktioner mellan olika NSTs också rapporterats6,11. NSTs visade sig också bilda komplex med funktionellt relaterade glykosylering enzymer12,13,14. Vi sökte efter ett alternativ till den nuvarande tekniken, fluorescens livstid imaging (FLIM)-baserade FRET-metoden, för att studera interaktioner av NSTs och funktionellt relaterade Golgi-bosatta proteiner, så vi bestämde oss för att testa den delade luciferas komplementeringsanalysen. Det tillät oss att identifiera en ny interaktion mellan en NST och ett funktionellt relaterat glykosylering enzym9.
Den senaste ändringen av den delade luciferaskomplementeringsanalysen, NanoBiT, används i protokollet som presenteras här15. Det förlitar sig på rekonstitutionen av luciferasenzymet (t.ex. NanoLuc) från de två fragmenten - den stora, som kallas stor BiT eller LgBiT, ett 17,6 kDa-protein och det lilla, bestående av endast 11 aminosyror, kallade små BiT eller SmBiT. De två proteinerna av intresse smälts samman med de kompletterande fragmenten och uttrycks övergående i en mänsklig cellinje. Om de två fusionsproteinerna samverkar produceras en luminiscens på plats efter tillsats av ett cellgenomsläppligt substrat. Dessa två fragment har optimerats så att de associerar med minsta affinitet om de inte sammanförs av en interaktion mellan de proteiner av intresse de smälts till.
I allmänhet har bioluminescensbaserade metoder vissa fördelar jämfört med de som bygger på fluorescens. Bioluminescerande signaler har ett högre signal-till-brus-förhållande eftersom bakgrundsluminescensen är försumbar jämfört med den luciferas-härledda signalen16. Fluorescensbaserade metoder lider däremot vanligtvis av en relativt hög bakgrund orsakad av fenomenet autofluorescens. Dessutom är bioluminescens mindre skadligt för de analyserade cellerna än fluorescens, eftersom det i det tidigare fallet inte finns något behov av att excitera provet. Av dessa skäl konkurrerar bioluminescerande metoder för att studera protonpumpshämmare in vivo ut de vanliga fluorescerande metoderna som Förster Resonance Energy Transfer (FRET) eller Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC).
Vårt protokoll bygger på att hänvisa luminiscens erhålls för proteinkombinationen av intresse för luminiscens som erhållits för kontrollkombinationen. Det senare inkluderar det av de testade proteinerna som smälts samman med ett större fragment och ett kontrollprotein (t.ex. HaloTag), smält med ett mindre fragment. Det senare är ett protein av bakteriellt ursprung som inte förväntas interagera med något av däggdjursproteiner. Att använda detta protein som en kontroll innebär begränsningar för topologin hos de Golgi-bosatta par av proteiner som ska analyseras. Eftersom detta protein i däggdjursceller syntetiseras i cytoplasma bör båda proteinerna av intresse ha minst en cytoplasmisk svans.
Detta tillvägagångssätt kan vara särskilt användbart vid inledande screening av protonpumpshämmare. Det kan bli en metod när fusionsproteinerna av intresse uttrycks på nivåer som helt enkelt är otillräckliga för att andra metoder ska kunna tillämpas. På samma sätt kan den delade luciferaskomplementeringsanalysen vara det bästa alternativet om proteinerna av intresse uttrycks på höga nivåer, men detta påverkar deras subcellulära lokalisering negativt eller är känt för att tvinga icke-specifika interaktioner. Eftersom det mindre fragmentet bara har 11 aminosyror kan den delade luciferaskomplementeringsanalysen tillämpas när det är omöjligt att använda större taggar. Slutligen kan den användas för att ytterligare bekräfta uppgifter som erhållits med hjälp av andra tekniker, som i det fall som presenteras här.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generering av uttrycksplasmider
- Undersök membrantopologin hos de proteiner som är av intresse med hjälp av ett topologiförutsägningsverktyg.
- Utforma kloningsstrategin så att de större och mindre fragmenten kommer att möta cytoplasman när fusionsproteinerna har satts in i Golgi-membranen. Om, som i det fall som presenteras här, både N- och C-termini av proteinerna av intresse är cytoplasmiskt orienterade, tagga proteinerna på åtta möjliga sätt (se figur 1B). Om N- eller C-ändstation av ett eller båda proteinerna av intresse är luminally orienterad, uteslut det från märkning.
- Subklon gener av intresse i lämpliga uttryck vektorer (se tabell över material) genom att följa standard kloning protokoll.
OBSERVERA: Det rekommenderas att testa alla möjliga orienteringar, eftersom vissa taggningsalternativ kanske inte fungerar på grund av otillräcklig närhet, suboptimala orienteringar eller rumsliga begränsningar.
2. Övergående transfektion av uttrycksplasmiderna till cellerna
- Skörda den vidhäftande HEK293T cellkulturen genom trypsinisering och återanvända cellerna i ett dedikerat komplett tillväxtmedium. Plätera cellerna (2 x 104/100 μL/brunn) på en klar botten, vit sida 96-välplatta. Justera det totala antalet brunnar så att de passar alla testade kombinationer och kontroller inklusive replikat.
OBS: Försök att endast använda plattans inre 60 brunnar för att minimera termiska skift och undvika avdunstning över natten. Användning av poly-D-lysinbelagda plattor rekommenderas starkt, såsom de som anges i materialregistret, annars kan celler lossna under de efterföljande tvättstegen. - Odla cellerna över natten under standardförhållanden (37 °C, 5% CO2).
- Nästa dag transfektera cellerna med önskade kombinationer av uttrycksplasmider som erhållits i punkt 1.1.
- Späd ut uttrycksplasmider i ett serumfritt medium (se Materialtabell) till 6,25 ng/μL för varje konstruktion.
- Tillsätt det lipidbaserade transfektreagenset vid ett lämpligt lipid-till-DNA-förhållande och inkubera enligt tillverkarens instruktioner.
- Tillsätt 8 μL lipid:DNA-blandning till avsedda brunnar. Blanda plattans innehåll genom skonsam rotation. Detta resulterar i transfektion av båda uttryckskonstruktionerna vid 50 ng/well.
- Odla cellerna i 20-24 h under standardförhållanden (37 °C, 5% CO2).
OBS: Odling av cellerna under en längre tid kan resultera i högre nivåer av fusionsproteinuttryck, vilket kan främja en icke-specifik associering mellan fragmenten.
3. Medelutbyte
- På nästa dag ersätt det konditionerade mediet med 100 μL av ett serumfritt medium i varje brunn. Se till att cellerna inte har lossnat vid medelstort utbyte.
OBS: Detta steg bör göras 2-3 h innan furimazinarbetslösningen tillsats. Serum tillbakadragande minimerar bakgrund orsakad av autoluminescens av furimazin.
4. Beredning av furimazinarbetslösning
- Strax före mätningen blandar du 1 volym furimazin med 19 volymer utspädningsbuffert (en 20-faldig utspädning).
OBS: Den totala volymen av den furimazinarbetslösning som ska beredas beror på antalet enskilda brunnar som ska analyseras (furimazinarbetslösningen tillsätts till cellodlingsmediet i ett 1:5-förhållande, därför bör varje brunn som tidigare fyllts med 100 μL av ett serumfritt medium 25 μL av furimazinarbetslösningen tillsättas). - Tillsätt furimazinarbetslösningen till avsedda brunnar (25 μL/brunn). Blanda försiktigt plattan för hand eller med en orbital shaker (t.ex. 15 s vid 300-500 varv/min).
5. Mätning av luminiscens
- Sätt in plattan i en luminiscensmikroplatta.
- För experiment som ska utföras vid 37 °C balansera plattan i 10-15 min vid angivna temperaturer.
- Välj de brunnar som ska analyseras.
- Läs luminiscens med integrationstid på 0,3 s. Fortsätt att övervaka luminiscens i upp till 2 timmar vid behov.
6. Dataanalys
- Beräkna medelvärden och standardavvikelser för alla testade kombinationer och kontrollkombinationer.
- Analysera data med enkelriktad ANOVA med flera jämförelser.
- Beräkna vikförändringsvärden genom att dividera en genomsnittlig luminiscens som erhållits för kombinationer av intresse med en genomsnittlig luminiscens som erhållits för motsvarande negativa kontroller. Utvärdera resultaten.
OBS: Metoden för dataanalys som föreslås här förutsätter att interaktionen kan hävdas om den luminiscens som erhållits för den testade kombinationen är statistiskt signifikant högre än den luminiscens som erhållits för motsvarande kontrollkombination och samtidigt förhållandet mellan dessa två värden överstiger 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att få de mest tillförlitliga uppgifterna i detta tillvägagångssätt bör alla möjliga kombinationer testas (se figur 1). Parallellt bör positiva och negativa kontroller inkluderas. Den positiva kontrollen bör bestå av de två proteiner som är kända för att interagera, varav det ena smälts samman med det större fragmentet och det andra smälts samman med det mindre fragmentet. Den negativa kontrollen bör idealiskt bestå av de två icke-interagerande typ III-membranproteinerna som är märkta på samma sätt. Att upprätta en sådan kontroll kan dock vara utmanande, eftersom bristen på interaktion mellan de två kontrollproteinerna bör bekräftas noggrant med hjälp av flera alternativa metoder. Därför kan man använda ett cytosoliskt protein av icke-mänskligt ursprung som inte förväntas interagera med något humant protein (t.ex. HaloTag) som en negativ kontroll, om N- och/eller C-termini av proteinerna, vars interaktion ska bestämmas, exponeras cytoplasmiskt som i det fall som presenteras här. Vi rekommenderar starkt en ytterligare verifiering av de resultat som erhålls med hjälp av denna typ av kontroll genom samtidiga uttryck av de otaggade varianterna av något av proteinerna av intresse i kombination med titrering av motsvarande plasmider. Om de två proteinerna specifikt interagerar, bör en extra kopia av någon av dem som saknar luciferasfragmentet resultera i en specifik minskning av luminiscensen.
Relativa luminiscensenheter (RLU) som är typiska för positiva och negativa kombinationer visas i tabell 1. Resultaten erhölls för de två NSTs, SLC35A2 och SLC35A3, som visade sig associeras genom co-immunoprecipitation och FLIM-FRET6 samt in situy ligatur assay11. Både SLC35A2 och SLC35A3 är Golgi-residenta membranproteiner av typ III med N- och C-termini som vetter mot cytoplasman (figur 1A). Därför finns det åtta möjliga märkningsalternativ och de resulterande fusionsproteinerna kan också sättas ihop på åtta möjliga sätt (figur 1B). Medelvärdet RLU-värden som motsvarar alla testade kombinationer och kontrollkombinationer visas i figur 2A. Den positiva kontrollen ingår också. Ett första krav för att ett valt resultat ska anses vara vägledande för en interaktion är att det RLU-värde som erhålls för kombinationen av ränta är statistiskt signifikant högre än det RLU-värde som erhållits för motsvarande kontrollkombination. I figur 2A ses tre sådana kombinationer (LgBiT-SLC35A2 + SLC35A3-SmBiT, SmBiT-SLC35A2 + LgBiT-SLC35A3 och SLC35A2-SmBiT + LgBiT-SLC35A3). Nästa steg i resultatanalysen innebär att uppnå nyckeltalsvärden för kombinationerna av ränta genom att dividera motsvarande RLU-värden med RLU-värden som erhållits för respektive kontroller. Resultaten av en sådan analys visas i figur 2B. Enligt tillverkarens förslag är förhållanden mellan 10 och 1000 mycket vägledande för specifika interaktioner. Det finns två kombinationer som uppfyller dessa kriterier (SmBiT-SLC35A2 + LgBiT-SLC35A3 och SLC35A2-SmBiT + LgBiT-SLC35A3) och stöder tanken att SLC35A2 och SLC35A3 interagerar. Det faktum att de andra sex kombinationerna är negativa betyder dock inte att det inte finns några interaktioner alls mellan respektive fusionsproteiner, utan snarare tyder på att märkningsstrategin inte var optimal i dessa fall. Det här exemplet visar hur viktigt det är att testa alla möjliga kombinationer.
Data som presenteras i figur 2 bekräftades dessutom av meduttrycket av HA-taggade SLC35A2 eller SLC35A3 med den kombination som resulterade i den högsta relativa luminiscensen, nämligen SLC35A2-LgBiT + SmBiT-SLC35A3. Varierande mängder av plasmids kodning HA-taggade NST varianter användes för co-transfection. Detta resulterade i en statistiskt signifikant, dosberoende minskning av RLU-värdena (figur 3). Specifika och dosberoende störningar av interaktionen mellan SLC35A2-LgBiT och SmBiT-SLC35A3 genom samtidig samtidiga uttryck av HA-taggade NST-varianter visas i tabell 2.
Det vanligaste problemet i samband med metoden som presenteras här är den dåliga effektiviteten av transfektion. För att verifiera om detta är orsaken till suboptimala resultat, inkludera positiv kontroll i alla experiment. Den positiva kontroll vi använde för att få de data som presenteras här består av de två interagerande fusionsproteinerna: cAPM-beroende proteinkinaskatalytisk subunit alfa (PRKACA) smält med det mindre fragmentet och cAPM-beroende proteinkinas typ II-alfa reglerande underenhet (PRKAR2A) smält med det större fragmentet. I våra händer nådde motsvarande RLU-värde ~ 6 x 105. En betydande (2-3 storleksordning) minskning av detta antal kan tyda på den suboptimala effektiviteten hos den utförda transfektionen. I sådana fall rekommenderar vi att man kontrollerar de odlade cellernas välbefinnande och ser till att lämpligt antal celler pläteras för transfektion.
Bild 1: Scheman för membrantopologi och taggning. (A) Membrantopologi av proteiner från SLC35A2 och SLC35A3. B) Möjligheter att märka proteiner från SLC35A2 och SLC35A3 med fragmenten av split luciferaskomplementation och kombinera de fusionsproteiner som blir resultatet för analysen. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Resultaten av den analys av delad luciferaskompleation som utförts i HEK293T-celler för de valda proteinkombinationerna och motsvarande negativa kontroller (bearbetade data). A) RLU-värden som erhållits för de valda proteinkombinationerna och motsvarande negativa kontroller. Negativt, HaloTag taggat med SmBiT; PRKAR2A, cAPM-beroende proteinkinas typ II-alfa reglerande underenhet; PRKACA, cAPM-beroende proteinkina katalytisk underenhet alfa. Data analyserades med hjälp av enkelriktad ANOVA med flera jämförelser och presenteras som en genomsnittlig ± standardavvikelse (SD) från tre tekniska replikat. p < 0,1 *, s < 0,05 **, s < 0,01 ***. (B) Vikförändringar beräknade genom att dividera en genomsnittlig luminiscens som erhållits för den testade kombinationen (RLU SAMPLE) med en genomsnittlig luminiscens som erhållits för motsvarande negativa kontroll (RLU CONTROL). Tröskelvärdet som anses tyda på en interaktion fastställdes till 10. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Specifik och dosberoende störning av interaktionen mellan SLC35A2-LgBiT och SmBiT-SLC35A3 genom samtidig samtidig samtidig uttryck av HA-märkta NST-varianter. HEK293T celler transfected med plasmider kodning SLC35A2-LgBiT och SmBiT-SLC35A3 och dessutom antingen med en tom pSelect plasmid (mock) eller med ökande mängder pSelect plasmider kodning HA-taggade SLC35A2 (vänster panel) och SLC35A3 (höger panel). Data analyserades med hjälp av enkelriktad ANOVA med flera jämförelser och presenteras som en genomsnittlig ± standardavvikelse (SD) från tre tekniska replikat. p < 0,05 **, s < 0,001 ****. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Tabell 1: Resultaten av den analys som utförts i HEK293T-celler för de valda proteinkombinationerna och motsvarande negativa kontroller (rådata). Obearbetade RLU-värden som erhållits för de valda proteinkombinationerna och motsvarande negativa kontroller visas. Negativt, HaloTag taggat med SmBiT; PRKAR2A, cAPM-beroende proteinkinas typ II-alfa reglerande underenhet; PRKACA, cAPM-beroende proteinkina katalytisk underenhet alfa, TR, teknisk replikat. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Tabell 2: Specifik och dosberoende störning av interaktionen mellan SLC35A2-LgBiT och SmBiT-SLC35A3 genom samtidig samtidig samtidig uttryck av HA-märkta NST-varianter (rådata). Obearbetade RLU-värden som erhållits för de valda proteinkombinationerna visas. Mock, celler som uttrycker SLC35A2-LgBiT och SmBiT-SLC35A3 samtransfected med en tom pSelect vektor; HA-SLC35A2, celler som uttrycker SLC35A2-LgBiT och SmBiT-SLC35A3 tillsammans transfekterade med de angivna mängderna av en pSelect plasmid kodning SLC35A2 taggad med HA epitop vid N-ändstationen; HA-SLC35A3, celler som uttrycker SLC35A2-LgBiT och SmBiT-SLC35A3 samtransfekterade med de angivna mängderna av en pSelect plasmid kodning SLC35A3 taggad med HA epitop vid N-ändstationen; TR, tekniskt replikat. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll som möjliggör demonstration av heterologa komplex som bildas mellan Golgi-bosatta typ III membranproteiner, såsom NSTs, med hjälp av den delade luciferaskomplementeringsanalysen. Det föreslagna tillvägagångssättet för dataanalys och tolkning innebär att den luminiscens som erhållits för proteinkombinationen av intresse för den luminiscens som erhållits för motsvarande kontrollkombination, som består av ett av de proteiner av intresse som smälts samman med det större fragmentet och kontrollproteinet av ett bakteriellt ursprung smält med det mindre fragmentet. Den senare uttrycks i cytoplasma av däggdjursceller; Att använda det som referens kräver därför att N- och/eller C-termini av proteinerna, vars interaktion ska analyseras, finns på den cytoplasmiska sidan av Golgi-membranet.
De kritiska stegen i protokollet är plasmiddesign, plätering av cellerna som ska transfected, transfektion själv, medelutbytet, beredningen av furimazinarbetslösningen och tillsats av den i cellerna. Plasmiddesignen bör göras på ett sådant sätt att båda luciferasfragmenten är vända mot cytoplasman, annars kommer kontrollkombinationer inte att fungera och referensvärdena för RLU saknas. Celler som ska transfekteras bör pläteras enligt protokollet, annars kan transfekteringseffektiviteten vara suboptimal. Vi rekommenderar att du använder multiwellplattor med den poly-L-lysinbelagda ytan för att stödja cellfäste medan mediet byts ut. Slutligen bör furimazinarbetslösningen vara nyberedd och omedelbart läggas till cellerna. När avläsningen har lagts till ska den utföras så snart som möjligt.
För att undvika resultat bör positiva och negativa kontroller alltid inkluderas. Den positiva kontrollen bör alltid användas så att transfekteringseffektiviteten övervakas. Det är mycket viktigt att alla möjliga fusionsproteiner som är topologiskt kompatibla med varandra samt med den HaloTag-baserade negativa kontrollen genereras och kombineras. Om möjligt bör den negativa kontrollen som består av ett membranprotein som inte interagerar med något av de proteiner som är av intresse användas. Här använde vi inte en sådan kontroll, eftersom dess utveckling fortfarande är på väg. Istället tvingade vi fram en specifik demontering av komplexen av intresse genom att uttrycka en extra, otaggad kopia av ett av de analyserade proteinerna. Uttryck vektorer vi använde bär relativt svag herpes simplex virus-tymidin kinas (HSV-TK) promotor, vilket säkerställer låga uttrycksnivåer som är optimala för att få specifika resultat. Vid suboptimala resultat kan det dock vara fördelaktigt att använda de CMV-baserade vektorerna eller alternativt optimera mängden plasmider som används för transfektion.
Den presenterade metoden, även om den är kraftfull och bekväm, har vissa begränsningar. För det första gör denna metod det inte möjligt att avgöra om de identifierade komplexen motsvarar dimers eller högre ordningens oligomerer. Dessutom kan subcellulär lokalisering av de interagerande proteinerna inte övervakas. Detta är dock möjligt vid utvidgningen av grundprotokollet med bioluminescerande avbildning, även om rumslig upplösning av sådana bilder skulle vara betydligt lägre jämfört med fluorescensbaserade metoder.
Den presenterade metoden är mycket snabb och effektiv (mätningen tar upp till flera minuter och data erhålls från tusentals celler). Databehandling och tolkning är också relativt okomplicerad. Liten eller ingen optimering av grundprotokollet behövs. Den enda specifika utrustning som krävs är en luminometer. Den delade luciferaskomplementeringsanalysen och BiFC arbetar enligt samma grundläggande princip, dvs. Allmänna fördelar med bioluminescensbaserade metoder jämfört med de som bygger på fluorescens listades redan i introduktionen. En specifik fördel med den delade luciferaskomplementeringsanalysen över BiFC är att den förstnämnda är helt reversibel15. I BiFC, när ett fluorescerande protein har rekonstruerats, skulle det inte separeras tillbaka till motsvarande icke-fluorescerande fragment17. Däremot är monteringen av NanoLuc-underenheterna reversibel, vilket skapar en unik möjlighet att studera dynamiken hos protonpumpshämmare. Slutligen tillåter den exceptionella känsligheten hos den presenterade metoden att anta att detta tillvägagångssätt bör fungera även med de cellinjer som är svåra att transfektera.
Protokollet som presenteras här gör det möjligt att avgöra om de två Golgi-bosatta typ III-membranproteinerna interagerar. Som redan nämnts kan den grundläggande inställningen av metoden kombineras med bioluminescensavbildning för att bekräfta den subcellulära lokaliseringen av PPI av intresse. Reversibiliteten hos denna split luciferase komplementeringsanalys gör det möjligt att studera dynamiken hos protonpumpshämmare i realtid. Den självlysande signalen från furimazin upprätthålls i ca 2 timmar. Substrat för den delade luciferaskomplementeringsanalysen som säkerställer en betydligt längre (timmar till dagar) varaktighet av den resulterande signalen finns dock också tillgängliga. Denna metod gör det möjligt att identifiera de faktorer som utlöser eller förhindrar PPI av intresse. Några av de senaste exemplen på dess tillämpning inkluderar studier om interaktioner mellan G-proteiner och G-proteinkopplade receptorer18, proteinkonformationella förändringar19, protein ubiquitination20, internalisering av cellytans receptorer21 och identifiering av faktorer som modulerar protonpumpshämmare22,23. Därför verkar denna metod vara ett mångsidigt verktyg med stor potential att uppfylla även mycket utmanande experimentella mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av bidrag nr 2016/23/D/NZ3/01314 från National Science Centre (NCN), Krakow, Polen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin-EDTA solution | |||
| Adherent mammalian cell line | |||
| BioCoat Poly-D-Lysine 96-well White/Clear Flat Bottom TC-treated Microplate, with Lid | Corning | 356651 | |
| Cell culture centrifuge | |||
| Cell culture supplements (heat-inactivated fetal bovine serum, L-glutamine, penicillin, streptamycin) | |||
| CO2 incubator | |||
| Expression plasmids encoding protein(s) of interest not tagged with NanoBiT fragments | |||
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| GloMax Discover Microplate Reader (or a different luminescence microplate reader) | Promega | GM3000 | |
| Growth medium dedicated to the cell line used | |||
| Materials and reagents for standard molecular cloning (bacteria, thermostable polymerase, restriction enzymes, DNA ligase, materials and reagents for nucleic acid purification) | |||
| NanoBiT MCS Starter System | Promega | N2014 | This kit contains vectors enabling tagging of the proteins of interest with NanoBiT fragments at different orientations as well as the control plasmid encoding HaloTag protein fused with SmBiT and a positive control plasmid pair. |
| Nano-Glo Live Cell Assay System | Promega | N2011 | This kit contains furimazine, which is a substrate enabling detection of the NanoLuc activity in living cells, and a dedicated dilution buffer. |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium, no phenol red | Gibco | 11058021 | |
| Oribital shaker | |||
| Software for data analysis (e.g. GraphPad Prism) | |||
| Thermocycler |
References
- Hadley, B., et al. Structure and function of nucleotide sugar transporters: Current progress. Computational and Structural Biotechnology Journal. 10 (16), 23-32 (2014).
- Puglielli, L., Hirschberg, C. B. Reconstitution, identification, and purification of the rat liver Golgi membrane GDP-fucose transporter. Journal of Biological Chemistry. 274 (50), 35596-35600 (1999).
- Puglielli, L., Mandon, E. C., Rancour, D. M., Menon, A. K., Hirschberg, C. B. Identification and purification of the rat liver Golgi membrane UDP-N-acetylgalactosamine transporter. Journal of Biological Chemistry. 274 (7), 4474-4479 (1999).
- Gao, X., Dean, N. Distinct protein domains of the yeast Golgi GDP-mannose transporter mediate oligomer assembly and export from the endoplasmic reticulum. Journal of Biological Chemistry. 275 (23), 17718-17727 (2000).
- Olczak, M., Guillen, E. Characterization of a mutation and an alternative splicing of UDP-galactose transporter in MDCK-RCAr cell line. Biochimica et Biophysica Acta. 1763 (1), 82-92 (2006).
- Maszczak-Seneczko, D., Sosicka, P., Majkowski, M., Olczak, T., Olczak, M. UDP-N-acetylglucosamine transporter and UDP-galactose transporter form heterologous complexes in the Golgi membrane. FEBS Letters. 586 (23), 4082-4087 (2012).
- Nji, E., Gulati, A., Qureshi, A. A., Coincon, M., Drew, D. Structural basis for the delivery of activated sialic acid into Golgi for sialyation. Nature Structural and Molecular Biology. 26 (6), 415-423 (2019).
- Parker, J. L., Corey, R. A., Stansfeld, P. J., Newstead, S. Structural basis for substrate specificity and regulation of nucleotide sugar transporters in the lipid bilayer. Nature Communications. 10 (1), 4657 (2019).
- Wiertelak, W., Sosicka, P., Olczak, M., Maszczak-Seneczko, D. Analysis of homologous and heterologous interactions between UDP-galactose transporter and beta-1,4-galactosyltransferase 1 using NanoBiT. Analytical Biochemistry. 593, 113599 (2020).
- Hong, K., Ma, D., Beverley, S. M., Turco, S. J. The Leishmania GDP-mannose transporter is an autonomous, multi-specific, hexameric complex of LPG2 subunits. Biochemistry. 39 (8), 2013-2022 (2000).
- Sosicka, P., et al. An insight into the orphan nucleotide sugar transporter SLC35A4. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1864 (5), 825-838 (2017).
- Sprong, H., et al. Association of the Golgi UDP-galactose transporter with UDP-galactose:ceramide galactosyltransferase allows UDP-galactose import in the endoplasmic reticulum. Molecular Biology of the Cell. 14 (8), 3482-3493 (2003).
- Maszczak-Seneczko, D., et al. UDP-galactose (SLC35A2) and UDP-N-acetylglucosamine (SLC35A3) Transporters Form Glycosylation-related Complexes with Mannoside Acetylglucosaminyltransferases (Mgats). Journal of Biological Chemistry. 290 (25), 15475-15486 (2015).
- Khoder-Agha, F., et al. N-acetylglucosaminyltransferases and nucleotide sugar transporters form multi-enzyme-multi-transporter assemblies in golgi membranes in vivo. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (9), 1821-1832 (2019).
- Dixon, A. S., et al. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).
- Tung, J. K., Berglund, K., Gutekunst, C. -A., Hochgeschwender, U., Gross, R. E. Bioluminescence imaging in live cells and animals. Neurophotonics. 3 (2), 025001 (2016).
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Molecular Cell. 9 (4), 789-798 (2002).
- Inoue, A., et al. Illuminating G-Protein-Coupling Selectivity of GPCRs. Cell. 177 (7), 1933-1947 (2019).
- White, C. W., Caspar, B., Vanyai, H. K., Pfleger, K. D. G., Hill, S. J. CRISPR-Mediated Protein Tagging with Nanoluciferase to Investigate Native Chemokine Receptor Function and Conformational Changes. Cell Chemical Biology. 27, 499-510 (2020).
- Akinjiyan, F. A., et al. A Novel Luminescence-Based High-Throuput Approach for Cellular Resolution of Protein Ubiquitination using Tandem Ubiquitin Binding Entities (TUBEs). SLAS Discovery. 25 (4), 350-360 (2020).
- Soave, M., Kellam, B., Woolard, J., Briddson, S. J., Hill, S. J. NanoBiT Complemetation to Monitor Agonist-Induced Adenosine A1 Receptor Internalization. SLAS Discovery. 25 (2), 186-194 (2020).
- Crowley, E., Leung, E., Reynisson, J., Richardson, A. Rapid changes in the ATG5-ATG16L1 complex following nutrient deprivation measured using NanoLuc Binary Technlology (NanoBiT). FEBS Journal. , 15275 (2020).
- Shetty, S. K., Walzem, R. L., Davies, B. S. J. A novel NanoBiT-based assay monitors the interaction between lipoprotein lipase and GPIHBP1 in real time. Journal of Lipid Research. 61 (4), 546-559 (2020).
