Summary
Il protocollo qui presentato ha lo scopo di dimostrare la presenza di interazioni eterologhe tra proteine di membrana di tipo III residenti a Golgi con N- e/o C-termini esposti citoplasmaticamente in cellule di mammifero vive utilizzando la variante più recente del test di complementazione della luciferasi divisa.
Abstract
L'obiettivo di questo protocollo è quello di esplorare l'applicabilità della variante più recente della complementazione della luciferasi divisa per dimostrare complessi eterologhi formati da trasportatori di zucchero nucleotidici (NST). Queste proteine multitransmembrana residenti in ER e Golgi trasportano gli zuccheri nucleotidici sintetizzati citoplasmaticamente attraverso le membrane degli organelli per fornire enzimi che mediano la glicosilazione con i loro substrati. Gli NST esistono come dimeri e/o oligomeri superiori. Sono state riportate anche interazioni eterologhe tra diversi NST. Per verificare se la tecnica è adatta per studiare il fenomeno dell'eteromerizzazione NST, l'abbiamo testata contro una combinazione dei due NST residenti a Golgi che hanno precedentemente dimostrato di associarsi con diversi altri mezzi. Il test di complementazione della luciferasi sembra essere particolarmente adatto per studiare le interazioni tra proteine di membrana residenti nel Golgi, in quanto non richiede alti livelli di espressione, che spesso innescano l'errata localizzazione delle proteine e aumentano il rischio di falsi positivi.
Introduction
Questo manoscritto descrive un protocollo passo-passo per verificare la presenza di interazioni eterologhe tra proteine di membrana di tipo III residenti nel Golgi in cellule umane trasfettate transitoriamente utilizzando la variante più recente del test di complementazione della luciferasi divisa. La procedura è stata ampiamente testata contro i trasportatori di zucchero nucleotidici (NST), ma siamo stati anche in grado di ottenere risultati positivi per altre proteine di membrana di tipo III residenti a Golgi i cui N- e / o C-termini sono rivolti verso il citoplasma.
Il nostro gruppo di ricerca esplora il ruolo degli NST nella glicosilazione delle macromolecole. Le NST sono proteine di membrana di tipo III residenti in Golgi e/o ER con N- e C-termini rivolti verso il lato citoplasmatico della membrana organellare1. Si pensa che gli NST trasportino zuccheri attivati da nucleotidi attraverso le membrane degli organelli per fornire glicosiltransferasi con i loro substrati. Gli NST formano dimeri e/o oligomeri superiori2,3,4,5,6,7,8,9,10. Inoltre, sono state riportate anche interazioni eterologhe tra diversi NST6,11. È stato anche dimostrato che gli NST formano complessi con enzimi di glicosilazione funzionalmente correlati12,13,14. Abbiamo cercato un'alternativa alla tecnica attualmente utilizzata, l'approccio FRET basato sull'imaging a fluorescenza (FLIM), per studiare le interazioni di NST e proteine residenti in Golgi funzionalmente correlate, quindi abbiamo deciso di testare il test di complementazione della luciferasi divisa. Ci ha permesso di identificare una nuova interazione tra un NST e un enzima glicosilazione funzionalmente correlato9.
La modifica più recente del test di complementazione della luciferasi divisa, NanoBiT, è utilizzata nel protocollo qui presentato15. Si basa sulla ricostituzione dell'enzima luciferasi (ad esempio, NanoLuc) dai due frammenti - quello grande, definito come grande BiT o LgBiT, una proteina 17,6 kDa, e quello piccolo, composto da soli 11 amminoacidi, definito come piccolo BiT o SmBiT. Le due proteine di interesse sono fuse con i frammenti complementari ed espresse transitoriamente in una linea cellulare umana. Se le due proteine di fusione interagiscono, una luminescenza viene prodotta in situ con l'aggiunta di un substrato permeabile alle cellule. Questi due frammenti sono stati ottimizzati in modo da associarsi a un'affinità minima a meno che non siano riuniti da un'interazione tra le proteine di interesse a cui sono fusi.
In generale, i metodi basati sulla bioluminescenza hanno alcuni vantaggi rispetto a quelli basati sulla fluorescenza. I segnali bioluminescenti hanno un rapporto segnale-rumore più elevato perché la luminescenza di fondo è trascurabile rispetto al segnale derivato dalla luciferasi16. Al contrario, gli approcci basati sulla fluorescenza di solito soffrono di uno sfondo relativamente alto causato dal fenomeno dell'autofluorescenza. Inoltre, la bioluminescenza è meno dannosa per le cellule analizzate rispetto alla fluorescenza, poiché nel primo caso non è necessario eccitare il campione. Per questi motivi gli approcci bioluminescenti allo studio degli IPP in vivo superano i metodi fluorescenti comunemente usati come Förster Resonance Energy Transfer (FRET) o Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC).
Il nostro protocollo si basa sul riferimento della luminescenza ottenuta per la combinazione proteica di interesse alla luminescenza ottenuta per la combinazione di controllo. Quest'ultimo include una delle proteine testate che viene fusa con un frammento più grande e una proteina di controllo (ad esempio, HaloTag), fusa con un frammento più piccolo. Quest'ultima è una proteina di origine batterica che non dovrebbe interagire con nessuna delle proteine dei mammiferi. L'uso di questa proteina come controllo pone limitazioni alla topologia delle coppie di proteine residenti a Golgi da analizzare. Poiché nelle cellule di mammifero questa proteina è sintetizzata nel citoplasma, entrambe le proteine di interesse dovrebbero avere almeno una coda citoplasmatica.
Questo approccio può essere particolarmente utile per lo screening iniziale degli IPP. Può diventare il metodo di scelta quando le proteine di fusione di interesse sono espresse a livelli che sono semplicemente insufficienti per l'applicazione di altri approcci. Allo stesso modo, il test di complementazione della luciferasi divisa può essere l'opzione migliore se le proteine di interesse sono espresse ad alti livelli, ma ciò influisce negativamente sulla loro localizzazione subcellulare o è noto per forzare interazioni non specifiche. Poiché il frammento più piccolo ha solo 11 amminoacidi, il test di complementazione della luciferasi divisa può essere applicato quando l'uso di tag più grandi è impossibile. Infine, può essere utilizzato per confermare ulteriormente i dati ottenuti utilizzando altre tecniche, come nel caso qui presentato.
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Protocol
1. Generazione di plasmidi di espressione
- Esaminare la topologia di membrana delle proteine di interesse utilizzando uno strumento di previsione della topologia.
- Progettare la strategia di clonazione in modo che i frammenti più grandi e più piccoli affrontino il citoplasma una volta che le proteine di fusione sono state inserite nelle membrane di Golgi. Se, come nel caso qui presentato, sia N- che C-termini delle proteine di interesse sono orientati citoplasmaticamente, etichettare le proteine in otto modi possibili (vedi Figura 1B). Se N- o C-terminus di una o entrambe le proteine di interesse è orientato luminalmente, escluderlo dal tagging.
- Subclonere i geni di interesse in vettori di espressione appropriati (vedi Tabella dei materiali) seguendo protocolli di clonazione standard.
NOTA: si consiglia di testare tutti i possibili orientamenti, poiché alcune opzioni di tagging potrebbero non funzionare a causa di una vicinanza insufficiente, di un orientamento non ottimale o di vincoli spaziali.
2. Trasfezione transitoria dei plasmidi di espressione nelle cellule
- Raccogliere la coltura cellulare HEK293T aderente mediante tripsinizzazione e risospese le cellule in un mezzo di crescita completo dedicato. Placcare le celle (2 x 104/100 μL/pozzetto) su un fondo trasparente, piastra bianca laterale a 96 pozzetti. Regolare il numero totale di pozzetti per adattarsi a tutte le combinazioni e i controlli testati, comprese le repliche.
NOTA: Tentare di utilizzare solo i 60 pozzetti interni della piastra per ridurre al minimo gli spostamenti termici ed evitare l'evaporazione notturna. L'utilizzo di piastre rivestite di poli-D-lisina è altamente raccomandato come quelle indicate nella Tabella dei Materiali, altrimenti le cellule potrebbero staccarsi durante le successive fasi di lavaggio. - Coltivare le cellule durante la notte in condizioni standard (37 °C, 5% CO2).
- Il giorno successivo trasfettate le cellule con le combinazioni desiderate di plasmidi di espressione ottenute al punto 1.1.
- Diluire i plasmidi di espressione in un mezzo privo di siero (vedi Tabella dei materiali) a 6,25 ng/μL per ogni costrutto.
- Aggiungere il reagente di trasfezione a base lipidica con un rapporto lipidico-DNA appropriato e incubare secondo le istruzioni del produttore.
- Aggiungere 8 μL di miscela lipidico:DNA ai pozzetti designati. Mescolare il contenuto della piastra mediante rotazione delicata. Ciò si traduce nella trasfezione di entrambi i costrutti di espressione a 50 ng/pozzetto.
- Coltivare le cellule per 20-24 ore in condizioni standard (37 °C, 5% CO2).
NOTA: La coltura delle cellule per un tempo più lungo può comportare livelli più elevati di espressione proteica di fusione, che può promuovere un'associazione non specifica tra i frammenti.
3. Scambio medio
- Il giorno successivo sostituire il mezzo condizionato con 100 μL di un mezzo privo di siero in ciascun pozzetto. Assicurarsi che le cellule non si siano staccate al momento dello scambio del mezzo.
NOTA: Questo passaggio deve essere eseguito 2-3 ore prima dell'aggiunta della soluzione di lavoro furimazina. Il ritiro del siero riduce al minimo lo sfondo causato dall'autoluminescenza della furimazina.
4. Preparazione della soluzione di lavoro furimazina
- Poco prima della misurazione, mescolare 1 volume di furimazina con 19 volumi di un tampone di diluizione (una diluizione di 20 volte).
NOTA: Il volume totale della soluzione di lavoro furimazina da preparare dipende dal numero di singoli pozzetti da analizzare (la soluzione di lavoro furimazina viene aggiunta al terreno di coltura cellulare in un rapporto 1:5, quindi, a ciascun pozzetto precedentemente riempito con 100 μL di un mezzo privo di siero devono essere aggiunti 25 μL della soluzione di lavoro furimazina). - Aggiungere la soluzione di lavoro furimazina ai pozzetti designati (25 μL/pozzetto). Mescolare delicatamente la piastra a mano o utilizzando uno shaker orbitale (ad esempio, 15 s a 300-500 giri / min).
5. Misurazione della luminescenza
- Inserire la piastra in un lettore di micropiastre a luminescenza.
- Per gli esperimenti che devono essere eseguiti a 37 °C, equilibrare la piastra per 10-15 minuti alla temperatura indicata.
- Selezionare i pozzetti da analizzare.
- Lettura luminescenza con tempo di integrazione di 0,3 s. Continuare a monitorare la luminescenza per un massimo di 2 ore quando necessario.
6. Analisi dei dati
- Calcola i valori medi e le deviazioni standard per tutte le combinazioni testate e di controllo.
- Analizza i dati utilizzando ANOVA unidirezionale con più confronti.
- Calcola i valori di variazione di piega dividendo una luminescenza media ottenuta per le combinazioni di interesse per una luminescenza media ottenuta per i corrispondenti controlli negativi. Valutare i risultati.
NOTA: L'approccio all'analisi dei dati qui proposto presuppone che l'interazione possa essere rivendicata se la luminescenza ottenuta per la combinazione testata è statisticamente significativamente superiore alla luminescenza ottenuta per la combinazione di controllo corrispondente e, allo stesso tempo, il rapporto di questi due valori supera 10.
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Representative Results
Per ottenere i dati più affidabili in questo approccio è necessario testare tutte le possibili combinazioni (vedere la Figura 1). Parallelamente, dovrebbero essere inclusi controlli positivi e negativi. Il controllo positivo dovrebbe consistere nelle due proteine che sono note per interagire, di cui una è fusa con il frammento più grande e l'altra è fusa con il frammento più piccolo. Il controllo negativo idealmente dovrebbe consistere nelle due proteine di membrana di tipo III non interagenti etichettate allo stesso modo. Tuttavia, stabilire un tale controllo può essere difficile, in quanto la mancanza di interazione delle due proteine di controllo dovrebbe essere accuratamente confermata utilizzando diversi approcci alternativi. Pertanto, si potrebbe impiegare una proteina citosolica di origine non umana che non dovrebbe interagire con alcuna proteina umana (ad esempio, HaloTag) come controllo negativo, se N- e / o C-termini delle proteine, la cui interazione deve essere determinata, sono esposti citoplasmaticamente come nel caso qui presentato. Raccomandiamo vivamente un'ulteriore verifica dei risultati ottenuti utilizzando questo tipo di controllo mediante co-espressione delle varianti senza tag di una delle proteine di interesse combinata con la titolazione dei plasmidi corrispondenti. Se le due proteine interagiscono specificamente, una copia extra di una di esse priva del frammento di luciferasi dovrebbe comportare una diminuzione specifica della luminescenza.
I valori delle unità di luminescenza relativa (RLU) tipici delle combinazioni positive e negative sono elencati nella Tabella 1. I risultati sono stati ottenuti per i due NST, SLC35A2 e SLC35A3, che hanno dimostrato di associarsi mediante co-immunoprecipitazione e FLIM-FRET6 e test di legatura di prossimità in situ11. Sia SLC35A2 che SLC35A3 sono proteine di membrana di tipo III residenti a Golgi con N- e C-termini rivolti verso il citoplasma (Figura 1A). Pertanto, ci sono otto possibili opzioni di tagging e le proteine di fusione risultanti possono essere impostate insieme anche in otto modi possibili (Figura 1B). I valori medi di RLU corrispondenti a tutte le combinazioni testate e di controllo sono illustrati nella Figura 2A. È incluso anche il controllo positivo. Un requisito iniziale affinché un risultato selezionato sia considerato indicativo di un'interazione è che il valore RLU ottenuto per la combinazione di interesse è statisticamente significativamente superiore al valore RLU ottenuto per la corrispondente combinazione di controllo. Nella Figura 2A si osservano tre combinazioni di questo tipo (LgBiT-SLC35A2 + SLC35A3-SmBiT, SmBiT-SLC35A2 + LgBiT-SLC35A3 e SLC35A2-SmBiT + LgBiT-SLC35A3). Il passo successivo nell'analisi dei risultati consiste nell'ottenere valori di rapporto per le combinazioni di interesse dividendo i corrispondenti valori RLU per i valori RLU ottenuti per i rispettivi controlli. I risultati di tale analisi sono mostrati nella Figura 2B. Secondo i suggerimenti del produttore, i rapporti tra 10 e 1000 sono altamente indicativi di interazioni specifiche. Esistono due combinazioni che soddisfano questi criteri (SmBiT-SLC35A2 + LgBiT-SLC35A3 e SLC35A2-SmBiT + LgBiT-SLC35A3) e supportano l'idea che SLC35A2 e SLC35A3 interagiscano. Tuttavia, il fatto che le altre sei combinazioni siano negative non significa che non ci siano interazioni tra le rispettive proteine di fusione, ma piuttosto suggerisce che la strategia di tagging non era ottimale in questi casi. Questo esempio mostra quanto sia importante testare tutte le possibili combinazioni.
I dati presentati nella Figura 2 sono stati inoltre confermati dalla co-espressione di SLC35A2 o SLC35A3 con tag HA con la combinazione che ha determinato la più alta luminescenza relativa, vale a dire SLC35A2-LgBiT + SmBiT-SLC35A3. Quantità variabili di plasmidi che codificano varianti NST con tag HA sono state utilizzate per la co-trasfezione. Ciò ha comportato una diminuzione statisticamente significativa e dose-dipendente dei valori di RLU (Figura 3). L'interruzione specifica e dose-dipendente dell'interazione tra SLC35A2-LgBiT e SmBiT-SLC35A3 mediante la co-espressione simultanea di varianti NST con tag HA è mostrata nella Tabella 2.
Il problema più comune associato al metodo qui presentato è la scarsa efficienza della trasfezione. Per verificare se questa è la causa di risultati non ottimali, includere il controllo positivo in tutti gli esperimenti. Il controllo positivo che abbiamo impiegato per ottenere i dati qui presentati è costituito dalle due proteine di fusione interagenti: la subunità catalitica alfa della proteina chinasi cAPM-dipendente (PRKACA) fusa con il frammento più piccolo e la subunità regolatrice della proteina chinasi tipo II-alfa dipendente da cAPM (PRKAR2A) fusa con il frammento più grande. Nelle nostre mani, il valore RLU corrispondente ha raggiunto ~ 6 x 105. Un calo significativo (2-3 ordini di grandezza) di questo numero potrebbe essere indicativo dell'efficienza non ottimale della trasfezione eseguita. In tal caso si consiglia di verificare il benessere delle cellule coltivate e assicurarsi che il numero appropriato di cellule venga placcato per la trasfezione.
Figura 1: Schemi della topologia e dell'etichettatura della membrana. (A) Topologia di membrana delle proteine SLC35A2 e SLC35A3. (B) Possibilità di etichettare le proteine SLC35A2 e SLC35A3 con i frammenti del saggio di complementazione della luciferasi divisa e di combinare le proteine di fusione risultanti per il saggio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Risultati del test di complementazione della luciferasi divisa eseguito in cellule HEK293T per le combinazioni proteiche selezionate e i corrispondenti controlli negativi (dati elaborati). (A) valori RLU ottenuti per le combinazioni proteiche selezionate e i corrispondenti controlli negativi. Negativo, HaloTag taggato con SmBiT; PRKAR2A, subunità regolatoria della proteina chinasi tipo II-alfa cAPM-dipendente; PRKACA, subunità alfa catalitica della proteina chinasi cAPM-dipendente. I dati sono stati analizzati utilizzando ANOVA unidirezionale con confronti multipli e sono presentati come una deviazione standard media ± (SD) da tre repliche tecniche. p < 0,1 *, p < 0,05 **, p < 0,01 ***. (B) Variazioni di piega calcolate dividendo una luminescenza media ottenuta per la combinazione testata (RLU SAMPLE) per una luminescenza media ottenuta per il corrispondente controllo negativo (RLU CONTROL). Il valore soglia considerato indicativo di un'interazione è stato fissato a 10. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Interruzione specifica e dose-dipendente dell'interazione tra SLC35A2-LgBiT e SmBiT-SLC35A3 mediante co-espressione simultanea di varianti NST con tag HA. Le cellule HEK293T sono state trasfettate con plasmidi che codificano SLC35A2-LgBiT e SmBiT-SLC35A3 e, inoltre, con un plasmide pSelect vuoto (mock) o con quantità crescenti di plasmidi pSelect che codificano SLC35A2 (pannello di sinistra) e SLC35A3 (pannello di destra) con tag HA. I dati sono stati analizzati utilizzando ANOVA unidirezionale con confronti multipli e sono presentati come una deviazione standard media ± (SD) da tre repliche tecniche. p < 0,05 **, p < 0,001 ****. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: Risultati del test eseguito in cellule HEK293T per le combinazioni proteiche selezionate e i corrispondenti controlli negativi (dati grezzi). Vengono mostrati i valori di RLU non trasformati ottenuti per le combinazioni proteiche selezionate e i corrispondenti controlli negativi. Negativo, HaloTag taggato con SmBiT; PRKAR2A, subunità regolatoria della proteina chinasi tipo II-alfa cAPM-dipendente; PRKACA, subunità catalitica alfa della proteina chinasi cAPM-dipendente, TR, replica tecnica. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
Tabella 2: Interruzione specifica e dose-dipendente dell'interazione tra SLC35A2-LgBiT e SmBiT-SLC35A3 mediante co-espressione simultanea di varianti NST con tag HA (dati grezzi). Vengono mostrati i valori di RLU non trasformati ottenuti per le combinazioni proteiche selezionate. Mock, celle che esprimono SLC35A2-LgBiT e SmBiT-SLC35A3 co-trasfettate con un vettore pSelect vuoto; HA-SLC35A2, cellule che esprimono SLC35A2-LgBiT e SmBiT-SLC35A3 co-trasfettate con le quantità indicate di un plasmide pSelect che codifica per SLC35A2 taggato con l'epitopo HA al N-terminus; HA-SLC35A3, cellule che esprimono SLC35A2-LgBiT e SmBiT-SLC35A3 co-trasfettate con le quantità indicate di un plasmide pSelect che codifica per SLC35A3 taggato con l'epitopo HA al N-terminus; TR, replica tecnica. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
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Discussion
Qui forniamo un protocollo dettagliato che consente la dimostrazione di complessi eterologhi formati tra proteine di membrana di tipo III residenti a Golgi, come le NST, utilizzando il test di complementazione della luciferasi divisa. L'approccio proposto all'analisi e all'interpretazione dei dati prevede di mettere in relazione la luminescenza ottenuta per la combinazione proteica di interesse con la luminescenza ottenuta per la corrispondente combinazione di controllo, che è composta da una delle proteine di interesse fuse con il frammento più grande e la proteina di controllo di origine batterica fusa con il frammento più piccolo. Quest'ultimo è espresso nel citoplasma delle cellule di mammifero; pertanto, utilizzarlo come riferimento richiede che N- e/o C-termini delle proteine, la cui interazione è da analizzare, si trovino sul lato citoplasmatico della membrana di Golgi.
I passaggi critici nel protocollo sono la progettazione del plasmide, la placcatura delle cellule da trasfettare, la trasfezione stessa, lo scambio del mezzo, la preparazione della soluzione di lavoro furimazina e l'aggiunta alle cellule. Il design del plasmide dovrebbe essere realizzato in modo tale che entrambi i frammenti di luciferasi siano rivolti verso il citoplasma, altrimenti le combinazioni di controllo non funzioneranno e mancheranno i valori RLU di riferimento. Le cellule da trasfettare devono essere placcate come specificato nel protocollo, altrimenti l'efficienza di trasfezione potrebbe essere non ottimale. Si consiglia di utilizzare piastre multiwell con la superficie rivestita in poli-L-lisina per supportare l'attacco della cella durante lo scambio del mezzo. Infine, la soluzione di lavoro furimazina deve essere preparata al momento e immediatamente aggiunta alle cellule. Una volta aggiunto, la lettura dovrebbe essere eseguita il prima possibile.
Per evitare risultati inconcludenti, dovrebbero sempre essere inclusi controlli positivi e negativi. Il controllo positivo dovrebbe essere sempre impiegato in modo che l'efficienza della trasfezione sia monitorata. È molto importante che tutte le possibili proteine di fusione che sono topologicamente compatibili tra loro e con il controllo negativo basato su HaloTag siano generate e combinate. Se possibile, dovrebbe essere utilizzato il controllo negativo costituito da una proteina di membrana che non interagisce con nessuna delle proteine di interesse. Qui, non abbiamo impiegato un tale controllo, poiché il suo sviluppo è ancora in arrivo. Invece, abbiamo forzato uno smontaggio specifico dei complessi di interesse co-esprimendo una copia extra e senza tag di una delle proteine analizzate. I vettori di espressione che abbiamo usato portano il promotore relativamente debole del virus dell'herpes simplex-timidina chinasi (HSV-TK), che garantisce bassi livelli di espressione ottimali per ottenere risultati specifici. Tuttavia, nel caso di risultati non ottimali potrebbe essere utile utilizzare i vettori basati su CMV o, in alternativa, ottimizzare la quantità di plasmidi utilizzati per la trasfezione.
Il metodo presentato, sebbene potente e conveniente, presenta alcune limitazioni. In primo luogo, questo metodo non consente di concludere se i complessi identificati corrispondano a dimeri o oligomeri di ordine superiore. Inoltre, la localizzazione subcellulare delle proteine interagenti non può essere monitorata. Ciò è, tuttavia, possibile con l'estensione del protocollo di base con l'imaging bioluminescente, sebbene la risoluzione spaziale di tali immagini sarebbe significativamente inferiore rispetto agli approcci basati sulla fluorescenza.
Il metodo presentato è molto veloce ed efficiente (la misurazione richiede fino a diversi minuti e i dati sono ottenuti da migliaia di celle). Anche l'elaborazione e l'interpretazione dei dati sono relativamente semplici. È necessaria poca o nessuna ottimizzazione del protocollo di base. L'unica attrezzatura specifica richiesta è un luminometro. Il test di complementazione della luciferasi divisa e il BiFC lavorano sullo stesso principio essenziale, cioè la ricostituzione di una proteina funzionale dai suoi frammenti non funzionali. I vantaggi generali degli approcci basati sulla bioluminescenza rispetto a quelli basati sulla fluorescenza erano già elencati nell'introduzione. Un vantaggio specifico del test di complementazione della luciferasi divisa rispetto a BiFC è che il primo è completamente reversibile15. In BiFC, una volta ricostituita una proteina fluorescente, non si dissocierebbe di nuovo nei corrispondenti frammenti non fluorescenti17. Al contrario, l'assemblaggio delle subunità NanoLuc è reversibile, il che crea un'opportunità unica per studiare la dinamica degli PPI. Infine, l'eccezionale sensibilità del metodo presentato consente di presumere che questo approccio dovrebbe funzionare anche con le linee cellulari difficili da trasfettare.
Il protocollo qui presentato permette di determinare se le due proteine di membrana di tipo III residenti nel Golgi interagiscono. Come già accennato, la configurazione di base del metodo può essere accoppiata con l'imaging a bioluminescenza per confermare la localizzazione subcellulare del PPI di interesse. La reversibilità di questo test di complementazione della luciferasi divisa consente di studiare la dinamica degli IPP in tempo reale. Il segnale luminescente derivato dalla furimazina viene sostenuto per circa 2 ore. Tuttavia, sono disponibili anche substrati per il test di complementazione della luciferasi divisa che garantiscono una durata sostanzialmente più lunga (da ore a giorni) del segnale risultante. Questo metodo consente l'identificazione dei fattori che attivano o impediscono il PPI di interesse. Alcuni degli esempi più recenti della sua applicazione includono studi sulle interazioni tra proteine G e recettori accoppiati alla proteina G18, cambiamenti conformazionali proteici19, ubiquitinazione proteica20, internalizzazione dei recettori della superficie cellulare21 e identificazione di fattori che modulano gli IPP22,23. Pertanto, questo metodo sembra essere uno strumento versatile con un alto potenziale per soddisfare anche obiettivi sperimentali molto impegnativi.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione n. 2016/23/D/NZ3/01314 del National Science Centre (NCN), Cracovia, Polonia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin-EDTA solution | |||
| Adherent mammalian cell line | |||
| BioCoat Poly-D-Lysine 96-well White/Clear Flat Bottom TC-treated Microplate, with Lid | Corning | 356651 | |
| Cell culture centrifuge | |||
| Cell culture supplements (heat-inactivated fetal bovine serum, L-glutamine, penicillin, streptamycin) | |||
| CO2 incubator | |||
| Expression plasmids encoding protein(s) of interest not tagged with NanoBiT fragments | |||
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| GloMax Discover Microplate Reader (or a different luminescence microplate reader) | Promega | GM3000 | |
| Growth medium dedicated to the cell line used | |||
| Materials and reagents for standard molecular cloning (bacteria, thermostable polymerase, restriction enzymes, DNA ligase, materials and reagents for nucleic acid purification) | |||
| NanoBiT MCS Starter System | Promega | N2014 | This kit contains vectors enabling tagging of the proteins of interest with NanoBiT fragments at different orientations as well as the control plasmid encoding HaloTag protein fused with SmBiT and a positive control plasmid pair. |
| Nano-Glo Live Cell Assay System | Promega | N2011 | This kit contains furimazine, which is a substrate enabling detection of the NanoLuc activity in living cells, and a dedicated dilution buffer. |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium, no phenol red | Gibco | 11058021 | |
| Oribital shaker | |||
| Software for data analysis (e.g. GraphPad Prism) | |||
| Thermocycler |
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