Summary
Burada sunulan protokol, bölünmüş lusiferaz kompleman testinin en son varyantını kullanarak, canlı memeli hücrelerinde sitoplazmik olarak maruz kalan N- ve / veya C-termini ile Golgi-yerleşik tip III membran proteinleri arasındaki heterolog etkileşimlerin oluşumunu göstermeyi amaçlamaktadır.
Abstract
Bu protokolün amacı, nükleotid şeker taşıyıcıları (NST'ler) tarafından oluşturulan heterolog kompleksleri göstermek için bölünmüş lusiferaz komplemansiyonunun en son varyantının uygulanabilirliğini araştırmaktır. Bu ER ve Golgi'de yerleşik multitransmembran proteinleri, substratlarıyla glikozilasyona aracılık eden enzimleri sağlamak için sitoplazmik olarak sentezlenmiş nükleotid şekerlerini organel membranları boyunca taşır. NST'ler dimerler ve / veya daha yüksek oligomerler olarak bulunur. Farklı NST'ler arasındaki heterolog etkileşimler de bildirilmiştir. Tekniğin NST heteromerizasyonu fenomenini incelemek için uygun olup olmadığını doğrulamak için, daha önce birkaç başka yolla ilişkili olduğu gösterilen iki Golgi'de yerleşik NST'nin bir kombinasyonuna karşı test ettik. Lusiferaz kompleman testi, Golgi'de yerleşik membran proteinleri arasındaki etkileşimleri incelemek için özellikle uygun görünmektedir, çünkü genellikle protein yanlış lokalizasyonunu tetikleyen ve yanlış pozitif riskini artıran yüksek ekspresyon seviyeleri gerektirmez.
Introduction
Bu makalede, bölünmüş lusiferaz kompleman testinin en son varyantını kullanarak, geçici olarak transfekte edilmiş insan hücrelerinde Golgi'de yerleşik tip III membran proteinleri arasındaki heterolog etkileşimlerin varlığını kontrol etmek için adım adım bir protokol açıklanmaktadır. Prosedür, nükleotid şeker taşıyıcılarına (NST'ler) karşı en kapsamlı şekilde test edilmiştir, ancak N- ve / veya C-termini sitoplazmaya bakan diğer Golgi-yerleşik tip III membran proteinleri için de olumlu sonuçlar elde edebildik.
Araştırma grubumuz, NST'lerin makromoleküllerin glikozilasyonundaki rolünü araştırmaktadır. NST'ler, organellar membranın sitoplazmik tarafına bakan N- ve C-termini ile Golgi ve/veya ER'de yerleşik tip III membran proteinleridir1. NST'lerin, glikoziltransferazları substratlarıyla beslemek için nükleotid ile aktive olmuş şekerleri organel zarları boyunca taşıdığı düşünülmektedir. NST'ler dimerler ve / veya daha yüksek oligomerler oluşturur2,3,4,5,6,7,8,9,10. Ayrıca, farklı NST'ler arasındaki heterolog etkileşimler de bildirilmiştir6,11. NST'lerin fonksiyonel olarak ilişkili glikozilasyon enzimleri ile kompleksler oluşturduğu da gösterilmiştir12,13,14. NST'lerin ve fonksiyonel olarak ilişkili Golgi'de yerleşik proteinlerin etkileşimlerini incelemek için günümüzde kullanılan floresan ömür boyu görüntüleme (FLIM) tabanlı FRET yaklaşımına bir alternatif aradık, bu yüzden bölünmüş lusiferaz kompleman testini test etmeye karar verdik. Bir NST ile fonksiyonel olarak ilişkili bir glikozilasyon enzimi arasındaki yeni bir etkileşimi tanımlamamızı sağladı9.
Bölünmüş lusiferaz kompleman testinin en son modifikasyonu olan NanoBiT, burada sunulan protokolde kullanılmaktadır15. Lusiferaz enziminin (örneğin, NanoLuc) iki parçadan yeniden yapılandırılmasına dayanır - büyük BiT veya LgBiT olarak adlandırılan büyük olanı, 17.6 kDa'lık bir protein ve küçük BiT veya SmBiT olarak adlandırılan sadece 11 amino asitten oluşan küçük olanı. İlgilenilen iki protein, tamamlayıcı parçalarla kaynaştırılır ve geçici olarak bir insan hücre hattında ifade edilir. İki füzyon proteini etkileşime girerse, hücre geçirgen bir substratın eklenmesiyle in situ olarak bir lüminesans üretilir. Bu iki parça, kaynaştıkları ilgili proteinler arasındaki bir etkileşimle bir araya getirilmedikleri sürece minimum afinite ile ilişkilendirilmeleri için optimize edilmiştir.
Genel olarak, biyolüminesans bazlı yöntemlerin floresan bazlı yöntemlere göre bazı avantajları vardır. Biyolüminesan sinyaller daha yüksek bir sinyal-gürültü oranına sahiptir, çünkü arka plan lüminesansı lusiferaz kaynaklı sinyale kıyasla ihmal edilebilir16. Buna karşılık, floresan temelli yaklaşımlar genellikle otofloresan fenomeninin neden olduğu nispeten yüksek bir arka plandan muzdariptir. Ayrıca, biyolüminesans, analiz edilen hücrelere floresandan daha az zararlıdır, çünkü eski durumda numuneyi uyarmaya gerek yoktur. Bu nedenlerden dolayı, PPI'ları in vivo olarak incelemeye yönelik biyolüminesan yaklaşımlar, Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) veya Bimoleküler Floresan Tamamlama (BiFC) gibi yaygın olarak kullanılan floresan yöntemlerden daha fazladır.
Protokolümüz, ilgilenilen protein kombinasyonu için elde edilen lüminesansı, kontrol kombinasyonu için elde edilen lüminesansa yönlendirmeye dayanmaktadır. İkincisi, daha büyük bir parça ile kaynaşmış test edilen proteinlerden birini ve daha küçük bir parça ile kaynaşmış bir kontrol proteinini (örneğin, HaloTag) içerir. İkincisi, memeli proteinlerinin hiçbiriyle etkileşime girmesi beklenmeyen bakteriyel kökenli bir proteindir. Bu proteini bir kontrol olarak kullanmak, analiz edilecek Golgi'de yaşayan protein çiftlerinin topolojisinde sınırlamalar getirir. Memeli hücrelerinde bu protein sitoplazmada sentezlendiğinden, ilgilenilen her iki proteinin de en az bir sitoplazmik kuyruğu olmalıdır.
Bu yaklaşım, ÜFE'lerin ilk taraması için özellikle yararlı olabilir. İlgilenilen füzyon proteinleri, uygulanacak diğer yaklaşımlar için yetersiz olan seviyelerde ifade edildiğinde tercih edilen yöntem haline gelebilir. Benzer şekilde, bölünmüş lusiferaz kompleman testi, ilgili proteinler yüksek seviyelerde eksprese edilirse en iyi seçenek olabilir, ancak bu, hücre altı lokalizasyonlarını olumsuz yönde etkiler veya spesifik olmayan etkileşimleri zorladığı bilinmektedir. Daha küçük fragman sadece 11 amino aside sahip olduğundan, daha büyük etiketler kullanıldığında bölünmüş lusiferaz kompleman testi uygulanabilir. Son olarak, burada sunulan durumda olduğu gibi, diğer teknikler kullanılarak elde edilen verileri daha fazla doğrulamak için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. İfade plazmidlerinin oluşturulması
- Bir topoloji tahmin aracı kullanarak ilgilenilen proteinlerin membran topolojisini inceleyin.
- Klonlama stratejisini, füzyon proteinleri Golgi membranlarına yerleştirildikten sonra daha büyük ve daha küçük fragmanların sitoplazmaya bakacağı şekilde tasarlayın. Burada sunulan örnekte olduğu gibi, ilgili proteinlerin hem N- hem de C-termini sitoplazmik olarak yönlendirilmişse, proteinleri sekiz olası şekilde etiketleyin (bkz. Şekil 1B). İlgilenilen proteinlerden birinin veya her ikisinin N- veya C-terminusu ışığa yönelikse, etiketlemeyi hariç tutun.
- Standart klonlama protokollerini izleyerek ilgilenilen genleri uygun ekspresyon vektörlerine (bakınız Malzeme Tablosu) alt klonlayın.
NOT: Bazı etiketleme seçenekleri yetersiz yakınlık, yetersiz yönlendirme veya uzamsal kısıtlamalar nedeniyle çalışmayabileceğinden, tüm olası yönlendirmelerin sınanması önerilir.
2. Plazmidlerin ekspresyonunun hücrelere geçici transfeksiyonu
- Yapışkan HEK293T hücre kültürünü tripsinizasyon ile toplayın ve hücreleri özel bir tam büyüme ortamında yeniden askıya alın. Hücreleri (2 x 104/100 μL/kuyu) şeffaf bir alt, beyaz tarafı 96 delikli bir plakaya yerleştirin. Toplam kuyu sayısını, replikalar da dahil olmak üzere test edilen tüm kombinasyonlara ve kontrollere uyacak şekilde ayarlayın.
NOT: Termal kaymaları en aza indirmek ve gece boyunca buharlaşmayı önlemek için plakanın yalnızca iç 60 kuyusunu kullanmaya çalışın. Malzeme Tablosunda belirtilenler gibi poli-D-lizin kaplı plakaların kullanılması şiddetle tavsiye edilir, aksi takdirde sonraki yıkama adımları sırasında hücreler ayrılabilir. - Hücreleri standart koşullarda (37 °C, %5 CO2) gece boyunca kültüre alın.
- Ertesi gün, 1.1 numaralı maddede elde edilen ekspresyon plazmidlerinin istenen kombinasyonları ile hücreleri transfekte edin.
- İfade plazmidlerini serumsuz bir ortamda seyreltin (bakınız Malzeme Tablosu) her yapı için 6.25 ng / μL'ye kadar.
- Lipid bazlı transfeksiyon reaktifini uygun bir lipit-DNA oranında ekleyin ve üreticinin talimatına göre inkübe edin.
- Belirlenen kuyucuklara 8 μL lipid: DNA karışımı ekleyin. Plakanın içeriğini nazik bir dönüşle karıştırın. Bu, her iki ekspresyon yapısının 50 ng / kuyucukta transfeksiyonu ile sonuçlanır.
- Standart koşullarda hücreleri 20-24 saat kültürleyin (37 °C, %5 CO2).
NOT: Hücrelerin daha uzun süre kültürlenmesi, fragmanlar arasında spesifik olmayan bir ilişkiyi teşvik edebilecek daha yüksek füzyon protein ekspresyonu seviyelerine neden olabilir.
3. Orta değişim
- Ertesi gün, şartlandırılmış ortamı her bir kuyucukta 100 μL serumsuz bir ortamla değiştirin. Hücrelerin orta değişimde ayrılmadığından emin olun.
NOT: Bu adım, furimazin çalışma çözeltisinin eklenmesinden 2-3 saat önce yapılmalıdır. Serum yoksunluğu, furimazinin otolüminesansının neden olduğu arka planı en aza indirir.
4. Furimazin çalışma çözeltisinin hazırlanması
- Ölçümden hemen önce, 1 hacim furimazini 19 hacimlik bir seyreltme tamponu (20 katlı seyreltme) ile karıştırın.
NOT: Hazırlanacak furimazin çalışma çözeltisinin toplam hacmi, analiz edilecek bireysel kuyucukların sayısına bağlıdır (furimazin çalışma çözeltisi, hücre kültürü ortamına 1: 5 oranında eklenir, bu nedenle, daha önce 100 μL serumsuz bir ortam ile doldurulmuş her bir kuyucuğa, furimazin çalışma çözeltisinin 25 μL'si eklenmelidir). - Furimazin çalışma solüsyonunu belirlenmiş kuyucuklara (25 μL/kuyu) ekleyin. Plakayı elle veya yörüngesel bir çalkalayıcı kullanarak yavaşça karıştırın (örneğin, 300-500 rpm'de 15 sn).
5. Lüminesans ölçümü
- Plakayı bir lüminesans mikroplaka okuyucusuna yerleştirin.
- 37 ° C'de yapılacak deneyler için plakayı belirtilen sıcaklıkta 10-15 dakika dengeleyin.
- Analiz edilecek kuyuları seçin.
- 0,3 sn entegrasyon süresi ile ışıltıyı okuyun. Gerektiğinde 2 saate kadar parlaklığı izlemeye devam edin.
6. Veri analizi
- Test edilen ve kontrol edilen tüm kombinasyonlar için ortalama değerleri ve standart sapmaları hesaplayın.
- Birden fazla karşılaştırmayla tek yönlü ANOVA kullanarak verileri analiz edin.
- Faiz kombinasyonları için elde edilen ortalama bir lüminesansı, karşılık gelen negatif kontroller için elde edilen ortalama bir lüminesansa bölerek katlama değişim değerlerini hesaplayın. Sonuçları değerlendirin.
NOT: Burada önerilen veri analizine yaklaşım, test edilen kombinasyon için elde edilen lüminesansın, karşılık gelen kontrol kombinasyonu için elde edilen lüminesanstan istatistiksel olarak anlamlı derecede yüksek olması ve aynı zamanda bu iki değerin oranının 10'u aşması durumunda etkileşimin talep edilebileceğini varsayar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu yaklaşımda en güvenilir verileri elde etmek için tüm olası kombinasyonlar test edilmelidir (bkz. Şekil 1). Paralel olarak, pozitif ve negatif kontroller dahil edilmelidir. Pozitif kontrol, etkileşime girdiği bilinen iki proteinden oluşmalıdır, bunlardan biri daha büyük parça ile kaynaştırılır ve diğeri daha küçük parça ile kaynaştırılır. Negatif kontrol ideal olarak, aynı şekilde etiketlenmiş iki etkileşimsiz tip III membran proteininden oluşmalıdır. Bununla birlikte, böyle bir kontrolün kurulması zor olabilir, çünkü iki kontrol proteininin etkileşiminin olmaması, birkaç alternatif yaklaşım kullanılarak iyice doğrulanmalıdır. Bu nedenle, etkileşimi belirlenecek proteinlerin N- ve/veya C-termini'nin burada sunulan durumda olduğu gibi sitoplazmik olarak maruz kalması durumunda, negatif kontrol olarak, herhangi bir insan proteini (örneğin, HaloTag) ile etkileşime girmesi beklenmeyen insan kökenli olmayan bir sitozolik protein kullanılabilir. Bu tür bir kontrol kullanılarak elde edilen sonuçların, ilgili proteinlerden herhangi birinin etiketlenmemiş varyantlarının karşılık gelen plazmidlerin titrasyonuyla birlikte ifade edilmesiyle birlikte ek bir şekilde doğrulanmasını şiddetle tavsiye ederiz. İki protein spesifik olarak etkileşime girerse, bunlardan herhangi birinin lusiferaz fragmanından yoksun ekstra bir kopyası, lüminesansta spesifik bir azalmaya neden olmalıdır.
Pozitif ve negatif kombinasyonlara özgü bağıl lüminesans birimleri (RLU) değerleri Tablo 1'de listelenmiştir. Sonuçlar, ko-immünopresipitasyon ve FLIM-FRET6 ile ilişkili olduğu gösterilen iki NST, SLC35A2 ve SLC35A3 için elde edildi ve ayrıca in situ proximity ligasyon testi11. Hem SLC35A2 hem de SLC35A3, sitoplazmaya bakan N- ve C-termini ile Golgi-yerleşik tip III membran proteinleridir (Şekil 1A). Bu nedenle, sekiz olası etiketleme seçeneği vardır ve ortaya çıkan füzyon proteinleri de sekiz olası şekilde bir araya getirilebilir (Şekil 1B). Test edilen ve kontrol edilen tüm kombinasyonlara karşılık gelen ortalama RLU değerleri Şekil 2A'da gösterilmiştir. Pozitif kontrol de dahildir. Seçilen bir sonucun bir etkileşimin göstergesi olarak kabul edilmesi için ilk gereklilik, ilgi kombinasyonu için elde edilen RLU değerinin, karşılık gelen kontrol kombinasyonu için elde edilen RLU değerinden istatistiksel olarak anlamlı derecede yüksek olmasıdır. Şekil 2A'da bu tür üç kombinasyon görülmektedir (LgBiT-SLC35A2 + SLC35A3-SmBiT, SmBiT-SLC35A2 + LgBiT-SLC35A3 ve SLC35A2-SmBiT + LgBiT-SLC35A3). Sonuçların analizinde bir sonraki adım, karşılık gelen RLU değerlerinin ilgili kontroller için elde edilen RLU değerlerine bölünmesiyle ilgili kombinasyonlar için oran değerlerinin elde edilmesini içerir. Bu tür analizlerin sonuçları Şekil 2B'de gösterilmiştir. Üreticinin önerilerine göre, 10 ile 1000 arasındaki oranlar, belirli etkileşimlerin göstergesidir. Bu kriterleri karşılayan iki kombinasyon vardır (SmBiT-SLC35A2 + LgBiT-SLC35A3 ve SLC35A2-SmBiT + LgBiT-SLC35A3) ve SLC35A2 ve SLC35A3'ün etkileşime girdiği fikrini destekler. Bununla birlikte, diğer altı kombinasyonun negatif olması, ilgili füzyon proteinleri arasında hiçbir etkileşim olmadığı anlamına gelmez, bunun yerine etiketleme stratejisinin bu durumlarda optimal olmadığını göstermektedir. Bu örnek, tüm olası kombinasyonları test etmenin ne kadar önemli olduğunu gösterir.
Şekil 2'de sunulan veriler ayrıca, HA etiketli SLC35A2 veya SLC35A3'ün, en yüksek göreceli lüminesansla, yani SLC35A2-LgBiT + SmBiT-SLC35A3 ile sonuçlanan kombinasyonla birlikte ekspresyonu ile doğrulanmıştır. Ko-transfeksiyon için HA-etiketli NST varyantlarını kodlayan plazmidlerin değişen miktarları kullanıldı. Bu, RLU değerlerinde istatistiksel olarak anlamlı, doza bağlı bir azalmaya neden oldu (Şekil 3). SLC35A2-LgBiT ve SmBiT-SLC35A3 arasındaki etkileşimin, HA etiketli NST varyantlarının eşzamanlı birlikte ekspresyonu ile spesifik ve doza bağlı bozulması Tablo 2'de gösterilmiştir.
Burada sunulan yöntemle ilişkili en yaygın sorun, transfeksiyonun zayıf verimliliğidir. Bunun optimal olmayan sonuçların nedeni olup olmadığını doğrulamak için, tüm deneylere pozitif kontrol ekleyin. Burada sunulan verileri elde etmek için kullandığımız pozitif kontrol, birbiriyle etkileşime giren iki füzyon proteininden oluşur: cAPM'ye bağımlı protein kinaz katalitik alt birim alfa (PRKACA), daha küçük fragmanla kaynaşmış ve cAPM'ye bağımlı protein kinaz tip II-alfa düzenleyici alt birim (PRKAR2A) daha büyük fragmanla kaynaşmıştır. Ellerimizde, karşılık gelen RLU değeri ~ 6 x 105'e ulaştı. Bu sayıdaki önemli bir düşüş (2-3 büyüklük sırası) gerçekleştirilen transfeksiyonun optimal olmayan etkinliğinin göstergesi olabilir. Böyle bir durumda, kültürlenmiş hücrelerin refahını kontrol etmenizi ve uygun sayıda hücrenin transfeksiyon için kaplandığından emin olmanızı öneririz.
Resim 1: Membran topolojisi ve etiketleme şemaları. (A) SLC35A2 ve SLC35A3 proteinlerinin membran topolojisi. (B) SLC35A2 ve SLC35A3 proteinlerini bölünmüş lusiferaz kompleman testi fragmanları ile etiketleme ve elde edilen füzyon proteinlerini tahlil için birleştirme olanakları. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Seçilen protein kombinasyonları ve buna karşılık gelen negatif kontroller (işlenmiş veriler) için HEK293T hücrelerinde yapılan bölünmüş lusiferaz kompleman testinin sonuçları. (A) Seçilen protein kombinasyonları ve buna karşılık gelen negatif kontroller için elde edilen RLU değerleri. Negatif, SmBiT ile etiketlenmiş HaloTag; PRKAR2A, cAPM'ye bağımlı protein kinaz tip II-alfa düzenleyici alt birim; PRKACA, cAPM'ye bağımlı protein kinaz katalitik alt birim alfa. Veriler tek yönlü ANOVA kullanılarak çoklu karşılaştırmalarla analiz edilmiş ve üç teknik kopyadan ortalama ± standart sapma (SD) olarak sunulmuştur. p < 0,1 *, p < 0,05 **, p < 0,01 ***. (B) Test edilen kombinasyon (RLU SAMPLE) için elde edilen ortalama bir lüminesansın, karşılık gelen negatif kontrol (RLU CONTROL) için elde edilen ortalama bir lüminesansa bölünmesiyle hesaplanan katlama değişiklikleri. Bir etkileşimin göstergesi olarak kabul edilen eşik değeri 10 olarak belirlenmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: SLC35A2-LgBiT ve SmBiT-SLC35A3 arasındaki etkileşimin, HA etiketli NST varyantlarının eşzamanlı birlikte ekspresyonu ile spesifik ve doza bağlı olarak bozulması. HEK293T hücreleri, SLC35A2-LgBiT ve SmBiT-SLC35A3 kodlayan plazmidlerle ve ayrıca boş bir pSelect plazmidiyle (alay) veya HA etiketli SLC35A2 (sol panel) ve SLC35A3'ü (sağ panel) kodlayan artan miktarda pSelect plazmidiyle transfekte edildi. Veriler tek yönlü ANOVA kullanılarak çoklu karşılaştırmalarla analiz edilmiş ve üç teknik kopyadan ortalama ± standart sapma (SD) olarak sunulmuştur. p < 0,05 **, p < 0,001 ****. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1: Seçilen protein kombinasyonları ve buna karşılık gelen negatif kontroller (ham veriler) için HEK293T hücrelerinde yapılan tahlilin sonuçları. Seçilen protein kombinasyonları için elde edilen işlenmemiş RLU değerleri ve buna karşılık gelen negatif kontroller gösterilir. Negatif, SmBiT ile etiketlenmiş HaloTag; PRKAR2A, cAPM'ye bağımlı protein kinaz tip II-alfa düzenleyici alt birim; PRKACA, cAPM'ye bağımlı protein kinaz katalitik alt birimi alfa, TR, teknik replikasyon. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Tablo 2: SLC35A2-LgBiT ve SmBiT-SLC35A3 arasındaki etkileşimin, HA etiketli NST varyantlarının eşzamanlı birlikte ekspresyonu ile spesifik ve doza bağlı olarak bozulması (ham veriler). Seçilen protein kombinasyonları için elde edilen işlenmemiş RLU değerleri gösterilmiştir. Mock, SLC35A2-LgBiT ve SmBiT-SLC35A3 eksprese eden hücreler boş bir pSelect vektörü ile birlikte transfekte edilir; HA-SLC35A2, SLC35A2-LgBiT ve SmBiT-SLC35A3'ü eksprese eden hücreler, N-terminusunda HA epitopu ile etiketlenmiş SLC35A2 kodlu bir pSelect plazmidinin belirtilen miktarlarıyla birlikte transfekte edilir; HA-SLC35A3, SLC35A2-LgBiT ve SmBiT-SLC35A3'ü eksprese eden hücreler, N-terminusunda HA epitopu ile etiketlenmiş SLC35A3 kodlu bir pSelect plazmid kodlamasının belirtilen miktarlarıyla birlikte transfekte edilir; TR, teknik çoğaltma. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, bölünmüş lusiferaz kompleman testi kullanılarak NST'ler gibi Golgi'de yerleşik tip III membran proteinleri arasında oluşan heterolog komplekslerin gösterilmesini sağlayan ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Veri analizi ve yorumlanması için önerilen yaklaşım, ilgilenilen protein kombinasyonu için elde edilen lüminesansın, daha büyük parça ile kaynaşmış ilgili proteinlerden birinden ve daha küçük parça ile kaynaşmış bir bakteri kökenli kontrol proteininden oluşan karşılık gelen kontrol kombinasyonu için elde edilen lüminesans ile ilişkilendirilmesini içerir. İkincisi, memeli hücrelerinin sitoplazmasında eksprese edilir; bu nedenle, referans olarak kullanmak, etkileşimi analiz edilecek proteinlerin N- ve / veya C-termini'sinin Golgi zarının sitoplazmik tarafında olmasını gerektirir.
Protokoldeki kritik adımlar plazmid tasarımı, transfekte edilecek hücrelerin kaplanması, transfeksiyonun kendisi, ortam değişimi, furimazin çalışma çözeltisinin hazırlanması ve hücrelere eklenmesidir. Plazmid tasarımı, her iki lusiferaz fragmanı sitoplazmaya bakacak şekilde yapılmalıdır, aksi takdirde kontrol kombinasyonları çalışmaz ve referans RLU değerleri eksik olur. Transfekte edilecek hücreler protokolde belirtildiği gibi kaplanmalıdır, aksi takdirde transfeksiyon etkinliği yetersiz olabilir. Ortam değiştirilirken hücre bağlantısını desteklemek için poli-L-lizin kaplı yüzeye sahip çok kuyulu plakalar kullanmanızı öneririz. Son olarak, furimazin çalışma çözeltisi taze olarak hazırlanmalı ve hemen hücrelere eklenmelidir. Eklendikten sonra, okuma mümkün olan en kısa sürede yapılmalıdır.
Sonuçsuz sonuçlardan kaçınmak için, olumlu ve olumsuz kontroller her zaman dahil edilmelidir. Transfeksiyon verimliliğinin izlenmesi için pozitif kontrol her zaman kullanılmalıdır. Topolojik olarak birbirleriyle ve HaloTag tabanlı negatif kontrolle uyumlu tüm olası füzyon proteinlerinin üretilmesi ve birleştirilmesi çok önemlidir. Mümkünse, ilgilenilen proteinlerden herhangi biriyle etkileşime girmeyen bir membran proteininden oluşan negatif kontrol kullanılmalıdır. Burada, gelişimi hala yolda olduğu için böyle bir kontrol uygulamadık. Bunun yerine, analiz edilen proteinlerden birinin ekstra, etiketsiz bir kopyasını birlikte ifade ederek ilgilenilen komplekslerin belirli bir sökülmesini zorladık. Kullandığımız ekspresyon vektörleri, spesifik sonuç elde etmek için en uygun olan düşük ekspresyon seviyelerini sağlayan nispeten zayıf herpes simpleks virüsü-timidin kinaz (HSV-TK) promotörünü taşır. Bununla birlikte, optimal olmayan sonuçlar durumunda, CMV tabanlı vektörleri kullanmak veya alternatif olarak, transfeksiyon için kullanılan plazmid miktarını optimize etmek yararlı olabilir.
Sunulan yöntem, güçlü ve kullanışlı olmasına rağmen, bazı sınırlamalara sahiptir. İlk olarak, bu yöntem, tanımlanan komplekslerin dimerlere mi yoksa daha yüksek dereceli oligomerlere mi karşılık geldiği sonucuna varılmasına izin vermez. Ayrıca, etkileşen proteinlerin hücre altı lokalizasyonu izlenemez. Bununla birlikte, bu, temel protokolün biyolüminesan görüntüleme ile genişletilmesi üzerine mümkündür, ancak bu tür görüntülerin uzamsal çözünürlüğü, floresan tabanlı yaklaşımlarla karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha düşük olacaktır.
Sunulan yöntem çok hızlı ve verimlidir (ölçüm birkaç dakika sürer ve veriler binlerce hücreden elde edilir). Veri işleme ve yorumlama da nispeten basittir. Temel protokolün optimizasyonu çok az veya hiç gerekli değildir. Gerekli tek özel ekipman bir luminometredir. Bölünmüş lusiferaz kompleman testi ve BiFC aynı temel prensip üzerinde çalışır, yani fonksiyonel olmayan fragmanlarından fonksiyonel bir proteinin yeniden sulandırılması. Biyolüminesans temelli yaklaşımların floresana dayalı yaklaşımlara göre genel avantajları Giriş'te listelenmiştir. BiFC üzerindeki bölünmüş lusiferaz kompleman testinin özel bir avantajı, birincisinin tamamen geri dönüşümlü olmasıdır15. BiFC'de, bir floresan proteini yeniden yapılandırıldıktan sonra, karşılık gelen floresan olmayan parçalara geri ayrılmaz17. Buna karşılık, NanoLuc alt birimlerinin montajı geri dönüşümlüdür, bu da ÜFE'lerin dinamiklerini incelemek için eşsiz bir fırsat yaratır. Son olarak, sunulan yöntemin istisnai duyarlılığı, bu yaklaşımın dönüştürülmesi zor olan hücre çizgileriyle bile çalışması gerektiğini varsaymaya izin verir.
Burada sunulan protokol, iki Golgi'de yerleşik tip III membran proteininin etkileşime girip girmediğini belirlemeye izin verir. Daha önce de belirtildiği gibi, yöntemin temel kurulumu, ilgilenilen PPI'nın hücre altı lokalizasyonunu doğrulamak için biyolüminesans görüntüleme ile birleştirilebilir. Bu bölünmüş lusiferaz kompleman testinin tersine çevrilebilirliği, ÜFE'lerin dinamiklerini gerçek zamanlı olarak incelemeye izin verir. Furimazinden türetilen ışıldayan sinyal yaklaşık 2 saat boyunca sürdürülür. Bununla birlikte, ortaya çıkan sinyalin önemli ölçüde daha uzun (saatler ila günler) bir süre olmasını sağlayan bölünmüş lusiferaz kompleman testi için substratlar da mevcuttur. Bu yöntem, ilgilenilen ÜFE'yi tetikleyen veya önleyen faktörlerin belirlenmesini sağlar. Uygulamasının en son örneklerinden bazıları, G proteinleri ve G-proteini ile eşleşmiş reseptörler18, protein konformasyonel değişiklikleri19, protein ubikitinasyonu20, hücre yüzey reseptörlerinin içselleştirilmesi21 ve PPI'ları modüle eden faktörlerin tanımlanması22,23 arasındaki etkileşimler üzerine yapılan çalışmaları içerir. Bu nedenle, bu yöntem çok zorlu deneysel hedefleri bile yerine getirme potansiyeli yüksek olan çok yönlü bir araç gibi görünmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma, Polonya'nın Krakow kentindeki Ulusal Bilim Merkezi'nden (NCN) 2016/23/D/NZ3/01314 no'lu hibe ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin-EDTA solution | |||
| Adherent mammalian cell line | |||
| BioCoat Poly-D-Lysine 96-well White/Clear Flat Bottom TC-treated Microplate, with Lid | Corning | 356651 | |
| Cell culture centrifuge | |||
| Cell culture supplements (heat-inactivated fetal bovine serum, L-glutamine, penicillin, streptamycin) | |||
| CO2 incubator | |||
| Expression plasmids encoding protein(s) of interest not tagged with NanoBiT fragments | |||
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| GloMax Discover Microplate Reader (or a different luminescence microplate reader) | Promega | GM3000 | |
| Growth medium dedicated to the cell line used | |||
| Materials and reagents for standard molecular cloning (bacteria, thermostable polymerase, restriction enzymes, DNA ligase, materials and reagents for nucleic acid purification) | |||
| NanoBiT MCS Starter System | Promega | N2014 | This kit contains vectors enabling tagging of the proteins of interest with NanoBiT fragments at different orientations as well as the control plasmid encoding HaloTag protein fused with SmBiT and a positive control plasmid pair. |
| Nano-Glo Live Cell Assay System | Promega | N2011 | This kit contains furimazine, which is a substrate enabling detection of the NanoLuc activity in living cells, and a dedicated dilution buffer. |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium, no phenol red | Gibco | 11058021 | |
| Oribital shaker | |||
| Software for data analysis (e.g. GraphPad Prism) | |||
| Thermocycler |
References
- Hadley, B., et al. Structure and function of nucleotide sugar transporters: Current progress. Computational and Structural Biotechnology Journal. 10 (16), 23-32 (2014).
- Puglielli, L., Hirschberg, C. B. Reconstitution, identification, and purification of the rat liver Golgi membrane GDP-fucose transporter. Journal of Biological Chemistry. 274 (50), 35596-35600 (1999).
- Puglielli, L., Mandon, E. C., Rancour, D. M., Menon, A. K., Hirschberg, C. B. Identification and purification of the rat liver Golgi membrane UDP-N-acetylgalactosamine transporter. Journal of Biological Chemistry. 274 (7), 4474-4479 (1999).
- Gao, X., Dean, N. Distinct protein domains of the yeast Golgi GDP-mannose transporter mediate oligomer assembly and export from the endoplasmic reticulum. Journal of Biological Chemistry. 275 (23), 17718-17727 (2000).
- Olczak, M., Guillen, E. Characterization of a mutation and an alternative splicing of UDP-galactose transporter in MDCK-RCAr cell line. Biochimica et Biophysica Acta. 1763 (1), 82-92 (2006).
- Maszczak-Seneczko, D., Sosicka, P., Majkowski, M., Olczak, T., Olczak, M. UDP-N-acetylglucosamine transporter and UDP-galactose transporter form heterologous complexes in the Golgi membrane. FEBS Letters. 586 (23), 4082-4087 (2012).
- Nji, E., Gulati, A., Qureshi, A. A., Coincon, M., Drew, D. Structural basis for the delivery of activated sialic acid into Golgi for sialyation. Nature Structural and Molecular Biology. 26 (6), 415-423 (2019).
- Parker, J. L., Corey, R. A., Stansfeld, P. J., Newstead, S. Structural basis for substrate specificity and regulation of nucleotide sugar transporters in the lipid bilayer. Nature Communications. 10 (1), 4657 (2019).
- Wiertelak, W., Sosicka, P., Olczak, M., Maszczak-Seneczko, D. Analysis of homologous and heterologous interactions between UDP-galactose transporter and beta-1,4-galactosyltransferase 1 using NanoBiT. Analytical Biochemistry. 593, 113599 (2020).
- Hong, K., Ma, D., Beverley, S. M., Turco, S. J. The Leishmania GDP-mannose transporter is an autonomous, multi-specific, hexameric complex of LPG2 subunits. Biochemistry. 39 (8), 2013-2022 (2000).
- Sosicka, P., et al. An insight into the orphan nucleotide sugar transporter SLC35A4. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1864 (5), 825-838 (2017).
- Sprong, H., et al. Association of the Golgi UDP-galactose transporter with UDP-galactose:ceramide galactosyltransferase allows UDP-galactose import in the endoplasmic reticulum. Molecular Biology of the Cell. 14 (8), 3482-3493 (2003).
- Maszczak-Seneczko, D., et al. UDP-galactose (SLC35A2) and UDP-N-acetylglucosamine (SLC35A3) Transporters Form Glycosylation-related Complexes with Mannoside Acetylglucosaminyltransferases (Mgats). Journal of Biological Chemistry. 290 (25), 15475-15486 (2015).
- Khoder-Agha, F., et al. N-acetylglucosaminyltransferases and nucleotide sugar transporters form multi-enzyme-multi-transporter assemblies in golgi membranes in vivo. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (9), 1821-1832 (2019).
- Dixon, A. S., et al. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).
- Tung, J. K., Berglund, K., Gutekunst, C. -A., Hochgeschwender, U., Gross, R. E. Bioluminescence imaging in live cells and animals. Neurophotonics. 3 (2), 025001 (2016).
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Molecular Cell. 9 (4), 789-798 (2002).
- Inoue, A., et al. Illuminating G-Protein-Coupling Selectivity of GPCRs. Cell. 177 (7), 1933-1947 (2019).
- White, C. W., Caspar, B., Vanyai, H. K., Pfleger, K. D. G., Hill, S. J. CRISPR-Mediated Protein Tagging with Nanoluciferase to Investigate Native Chemokine Receptor Function and Conformational Changes. Cell Chemical Biology. 27, 499-510 (2020).
- Akinjiyan, F. A., et al. A Novel Luminescence-Based High-Throuput Approach for Cellular Resolution of Protein Ubiquitination using Tandem Ubiquitin Binding Entities (TUBEs). SLAS Discovery. 25 (4), 350-360 (2020).
- Soave, M., Kellam, B., Woolard, J., Briddson, S. J., Hill, S. J. NanoBiT Complemetation to Monitor Agonist-Induced Adenosine A1 Receptor Internalization. SLAS Discovery. 25 (2), 186-194 (2020).
- Crowley, E., Leung, E., Reynisson, J., Richardson, A. Rapid changes in the ATG5-ATG16L1 complex following nutrient deprivation measured using NanoLuc Binary Technlology (NanoBiT). FEBS Journal. , 15275 (2020).
- Shetty, S. K., Walzem, R. L., Davies, B. S. J. A novel NanoBiT-based assay monitors the interaction between lipoprotein lipase and GPIHBP1 in real time. Journal of Lipid Research. 61 (4), 546-559 (2020).
