Summary
ここで提示されたプロトコルは、スプリットルシフェラーゼ相補アッセイの最新の変異体を用いて、生きた哺乳動物細胞におけるゴルジ常駐III型膜タンパク質と細胞質的に露出したN末端および/またはC末端との間の異種相互作用の発生を実証することを意図している。
Abstract
このプロトコルの目的は、ヌクレオチド糖トランスポーター(NST)によって形成される異種複合体を実証するためのスプリットルシフェラーゼ相補の最新の変異体の適用可能性を探索することである。これらのERおよびゴルジ常駐多膜貫通タンパク質は、細胞質的に合成されたヌクレオチド糖を細胞小器官膜全体に運び、グリコシル化を媒介する酵素を基質とともに供給する。NSTは二量体および/またはそれ以上のオリゴマーとして存在する。異なるNST間の異種相互作用も報告されている。この技術がNSTヘテロマー化の現象の研究に適しているかどうかを検証するために、我々は以前にいくつかの他の手段によって会合することが示された2つのゴルジに常駐するNSTの組み合わせに対してそれを試験した。ルシフェラーゼ相補アッセイは、高い発現レベルを必要とせず、しばしばタンパク質の誤局在化を引き起こし、偽陽性のリスクを高めるため、ゴルジ体常在性膜タンパク質間の相互作用の研究に特に適しているようである。
Introduction
この原稿では、スプリットルシフェラーゼ相補アッセイの最新のバリアントを使用して、一過性にトランスフェクトされたヒト細胞におけるゴルジ体常駐III型膜タンパク質間の異種相互作用の存在をチェックするための段階的なプロトコルについて説明しています。この手順は、ヌクレオチド糖トランスポーター(NST)に対して最も広範囲に試験されていますが、N末端および/またはC末端が細胞質に面している他のゴルジ常駐III型膜タンパク質についても肯定的な結果を得ることができました。
我々の研究グループは、巨大分子のグリコシル化におけるNSTの役割を探究している。NSTはゴルジ体および/またはER常駐III型膜タンパク質であり、N末端およびC末端はオルガネラー膜の細胞質側を向いています1。NSTは、糖転移酵素に基質を供給するために、オルガネラ膜を横切ってヌクレオチド活性化糖を運ぶと考えられている。NSTは二量体および/またはそれ以上のオリゴマー2、3、4、5、6、7、8、9、10を形成する。さらに、異なるNST間の異種相互作用も報告されている6,11。NSTはまた、機能的に関連するグリコシル化酵素との複合体を形成することが実証された12、13、14。私たちは、NSTと機能的に関連するゴルジ体常駐タンパク質の相互作用を研究するために、現在使用されている蛍光寿命イメージング(FLIM)ベースのFRETアプローチに代わるものを探し、スプリットルシフェラーゼ相補アッセイをテストすることに決めました。これにより、NSTと機能的に関連するグリコシル化酵素との間の新しい相互作用を同定することができました9。
スプリットルシフェラーゼ相補アッセイの最新の改変であるNanoBiTは、ここで提示されたプロトコルで使用されています15。これは、2つの断片からのルシフェラーゼ酵素(例えば、NanoLuc)の再構成に依存している - 大きなBiTまたはLgBiTと呼ばれる大きなもの、17.6kDaのタンパク質、および小さなBiTまたはSmBiTと呼ばれる11個のアミノ酸のみで構成される小さなもの。目的の2つのタンパク質を相補的断片と融合させ、ヒト細胞株中で一過性に発現させる。2つの融合タンパク質が相互作用する場合、細胞透過性基質の添加時にその場で発光が生成される。これら2つの断片は、それらが融合している目的のタンパク質間の相互作用によって一緒にされない限り、それらが最小の親和性で会合するように最適化されている。
一般に、生物発光ベースの方法は、蛍光に基づく方法よりもいくつかの利点を有する。生物発光シグナルは、バックグラウンド発光がルシフェラーゼ由来のシグナルと比較して無視できる程度であるため、より高いシグナル対ノイズ比を有する16。対照的に、蛍光ベースのアプローチは、通常、自己蛍光の現象によって引き起こされる比較的高いバックグラウンドに苦しむ。その上、生物発光は蛍光よりも分析された細胞にとって有害性が低く、前者の場合のように試料を励起する必要はない。これらの理由から、インビボでPPIを研究するための生物発光アプローチは、フェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)や二分子蛍光相補(BiFC)などの一般的に使用される蛍光法よりも競合します。
我々のプロトコールは、目的のタンパク質組み合わせについて得られた発光を、対照の組み合わせについて得られた発光に参照することに依存している。後者は、より大きな断片と融合された試験されたタンパク質の1つと、より小さな断片と融合された対照タンパク質(例えば、HaloTag)とを含む。後者は、哺乳類のタンパク質のいずれとも相互作用するとは予想されない細菌起源のタンパク質である。このタンパク質を対照として使用すると、分析されるゴルジ常駐タンパク質の対のトポロジーに制限が生じる。哺乳動物細胞ではこのタンパク質は細胞質内で合成されるので、目的の両方のタンパク質は少なくとも1つの細胞質尾部を有するべきである。
このアプローチは、PPIの初期スクリーニングに特に有用であり得る。これは、目的の融合タンパク質が、他のアプローチを適用するには単に不十分なレベルで発現される場合に、選択の方法となり得る。同様に、分割ルシフェラーゼ相補アッセイは、目的のタンパク質が高レベルで発現している場合に最良の選択肢となり得るが、これはそれらの細胞内局在化に悪影響を及ぼすか、または非特異的相互作用を強制することが知られている。より小さい断片は11個のアミノ酸しか有さないので、より大きなタグを使用するのが不可能である場合に分割ルシフェラーゼ相補アッセイを適用することができる。最後に、ここで提示する場合のように、他の技術を用いて得られたデータをさらに確認するために採用することができる。
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Protocol
発現プラスミドの作製
- トポロジー予測ツールを使用して、目的のタンパク質の膜トポロジーを調べます。
- 融合タンパク質がゴルジ膜に挿入されると、大きい断片と小さい断片が細胞質に面するようにクローニング戦略を設計します。ここで提示する場合のように、目的のタンパク質のN末端とC末端の両方が細胞質的に配向している場合は、8つの可能な方法でタンパク質にタグを付けます( 図1Bを参照)。目的のタンパク質の一方または両方のN末端またはC末端が光度配向している場合は、タグ付けから除外します。
- 標準的なクローニングプロトコールに従って、目的の遺伝子を適切な発現ベクター( 材料表を参照)にサブクローニングします。
メモ: 近接性の欠如、最適でない方向、または空間的制約のために、一部のタグ付けオプションが機能しない可能性があるため、考えられるすべての向きをテストすることをお勧めします。
2. 発現プラスミドの細胞への一過性トランスフェクション
- トリプシン処理によって付着したHEK293T細胞培養物を回収し、専用の完全増殖培地に細胞を再懸濁する。細胞(2 x 104/100 μL/ウェル)を透明な底の白い側面96ウェルプレートにプレートします。ウェルの総数を調整して、反復を含むすべての試験済みの組み合わせと対照に対応します。
メモ: プレートの内側の 60 ウェルのみを使用して、熱シフトを最小限に抑え、一晩の蒸発を回避してください。 材料表に示されているようなポリD-リジンコーティングプレートを使用することを強く推奨し、そうしないとその後の洗浄ステップ中に細胞が剥離する可能性がある。 - 細胞を標準条件(37°C、5%CO2)で一晩培養する。
- 翌日、ポイント1.1で得られた発現プラスミドの所望の組み合わせで細胞をトランスフェクトする。
- 発現プラスミドを無血清培地( 材料表を参照)で希釈し、各構築物について6.25 ng/μLに希釈する。
- 脂質ベースのトランスフェクション試薬を適切な脂質対DNA比で添加し、メーカーの指示に従ってインキュベートします。
- 8 μL の脂質:DNA混合物を指定されたウェルに加える。プレートの内容物を緩やかな回転で混ぜる。これにより、両方の発現構築物を50ng/ウェルでトランスフェクションする。
- 細胞を標準条件(37°C、5%CO2)で20〜24時間培養する。
注:細胞をより長い時間培養すると、融合タンパク質発現のレベルが高くなり、断片間の非特異的な会合が促進される可能性があります。
3. 媒体交換
- 翌日、馴化培地を各ウェル内の無血清培地100 μLと交換する。培地交換時に細胞が剥離していないことを確認してください。
注:このステップは、フリマジン作動溶液を添加する2〜3時間前に行う必要があります。血清離脱は、フリマジンの自律発光によって引き起こされるバックグラウンドを最小限に抑える。
4.フリマジン作業溶液の調製
- 測定の直前に、1容量のフリマジンを19容量の希釈バッファー(20倍希釈)と混合する。
注:調製されるフリマジン作動溶液の総量は、分析される個々のウェルの数に依存する(フリマジン作動溶液は1:5の比率で細胞培養培地に添加されるので、100μLの無血清培地で以前に充填された各ウェルに25μLのフリマジン作動溶液を添加するべきである)。 - フリマジン作業溶液を指定されたウェル(25 μL/ウェル)に加えます。プレートを手で、またはオービタルシェーカー(例えば、300〜500rpmで15秒)を使用して静かに混合する。
5. 発光の測定
- プレートをルミネッセンスマイクロプレートリーダーに挿入します。
- 37°Cで行われる実験については、示された温度でプレートを10〜15分間平衡化する。
- 分析する井戸を選択します。
- 積分時間0.3秒で発光を読み取る。必要に応じて、発光を最大2時間監視し続けます。
6. データ解析
- 試験済みと対照のすべての組み合わせの平均値と標準偏差を計算します。
- 多重比較を伴う一元配置分散分析を使用してデータを分析します。
- 目的の組合せについて得られた平均発光を、対応する陰性対照について得られた平均発光で割ることによって、フォールド変化値を計算する。結果を評価します。
注:ここで提案するデータ分析へのアプローチは、試験された組み合わせについて得られた発光が、対応する対照の組み合わせについて得られた発光よりも統計的に有意に高く、同時に、これら2つの値の比が10を超える場合に、相互作用を主張できると仮定する。
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Representative Results
このアプローチで最も信頼性の高いデータを取得するには、考えられるすべての組み合わせをテストする必要があります ( 図 1 参照)。並行して、ポジティブコントロールとネガティブコントロールを含める必要があります。ポジティブコントロールは、相互作用することが知られている2つのタンパク質からなるべきであり、そのうちの1つは大きなフラグメントと融合し、もう1つは小さなフラグメントと融合する。陰性対照は、理想的には、同様にタグ付けされた2つの非相互作用III型膜タンパク質からなるべきである。しかし、このような制御を確立することは、2つの対照タンパク質の相互作用の欠如がいくつかの代替アプローチを用いて徹底的に確認されるべきであるため、困難な場合がある。したがって、相互作用が決定されるタンパク質のN末端および/またはC末端が、ここで提示される場合のように細胞質的に露出している場合、いかなるヒトタンパク質(例えば、HaloTag)とも相互作用するとは予想されない非ヒト起源の細胞質ゾルタンパク質を陰性対照として採用することができる。このタイプのコントロールを使用して得られた結果のさらなる検証を、目的のタンパク質のいずれかのタグなし変異体の共発現と、対応するプラスミドの滴定と組み合わせることを強くお勧めします。2つのタンパク質が特異的に相互作用する場合、ルシフェラーゼ断片を欠いているそれらのいずれかの余分なコピーは、発光の特異的な減少をもたらすはずである。
正と負の組み合わせに典型的な相対発光単位(RLU)値を 表1に列挙する。結果は、共免疫沈降およびFLIM−FRET6 ならびにin situ近接ライゲーションアッセイ11によって会合することが示された2つのNST、SLC35A2およびSLC35A3について得られた。SLC35A2およびSLC35A3はいずれもゴルジ常在性III型膜タンパク質であり、N末端およびC末端が細胞質に面している(図1A)。したがって、8つの可能なタグ付けオプションがあり、得られた融合タンパク質は8つの可能な方法でも一緒に設定することができます(図1B)。試験および対照のすべての組み合わせに対応する平均RLU値を 図2Aに示します。陽性対照も含まれる。選択された結果が交互作用の指標と見なされるための初期要件は、対象の組み合わせについて得られたRLU値が、対応する対照の組み合わせについて得られたRLU値よりも統計的に有意に高いことである。 図2A では、3つのそのような組み合わせが見られる(LgBiT−SLC35A2+SLC35A3−SmBiT、SmBiT−SLC35A2+LgBiT−SLC35A3およびSLC35A2−SmBiT+LgBiT−SLC35A3)。結果分析の次のステップでは、対応するRLU値をそれぞれのコントロールについて得られたRLU値で割ることによって、目的の組み合わせの比率値を取得します。このような分析の結果を 図2Bに示す。製造業者の提案によれば、10〜1000の間の比率は、特定の相互作用を非常に示唆する。これらの基準を満たす2つの組み合わせ(SmBiT-SLC35A2 + LgBiT-SLC35A3およびSLC35A2-SmBiT + LgBiT-SLC35A3)があり、SLC35A2とSLC35A3が相互作用するという考えを支持する。しかし、他の6つの組み合わせが陰性であるという事実は、それぞれの融合タンパク質間に相互作用が全くないことを意味するものではなく、むしろこれらの場合においてタグ付け戦略が最適ではなかったことを示唆している。この例は、考えられるすべての組み合わせをテストすることがいかに重要であるかを示しています。
図2に提示されたデータは、 HA タグ付きSLC35A2またはSLC35A3と、最も高い相対発光をもたらした組み合わせ、すなわちSLC35A2−LgBiT+SmBiT−SLC35A3との共発現によってさらに確認された。HAタグ付きNST変異体をコードする様々な量のプラスミドを、同時トランスフェクションに使用した。その結果、RLU値の統計的に有意な用量依存的な減少がもたらされました(図3)。HAタグ付きNST変異体の同時共発現によるSLC35A2−LgBiTとSmBiT−SLC35A3との間の相互作用の特異的および用量依存的破壊を 表2に示す。
ここで紹介する方法に関連する最も一般的な問題は、トランスフェクションの効率の悪さです。これが最適でない結果の原因であるかどうかを検証するために、すべての実験に陽性対照を含める。ここで提示されたデータを得るために採用したポジティブコントロールは、2つの相互作用する融合タンパク質からなる:cAPM依存性プロテインキナーゼ触媒サブユニットα(PRKACA)は、より小さな断片と融合し、cAPM依存性プロテインキナーゼII型アルファ調節サブユニット(PRKAR2A)は大きな断片と融合した。私たちの手では、対応するRLU値は〜6 x 105に達しました。この数値の大幅な(2~3桁の)減少は、実行されたトランスフェクションの効率が最適でないことを示している可能性があります。このような場合は、培養細胞のウェルビーイングを確認し、適切な数の細胞がトランスフェクション用に播種されていることを確認することをお勧めします。
図1:膜トポロジとタグ付けの回路図。 (A)SLC35A2およびSLC35A3タンパク質の膜トポロジー。(B)SLC35A2およびSLC35A3タンパク質をスプリットルシフェラーゼ相補アッセイ断片でタグ付けし、得られた融合タンパク質をアッセイのために組み合わせる可能性。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:選択されたタンパク質の組み合わせおよび対応する陰性対照についてHEK293T細胞において実施された分割ルシフェラーゼ相補アッセイの結果(プロセシングされたデータ)。 (a)選択されたタンパク質の組み合わせおよび対応する陰性対照について得られたRLU値。ネガティブ, HaloTag with SmBiT;PRKAR2A、cAPM依存性プロテインキナーゼII型アルファ調節サブユニット;PRKACA、cAPM依存性プロテインキナーゼ触媒サブユニットα。データは、多重比較を伴う一元配置分散分析を使用して分析され、3つの技術反復から標準偏差(SD)±平均として表されます。p < 0.1 *, p < 0.05 **, p < 0.01 ***. (B)試験された組み合わせ(RLUサンプル)について得られた平均発光を、対応する陰性対照(RLUコントロール)について得られた平均発光で割ることによって計算されるフォールド変化。相互作用を示すと考えられる閾値は10に設定した。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:HAタグ付きNST変異体の同時共発現によるSLC35A2-LgBiTとSmBiT-SLC35A3との間の相互作用の特異的および用量依存的破壊。HEK293T細胞をSLC35A2-LgBiTおよびSmBiT-SLC35A3をコードするプラスミドでトランスフェクトし、さらに、空のpSelectプラスミド(模擬)またはHAタグ付きSLC35A2(左パネル)およびSLC35A3をコードするpSelectプラスミドの増加量(右パネル)のいずれかでトランスフェクトした。データは、多重比較を伴う一元配置分散分析を使用して分析され、3つの技術反復から標準偏差(SD)±平均として表されます。p < 0.05 **, p < 0.001 ****.この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
表1:選択されたタンパク質組合せおよび対応する陰性対照についてHEK293T細胞において実施されたアッセイの結果(生データ)。 選択されたタンパク質の組み合わせおよび対応する陰性対照について得られた未処理のRLU値が示されている。ネガティブ, HaloTag with SmBiT;PRKAR2A、cAPM依存性プロテインキナーゼII型アルファ調節サブユニット;PRKACA、cAPM依存性プロテインキナーゼ触媒サブユニットα、TR、技術的複製。 このテーブルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表2:HAタグ付きNST変異体の同時共発現によるSLC35A2-LgBiTとSmBiT-SLC35A3との間の相互作用の特異的および用量依存的破壊(生データ)。 選択されたタンパク質の組み合わせについて得られた未処理のRLU値が示されている。偽、SLC35A2-LgBiTおよびSmBiT-SLC35A3を発現する細胞を空のpSelectベクターで同時トランスフェクト;HA-SLC35A2、SLC35A2-LgBiTおよびSmBiT-SLC35A3を発現する細胞を、N末端にHAエピトープでタグ付けしたSLC35A2をコードするpSelectプラスミドの指示された量で同時トランスフェクトし;HA-SLC35A3、SLC35A2-LgBiTおよびSmBiT-SLC35A3を発現する細胞を、N末端にHAエピトープでタグ付けされたSLC35A3をコードするpSelectプラスミドの示された量で共トランスフェクトし;TR、技術的な複製。 このテーブルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、分割ルシフェラーゼ相補アッセイを使用して、NSTなどのゴルジ常駐III型膜タンパク質間に形成される異種複合体の実証を可能にする詳細なプロトコルを提供します。データ解析および解釈への提案されたアプローチは、目的のタンパク質の組み合わせについて得られた発光を、より大きな断片と融合した目的のタンパク質の1つおよびより小さい断片と融合した細菌起源の制御タンパク質からなる対応する対照の組み合わせについて得られた発光に関連付けることを含む。後者は哺乳動物細胞の細胞質で発現される。したがって、それを基準として使用するには、相互作用を分析するタンパク質のN末端および/またはC末端がゴルジ膜の細胞質側にある必要があります。
プロトコールの重要なステップは、プラスミド設計、トランスフェクションする細胞のプレーティング、トランスフェクション自体、培地交換、フリマジン作業溶液の調製および細胞への添加です。プラスミド設計は、両方のルシフェラーゼ断片が細胞質に面するように行う必要があり、そうしないと、制御の組み合わせが機能せず、参照RLU値が欠落します。トランスフェクションされる細胞は、プロトコールに指定されているように播種されるべきであり、さもなければ、トランスフェクション効率は最適ではないかもしれない。培地交換中に細胞付着をサポートするために、ポリ-L-リジンコーティングされた表面を有するマルチウェルプレートを使用することをお勧めします。最後に、フリマジン作業溶液を新たに調製し、直ちに細胞に添加すべきである。追加したら、できるだけ早く読み出しを実行する必要があります。
決定的な結果にならないようにするには、ポジティブコントロールとネガティブコントロールを常に含める必要があります。トランスフェクション効率が監視されるように、ポジティブコントロールを常に採用する必要があります。HaloTagベースのネガティブコントロールと同様に、互いに位相的に適合性のあるすべての可能な融合タンパク質が生成され、組み合わされることが非常に重要です。可能であれば、目的のタンパク質のいずれかと相互作用しない膜タンパク質を含む陰性対照を使用すべきである。ここでは、その開発がまだ進行中であるため、そのような制御を採用しませんでした。代わりに、分析されたタンパク質の1つの余分なタグなしコピーを共発現させることによって、目的の複合体の特定の分解を強制した。我々が使用した発現ベクターは、比較的弱い単純ヘルペスウイルス-チミジンキナーゼ(HSV-TK)プロモーターを保有しており、特定の結果を得るのに最適な低発現レベルを保証します。ただし、最適でない結果の場合は、CMV ベースのベクターを使用するか、あるいはトランスフェクションに使用するプラスミドの量を最適化することが有益である可能性があります。
提示された方法は、強力で便利であるが、いくつかの制限がある。第1に、この方法は、同定された複合体が二量体または高次オリゴマーのいずれに対応するかを結論付けることを可能にするものではない。その上、相互作用するタンパク質の細胞内局在をモニターすることはできない。しかし、これは生物発光イメージングによる基本プロトコルの拡張によって可能であるが、そのような画像の空間分解能は蛍光ベースのアプローチと比較すると著しく低いであろう。
提示された方法は非常に高速で効率的です(測定には数分かかり、データは何千もの細胞から得られます)。データの処理と解釈も比較的簡単です。基本プロトコルの最適化はほとんど、またはまったく必要ありません。必要な唯一の特定の機器は、ルミノメーターです。スプリットルシフェラーゼ相補アッセイおよびBiFCは、同じ本質的な原理、すなわち、その非機能的断片からの機能性タンパク質の再構成に取り組む。蛍光に基づくアプローチに対する生物発光ベースのアプローチの一般的な利点は、すでに序論に記載されています。BiFCに対するスプリットルシフェラーゼ相補アッセイの具体的な利点は、前者が完全に可逆的であることです15。BiFCでは、蛍光タンパク質が再構成されると、対応する非蛍光断片に解離して戻らない17。対照的に、NanoLucサブユニットの組み立ては可逆的であり、PPIのダイナミクスを研究するユニークな機会を作り出します。最後に、提示された方法の並外れた感度は、このアプローチがトランスフェクトが困難な細胞株でも機能すると仮定することを可能にする。
ここに提示されたプロトコルは、2つのゴルジ常駐III型膜タンパク質が相互作用するかどうかを決定することを可能にする。既に述べたように、本方法の基本的なセットアップは、生物発光イメージングと組み合わせて、目的のPPIの細胞内局在を確認することができる。この分割ルシフェラーゼ相補アッセイの可逆性により、PPIのダイナミクスをリアルタイムで研究することができます。このフリマジンに由来する発光シグナルは約2時間持続する。しかしながら、得られるシグナルの実質的に長い(数時間〜数日)持続時間を保証する分割ルシフェラーゼ相補アッセイのための基質も利用可能である。この方法により、目的のPPIをトリガーまたは防止する要因を特定できます。その応用の最近の例のいくつかには、Gタンパク質とGタンパク質共役型受容体との間の相互作用に関する研究18、タンパク質立体構造変化19、タンパク質ユビキチン化20、細胞表面受容体のインターナリゼーション21、およびPPIs22,23を調節する因子の同定が含まれる。したがって、この方法は、非常に困難な実験目標でさえも達成する高い可能性を秘めた汎用性の高いツールであるように思われる。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この研究は、ポーランドのクラクフにある国立科学センター(NCN)からの助成金番号2016/23/D/NZ3/01314によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin-EDTA solution | |||
| Adherent mammalian cell line | |||
| BioCoat Poly-D-Lysine 96-well White/Clear Flat Bottom TC-treated Microplate, with Lid | Corning | 356651 | |
| Cell culture centrifuge | |||
| Cell culture supplements (heat-inactivated fetal bovine serum, L-glutamine, penicillin, streptamycin) | |||
| CO2 incubator | |||
| Expression plasmids encoding protein(s) of interest not tagged with NanoBiT fragments | |||
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| GloMax Discover Microplate Reader (or a different luminescence microplate reader) | Promega | GM3000 | |
| Growth medium dedicated to the cell line used | |||
| Materials and reagents for standard molecular cloning (bacteria, thermostable polymerase, restriction enzymes, DNA ligase, materials and reagents for nucleic acid purification) | |||
| NanoBiT MCS Starter System | Promega | N2014 | This kit contains vectors enabling tagging of the proteins of interest with NanoBiT fragments at different orientations as well as the control plasmid encoding HaloTag protein fused with SmBiT and a positive control plasmid pair. |
| Nano-Glo Live Cell Assay System | Promega | N2011 | This kit contains furimazine, which is a substrate enabling detection of the NanoLuc activity in living cells, and a dedicated dilution buffer. |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium, no phenol red | Gibco | 11058021 | |
| Oribital shaker | |||
| Software for data analysis (e.g. GraphPad Prism) | |||
| Thermocycler |
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