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Biology

Nachweis heterologer Komplexe, die von Golgi-residenten Typ-III-Membranproteinen gebildet werden, mittels Split-Luciferase-Komplementierungsassay

Published: September 10, 2020 doi: 10.3791/61669

Summary

Das hier vorgestellte Protokoll soll das Auftreten heterologer Interaktionen zwischen Golgi-residenten Typ-III-Membranproteinen mit zytoplasmatisch exponierten N- und/oder C-Termini in lebenden Säugetierzellen unter Verwendung der neuesten Variante des Split-Lucifererase-Komplementierungsassays demonstrieren.

Abstract

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Anwendbarkeit der neuesten Variante der gespaltenen Luciferase-Komplementierung für den Nachweis heterologer Komplexe, die von Nukleotid-Zuckertransportern (NSTs) gebildet werden, zu untersuchen. Diese ER- und Golgi-residenten Multitransmembranproteine transportieren die zytoplasmatisch synthetisierten Nukleotidzucker über Organellenmembranen, um Enzyme zu liefern, die die Glykosylierung mit ihren Substraten vermitteln. NSTs existieren als Dimere und/oder höhere Oligomere. Heterologe Wechselwirkungen zwischen verschiedenen NSTs wurden ebenfalls berichtet. Um zu überprüfen, ob die Technik für die Untersuchung des Phänomens der NST-Heteromerisierung geeignet ist, haben wir sie gegen eine Kombination der beiden Golgi-ansässigen NSTs getestet, von denen zuvor gezeigt wurde, dass sie sich auf verschiedene andere Weise assoziieren. Der Luciferase-Komplementierungsassay scheint besonders geeignet zu sein, um Wechselwirkungen zwischen Golgi-residenten Membranproteinen zu untersuchen, da er keine hohen Expressionsniveaus erfordert, die oft eine Proteinfehllokalisation auslösen und das Risiko von falsch positiven Ergebnissen erhöhen.

Introduction

Dieses Manuskript beschreibt ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Überprüfung auf das Vorhandensein heterologer Interaktionen zwischen Golgi-residenten Typ-III-Membranproteinen in transient transfizierten menschlichen Zellen unter Verwendung der neuesten Variante des Split-Lucifererase-Komplementierungsassays. Das Verfahren wurde am umfangreichsten gegen Nukleotid-Zuckertransporter (NSTs) getestet, aber wir konnten auch positive Ergebnisse für andere Golgi-residente Typ-III-Membranproteine erzielen, deren N- und/oder C-Termini dem Zytoplasma zugewandt sind.

Unsere Forschungsgruppe untersucht die Rolle von NSTs bei der Glykosylierung von Makromolekülen. NSTs sind Golgi- und/oder ER-residente Typ-III-Membranproteine mit N- und C-Termini, die der zytoplasmatischen Seite der Organellamembran zugewandt sind1. Es wird angenommen, dass NSTs nukleotidaktivierte Zucker über Organellenmembranen transportieren, um Glykosyltransferasen mit ihren Substraten zu versorgen. NSTs bilden Dimere und/oder höhere Oligomere2,3,4,5,6,7,8,9,10. Darüber hinaus wurden auch heterologe Wechselwirkungen zwischen verschiedenen NSTs berichtet6,11. Es wurde auch gezeigt, dass NSTs Komplexe mit funktionell verwandten Glykosylierungsenzymen bilden12,13,14. Wir suchten nach einer Alternative zur derzeit verwendeten Technik, dem FLIM-basierten FRET-Ansatz (Fluorescence Lifetime Imaging), um die Wechselwirkungen von NSTs und funktionell verwandten Golgi-residenten Proteinen zu untersuchen, also beschlossen wir, den Split-Luciferase-Komplementierungsassay zu testen. Es ermöglichte uns, eine neuartige Wechselwirkung zwischen einem NST und einem funktionell verwandten Glykosylierungsenzym zu identifizieren9.

Die jüngste Modifikation des Split-Luciferase-Komplementierungsassays NanoBiT wird in dem hier vorgestellten Protokoll verwendet15. Es beruht auf der Rekonstitution des Luciferase-Enzyms (z. B. NanoLuc) aus den beiden Fragmenten - dem großen, das als großes BiT oder LgBiT bezeichnet wird, einem 17,6-kDa-Protein, und dem kleinen, das aus nur 11 Aminosäuren besteht, das als kleines BiT oder SmBiT bezeichnet wird. Die beiden interessierenden Proteine werden mit den komplementären Fragmenten verschmolzen und vorübergehend in einer menschlichen Zelllinie exprimiert. Wenn die beiden Fusionsproteine interagieren, entsteht in situ durch Zugabe eines zelldurchlässigen Substrats eine Lumineszenz. Diese beiden Fragmente wurden so optimiert, dass sie sich mit minimaler Affinität assoziieren, es sei denn, sie werden durch eine Wechselwirkung zwischen den Proteinen von Interesse, mit denen sie verschmolzen sind, zusammengebracht.

Im Allgemeinen haben biolumineszenzbasierte Methoden einige Vorteile gegenüber denen, die auf Fluoreszenz basieren. Biolumineszenzsignale haben ein höheres Signal-Rausch-Verhältnis, da die Hintergrundlumineszenz im Vergleich zum Luciferase-abgeleiteten Signal16 vernachlässigbar ist. Im Gegensatz dazu leiden fluoreszenzbasierte Ansätze in der Regel unter einem relativ hohen Hintergrund, der durch das Phänomen der Autofluoreszenz verursacht wird. Außerdem ist die Biolumineszenz für die analysierten Zellen weniger schädlich als die Fluoreszenz, da im ersten Fall keine Notwendigkeit besteht, die Probe anzuregen. Aus diesen Gründen übertreffen biolumineszierende Ansätze zur Untersuchung von PPIs in vivo die häufig verwendeten fluoreszierenden Methoden wie Förster Resonance Energy Transfer (FRET) oder Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC).

Unser Protokoll beruht auf der Bezugnahme der Lumineszenz, die für die Proteinkombination von Interesse ist, auf die Lumineszenz, die für die Kontrollkombination erhalten wird. Letzteres umfasst eines der getesteten Proteine, das mit einem größeren Fragment verschmolzen ist, und ein Kontrollprotein (z. B. HaloTag), das mit einem kleineren Fragment verschmolzen ist. Letzteres ist ein Protein bakteriellen Ursprungs, von dem nicht erwartet wird, dass es mit einem der Säugetierproteine interagiert. Die Verwendung dieses Proteins als Kontrolle schränkt die Topologie der zu analysierenden Golgi-residenten Proteinpaare ein. Da dieses Protein in Säugetierzellen im Zytoplasma synthetisiert wird, sollten beide interessierenden Proteine mindestens einen zytoplasmatischen Schwanz haben.

Dieser Ansatz kann besonders nützlich für das anfängliche Screening von PPIs sein. Es kann die Methode der Wahl werden, wenn die interessierenden Fusionsproteine in Konzentrationen ausgedrückt werden, die für die Anwendung anderer Ansätze einfach nicht ausreichen. In ähnlicher Weise kann der Split-Luciferase-Komplementierungsassay die beste Option sein, wenn die interessierenden Proteine in hohen Konzentrationen exprimiert werden, was sich jedoch nachteilig auf ihre subzelluläre Lokalisation auswirkt oder dafür bekannt ist, unspezifische Wechselwirkungen zu erzwingen. Da das kleinere Fragment nur 11 Aminosäuren enthält, kann der Split-Luciferase-Komplementierungsassay angewendet werden, wenn die Verwendung größerer Tags unmöglich ist. Schließlich kann es verwendet werden, um Daten, die mit anderen Techniken erhalten wurden, wie in dem hier vorgestellten Fall, weiter zu bestätigen.

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Protocol

1. Erzeugung von Expressionsplasmiden

  1. Untersuchen Sie die Membrantopologie der interessierenden Proteine mit einem Topologievorhersagewerkzeug.
  2. Entwerfen Sie die Klonierungsstrategie so, dass die größeren und kleineren Fragmente dem Zytoplasma gegenüberstehen, sobald die Fusionsproteine in die Golgi-Membranen eingefügt wurden. Wenn, wie im hier dargestellten Fall, sowohl N- als auch C-Termini der interessierenden Proteine zytoplasmatisch orientiert sind, markieren Sie die Proteine auf acht mögliche Arten (siehe Abbildung 1B). Wenn der N- oder C-Terminus eines oder beider Proteine von Interesse luminal orientiert ist, schließen Sie ihn vom Tagging aus.
  3. Subklonen Sie die interessierenden Gene in geeignete Expressionsvektoren (siehe Materialtabelle), indem Sie die Standard-Klonierungsprotokolle befolgen.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, alle möglichen Ausrichtungen zu testen, da einige Tagging-Optionen aufgrund unzureichender Nähe, suboptimaler Ausrichtung oder räumlicher Einschränkungen möglicherweise nicht funktionieren.

2. Transiente Transfektion der Expressionsplasmide in die Zellen

  1. Ernten Sie die adhärente HEK293T-Zellkultur durch Trypsinisierung und resuspendieren Sie die Zellen in einem speziellen vollständigen Wachstumsmedium. Platten Sie die Zellen (2 x 104/100 μL/Well) auf eine klare untere, weiße 96-Well-Platte. Passen Sie die Gesamtzahl der Bohrlöcher an, um alle getesteten Kombinationen und Kontrollen einschließlich Replikationen aufzunehmen.
    HINWEIS: Versuchen Sie, nur die inneren 60 Vertiefungen der Platte zu verwenden, um thermische Verschiebungen zu minimieren und eine Verdunstung über Nacht zu vermeiden. Die Verwendung von Poly-D-Lysin-beschichteten Platten, wie sie in der Materialtabelle angegeben sind, wird dringend empfohlen, da sich sonst Zellen während der nachfolgenden Waschschritte ablösen können.
  2. Kultivieren Sie die Zellen über Nacht unter Standardbedingungen (37 °C, 5% CO2).
  3. Am nächsten Tag werden die Zellen mit den gewünschten Kombinationen von Expressionsplasmiden transfiziert, die in Nummer 1.1 erhalten wurden.
    1. Verdünnte Expressionsplasmide in einem serumfreien Medium (siehe Materialtabelle) auf 6,25 ng/μL für jedes Konstrukt.
    2. Fügen Sie das lipidbasierte Transfektionsreagenz in einem geeigneten Lipid-zu-DNA-Verhältnis hinzu und inkubieren Sie es gemäß den Anweisungen des Herstellers.
    3. 8 μL Lipid:DNA-Gemisch in die dafür vorgesehenen Vertiefungen geben. Mischen Sie den Inhalt der Platte durch sanfte Rotation. Dies führt zu einer Transfektion beider Ausdruckskonstrukte bei 50 ng/well.
  4. Kultivieren Sie die Zellen für 20-24 h unter Standardbedingungen (37 °C, 5% CO2).
    HINWEIS: Die Kultivierung der Zellen über einen längeren Zeitraum kann zu einer höheren Expression von Fusionsproteinen führen, was eine unspezifische Assoziation zwischen den Fragmenten fördern kann.

3. Mittlerer Austausch

  1. Ersetzen Sie am nächsten Tag das konditionierte Medium durch 100 μL eines serumfreien Mediums in jedem Bohrloch. Stellen Sie sicher, dass sich die Zellen beim Mediumsaustausch nicht gelöst haben.
    HINWEIS: Dieser Schritt sollte 2-3 Stunden vor der Zugabe der Furimazin-Arbeitslösung durchgeführt werden. Der Serumentzug minimiert den Hintergrund, der durch die Autolumineszenz von Furimazin verursacht wird.

4. Vorbereitung der Furimazin-Arbeitslösung

  1. Mischen Sie kurz vor der Messung 1 Volumen Furimazin mit 19 Volumina eines Verdünnungspuffers (eine 20-fache Verdünnung).
    HINWEIS: Das Gesamtvolumen der herzustellenden Furimazin-Arbeitslösung hängt von der Anzahl der einzelnen zu analysierenden Vertiefungen ab (die Furimazin-Arbeitslösung wird dem Zellkulturmedium im Verhältnis 1:5 zugesetzt, daher sollte jedem zuvor mit 100 μL gefüllten Bohrloch eines serumfreien Mediums 25 μL der Furimazin-Arbeitslösung zugegeben werden).
  2. Fügen Sie die Furimazin-Arbeitslösung zu den vorgesehenen Vertiefungen hinzu (25 μL/Well). Mischen Sie die Platte vorsichtig von Hand oder mit einem Orbitalschüttler (z. B. 15 s bei 300-500 U / min).

5. Messung der Lumineszenz

  1. Setzen Sie die Platte in einen Lumineszenz-Mikroplattenleser ein.
    1. Für Experimente, die bei 37 °C durchgeführt werden sollen, gleicht die Platte für 10-15 min bei der angegebenen Temperatur aus.
  2. Wählen Sie die zu analysierenden Vertiefungen aus.
  3. Leselumineszenz mit einer Integrationszeit von 0,3 s. Überwachen Sie bei Bedarf bis zu 2 Stunden lang die Lumineszenz.

6. Datenanalyse

  1. Berechnen Sie Mittelwerte und Standardabweichungen für alle geprüften und Regelkombinationen.
  2. Analysieren Sie Daten mit unidirektionaler ANOVA mit mehreren Vergleichen.
  3. Berechnen Sie Faltungsänderungswerte, indem Sie eine mittlere Lumineszenz, die für Kombinationen von Interesse erhalten wird, durch eine mittlere Lumineszenz dividieren, die für die entsprechenden Negativkontrollen erhalten wird. Bewerten Sie die Ergebnisse.
    ANMERKUNG: Der hier vorgeschlagene Ansatz zur Datenanalyse geht davon aus, dass die Wechselwirkung beansprucht werden kann, wenn die für die getestete Kombination erhaltene Lumineszenz statistisch signifikant höher ist als die für die entsprechende Kontrollkombination erhaltene Lumineszenz und gleichzeitig das Verhältnis dieser beiden Werte 10 übersteigt.

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Representative Results

Um die zuverlässigsten Daten in diesem Ansatz zu erhalten, sollten alle möglichen Kombinationen getestet werden (siehe Abbildung 1). Parallel dazu sollten Positiv- und Negativkontrollen einbezogen werden. Die Positivkontrolle sollte aus den beiden Proteinen bestehen, von denen bekannt ist, dass sie interagieren, von denen eines mit dem größeren Fragment und das andere mit dem kleineren Fragment verschmolzen ist. Die Negativkontrolle sollte idealerweise aus den beiden nicht interagierenden Typ-III-Membranproteinen bestehen, die ebenfalls markiert sind. Die Etablierung einer solchen Kontrolle kann jedoch eine Herausforderung darstellen, da die fehlende Wechselwirkung der beiden Kontrollproteine mit mehreren alternativen Ansätzen gründlich bestätigt werden sollte. Daher könnte man ein zytosolisches Protein nichtmenschlichen Ursprungs, von dem nicht erwartet wird, dass es mit einem menschlichen Protein (z.B. HaloTag) interagiert, als Negativkontrolle verwenden, wenn N- und/oder C-Termini der Proteine, deren Wechselwirkung bestimmt werden soll, zytoplasmatisch exponiert sind, wie im hier dargestellten Fall. Wir empfehlen dringend eine zusätzliche Überprüfung der Ergebnisse, die mit dieser Art der Kontrolle erzielt wurden, durch Co-Expression der nicht markierten Varianten eines der interessierenden Proteine in Kombination mit Titration der entsprechenden Plasmide. Wenn die beiden Proteine spezifisch interagieren, sollte eine zusätzliche Kopie von beiden, denen das Luciferase-Fragment fehlt, zu einer spezifischen Abnahme der Lumineszenz führen.

Relative Lumineszenzeinheiten (RLU) Werte, die für positive und negative Kombinationen typisch sind, sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die Ergebnisse wurden für die beiden NSTs, SLC35A2 und SLC35A3, erzielt, von denen gezeigt wurde, dass sie durch Co-Immunpräzipitation und FLIM-FRET6 sowie in situ Proximity-Ligationsassay11 assoziiert sind. Sowohl SLC35A2 als auch SLC35A3 sind Golgi-residente Typ-III-Membranproteine mit N- und C-Termini, die dem Zytoplasma zugewandt sind (Abbildung 1A). Daher gibt es acht mögliche Markierungsoptionen und die resultierenden Fusionsproteine können auch auf acht mögliche Arten zusammengesetzt werden (Abbildung 1B). Die mittleren RLU-Werte, die allen getesteten und Kontrollkombinationen entsprechen, sind in Abbildung 2A dargestellt. Die Positivkontrolle ist ebenfalls enthalten. Eine erste Voraussetzung dafür, dass ein ausgewähltes Ergebnis als Hinweis auf eine Wechselwirkung angesehen werden kann, besteht darin, dass der für die Zinskombination erhaltene RLU-Wert statistisch signifikant höher ist als der für die entsprechende Kontrollkombination erhaltene RLU-Wert. In Abbildung 2A sind drei solcher Kombinationen zu sehen (LgBiT-SLC35A2 + SLC35A3-SmBiT, SmBiT-SLC35A2 + LgBiT-SLC35A3 und SLC35A2-SmBiT + LgBiT-SLC35A3). Der nächste Schritt bei der Analyse der Ergebnisse besteht darin, Verhältniswerte für die interessierenden Kombinationen zu erhalten, indem die entsprechenden RLU-Werte durch die für die jeweiligen Kontrollen erhaltenen RLU-Werte dividiert werden. Die Ergebnisse einer solchen Analyse sind in Abbildung 2B dargestellt. Nach den Vorschlägen des Herstellers sind Verhältnisse zwischen 10 und 1000 sehr indikativ für spezifische Interaktionen. Es gibt zwei Kombinationen, die diese Kriterien erfüllen (SmBiT-SLC35A2 + LgBiT-SLC35A3 und SLC35A2-SmBiT + LgBiT-SLC35A3) und die Idee unterstützen, dass SLC35A2 und SLC35A3 interagieren. Die Tatsache, dass die anderen sechs Kombinationen negativ sind, bedeutet jedoch nicht, dass es überhaupt keine Wechselwirkungen zwischen den jeweiligen Fusionsproteinen gibt, sondern deutet darauf hin, dass die Tagging-Strategie in diesen Fällen nicht optimal war. Dieses Beispiel zeigt, wie wichtig es ist, alle möglichen Kombinationen zu testen.

Die in Abbildung 2 dargestellten Daten wurden zusätzlich durch die Co-Expression von HA-markierten SLC35A2 oder SLC35A3 mit der Kombination bestätigt, die zu der höchsten relativen Lumineszenz führte, nämlich SLC35A2-LgBiT + SmBiT-SLC35A3. Unterschiedliche Mengen der Plasmide, die HA-markierte NST-Varianten kodieren, wurden für die Co-Transfektion verwendet. Dies führte zu einer statistisch signifikanten, dosisabhängigen Abnahme der RLU-Werte (Abbildung 3). Eine spezifische und dosisabhängige Störung der Wechselwirkung zwischen SLC35A2-LgBiT und SmBiT-SLC35A3 durch die gleichzeitige Co-Expression von HA-getaggten NST-Varianten ist in Tabelle 2 dargestellt.

Das häufigste Problem, das mit der hier vorgestellten Methode verbunden ist, ist die schlechte Effizienz der Transfektion. Um zu überprüfen, ob dies die Ursache für suboptimale Ergebnisse ist, schließen Sie die Positivkontrolle in alle Experimente ein. Die Positivkontrolle, die wir verwendet haben, um die hier vorgestellten Daten zu erhalten, besteht aus den beiden interagierenden Fusionsproteinen: cAPM-abhängige Proteinkinase-katalytische Untereinheit alpha (PRKACA), die mit dem kleineren Fragment verschmolzen ist, und cAPM-abhängige Proteinkinase Typ II-alpha regulatorische Untereinheit (PRKAR2A), die mit dem größeren Fragment verschmolzen ist. In unseren Händen erreichte der entsprechende RLU-Wert ~6 x 105. Ein signifikanter Rückgang (2-3 Größenordnungen) dieser Zahl könnte auf die suboptimale Effizienz der durchgeführten Transfektion hinweisen. In einem solchen Fall empfehlen wir, das Wohlbefinden der kultivierten Zellen zu überprüfen und sicherzustellen, dass die entsprechende Anzahl von Zellen für die Transfektion plattiert wird.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Membrantopologie und des Taggings. (A) Membrantopologie der Proteine SLC35A2 und SLC35A3. (B) Möglichkeiten der Markierung von SLC35A2- und SLC35A3-Proteinen mit den gespaltenen Luciferase-Komplementierungsassay-Fragmenten und der Kombination der resultierenden Fusionsproteine für den Assay. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Ergebnisse des in HEK293T-Zellen durchgeführten Split-Luciferase-Komplementierungstests für die ausgewählten Proteinkombinationen und die entsprechenden Negativkontrollen (verarbeitete Daten). (A) RLU-Werte, die für die ausgewählten Proteinkombinationen und die entsprechenden Negativkontrollen erhalten wurden. Negativ, HaloTag getaggt mit SmBiT; PRKAR2A, cAPM-abhängige Proteinkinase Typ II-alpha regulatorische Untereinheit; PRKACA, cAPM-abhängige Proteinkinase-katalytische Untereinheit alpha. Die Daten wurden mittels Einweg-ANOVA mit mehreren Vergleichen analysiert und werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) aus drei technischen Replikaten dargestellt. p < 0,1 *, p < 0,05 **, p < 0,01 ***. (B) Faltenänderungen, berechnet durch Division einer mittleren Lumineszenz, die für die geprüfte Kombination (RLU SAMPLE) erhalten wurde, durch eine mittlere Lumineszenz, die für die entsprechende Negativkontrolle (RLU CONTROL) erhalten wurde. Der Schwellenwert, der als Hinweis auf eine Interaktion angesehen wird, wurde auf 10 festgelegt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Spezifische und dosisabhängige Störung der Wechselwirkung zwischen SLC35A2-LgBiT und SmBiT-SLC35A3 durch gleichzeitige Co-Expression von HA-getaggten NST-Varianten. HEK293T-Zellen wurden mit Plasmiden transfiziert, die für SLC35A2-LgBiT und SmBiT-SLC35A3 kodieren, und zusätzlich entweder mit einem leeren pSelect-Plasmid (Mock) oder mit zunehmenden Mengen an pSelect-Plasmiden, die für die HA-markierten SLC35A2 (linkes Bild) und SLC35A3 (rechtes Bild) kodieren. Die Daten wurden mittels Einweg-ANOVA mit mehreren Vergleichen analysiert und werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) aus drei technischen Replikaten dargestellt. p < 0,05 **, p < 0,001 ****. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Tabelle 1: Ergebnisse des Assays in HEK293T-Zellen für die ausgewählten Proteinkombinationen und die entsprechenden Negativkontrollen (Rohdaten). Unverarbeitete RLU-Werte, die für die ausgewählten Proteinkombinationen und die entsprechenden Negativkontrollen erhalten wurden, werden angezeigt. Negativ, HaloTag getaggt mit SmBiT; PRKAR2A, cAPM-abhängige Proteinkinase Typ II-alpha regulatorische Untereinheit; PRKACA, cAPM-dependent protein kinase catalytic subunit alpha, TR, technische Replikation. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Spezifische und dosisabhängige Störung der Wechselwirkung zwischen SLC35A2-LgBiT und SmBiT-SLC35A3 durch gleichzeitige Co-Expression von HA-getaggten NST-Varianten (Rohdaten). Unverarbeitete RLU-Werte, die für die ausgewählten Proteinkombinationen erhalten wurden, werden angezeigt. Mock, Zellen, die SLC35A2-LgBiT und SmBiT-SLC35A3 exprimieren, co-transfiziert mit einem leeren pSelect-Vektor; HA-SLC35A2, Zellen, die SLC35A2-LgBiT und SmBiT-SLC35A3 exprimieren, co-transfiziert mit den angegebenen Mengen eines pSelect-Plasmids, das SLC35A2 kodiert, markiert mit dem HA-Epitop am N-Terminus; HA-SLC35A3, Zellen, die SLC35A2-LgBiT und SmBiT-SLC35A3 exprimieren, ko-transfiziert mit den angegebenen Mengen eines pSelect-Plasmids, das SLC35A3 kodiert, markiert mit dem HA-Epitop am N-Terminus; TR, technische Replik. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

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Discussion

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Verfügung, das den Nachweis heterologer Komplexe ermöglicht, die zwischen Golgi-residenten Typ-III-Membranproteinen wie NSTs gebildet werden, indem wir den Split-Luciferase-Komplementierungsassay verwenden. Der vorgeschlagene Ansatz zur Datenanalyse und -interpretation besteht darin, die für die interessierende Proteinkombination erhaltene Lumineszenz mit der für die entsprechende Kontrollkombination erhaltenen Lumineszenz in Beziehung zu setzen, die aus einem der interessierenden Proteine besteht, die mit dem größeren Fragment verschmolzen sind, und dem Kontrollprotein bakteriellen Ursprungs, das mit dem kleineren Fragment verschmolzen ist. Letzteres wird im Zytoplasma von Säugetierzellen exprimiert; Daher erfordert die Verwendung als Referenz, dass sich N- und/oder C-Termini der Proteine, deren Wechselwirkung analysiert werden soll, auf der zytoplasmatischen Seite der Golgi-Membran befinden.

Die kritischen Schritte im Protokoll sind das Plasmiddesign, die Beschichtung der zu transfektierenden Zellen, die Transfektion selbst, der Mediumsaustausch, die Herstellung der Furimazin-Arbeitslösung und deren Zugabe zu den Zellen. Das Plasmiddesign sollte so gemacht werden, dass beide Luciferase-Fragmente dem Zytoplasma zugewandt sind, da sonst Kontrollkombinationen nicht funktionieren und die Referenz-RLU-Werte fehlen. Zellen, die transfiziert werden sollen, sollten gemäß den Angaben im Protokoll plattiert werden, da sonst die Transfektionseffizienz suboptimal sein könnte. Wir empfehlen, Multiwell-Platten mit der poly-L-lysinbeschichteten Oberfläche zu verwenden, um die Zellbefestigung während des Austauschs des Mediums zu unterstützen. Schließlich sollte die Furimazin-Arbeitslösung frisch zubereitet und sofort in die Zellen gegeben werden. Sobald es hinzugefügt wurde, sollte das Auslesen so schnell wie möglich durchgeführt werden.

Um nicht schlüssige Ergebnisse zu vermeiden, sollten immer positive und negative Kontrollen enthalten sein. Die Positivkontrolle sollte immer so eingesetzt werden, dass die Transfektionseffizienz überwacht wird. Es ist sehr wichtig, dass alle möglichen Fusionsproteine, die topologisch sowohl untereinander als auch mit der HaloTag-basierten Negativkontrolle kompatibel sind, erzeugt und kombiniert werden. Wenn möglich, sollte die Negativkontrolle verwendet werden, die ein Membranprotein umfasst, das nicht mit einem der interessierenden Proteine interagiert. Hier haben wir keine solche Kontrolle eingesetzt, da ihre Entwicklung noch auf dem Weg ist. Stattdessen erzwangen wir eine spezifische Demontage der interessierenden Komplexe, indem wir eine zusätzliche, nicht markierte Kopie eines der analysierten Proteine mitexprimierten. Die von uns verwendeten Expressionsvektoren tragen den relativ schwachen Herpes-simplex-Virus-Thymidinkinase-Promotor (HSV-TK), der niedrige Expressionsniveaus gewährleistet, die für ein bestimmtes Ergebnis optimal sind. Bei suboptimalen Ergebnissen kann es jedoch vorteilhaft sein, die CMV-basierten Vektoren zu verwenden oder alternativ die Menge der für die Transfektion verwendeten Plasmide zu optimieren.

Die vorgestellte Methode ist zwar leistungsstark und bequem, weist jedoch einige Einschränkungen auf. Erstens erlaubt diese Methode keinen Rückschluss darauf, ob die identifizierten Komplexe Dimeren oder Oligomeren höherer Ordnung entsprechen. Außerdem kann die subzelluläre Lokalisation der interagierenden Proteine nicht überwacht werden. Dies ist jedoch durch die Erweiterung des Basisprotokolls mit biolumineszierender Bildgebung möglich, obwohl die räumliche Auflösung solcher Bilder im Vergleich zu fluoreszenzbasierten Ansätzen deutlich niedriger wäre.

Die vorgestellte Methode ist sehr schnell und effizient (die Messung dauert bis zu mehreren Minuten und die Daten werden von Tausenden von Zellen erhalten). Auch die Datenverarbeitung und -interpretation ist relativ einfach. Es ist wenig oder gar keine Optimierung des Basisprotokolls erforderlich. Die einzige spezifische Ausrüstung, die benötigt wird, ist ein Luminometer. Der Split-Luciferase-Komplementierungsassay und BiFC arbeiten nach dem gleichen wesentlichen Prinzip, d.h. der Rekonstitution eines funktionellen Proteins aus seinen nicht-funktionellen Fragmenten. Allgemeine Vorteile von Biolumineszenz-basierten Ansätzen gegenüber solchen, die auf Fluoreszenz basieren, wurden bereits in der Einleitung aufgeführt. Ein besonderer Vorteil des Split-Luciferase-Komplementierungstests gegenüber BiFC besteht darin, dass ersterer vollständig reversibel ist15. In BiFC würde ein fluoreszierendes Protein, sobald es rekonstituiert ist, nicht wieder in die entsprechenden nicht-fluoreszierenden Fragmente dissoziieren17. Im Gegensatz dazu ist die Montage der NanoLuc-Untereinheiten reversibel, was eine einzigartige Gelegenheit bietet, die Dynamik von PPIs zu untersuchen. Schließlich erlaubt die außergewöhnliche Empfindlichkeit der vorgestellten Methode die Annahme, dass dieser Ansatz auch mit den Zelllinien funktionieren sollte, die schwer zu transfektieren sind.

Das hier vorgestellte Protokoll erlaubt es festzustellen, ob die beiden Golgi-residenten Typ-III-Membranproteine interagieren. Wie bereits erwähnt, kann der grundlegende Aufbau der Methode mit der Biolumineszenzbildgebung gekoppelt werden, um die subzelluläre Lokalisation des PPI von Interesse zu bestätigen. Die Reversibilität dieses Split-Luciferase-Komplementierungsassays ermöglicht es, die Dynamik von PPIs in Echtzeit zu untersuchen. Das von Furimazin abgeleitete Lumineszenzsignal wird etwa 2 Stunden lang aufrechterhalten. Es sind jedoch auch Substrate für den Split-Luciferase-Komplementierungsassay erhältlich, die eine wesentlich längere (Stunden bis Tage) Dauer des resultierenden Signals gewährleisten. Diese Methode ermöglicht die Identifizierung der Faktoren, die den PPI von Interesse auslösen oder verhindern. Zu den jüngsten Anwendungsbeispielen gehören Studien zu Wechselwirkungen zwischen G-Proteinen und G-Protein-gekoppelten Rezeptoren18, Proteinkonformationsänderungen19, Proteinubiquitinierung20, Internalisierung von Zelloberflächenrezeptoren21 und Identifizierung von Faktoren, die PPIs modulieren22,23. Daher scheint diese Methode ein vielseitiges Werkzeug mit einem hohen Potenzial zu sein, um auch sehr anspruchsvolle experimentelle Ziele zu erreichen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch das Stipendium Nr. 2016/23/D/NZ3/01314 des National Science Centre (NCN), Krakau, Polen, unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin-EDTA solution
Adherent mammalian cell line
BioCoat Poly-D-Lysine 96-well White/Clear Flat Bottom TC-treated Microplate, with Lid Corning 356651
Cell culture centrifuge
Cell culture supplements (heat-inactivated fetal bovine serum, L-glutamine, penicillin, streptamycin)
CO2 incubator
Expression plasmids encoding protein(s) of interest not tagged with NanoBiT fragments
FuGENE HD Transfection Reagent Promega E2311
GloMax Discover Microplate Reader (or a different luminescence microplate reader) Promega GM3000
Growth medium dedicated to the cell line used
Materials and reagents for standard molecular cloning (bacteria, thermostable polymerase, restriction enzymes, DNA ligase, materials and reagents for nucleic acid purification)
NanoBiT MCS Starter System Promega N2014 This kit contains vectors enabling tagging of the proteins of interest with NanoBiT fragments at different orientations as well as the control plasmid encoding HaloTag protein fused with SmBiT and a positive control plasmid pair.
Nano-Glo Live Cell Assay System Promega N2011 This kit contains furimazine, which is a substrate enabling detection of the NanoLuc activity in living cells, and a dedicated dilution buffer.
Opti-MEM I Reduced Serum Medium, no phenol red Gibco 11058021
Oribital shaker
Software for data analysis (e.g. GraphPad Prism)
Thermocycler

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Biologie Ausgabe 163 Split-Luciferase-Komplementierungsassay Protein-Protein-Interaktionen PPIs Lumineszenz Biolumineszenz heterologe Komplexe Golgi-Apparat Typ-III-Membranproteine Nukleotid-Zuckertransporter NSTs transiente Transfektion
Nachweis heterologer Komplexe, die von Golgi-residenten Typ-III-Membranproteinen gebildet werden, mittels Split-Luciferase-Komplementierungsassay
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Wiertelak, W., Olczak, M.,More

Wiertelak, W., Olczak, M., Maszczak-Seneczko, D. Demonstration of Heterologous Complexes formed by Golgi-Resident Type III Membrane Proteins using Split Luciferase Complementation Assay. J. Vis. Exp. (163), e61669, doi:10.3791/61669 (2020).

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