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Bioengineering

लाइव माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के तहत 3डी हाइड्रोगेल का नियंत्रित तनाव

Published: December 4, 2020 doi: 10.3791/61671
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 2, 3,4
1Department of Biomedical Engineering, Faculty of Engineering, Tel-Aviv University, 2Department of Materials Science and Engineering, Faculty of Engineering, Tel-Aviv University, 3School of Mechanical Engineering, Faculty of Engineering, Tel-Aviv University, 4Center for the Physics and Chemistry of Living Systems, Tel-Aviv University

Summary

प्रस्तुत विधि में सिलिकॉन रबर में एम्बेडेड 3 डी सॉफ्ट हाइड्रोगेल का एकीय खींच शामिल है, जबकि लाइव कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी की अनुमति देता है। बाहरी और आंतरिक हाइड्रोगेल उपभेदों के साथ-साथ फाइबर संरेखण का लक्षण वर्णन किया जाता है। विकसित डिवाइस और प्रोटोकॉल विभिन्न तनाव व्यवस्थाओं के लिए कोशिकाओं की प्रतिक्रिया का आकलन कर सकते हैं।

Abstract

बाहरी ताकतें ऊतक निर्माण, विकास और रखरखाव में एक महत्वपूर्ण कारक हैं। इन ताकतों के प्रभावों का अक्सर विशेष इन विट्रो स्ट्रेचिंग विधियों का उपयोग करके अध्ययन किया जाता है। विभिन्न उपलब्ध प्रणालियां 2डी सब्सट्रेट-आधारित स्ट्रेचर का उपयोग करती हैं, जबकि सॉफ्ट हाइड्रोगेल्स को तनाव देने के लिए 3डी तकनीकों की पहुंच अधिक प्रतिबंधित है। यहां, हम एक विधि का वर्णन करते हैं जो नमूना वाहक के रूप में लोचदार सिलिकॉन स्ट्रिप का उपयोग करके, उनकी परिधि से नरम हाइड्रोगेल के बाहरी खींच की अनुमति देता है। इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली स्ट्रेचिंग सिस्टम का निर्माण 3डी-मुद्रित भागों और कम लागत वाले इलेक्ट्रॉनिक्स से किया जाता है, जिससे अन्य प्रयोगशालाओं में इसे सरल और आसान बनाया जाता है। प्रायोगिक प्रक्रिया सिलिकॉन स्ट्रिप के केंद्र में कट-आउट में पॉलीमराइजिंग मोटी (>100 माइक्रोन) सॉफ्ट फिब्रिन हाइड्रोगेल्स (~ 100 पीए के लोचदार मोडुलस) के साथ शुरू होती है। सिलिकॉन-जेल निर्माण तब मुद्रित-खींच डिवाइस से जुड़े होते हैं और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप चरण पर रखे जाते हैं। लाइव माइक्रोस्कोपी के तहत स्ट्रेचिंग डिवाइस सक्रिय होता है, और जैल को विभिन्न खिंचाव परिमाण पर चित्रित किया जाता है। छवि प्रसंस्करण का उपयोग तब जेल की 3 डी मोटाई(जेड-एक्सिस)में अपेक्षाकृत समरूप उपभेदों और फाइबर संरेखण का प्रदर्शन करते हुए परिणामी जेल विरूपण की मात्रा निर्धारित करने के लिए किया जाता है। इस विधि के फायदों में सीटू माइक्रोस्कोपी में निष्पादित करते समय 3 डी में बेहद नरम हाइड्रोगेल को तनाव देने की क्षमता और उपयोगकर्ता की जरूरतों के अनुसार नमूने की ज्यामिति और आकार में हेरफेर करने की स्वतंत्रता शामिल है। इसके अतिरिक्त, उचित अनुकूलन के साथ, इस विधि का उपयोग अन्य प्रकार के हाइड्रोगेल (जैसे, कोलेजन, पॉलीएक्रिलीन ग्लाइकोल) को फैलाने के लिए किया जा सकता है और अधिक बायोमिमेटिक 3 डी स्थितियों के तहत बाहरी ताकतों के लिए कोशिकाओं और ऊतक प्रतिक्रिया के विश्लेषण के लिए अनुमति दे सकता है।

Introduction

यांत्रिक बलों के ऊतक प्रतिक्रिया जीन अभिव्यक्ति1,कोशिका भेदभाव2,और ऊतक रीमॉडलिंग3सहित जैविक कार्यों की एक विस्तृत श्रृंखला का एक अभिन्न हिस्सा है। इसके अलावा, फाइबर संरेखण और डेन्सिफिकेशन जैसे एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम) में बल-प्रेरित परिवर्तन सेल व्यवहार और ऊतक निर्माण4,5,6को प्रभावित कर सकते हैं। ईसीएम की रेशेदार जाल संरचना में गैर-रैखिक लोच, गैर-एफ़िन विरूपण और प्लास्टिक विरूपण7,8,9,10, 11,12जैसे पेचीदा यांत्रिक गुण हैं। ये गुण इस बात पर प्रभाव डालते हैं कि कोशिकाएं और उनके आसपास के सूक्ष्म पर्यावरण बाहरी यांत्रिक बलों का जवाब कैसे देते हैं13,14. यह समझना कि ईसीएम और ऊतक यांत्रिक बलों का जवाब कैसे देते हैं, ऊतक इंजीनियरिंग के क्षेत्र में और अधिक सटीक कंप्यूटेशनल और सैद्धांतिक मॉडल के विकास में प्रगति को सक्षम करेगा।

यांत्रिक रूप से नमूनों को फैलाने के लिए सबसे आम तरीकों ने सेल-लादेन 2डी सब्सट्रेट्स पर ध्यान केंद्रित किया है ताकि सेल व्यवहार पर प्रभाव का पता लगाया जा सके। इनमें, उदाहरण के लिए, पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) सब्सट्रेट्स पर दबाव लगाना और खिंचाव दिशा15, 16, 17,18,19के संबंध में सेल रीओरिएटिंग कोणों का विश्लेषण करना शामिल है। फिर भी, बाहरी खिंचाव के लिए 3 डी सेल एम्बेडेड हाइड्रोगेल की प्रतिक्रिया की जांच करने वाले तरीके, एक ऐसी स्थिति जो ऊतक माइक्रोएनवायरमेंट की अधिक बारीकी से नकल करती है, अधिक सीमित हैं। 3डी स्ट्रेचिंग विधियों की ओर प्रगति का विशेष महत्व है क्योंकि 3डी मैट्रिस 20 की तुलना में कोशिकाएं2डीसब्सट्रेट्स पर अलग व्यवहार करती हैं। इन व्यवहारों में सेलुलर पुनर्संरेखण, प्रोटीन अभिव्यक्ति का स्तर, और माइग्रेशन पैटर्न21,22,23शामिल हैं।

3डी सैंपल खींचने की अनुमति देने वाले तरीकों और उपकरणों में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध24 , 25,26,27,28और प्रयोगशाला अनुसंधान29 के लिए विकसित किए गए दोनों शामिल हैं । इन तरीकों में डिस्टेंसिबल सिलिकॉन ट्यूब30, मल्टी-वेल चैम्बर्स31, क्लैंप26,32, बायोरिएक्टर11,33,कैंटिलीवर्स34,35,36और मैग्नेट37,38का उपयोग करते हैं । कुछ तकनीकें ऐसे खिंचाव उत्पन्न करती हैं जो स्थानीय रूप से 3 डी हाइड्रोगेल को विकृत करती है, उदाहरण के लिए जेल5में दो एकल बिंदुओं से सुई खींचकर, जबकि अन्य जेल16के पूरे थोक के विरूपण के लिए अनुमति देते हैं। इसके अलावा, इनमें से अधिकांश प्रणालियां एक्स-वाई विमान में तनाव क्षेत्र के विश्लेषण पर ध्यान केंद्रित करती हैं, जिसमें जेड-दिशामें तनाव क्षेत्र पर सीमित जानकारी होती है। इसके अतिरिक्त, इन उपकरणों के केवल एक मुट्ठी भर सीटू इमेजिंग में सूक्ष्म करने में सक्षम हैं । सीटू उच्च आवर्धन इमेजिंग (जैसे, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप) में मुख्य चुनौती उद्देश्य लेंस से नमूने के लिए कुछ सौ माइक्रोन की सीमित कार्य दूरी है। जो उपकरण स्ट्रेच के दौरान लाइव इमेजिंग की अनुमति देते हैं , जेड- धुरी में तनाव की एकरूपता का त्याग करते हैं या अपेक्षाकृत जटिल होते हैं और अन्य प्रयोगशालाओं में प्रजनन करना मुश्किल होता है39,40.

3डी हाइड्रोगेल को फैलाने के लिए यह दृष्टिकोण लाइव कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के दौरान स्थिर या चक्रीय एकक्षी तनाव के लिए अनुमति देता है। स्ट्रेचिंग डिवाइस (जिसे 'स्मार्ट साइक्लिक यूनिएक्सियल स्ट्रेचर - स्कायस' कहा जाता है) का निर्माण 3 डी मुद्रित भागों और कम लागत वाले हार्डवेयर का उपयोग करके किया जाता है, जिससे अन्य प्रयोगशालाओं में आसान प्रजनन की अनुमति होती है। डिवाइस से जुड़ा एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सिलिकॉन रबर है जिसके केंद्र में ज्यामितीय कट-आउट है। कट-आउट को भरने के लिए हाइड्रोगेल घटकों को बहुलीकृत किया जाता है। बहुलीकरण के दौरान, बायोलॉजिकल हाइड्रोगेल, जैसे फिब्रिन या कोलेजन, स्वाभाविक रूप से कट-आउट की आंतरिक दीवारों का पालन करते हैं। SCyUS का उपयोग करना, सिलिकॉन पट्टी uniaxially फैला है, एम्बेडेड 3 डी हाइड्रोगेल41को नियंत्रित उपभेदों को स्थानांतरित करता है।

यह प्रणाली अन्य मौजूदा तरीकों की तुलना में सुविधाओं और फायदों के अद्वितीय संयोजन के लिए अनुमति देती है। सबसे पहले, सिस्टम अपनी परिधि से मोटी 3 डी सॉफ्ट हाइड्रोगेल (>100 माइक्रोन मोटी, <1 केपीए कठोरता) के एकेक्सियल स्ट्रेचिंग की अनुमति देता है, जिसमें पूरेहाइड्रोगेल में जेड-समरूप विकृति होती है। ये हाइड्रोगेल पारंपरिक तन्य तकनीकों द्वारा सोचने और फैलाए जाने के लिए बहुत नरम हैं। दूसरा, स्ट्रेचिंग डिवाइस को अन्य प्रयोगशालाओं में आसानी से दोहराया जा सकता है क्योंकि 3डी प्रिंटिंग शोधकर्ताओं के लिए आसानी से उपलब्ध है और डिजाइन में इस्तेमाल होने वाले इलेक्ट्रॉनिक्स कम लागत वाले हैं । तीसरा, और शायद सबसे आकर्षक विशेषता, ज्यामिति और सिलिकॉन पट्टी में कट-आउट के आकार को आसानी से हेरफेर किया जा सकता है, जिससे ट्यूनेबल स्ट्रेन ग्रेडिएंट और बाउंड्री कंडीशन के साथ-साथ विभिन्न प्रकार के नमूना वॉल्यूम का उपयोग, कुछ माइक्रोलीटर तक नीचे हो सकता है।

प्रस्तुत प्रोटोकॉल में लाइव कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के तहत एकीय खिंचाव द्वारा आगे बढ़ते 0.5 मिमी मोटी सिलिकॉन रबर स्ट्रिप्स में ~ 2 मिमी व्यास डिस्क में फिब्रिन जेल मोल्डिंग होते हैं। निम्नलिखित ज्यामितीय कट-आउट पर कार्य करने वाले उपभेदों को मापने और विश्लेषण करने के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं, हाइड्रोगेल में विकसित आंतरिक उपभेदों के साथ-साथ विभिन्न खिंचाव जोड़तोड़ के बाद फाइबर संरेखण के परिणामस्वरूप विस्तार से चर्चा करता है। अंत में, हाइड्रोगेल में कोशिकाओं को एम्बेड करने और उन्हें नियंत्रित बाहरी खिंचाव के लिए उजागर करने की संभावना पर चर्चा की जाती है।

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Protocol

1. समाधान तैयारी (पहले से किया जाना है)

  1. फिब्रिनोजेन लेबलिंग
    नोट: लेबलिंग चरण की आवश्यकता केवल तभी होती है जब फाइब्रिन जेल के विरूपण का विश्लेषण वांछित हो। सेलुलर प्रयोगों के लिए, अवेलेबल जेल का उपयोग करना संभव है।
    1. 50 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में 10 मिलीग्राम/एमएल succinimidyl एस्टर फ्लोरोसेंट डाई (डीएमएसओ में भंग) के 1.5 एमएल में 15 मिलीग्राम/एमएल फिब्रिनोजेन सॉल्यूशन (5:1 का मोलर अनुपात) में 38 माइक्रोन जोड़ें और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए एक शेकर पर रखें। बाद में, ट्यूब को 800 x ग्राम (कमरे के तापमान) पर 3 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र में रखें।
    2. इन चरणों का पालन करके,42, अप्रतिरक्षित डाई को अलग करने के लिए डेक्सट्रान जेल राल(सामग्री की तालिका) केसाथ पैक किए गए एक डेसाल्टिंग कॉलम के माध्यम से पिछले चरण से सुपरनैंट को फ़िल्टर करें।
      1. फाइब्रिनोजेन बफर के 25 एमएल के साथ कॉलम को प्री-वॉश करें।
      2. धीरे-धीरे लेबल-फिब्रिनोजेन को चरण 1.1.1 से कॉलम में इंजेक्ट करें, जिससे यह सुनिश्चित हो जाए कि फ़िल्टर में प्रवेश करने वाले कोई बुलबुले नहीं हैं। एल्यूट किए गए समाधान के पहले ~ 0.3 एमएल (बेहोश रंग के तरल की 4-6 बूंदें) को त्यागें। फिर शुद्ध समाधान के निम्नलिखित 1.0-1.5 एमएल एकत्र करें (अधिक विशिष्ट विवरणों के लिए निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करें)।
      3. सिरिंज-चालित फिल्टर (0.22-0.45 माइक्रोन) का उपयोग करके परिणामी शुद्ध समाधान को निष्फल करके निस्पंदन प्रक्रिया को समाप्त करें।
      4. कॉलम को साफ और रीसायकल करने के लिए, फिब्रिनोजेन बफर के 20 एमएल के साथ धोएं, और फिर 20% इथेनॉल के 25 एमएल में स्टोर करें।
  2. उन्मूलन के बाद, विस्तारित जैल की वांछित संख्या के आधार पर, परिणामी शुद्ध लेबल-फाइब्रिनोजेन को ~ 7-50 माइक्रोन के छोटे एलिकोट्स में विभाजित करें। प्रत्येक फैला हुआ 2 मिमी व्यास सर्कल जेल के लिए, लगभग 3.5 माइक्रोनल फिब्रिनोजेन तैयार करें (2.5 माइक्रोल का उपयोग प्रति जेल + 1 माइक्रोन पाइपिंग त्रुटियों के लिए किया जाएगा)।
    1. एलिकोट्स को -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्टोर करें। वे के बारे में एक साल तक इस्तेमाल किया जा सकता है (यह गल और फिर से फ्रीज करने की सिफारिश नहीं है) ।
    2. इस प्रोटोकॉल के शेष के लिए, चरण 4 तक फ्रिज (4 डिग्री सेल्सियस) में शुद्ध लेबल वाले फाइब्रिनोजन के लगभग 7 माइक्रोन रखें। यह मात्रा दो फैला हुआ जैल के निर्माण के लिए है (प्रति जेल 2.5 माइक्रोन की आवश्यकता होती है, और नमूना तैयारी में त्रुटियों के लिए 1 माइक्रोन की अतिरिक्त मात्रा का उपयोग किया जाता है)।
      नोट: यह फ़िल्टरिंग प्रक्रिया आम तौर पर प्रारंभिक 15 मिलीग्राम/एमएल फाइब्रिनोजेन समाधान को लगभग 10 मिलीग्राम/एमएल की अंतिम एकाग्रता के लिए पतला करती है । कमजोर पड़ने का कारक निर्माता के प्रोटोकॉल में निर्दिष्ट फाइब्रिनोजेन की प्रारंभिक मात्रा और एकाग्रता पर निर्भर करता है।
  3. थ्रोम्बिन समाधान के 7 माइक्रोन तैयार करें (थ्रोम्बिन बफर का उपयोग करके 2 इकाइयों/एमएल, सामग्री की तालिका)का उपयोग करके पतला करें और चरण 4 तक रेफ्रिजरेटर (4 डिग्री सेल्सियस) में रखें। इस मात्रा का उद्देश्य दो फैला हुआ जैल के कट-आउट को भरना है।
    नोट: आंतरिक तनाव विश्लेषण करने के लिए, 1 माइक्रोन व्यास फ्लोरोसेंट गोलाकार मोती (पानी में निलंबन [2% ठोस] के रूप में खरीदा गया प्लस 2 एमएमएन3)थ्रोम्बिन समाधान में जोड़ा जाना चाहिए (1:25 v/v% मनका का अनुपात: थ्रोम्बिन 40x उद्देश्य के लिए अनुशंसित है)। मोतियों को केवल तभी शामिल किया जाना चाहिए जब आंतरिक तनाव माप वांछित हों, या तो उपस्थिति या कोशिकाओं की अनुपस्थिति में।

2. सिलिकॉन पट्टी की तैयारी

  1. 0.5 मिमी मोटी सिलिकॉन रबर को पुनः प्राप्त करें और इसे स्ट्रिप (चित्रा 1) के केंद्र में2 मिमी व्यास छेद के साथ 15 x 80मिमी 2स्ट्रिप्स में काटें। यदि संभव हो, तो उच्च परिशुद्धता के लिए एक प्रोग्रामेबल लेजर कटर का उपयोग करें। यदि प्रोग्राम करने योग्य मशीनरी उपलब्ध नहीं है, तो कैंची स्ट्रिप आउटलाइन को काटने के लिए पर्याप्त है और केंद्र कट-आउट के लिए एक छोटा छेद-पंच पर्याप्त है।
    नोट: वाणिज्यिक सिलिकॉन रबर आमतौर पर दोनों पक्षों पर प्लास्टिक की चादर के साथ खरीदा जाता है । यदि संभव हो तो सिलिकॉन के दोनों किनारों पर मूल प्लास्टिक कवर रखें। यदि पिछले प्रयोग से सिलिकॉन स्ट्रिप्स का पुन: उपयोग करते हैं, तो उन्हें 0.5 घंटे के लिए ट्रिप्सिन के साथ इलाज करें, 0.5 घंटे के लिए 0.2 एम नाओएच में भिगोएं, और फिर 1 घंटे के लिए 70% इथेनॉल में भिगोएं। उपयोग से पहले उन्हें सूखने दें।
  2. कम से कम 20 × 30मिमी2 के आयामों के साथ सीलिंग फिल्म (हाइड्रोफोबिक) परतें तैयार करें, इसलिए वे सिलिकॉन पट्टी से व्यापक हैं और इस प्रकार पूरे ज्यामितीय कट-आउट पर सील बनाने की अनुमति देते हैं।
  3. 70% इथेनॉल के साथ 10 सेमी डिश धोएं, और फिर गैर-लिंटिंग नाजुक कार्य पोंछे (बाँझ और गैर-बाँझ प्रयोगों दोनों के लिए) के साथ पोंछें और सूखें। यह कदम महत्वपूर्ण है क्योंकि यह सीलिंग फिल्म परतों को बेहतर प्लेट से चिपके रहने और तैयारी प्रक्रिया के दौरान नमूना के आंदोलन को प्रतिबंधित करने की अनुमति देता है।
  4. धोया 10 सेमी पकवान में सीलिंग फिल्म परतों प्लेस तो वहां पर्याप्त जगह के लिए प्रत्येक पकवान में दो स्ट्रिप्स जगह के साथ-साथ(चित्रा 2A)है ।
    1. सिलिकॉन पट्टी के एक तरफ से प्लास्टिक की चादर निकालें और सीलिंग फिल्म परत पर उजागर पक्ष जगह है तो कट आउट सीलिंग फिल्म परत(चित्रा 2B)से पूरी तरह से घिरा हुआ है । फिर, साफ दस्ताने उंगलियों का उपयोग करके कट-आउट के आसपास के क्षेत्र को सील करने के लिए सीलिंग फिल्म परत के खिलाफ सिलिकॉन पर धीरे से दबाएं।
      नोट: सुनिश्चित करें कि सिलिकॉन और सीलिंग फिल्म के बीच कोई हवा-जेब नहीं हैं, विशेष रूप से कट-आउट के आसपास। डिश(चित्रा 2C)के नीचे की ओर की जांच करके ऐसा करें ।

Figure 1
चित्रा 1: हाइड्रोजेल तनाव दृष्टिकोण। (A)15 × 80 मिमी2 सिलिकॉन स्ट्रिप जिसमें स्ट्रिप के केंद्र में 2 मिमी व्यास कट-आउट(बी)एंबेडेड फिब्रिन जेल के साथ एक गोलाकार कट-आउट के साथ सिलिकॉन स्ट्रिप है। उदाहरण के प्रयोजनों के लिए, सिलिकॉन में कट-आउट सिलिकॉन स्ट्रिप (नारंगी), परिपत्र जेल (बीच में कट-आउट) और कपड़े एक्सटेंडर (ग्रीन) के साथ खींच दृष्टिकोण के वास्तविक प्रयोगों(सी)योजनाबद्ध) की तुलना में बड़ा है, और कपड़े विस्तारक (हरे रंग) जो सिलिकॉन को खींचने वाले डिवाइस से जोड़ते हैं। जेल का बढ़ा हुआ क्षेत्र सिलिकॉन के एकीकृत खींच के जवाब में जेल के विरूपण को इंगित करता है। सादगी के लिए, जेल(जेड-एक्सिस)की मोटाई के साथ संपीड़न चित्रण में नहीं दिखाया गया है। आंकड़े 1B और 1C Roitblat Riba एट al.४१कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें से अनुकूलित किया गया है ।

Figure 2
चित्रा 2: जेल बहुलीकरण से पहले सीलिंग फिल्म परत पर सिलिकॉन स्ट्रिप के उचित प्लेसमेंट का उदाहरण। }10 सेमी डिश में दो सीलिंग फिल्म लेयर का प्लेसमेंट(B)सीलिंग फिल्म लेयर्स पर सिलिकॉन स्ट्रिप्स का प्लेसमेंट(सी)नीचे-देखें डिश, सिलिकॉन और सीलिंग फिल्म लेयर के बीच एयर-सील प्रदर्शित करना । बाएं:एयर-पॉकेट के बिना कट-आउट के चारों ओर सिलिकॉन पट्टी के लिए सीलिंग फिल्म परत की उचित मुहर। सही:सिलिकॉन स्ट्रिप कट-आउट के लिए सीलिंग फिल्म परत की अनुचित सील कट-आउट के किनारे के चारों ओर हवा की जेब के साथ। इससे सिलिकॉन के नीचे हाइड्रोजेल घटकों का रिसाव होगा। लाल तीर एक ऐसे क्षेत्र की ओर इशारा करता है जहां एक हवा की जेब का गठन किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

3. कोशिकाओं के साथ थ्रोम्बिन तैयार करना

नोट: इस कदम को तभी करें जब हाइड्रोगेल में कोशिकाओं को एम्बेड करना वांछित हो, और जैविक हुड(सामग्रियों की तालिका)में बाँझ परिस्थितियों में।

  1. नसबंदी: सेलुलर प्रयोग से पहले दिन, सिलिकॉन स्ट्रिप्स और सीलिंग फिल्म परतों को रात भर 70% इथेनॉल में रखें और फिर प्रत्येक तरफ 30 मिनट के लिए यूवी नसबंदी करें (यदि 10 सेमी व्यंजन पहले से बाँझ नहीं हैं, तो उन्हें 70% इथेनॉल धोने के बाद 30 मिनट के लिए यूवी प्रकाश के तहत भी निष्फल किया जाना चाहिए)। प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली यूवी प्रणाली जैविक हुड में निर्मित है।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, सिलिकॉन स्ट्रिप्स पर एक ऑटोक्लेव नसबंदी चक्र (140 डिग्री सेल्सियस) किया जा सकता है क्योंकि वे 260 डिग्री सेल्सियस तक प्रतिरोधी हैं।
  2. सेल एकाग्रता निर्धारित करने के लिए एक सेल काउंट करें, और फिर 1.5 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में थ्रोम्बिन (2 इकाइयों/एमएल) के 7 माइक्रोन के साथ सेल पेलेट को फिर से निलंबित करें। हम 800 कोशिकाओं की कोशिका एकाग्रता की सलाह देते हैं/ कोशिकाओं को तब तक ठंडा रखें जब तक उपयोग न हो जाए (कोशिकाओं को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए आधे घंटे से अधिक न करें)।

4. फाइब्रिन जैल का बहुलीकरण

  1. रेफ्रिजरेटर (स्टेप 1 में तैयार) से 2 यूनिट/एमएल थ्रोम्बिन और 10 मिलीग्राम/एमएल लेबल-फाइब्रिनोजेन समाधान ों को पुनः प्राप्त करें और उन्हें बर्फ पर रखें जहां वे सुलभ होंगे ।
    नोट: पॉलीमराइजेशन रिएक्शन गतिज को धीमा करने के लिए मिश्रण प्रक्रिया से पहले समाधानों को ठंडा रखा जाता है। यह प्रोटीन के अधिक समरूप मिश्रण के लिए अनुमति देता है।
  2. डिश (es) सेट अप (चरण 2) के साथ, लेबल-फाइब्रिनोजेन के 2.5 माइक्रोन निकालें और इसे सिलिकॉन कट-आउट (इसके नीचे की ओर से जुड़ी सीलिंग फिल्म परत के साथ) में समान रूप से निकालें ताकि कट-आउट की पूरी परिधि फाइब्रिनोजेन के संपर्क में हो। सावधान रहें कि किसी भी हवा-जेब या बुलबुले को समाधान में कहीं भी बनाने की अनुमति न दें, कट-आउट (सीलिंग फिल्म परत और सिलिकॉन के बीच इंटरफ़ेस) के निचले किनारों पर विशेष ध्यान दें।
  3. तुरंत थ्रोम्बिन (कोशिकाओं/मोतियों के साथ या बिना) के 2.5 माइक्रोन लें और इसे सीधे कट-आउट (5 माइक्रोल फाइब्रिन की अंतिम मात्रा तक पहुंचने) में फाइब्रिनोजेन समाधान में पिपेट करें। फिर जल्दी से ~ 10 बार ध्यान से ऊपर और नीचे पाइपिंग द्वारा दो समाधान मिश्रण। मिश्रण प्रक्रिया के दौरान, टिप को पूरी मात्रा के चारों ओर ले जाएं ताकि यथासंभव समरूप समाधान बनाया जा सके।
  4. प्रत्येक डिश के किनारे के साथ फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस) [वैकल्पिक रूप से सेल प्रयोगों के लिए सेल माध्यम, सामग्री की तालिका]की एक बहुत छोटी मात्रा जोड़ें ताकि पॉलीमेशन प्रक्रिया के दौरान हाइड्रोगेल सूख न जाए। सुनिश्चित करें कि पीबीएस/सेल माध्यम और नमूनों के बीच कोई संपर्क नहीं है क्योंकि इससे नमूने को नुकसान होगा ।
  5. डिश (es) को कवर करें और उन्हें 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में रखें।
    नोट: आवश्यक इनक्यूबेशन समय जेल की मात्रा पर निर्भर है। यदि बड़ी मात्रा का उपयोग किया जाता है, तो इनक्यूबेशन समय बढ़ जाना चाहिए।
  6. इनक्यूबेटर से डिश (es) निकालें और पकवान के लिए PBS/सेल माध्यम जोड़ें, पूरे जेल सिलिकॉन निर्माण जलमग्न ।
  7. ध्यान से नमूना एक समय में पकवान से एक निर्माण उठा यकीन है कि सीलिंग फिल्म परत पट्टी का पालन किया जाता है बना रही है । धीरे-धीरे सिलिकॉन से सीलिंग फिल्म परत को धीरे-धीरे सिलिकॉन के एक छोर से दूसरे(चित्रा 3)में पीटकर अलग कर दिया। कट-आउट के करीब के क्षेत्रों से खींचने से बचें जहां तनाव सांद्रता मौजूद हो सकती है (यह गैर-परिपत्र ज्यामिति के लिए मुख्य रूप से महत्वपूर्ण है)। कट-आउट के साथ किसी भी संपर्क से बचें क्योंकि यह नमूना को नुकसान पहुंचाएगा।
  8. स्ट्रिप को वापस पीबीएस/सेल मीडियम के साथ डिश में रखें ताकि स्ट्रिप डिश में तैर रही हो । फिर प्रत्येक नमूने की स्थिति का गुणात्मक रूप से आकलन करने के लिए डिश (es) को एक मानक सेल-कल्चर माइक्रोस्कोप में ले जाएं। जैल एक समान होना चाहिए, कट-आउट में निरंतर, और कोई बुलबुले मौजूद नहीं होने चाहिए। एक गाइड के रूप में चित्रा 4 का उपयोग करना, आगे के विश्लेषण के लिए सबसे अच्छा नमूनों का चयन करें।

Figure 3
चित्रा 3: सिलिकॉन पट्टी के नीचे से सीलिंग फिल्म परत का उचित निष्कासन। हटाने की प्रक्रिया धीरे-धीरे की जानी चाहिए ताकि हाइड्रोगेल कट-आउट की आंतरिक दीवारों के साथ अपने आसंजन को फाड़ या तोड़ न दे। सफेद तीर हटाने की दिशा दिखाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: सिलिकॉन कट-आउट में फाइब्रिन जैल का सूक्ष्म अवलोकन। (क)ठीक से पॉलीमराइज्ड फिब्रिन जेल के दो उदाहरण। जेल की सापेक्ष एकरूपता और कट-आउट(बी)के किनारों पर पूर्ण आसंजन पर ध्यान दें नमूना बहुलीकरण विफलता के दो उदाहरण। शीर्ष:नीचे बाईं ओर बनने वाले कई बुलबुले और समुच्चय पर ध्यान दें। नीचे:कट-आउट किनारों से जेल के फाड़ने और कट-आउट के नीचे बाएं क्षेत्र में समुच्चय पर ध्यान दें। स्केल बार = 300 माइक्रोन कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

5. SCyUS डिवाइस पर नमूना लोड हो रहा है

  1. PBS/सेल माध्यम(चित्रा 5)के साथ स्नान भरें और सिलिकॉन पट्टी शीर्ष भर में नमूना जेल ले जाने तो समाप्त होता है स्नान के प्रत्येक पक्ष पर बैठे हैं । स्नान जेल के किसी भी सूखने से बचने के लिए होता है। कपड़े स्ट्रिप्स (हरे) के साथ क्लैंप (बैंगनी) को रखें और कस दें ताकि सभी टुकड़े केंद्र में कट-आउट(चित्रा 5)के साथ एक सीधी पट्टी बनाने के लिए जुड़े हों।
  2. SCyUS डिवाइस को पुनः प्राप्त करें और एल्यूमीनियम तरल अच्छी तरह से और 22 मिमी x 40 मिमी आयताकार ग्लास कवरलिप (नंबर 1 या 1.5)(चित्रा 6Aiii)संलग्न करें। सीलिंग सामग्री (जैसे, वैक्यूम तेल) का उपयोग करके कुएं के नीचे कवर स्लिप संलग्न करें ताकि अच्छी तरह से रिसाव के बिना तरल से भरा जा सके।
    1. पीबीएस/सेल मीडियम के ~ 1-2 एमएल से अच्छी तरह से भरें और स्ट्रिप + फैब्रिक + जेल का निर्माण(चित्रा 6B)को डिवाइस में रखें । कपड़े की पट्टी(2)को ब्रैकेट में दबा दें(1)ताकि कट-आउट + जेल(5)केंद्र में हो जैसा कि दिखाया गया है, फिर ध्यान से पिन-डाउनडालने (4)को डिवाइस में रखें और इसे जगह में लॉक करें।
    2. इसके बाद, धुरी के लिए अन्य कपड़े की ओर डालें (सर्वोमोटर संलग्न किए बिना) और इसे धुरी(चित्रा 6C)में बंद करें।
  3. माइक्रोस्कोप(चित्रा 6C)के चरण में संलग्न नमूने के साथ SCyUS डिवाइस डालें। यूएसबी केबल के माध्यम से कंप्यूटर से माइक्रोकंट्रोलर(सामग्री की तालिका)कनेक्ट करें और सर्वोमोटर को माइक्रोकंट्रोलर से कनेक्ट करें। कंप्यूटर पर SCyUS नियंत्रण मॉड्यूल खोलें। अब यह नमूना कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के तहत जेल की मोटाई और फाइबर एकरूपता की पर्याप्तता की जांच करने के लिए इमेजिंग के लिए तैयार है।

Figure 5
चित्रा 5: (A)जिग जिसमें पीबीएस बाथ (3 डी मुद्रित)(बी)जिग पर स्ट्रिप प्लेसमेंट होता है ताकि कोष्ठक (बैंगनी रंग में) की उचित इन-लाइन अटैचमेंट सुनिश्चित किया जा सके और जेल के सूखने को रोका जा सके । इस आंकड़े को Roitblat Riba एट अल से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है ।४१कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: SCyUS खींच डिवाइस। (ए)SCyUS के मुख्य भागों के एक सीएडी मॉडल के कई विचार: सर्वो (नीला), स्थिर लंगर (लाल) से जुड़े धुरी, डालें कि सिलिकॉन पट्टी नीचे पिन (बैंगनी) और फिक्सर है कि ऊपर उठने से डालने को रोकने (पीला-हरा) । सिस्टम का एक शीर्ष दृश्य(एआई),सिस्टम का एक कट दृश्य(एआईआई)स्ट्रिप (ऑरेंज लाइन) का रास्ता दिखाता है, और एक ग्लास कवरलिप के साथ एल्यूमीनियम तरल का एक बॉटम व्यू(एआईई)अच्छी तरह से। तरल कुएं को प्रमुख थ्रेडिंग में लगे पेंच की बारी के साथ ऊपर और नीचे ले जाया जा सकता है। एल्यूमीनियम अच्छी तरह से ऊपर की ओर आंदोलन बैंगनी डालने की ओर पंखों से सीमित है, जैसा कि सफेद तीर(बी)वास्तविक प्रणाली द्वारा दिखाया गया है:(1)स्टेटिक एंकर(2)हरे रंग के गैर-स्ट्रेचेबल फैब्रिक(3)एल्यूमीनियम लिक्विड वेल हाइट कंट्रोल के लिए पेंच(4)रेड पिन-डाउनडालने (5)एक सिलिकॉन स्ट्रिप जिसमें एक गोलाकार कट-आउट(6)ब्लू कनेक्टिंग क्लैंप(सी)एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर रखा गया स्ट्रेचिंग सिस्टम । सर्वोमोटर और धुरी को तीर से दिखाया गया है। इस आंकड़े को Roitblat Riba एट अल से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है ।४१कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

6. नमूने के लिए पर्याप्त जेल सुनिश्चित करें

  1. कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप(सामग्री की तालिका) काउपयोग करके कम आवर्धन (10×), कम-रिज़ॉल्यूशन (~ 1.4 माइक्रोन x 1.4 माइक्रोन पिक्सेल आकार) कॉन्फोकल जेड-स्टैक (≤10 जेड-स्लाइस के एक कदम आकार के साथ ले लो लगभग 10 माइक्रोन पर्याप्त है) सिलिकॉन की मोटाई (चित्रा 7ए-बी)में ज्यामितीय कट-आउट की परिधि के लिए एकरूपता और आसंजन की जांच करने के लिए 488/543/561 के लेजर का उपयोग करके पूरे जेल की टाइल छवि। निम्नलिखित चरणों के लिए मानचित्र के रूप में इस जेड-स्टैक छवि का उपयोग करें।
  2. कम रिज़ॉल्यूशन लाइव इमेजिंग का उपयोग करके, जेल को स्कैन करें और सबसे कम जेड-स्थितिनिर्धारित करें जहां कट-आउट की भीतरी दीवारों पर पूर्ण आसंजन कोई आंसू या बुलबुले के साथ स्पष्ट है और माइक्रोस्कोप(जेडएल)के जेड-स्थानपर ध्यान दें। अपनी परिधि के दौरान सिलिकॉन के लिए जेल के पूर्ण आसंजन का निर्धारण करने के लिए, जेल के फ्लोरोसेंट लेबल के इंटरफेस और माइक्रोस्कोप(चित्रा 7C)के तहत सिलिकॉन स्ट्रिप (डार्क बैकग्राउंड) को स्कैन करें।
  3. जेड-दिशामें तब तक जाएं जब तक कि जेल में अब निरंतरता न हो और जेड-पोजिशन(जेडयू)पर ध्यान दें:
  4. जेड-दिशाकी ऊपरी सीमा(जेडएल)को कमसीमा से घटाएं । यह नमूने की संदर्भ मोटाई है(जेडओ):
    Equation 1
    यदि जेडओ 100 माइक्रोन ≥ है तो जेल को विश्लेषण के लिए संतोषजनक माना जाता है। ध्यान दें कि सिलिकॉन कट-आउट की मोटाई लगभग 500 माइक्रोन है, लेकिन कट-आउट में जेल बहुलीकरण आमतौर पर एक छोटे जेल मोटाई में परिणाम देता है। 100 माइक्रोन सिलिकॉन कट-आउट से जेल के आंसू या टुकड़ी के बिना, एक स्थिर खींच प्रक्रिया सुनिश्चित करने के लिए न्यूनतम अनुशंसित मोटाई है।
    नोट: विभिन्न XY स्थानों पर, जेल की मोटाई भिन्न हो सकती है। प्रोटोकॉल का यह खंड जेल की न्यूनतम मोटाई को मापता है, जिससे हम जेल की गुणवत्ता निर्धारित कर सकते हैं और इंगित करते हैं कि क्या यह खींचने के लिए पर्याप्त है। इसके अतिरिक्त, जेल के केंद्र को ढूंढना पोस्ट-स्ट्रेचिंग पर लौटने के लिए एक संदर्भ बिंदु प्रदान करता है, चाहे वह स्थिर या गतिशील हो।

Figure 7
चित्रा 7: जेल एकरूपता। टाइल छवियों पर कब्जा कर लिया और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर(सामग्री की मेज)(ए)का उपयोग कर सिले गए थे एक एकल सिले टाइल जेड-एकफाइब्रिन जेल नमूने की छवि का टुकड़ा अनुचित थ्रोम्बिन और फाइब्रिनजेन मिश्रण पूर्व बहुलकीकरण के कारण अपेक्षाकृत अधेनेस फाइबर घनत्व के साथ । यह जेल अपेक्षाकृत समरूप फाइबर घनत्व के साथ एक फाइब्रिन जेल नमूने की एक एकल सिले टाइल जेड-स्लाइसछवि एक विश्वसनीय विश्लेषण(बी)प्रदान नहीं करेगा। यह प्रयोगों को खींचने के लिए एक स्वीकार्य जेल है। छवियों के लिए स्केल बार ए और बी फ्लोरोसेंटली लेबल वाले जेल (लाल) और सिलिकॉन (काली पृष्ठभूमि) के बीच इंटरफेस में 200 माइक्रोन (सी)ज़ूम है। स्केल बार = 100 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

7. SCyUS ऑपरेशन, खींच और इमेजिंग

  1. अब जब कि नमूना संतोषजनक गुणवत्ता का होना निर्धारित किया गया है और SCyUS डिवाइस पर ठीक से सेट है, नमूना की पूर्व फैला स्थिति निर्धारित करते हैं । यह कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप (चरण 6.2 के समान) के तहत लाइव इमेजिंग का उपयोग करके हासिल किया जाता है।
    1. सुनिश्चित करें कि सर्वोमोटर गो टू जीरो सर्वो पोस बटन (चित्रा 8A पर क्लिक करें और यह सुनिश्चित करके कि चित्रा 8B शून्य प्रदर्शित करता है) पर क्लिक करके अपनी शून्य स्थिति में है और इसे खींचने वाले डिवाइस से संलग्न करता है जैसा कि चित्रा 6Cमें देखा गया है।
      नोट: इस कदम को धीरे-धीरे और सावधानी से करें क्योंकि नमूने पर कोई अतिरिक्त तनाव न डालें।
    2. नमूना इमेजिंग करते समय, मोटर एक डिग्री(चित्रा 8C)को दक्षिणावर्त दिशा में एक समय में +1 बटन पर क्लिक करके स्थानांतरित करें जब तक कि कट-आउट के दाईं ओर स्थानांतरित करने के लिए मनाया न जाए। फिर, -1 बटन पर क्लिक करके आंदोलन(चित्रा 8D)को अंतिम चरण की स्थिति में वापस रिवर्स करें। यह सत्यापित करता है कि नमूना न्यूनतम तनाव में है। संदर्भ स्थिति सेट करने के लिए सेट मिन सर्वो पोजिशन बटन(चित्रा 8E)पर क्लिक करें। गो टू मिन सर्वो पोजीशन बटन(चित्रा 8F)पर क्लिक करके किसी भी समय संदर्भ स्थिति में लौटना संभव है।
      नोट: त्रुटि को कम करने के लिए इस चरण के लिए उच्च आवर्धन उद्देश्य (≥40×) का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।
    3. एक उच्च आवर्धन (40×), उच्च संकल्प (~ 0.2 माइक्रोन × 0.2 माइक्रोन पिक्सेल आकार), पूरे जेल क्षेत्र के एकल जेड-स्लाइस टाइल छवि पर कब्जा करें। इसका उपयोग पोस्ट-प्रोसेसिंग विश्लेषण के लिए संदर्भ छवि के रूप में किया जाएगा। जेल की मोटाई केबीच में एक जेड -स्लाइस छवि को कैप्चर करने की सिफारिश की जाती है (ईक्यू 1से जेडओ का उपयोग करके), यह खींचने के बाद लगभग एक ही जेड-स्थितिमें वापसी की अनुमति देगा। इसके अलावा, ध्यान रखें कि पूरे जेल क्षेत्र की उच्च-रिज़ॉल्यूशन टाइल छवियों में काफी समय (~ 20-30 मिनट) होता है।
    4. अब सैंपल स्टेटिक स्ट्रेचिंग के लिए तैयार है। जीयूआई में एक समय में एक डिग्री(चित्रा 8C)को आगे बढ़ाते हुए वांछित खिंचाव परिमाण में सर्वोमोटर को समायोजित करें (इसे धीरे-धीरे, लगभग 1 डिग्री/सेकंड करें)।
  2. प्रत्येक खंड परिमाण में जहां विश्लेषण वांछित है, प्रसंस्करण के बाद विश्लेषण के लिए पूरे जेल क्षेत्र की एक जेड-स्लाइस हाई-रिज़ॉल्यूशन टाइल छवि कैप्चर करें। चरण 6.2 के समान, सत्यापित करें कि जेल ने जेल (लाल) और सिलिकॉन (अंधेरे पृष्ठभूमि) के बीच इंटरफ़ेस को स्कैन करके अपनी परिधि के दौरान सिलिकॉन से अलग नहीं किया है, जो पिछले खिंचाव परिमाण से आसंजन में परिवर्तन की तलाश में है।
    नोट: मोटर की सक्रियता के दौरान, एक्स-वाई (कम रिज़ॉल्यूशन, कम आवर्धन सेटिंग्स के साथ) में जेल स्थान का पालन करने के लिए लाइव इमेजिंग का उपयोग करें। जेल एक जेड-पॉइसन प्रभाव का अनुभव करता है जहां जेल का निचला हिस्सा उगता है, इसलिए माइक्रोस्कोप की जेड-स्थितिको हर खिंचाव परिमाण के लिए जेल मोटाई के अनुमानित केंद्र में भी समायोजित किया जाना चाहिए। यह प्रत्येक खंड परिमाण के लिए जेडओ (Eq. 1)की पुनर्गणना करके प्राप्त किया जा सकता है। चूंकि जेड-दिशामें खिंचाव अपेक्षाकृत समरूप है, इसलिए जेल की सटीक केंद्र गहराई को ढूंढना महत्वपूर्ण नहीं है।

Figure 8
चित्रा 8: SCyUS नियंत्रण मॉड्यूल के लिए जीयूआई। }डिग्री में मोटर की स्थिति। मूल्य -90 डिग्री से 90 डिग्री(बी)'सेट मिनिमम सर्वो पोजीशन' से लेकर है। यह बटन एक पूर्व-निर्धारित न्यूनतम स्थिति के लिए अनुमति देता है, एक नई संदर्भ स्थिति स्थापित करने के लिए जो शून्य सर्वो स्थिति(सी)'प्लस 1 डिग्री' बटन से अलग है, सर्वो मोटर को एक डिग्री दक्षिणावर्त(डी)'माइनस 1 डिग्री' बटन सर्वो मोटर वन-डिग्री ले जाता है काउंटर-क्लॉकवाइज(ई)'जीरो पोजीशन पर जाएं' बटन सर्वोमोटर स्थिति को 0 डिग्री ([ए] सेट करने के लिए सेट किया जाएगा शून्य करने के लिए सेट किया जाएगा)(एफ)'न्यूनतम सर्वो स्थिति में जाएं' बटन सर्वोमोटर को परिभाषित 'मिन' स्थिति में ले जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

8. पोस्ट-प्रोसेसिंग बाहरी तनाव माप

  1. कट-आउट सीमाओं के प्रभावी उपभेदों को मापने के लिए, वाई-एक्सिस(चित्रा 9A)के केंद्र में खिंचाव दिशा(एक्स-एक्सिस)में किनारे से किनारे की लंबाई को मापें।
    1. इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर (इमेजजे फिजी43)पर प्री-स्ट्रेच इमेज अपलोड करें और सबसे बड़ी-बढ़त से किनारे की दूरी को मापें जिसे केंद्र में छेद की अक्षीय लंबाई () के रूप में परिभाषित किया गया Equation 8 है।
    2. ऊपर से नीचे तक की सबसे बड़ी दूरी को लंबवत दूरी () के रूप में परिभाषित करें Equation 6 ।
    3. सभी खिंचाव अंतराल छवियों के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं Equation 7 और Equation 5 कट-आउट परिधि(चित्रा 9A, नीचे)की अक्षीय () और लंबवत () दूरी की गणना करें और फिर कट-आउट किनारों के उपभेदों को खोजने के लिए निम्नलिखित गणनाएं करें:

Equation 2

Equation 3

Figure 9
चित्रा 9: सिलिकॉन पट्टी के बाहरी खींच के कारण जेल उपभेदों। (A) एक्स-वाई क्रॉस-सेक्शन एक संयुक्त राष्ट्र-फैला फिब्रिन जेल (ऊपर) का, और εछेद के आवेदन के बाद = एक्स दिशा (नीचे) के साथ 64% तनाव। जेल फ्लोरोसेंट मोतियों के साथ एम्बेडेड है। εछेद की गणना के लिए उपयोग की जाने वाली डी और एल की प्रासंगिक लंबाई छवियों में इंगित की जाती है(बी)ज़ूम-इन छवियों में धराशायी वर्ग क्षेत्र में चिह्नित इस अध्ययन में विचार किए जानेवालेतनाव प्रकारों का चित्रण: εछेद अपने अधिकतम व्यास पर कट-आउट का अक्षीय तनाव है, और εजेल जेल के केंद्र में अक्षीय तनाव है (जैसा कि मनका कुल स्थानों द्वारा मापा जाता है)(डी) xx दिशा (लाल रेखा) और वाई दिशा (हरी रेखा) दोनों में εछेद और εजेल के बीच एक रैखिक संबंध पाया गया था। इस आंकड़े को Roitblat Riba एट अल से अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया है ।४१कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

9. फाइबर ओरिएंटेशन विश्लेषण

  1. खिंचाव के परिमाण को बढ़ाने के लिए रेशेदार जेल की संरचनात्मक प्रतिक्रिया को चिह्नित करने के लिए फाइबर संरेखण के मात्राकरण का उपयोग करें। इमेजजे फिजी सॉफ्टवेयर (एनआईएच)43 पर उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों को अपलोड करें और फिर ओरिएंटेशनजे (ईपीएफएल)44 मॉड्यूल (सेटिंग्स: गॉसियन रेडिएंट, और 3-पिक्सेल विंडो, फिगर 10)का उपयोग करके विश्लेषण करें।
    1. ओरिएंटेशन हिस्टोग्राम के 2D नेमेटिक ऑर्डर पैरामीटर (एनओपी) की गणना करें:45
      Equation 4
      नोट: एनओपी = 1 का एक मूल्य अक्षीय दिशा (कोण शून्य) के साथ सही संरेखण को इंगित करता है और एनओपी = 0 आइसोट्रोपी इंगित करता है। अभिविन्यास कोण, θ,छवि विश्लेषण के माध्यम से प्राप्त तनाव धुरी (एक्स-एक्सिस) के संबंध में फाइबर कोण है और ओरिएंटेशनजे दस्तावेज में ठीक से परिभाषित किया गया है। 44

Figure 10
चित्रा 10: फिजी इमेजजे सॉफ्टवेयर का उपयोग करके फाइबर ओरिएंटेशन विश्लेषण। (A)एक तीर के साथ इमेजजे का मुख्य मेनू जो 'प्लगइन्स' पुलडाउन मेनू के स्थान को दर्शाता है जहां 'ओरिएंटेशनजे' पाया जा सकता है। 'ओरिएंटेशनजे' के विस्तारित मेनू के तहत, 'ओरिएंटेशनजे डिस्ट्रीब्यूशन' विकल्प(B)ओरिएंटेशनजे के वितरण मॉड्यूल पर क्लिक करें। 'स्थानीय विंडो σ' को 3 पिक्सल और 'ग्रेडिएंट' को 'गॉसियन' सेट करें। इसके बाद 'भागो' बटन (लाल तीर) दबाएं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

10. मैनुअल आंतरिक जेल तनाव विश्लेषण

  1. एम्बेडेड मोतियों के साथ हाइड्रोजेल की लाइव हाई-आवर्धन इमेजिंग करते समय, प्रत्येक खंड परिमाण के बाद एक ही स्थान पर लौटने के लिए आसानी से पहचानने योग्य सुविधाओं (जैसे, मोतियों के समुच्चय) के साथ ब्याज के क्षेत्र (आरओआई) का मैन्युअल रूप से पता लगाएं।
    नोट: जेड-दिशा (Poisson प्रभाव) में संपीड़न खिंचाव बढ़ जाती है के रूप में मनका घनत्व में वृद्धि करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, इसलिए हम मनका चुनने का सुझाव काफी बड़ा समुच्चय, तो वे स्पष्ट रूप से पहचाने जाते हैं । यह प्रोटोकॉल फाइब्रिन जेल के मध्य क्षेत्र के विश्लेषण के लिए कहता है, हालांकि किसी भी क्षेत्र को चुना जा सकता है।
  2. प्री-स्ट्रेच स्थिति (चरण 6) में, चयनित आरओआई की एक उच्च-रिज़ॉल्यूशनजेड-स्टैक छवि पर कब्जा करें। प्रत्येक वांछित खिंचाव अंतराल के बाद, उसी आरओआई पर लौटें और छवि कैप्चर प्रक्रिया को दोहराएं।
  3. छवियों को लें और उन्हें इमेजजे में आयात करें। आरओआई में, प्रत्येक दृश्यमान मनका कुल के एक्स-वाई पिक्सेल स्थान को रिकॉर्ड करें। रिकॉर्ड किए गए डेटा को स्प्रेडशीट में स्थानांतरित करें।
  4. समुच्चय की हर जोड़ी के बीच की दूरियों को मापें और संदर्भ छवि में एक ही जोड़े की दूरियों से उनकी तुलना करें, जिससे एक्स और वाई दिशाओं में उपभेदों की गणना की अनुमति मिल सके।
    नोट: यदि जेल को (स्थिर छवि कैप्चर के बजाय) बढ़ाया जाता है, तो जेल को बढ़ाया जाता है, तो उपभेदों का एक स्वचालित विश्लेषण डिजिटल छवि या वॉल्यूम सहसंबंध (डीआईसी/डीवीसी) विधियों के साथ किया जा सकता है, जैसा कि पहले46,47का प्रदर्शन किया गया था। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि स्वचालित डीआईसी/डीवीसी विश्लेषण इस सेटिंग में चुनौतीपूर्ण है, क्योंकि जेड-स्टैकन केवल एक्स-वाई विमान में चल रहा है बल्कि पॉइसन प्रभाव (संपीड़न) के कारण जेड-दिशामें भी है, जो रिकॉर्ड की गई फिल्म के दौरान काफी बहाव के लिए लेखांकन है ।

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Representative Results

1 डी फ्लोरोसेंट मोतियों के साथ एम्बेडेड 3डी फाइब्रिन हाइड्रोगेल को ले जाने वाली सिलिकॉन स्ट्रिप पर लागू बढ़ते परिमाण के स्थिर खिंचाव से प्रतिनिधि डेटा, चित्र 9में दिखाया गया है। विश्लेषण कट-आउट के ज्यामितीय परिवर्तनों के साथ-साथ जेल के भीतर विकसित उपभेदों पर सिलिकॉन खिंचाव के प्रभाव को दर्शाता है। पूरे जेल की जेड-स्टैकछवियों का उपयोग मूल सर्कल के आकार के कट-आउट के विरूपण का मूल्यांकन करने के लिए किया जाता है, जो अण्डाकार ज्यामिति(चित्रा 9A)के लिए है। इन छवियों का उपयोग εxx(छेद)(समीकरण 2)की गणना करने के लिए किया जाता है। जेल स्ट्रेचिंग के दौरान कई मनका समुच्चय(चित्रा 9 बी)में ज़ूम इन और मैन्युअल रूप से ट्रैक करना, केंद्र में स्थानीय जेल उपभेदों की गणना के लिए अनुमति देता है, एक्सियल εएक्सएक्स(जेल)और लंबवत εवाई(जेल)दिशाओं(चित्रा 9सी, डी)। अक्षीय उपभेद सिलिकॉन कट-आउट किनारे से जेल के केंद्र तक अपेक्षाकृत रैखिक रूप से प्रचारित करते हैं और कंप्रेसिव लंबवत उपभेदों(चित्रा 9 डी)से बड़े होते हैं।

फ्लोरोसेंटली लेबल वाले जेल की उच्च आवर्धन छवियां सिलिकॉन खिंचाव से प्रेरित फाइबर संरेखण के अवलोकन और मात्राकरण के लिए अनुमति देती हैं। चित्रा 11 एक ठेठ संयुक्त राष्ट्र फैला हुआ है और अपेक्षाकृत आइसोट्रोपिक हाइड्रोजेल(चित्रा 11A)और उच्च ८०% कट आउट खिंचाव दिशा में अत्यधिक गठबंधन फाइबर चित्रण तनाव के तहत एक हाइड्रोजेल की छवियों में प्रतिनिधि ज़ूम-इन से पताचलता है (चित्रा 11B)। इमेजजे का उपयोग करके फाइबर रीओरिएंटेशन के विश्लेषण से फाइबर अलाइनमेंट (एनओपी) के बीच लगभग रैखिक निर्भरता और कट-आउट(εहोल)पर बाहरी तनाव 40% से ऊपर के उपभेदों तक, 40%(चित्रा 11D)से ऊपर के उपभेदों पर मध्यम संतृप्ति के साथ पता चला। चित्रा 12में विभिन्न जेड- स्लाइस में फाइबर संरेखण का विस्तृत विश्लेषण दिखाया गया है । यहां, फाइबर अलाइनमेंट के हिस्टोग्राम की गणना प्रत्येक जेड-स्लाइस(चित्रा 12 ए)के साथ-साथ उनके संबंधित एनओपी(चित्रा 12B)के लिए की जातीहै, और कट-आउट(चित्रा 12सी)के प्रत्येक बाहरी तनाव परिमाण के लिए सभी जेड-स्लाइसपर औसत एनओपी। जैसे-जैसे εछेद बढ़ता है, फाइबर संरेखण बढ़ता है, एक समग्र गैर-रैखिक वक्र के बाद जैसा कि चित्र 12Cमें दिखाया गया है। ध्यान दें कि जैल-अक्ष केसाथ पोइससन प्रभाव के कारण अनुबंध करता है, जो चित्रा 12Bमें उच्च उपभेदों पर छोटी रेखाओं द्वारा दर्शाया जाता है।

चूंकि पूरे जेल में आंतरिक उपभेदों का गहराई से विश्लेषण करना मुश्किल साबित हुआ है, इसलिए हम यहां फिब्रिन(चित्रा 13)के यांत्रिक गुणों को देखते हुए 2डी निरंतर सामग्री पर किए गए परिमित तत्व (एफई) सिमुलेशन के प्रारंभिक परिणाम प्रदान करते हैं। कट-आउट का बाहरी तनाव ~ 40% है और रंग-मानचित्र खिंचाव-प्रेरित तनाव क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है। रंग-मानचित्र 38%-42% से होता है, यह दर्शाता है कि परिपत्र जेल क्षेत्र में जेल उपभेद अपेक्षाकृत समरूप हैं। हम ध्यान दें कि यदि अन्य जेल ज्यामिति का उपयोग किया जाता है, तो तनाव में ढाल उत्पन्न हो सकते हैं, और यह भविष्य के अध्ययनों के लिए एक विषय है।

यह प्रदर्शित करने के लिए कि एम्बेडेड फाइब्रिन जैल उच्च उपभेदों (0 से +30%) और आवृत्तियों (1 हर्ट्ज तक) पर सिलिकॉन पट्टी के आसंजन को बनाए रख सकते हैं, हम प्रारंभिक परीक्षणों (इस परीक्षण के लिए प्रोटोकॉल इस काम में शामिल नहीं है) को दिखाते हैं जिसमें कट-आउट की भीतरी दीवारों से जैल की कोई टुकड़ी नहीं दिखाई देती है। तीन जैल का परीक्षण किया गया, ~87 मिनट की कुल अवधि के लिए जेल 1, 60 मिनट के लिए जेल 2 और 30 मिनट कुल(तालिका 1)के लिए जेल 3। इन तीनों मामलों में फाइब्रिन हाइड्रोगेल ने सिलिकॉन के लिए अपना आसंजन बनाए रखा।

Figure 11
चित्रा 11: बाहरी खिंचाव के जवाब में जेल फाइबर संरेखण। फ्लोरोसेंटी-लेबल वाले जेल के केंद्र में ली गई छवियां(ए)अनस्ट्रेचिंग और(बी) εछेद= 80%(सी)के आवेदन के बाद बढ़ते εछेद [%] उपभेदों के तहत फाइबर झुकाव के औसत हिस्टोग्राम। ग्रे त्रुटि सलाखों के तीन अलग जेल नमूनों के लिए ε छेद के एक समारोह के रूप में प्रत्येक परीक्षण तनाव(डी)औसत Nematic आदेश पैरामीटर (एनओपी) के लिए मूल्यांकन जेड में ४० स्लाइस के बीच मतभेदों का संकेत मिलता है (सहित "जेल 1" है कि चित्रा 11ए-सीमें विश्लेषण किया जाता है) । त्रुटि सलाखों के जेडमें स्लाइस के बीच मतभेद का संकेत-प्रत्येक खिंचाव परिमाण के ढेर । इस आंकड़े को Roitblat Riba एट अल से अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया है ।४१कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 12
चित्रा 12: विभिन्न जेड-स्लाइसके लिए फाइबर ओरिएंटेशन के ओरिएंटेशन44 टूल (इमेजजे सॉफ्टवेयर)43 (ए)3डी हिस्टोग्राम ऑफ फाइबर ओरिएंटेशन का उपयोग करके फाइबर ओरिएंटेशन का विश्लेषण। दिखाए गए दो हिस्टोग्राम के उदाहरण हैं जो फैला हुआ है(εछेद = 17.6%, शीर्ष) और संयुक्त राष्ट्र-फैला (नीचे) जैल। हिस्टोग्राम को सामान्यीकृत किया जाता है ताकि वक्र के तहत क्षेत्र 1(बी)परिणामस्वरूप एनओपी बनाम जेड-गहराईके बराबर हो; ग्राफ ε होल के एक समारोह के रूप में जेड-डेप(सी)मतलब एनओपी के एक समारोह के रूप में प्रत्येक हिस्टोग्राम के NOP की गणना से पता चलता है। त्रुटि सलाखों के एक ही जेल में एक ही XY बिंदु पर एक व्यक्तिगत खिंचाव परिमाण में सभी जेडस्लाइस के लिए NOP के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 13
चित्रा 13: एक फैला जेल का 2D परिमित तत्व (FE) सिमुलेशन। जेल(εछेद ≈ 40%) एक सिलिकॉन वाहक द्वारा फैलाया जाता है। तनाव क्षेत्र को अधिकतम प्रमुख तनाव के मूल्यों के साथ प्रस्तुत किया जाता है जहां मामूली ढाल मनाया जाता है। बिंदीदार रेखा द्वारा दर्शाया गया चक्र छेद की पूर्व-तनावपूर्ण ज्यामिति है, मूल लंबाई(एलओ)खिंचाव लागू होने से पहले एक्स-एक्सिस के साथ केंद्र की लंबाई है, और खिंचाव लागू होने के बाद एक्स-एक्सिस के साथ फैला हुआ लंबाई(एल)केंद्र लंबाई है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

जेल #1 डायनेमिक स्ट्रेन आयाम (फ्रीक्वेंसी 1 हर्ट्ज) गतिशील खिंचाव अवधि (न्यूनतम)
0-37% 0.1
1
5
15
30
0-48% 1
5
30
गतिशील खिंचाव के तहत कुल समय 87 मिनट
जेल #2 डायनेमिक स्ट्रेन आयाम (फ्रीक्वेंसी 1 हर्ट्ज) गतिशील खिंचाव अवधि (न्यूनतम)
0-30% 0
10
20
30
0-50% 30
गतिशील खिंचाव के तहत कुल समय 60 मिनट
जेल #3 डायनेमिक स्ट्रेन आयाम (फ्रीक्वेंसी 1 हर्ट्ज) गतिशील खिंचाव अवधि (न्यूनतम)
0-30% 10
20
30
गतिशील खिंचाव के तहत कुल समय 30 मिनट

तालिका 1: अवधारणा के गतिशील खिंचाव सबूत के प्रतिनिधि परिणाम। सिलिकॉन स्ट्रिप्स में तीन जैल एम्बेडेड थे और विभिन्न अवधियों के लिए गतिशील रूप से (1 हर्ट्ज) फैला हुआ था। उपभेदों शून्य से लेकर 30% से ऊपर विभिन्न परिमाण तक थे। सभी तीन जैल ने सिलिकॉन पट्टी के परिपत्र कट-आउट की भीतरी दीवारों पर सफलतापूर्वक अपने आसंजन को बनाए रख दिया।

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Discussion

यहां प्रस्तुत विधि और प्रोटोकॉल काफी हद तक Roitblat Riba एट अल द्वारा हमारे पिछले अध्ययन पर आधारित हैं ।४१ हम यहां पूर्ण कंप्यूटर सहायता प्राप्त डिजाइन (सीएडी), पायथन और SCyUS डिवाइस के माइक्रोकंट्रोलर कोड शामिल हैं ।

मौजूदा दृष्टिकोणों पर प्रस्तुत विधि के प्रमुख फायदों में उनकी परिधि से और लाइव कॉन्फोकल इमेजिंग के तहत बहुत नरम 3 डी हाइड्रोगेल (~ 100 पीए के लोचदार मॉड्यूलस) को तनाव देने की संभावना शामिल है। अन्य तरीके आमतौर पर जेड-एक्सिसमें तनाव क्षेत्रों को लागू करने की क्षमता में सीमित होते हैं और खींचते समय सीटू उच्च-आवर्धन माइक्रोस्कोपी छवियों में प्रदान करने में असमर्थ होते हैं, ज्यादातर नमूने से उद्देश्य लेंस तक काम करने की दूरी सीमाओं के कारण। अधिकांश उपलब्ध प्रणालियां 2डी सब्सट्रेट-स्ट्रेचिंग पर आधारित होती हैं, जो शारीरिक ऊतक वातावरण की नकल करने में सीमित हैं।

सिस्टम की सीमाओं में जेल के बाद पॉलीमराइजेशन(चित्रा 7 ए)के फाइबर घनत्व की संभावित असंगत एकरूपता शामिल है, खासकर जब बड़े जेल की मात्रा या जटिल ज्यामिति का उपयोग किया जाता है। इस तरह की गैर-एकरूपताएं जेल में गैर-समान उपभेदों और फाइबर संरेखण का कारण बन सकती हैं। इसके अलावा, अपेक्षाकृत गहरे जेड-सेक्शन(>30 माइक्रोन) पर ऑप्टिकल प्रतिबंध फाइबर अभिविन्यास के विश्लेषण में त्रुटियों को जन्म दे सकते हैं।

3 डी स्ट्रेचिंग प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण चरणों में निम्नलिखित (i) यह सुनिश्चित करना शामिल है कि नमूना जैल ने सिलिकॉन के भीतर ज्यामितीय कट-आउट की भीतरी दीवारों के लिए पूर्ण आसंजन हासिल किया है, बुलबुले या आंसू के बिना, विशेष रूप से जेड-दिशाके साथ। कम से कम 100 माइक्रोन(Eq. 1)की मोटाई के साथ नमूने की पूर्ण आसंजन और निरंतरता एक वांछित तनाव(ii) के लिए नमूने को मज़बूती से फैलाने के लिए महत्वपूर्ण है। सिलिकॉन स्ट्रिप को 3 डी मुद्रित जिग(चित्रा 5A)का उपयोग करके कोष्ठक और गैर-लोचदार कपड़े की लंबाई विस्तारकों से जोड़ना आवश्यक है और यह सत्यापित करना है कि सभी टुकड़े इन-लाइन संलग्न हैं, यह सुनिश्चित करते हुए कि तनाव सममित रूप से जेल में प्रेरित है। यह डिवाइस के धुरी(चित्रा 6बी-सी)(iii) के सही लोडिंग पर भी लागू होता है, ध्यान से नमूने के संदर्भ (पूर्व-खिंचाव) स्थिति को कैप्चर करें। यदि संदर्भ छवि ली जाती है, जबकि नमूना पहले से ही तनाव में है (उदाहरण के लिए, इस चरण से पहले सर्वोमोटर के लगाव के कारण), सभी तनाव माप गलत होंगे।

प्रस्तुत प्रोटोकॉल के संभावित भविष्य के अनुप्रयोगों और संशोधनों में निम्नलिखित शामिल हैं:

(i) सेल एम्बेडेड हाइड्रोगेल पर चक्रीय खिंचाव व्यवस्था लागू की जा सकती है। मोटर के गतिशील आंदोलन के रूप में माइक्रोकंट्रोलर सॉफ्टवेयर द्वारा एन्कोड किया जाता है, किसी भी चक्रीय प्रोफ़ाइल को प्रोग्राम किया जा सकता है, केवल संकल्प और सिस्टम में नियोजित मोटर की रोटेशन गति (रोइब्लाट रिबा एट अल41में उपलब्ध अधिक विवरण) द्वारा विवश किया जा सकता है। इस काम में, हमने दिखा दिया कि फाइब्रिन जेल गतिशील खिंचाव(तालिका 1)के तहत आसंजन को बनाए रख सकता है। हालांकि आगे परीक्षण आवश्यक है, चक्रीय लोडिंग के आवेदन हाइड्रोगेल और एम्बेडेड कोशिकाओं की गतिशील प्रतिक्रिया में अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा ।

2 सिलिकॉन कट-आउट की ज्यामिति और मात्रा को संशोधित किया जा सकता है। वर्तमान प्रोटोकॉल में, हमने केवल एक परिपत्र ज्यामिति में जैल पर ध्यान केंद्रित किया। ऐसी स्थितियों में, आंतरिक उपभेद पूरे जेल में अपेक्षाकृत सजातीय होते हैं, जैसा कि हमारे FE सिमुलेशन(चित्रा 13)द्वारा भविष्यवाणी की गई है। हालांकि, यदि सिलिकॉन के कट-आउट अनुभाग को संशोधित करके अन्य जेल ज्यामिति पर विचार किया जाएगा, तो ढाल उभरकर सामने आएंगे। उदाहरण के लिए, एक 'हीरा' के आकार का कट-आउट संभावित रूप से खिंचाव की दिशा के साथ कट-आउट की प्रारंभिक लंबाई में क्रमिक परिवर्तन के कारण जेल उपभेदों में ढाल का कारण बन सकता है। जेल तनाव नियंत्रण की यह विधि विशेष रूप से आकर्षक है, क्योंकि विभिन्न आकार के कट-आउट निर्माण के लिए अपेक्षाकृत तुच्छ हैं। इसके अतिरिक्त, सिलिकॉन कट-आउट की मोटाई और क्षेत्र को आसानी से जेल की मात्रा में समायोजन के लिए अनुमति देता है, कुछ माइक्रोलीटर की लघु मात्रा से मिमी-सेमी स्केल जेल आकार से जुड़े बड़े वॉल्यूम तक बदला जा सकता है। इसके अलावा, एक ही सिलिकॉन स्ट्रिप में कई कट-आउट शामिल करना संभव है, जिससे एक साथ कई जैल को खींचने की अनुमति होती है।

3 कोशिकाओं को हाइड्रोगेल में एम्बेडेड किया जा सकता है। कुछ चुनौतियां हैं जिन्हें फैला हुआ हाइड्रोगेल में कोशिकाओं को एम्बेड करते समय ध्यान में रखा जाना चाहिए। 3 डी हाइड्रोगेल में एम्बेडेड अधिकांश कोशिकाएं मैट्रिक्स पर काफी कर्षण बलों को लागू करती हैं, साथ ही समय के साथ मैट्रिक्स को अपमानित करती हैं। इसके परिणामस्वरूप वैश्विक संकुचन और जेल का पाचन हो सकता है, जिससे इनक्यूबेशन के लंबे समय में सिलिकॉन कट-आउट आंतरिक दीवार से जेल का वियोग हो सकता है। इस स्थिति से निपटने का एक संभावित तरीका कम सेल सांद्रता का उपयोग करना और सेलुलर प्रयोगों के समय को एक अंतराल तक सीमित करना है कि जेल संकुचन और गिरावट न्यूनतम है। हमने पहले 5 घंटे की अवधि में 10% की अवधि में फाइब्रिन जेल में फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं को बनाने की संभावना का प्रदर्शन किया है, सिलिकॉन कट-आउट41से जेल फाड़ने या वियोग के किसी भी सबूत के बिना।

(iv) इस सेटअप का परीक्षण अन्य प्रकार के हाइड्रोगेल के साथ भी किया जाना चाहिए, विशेष रूप से सिंथेटिक लोगों जैसे पॉलीएक्रिलेमाइड (पीएए) या पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) आधारित हाइड्रोगेल, जिनका उपयोग आमतौर पर सेल कल्चर के लिए किया जाता है । सिलिकॉन कट-आउट के लिए इन हाइड्रोगेल के प्राकृतिक आसंजन की जांच की जानी चाहिए, और यदि जेल खींचने के लिए अपर्याप्त पाया जाता है, तो आसंजन को प्रोत्साहित करने के लिए तकनीकों का उपयोग किया जाना चाहिए। कट-आउट सतह पर जैविक गोंद48,49 या रासायनिक उपचार50,51,52 के उपयोग पर विचार किया जाना चाहिए।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यहां शामिल कुछ आंकड़े कॉपीराइट क्लीयरेंस सेंटर से अनुमति द्वारा अनुकूलित किए गए हैं: स्प्रिंगर नेचर, बायोमेडिकल इंजीनियरिंग के इतिहास। लाइव माइक्रोस्कोपी इमेजिंग, ए रोइब्लाट रिबा, एस नाटान, ए कोलेल, एच रुशकिन, ओ त्चिचेयान, ए लेसमैन, कॉपीराइट© (2019) को सक्षम करते हुए एक समान जेड-एक्सिस उपभेदों के साथ 3डी हाइड्रोगेल्स को तनाव देते हैं।

https://doi.org/10.1007/s10439-019-02426-7

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 546 carboxylic acid, succinimidyl ester Invitrogen A20002
Cell Medium (DMEM High Glucose) Biological Industries 01-052-1A Add 10% FBS, 1% PNS, 1% L-Glutamine, 1% Sodium Pyruvate
Cover Slip #1.5 Bar-Naor Ltd. BN72204-30 22×40 mm
DIMETHYL SULPHOXIDE 99.5% GC DMSO Sigma-Aldrich Inc. D-5879-500 ML
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Biological Industries 02-023-1A
EVICEL Fibrin Sealant (Human) Omrix Biopharmaceuticals 3902 Fibrinogen: 70 mg/mL, Thrombin: 800-1200 IU/mL
Fibrinogen Buffer N/A Recipe for 1L: 7g NaCl, 2.94g trisodium citrate dihydrate, 9g glycine, 20g arginine hydrochloride & 0.15g calcium chloride dihydrate. Bring final volume to 1L with PuW (pH 7.0-7.2)
Fluorescent micro-beads FluoSpheres (1 µm) Invitrogen F8820 Orange (540/560)
Provided as suspension (2% solids) in water plus 2 mM sodium azide
High-Temperature Silicone Rubber McMaster-Carr 3788T41 580 µm-thick
E = 1.5 Mpa
Poisson Ratio = 0.48
Tensile Strength = 4.8 MPa
Upper limit of stretch = +300% engineering strain
HiTrap desalting column 5 mL (Sephadex G-25 packed) GE Healthcare 17-1408-01
HIVAC-G High Vacuum Sealing Compound Shin-Etsu Chemical Co., Ltd. HIVAC-G 100
ImageJ FIJI software39 National Institute of Health, Bethesda, MD Version 1.8.0_112
Microcontroller (Adruino Uno + Adafruit Motorshield v2.3) Arduino/Adafruit Arduino-DK001/Adafruit-1438
MicroVL 21R Centrifuge Thermo Scientific 75002470
Parafilm Bemis PM-996
Primovert Light Microscope Carl Zeiss Suzhou Co., Ltd. 491206-0011-000
SCyUS CAD (Solidworks) Dassault Systèmes N/A
SCyUS Code37 N/A N/A
Servomotor - TowerPro SG-5010 Adafruit 155
SL 16R Centrifuge Thermo Scientific 75004030 For 50 mL tubes
Sterile 10 cm non-culture plates Corning 430167
Thrombin buffer N/A Recipe for 1L: 20g mannitol, 8.77g NaCl, 2.72g sodium acetate trihydrate, 24 mL 25% Human Serum Albumin, 5.88g calcium chloride. Bring final volume to 1L with PuW (pH 7.0)
Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%) Biological Industries 03-052-1B
USB Cable (Type B Male to Type A Male) N/A N/A
Zeiss LSM 880 Confocal Microscope Carl Zeiss AG 2811000417
ZEN 2.3 SP1 FP3 (black) Carl Zeiss AG Release Version 14.0.0.0

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Kolel, A., Roitblat Riba, A., Natan, … More

Kolel, A., Roitblat Riba, A., Natan, S., Tchaicheeyan, O., Saias, E., Lesman, A. Controlled Strain of 3D Hydrogels under Live Microscopy Imaging. J. Vis. Exp. (166), e61671, doi:10.3791/61671 (2020).

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