Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Kontrollerad stam av 3D-hydrogeler under levande mikroskopiavbildning

Published: December 4, 2020 doi: 10.3791/61671
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 2, 3,4
1Department of Biomedical Engineering, Faculty of Engineering, Tel-Aviv University, 2Department of Materials Science and Engineering, Faculty of Engineering, Tel-Aviv University, 3School of Mechanical Engineering, Faculty of Engineering, Tel-Aviv University, 4Center for the Physics and Chemistry of Living Systems, Tel-Aviv University

Summary

Den presenterade metoden innebär enaxial sträckning av 3D mjuka hydrogeler inbäddade i silikongummi samtidigt som levande konfokal mikroskopi tillåts. Karakterisering av de yttre och inre hydrogelstammarna samt fiberjustering demonstreras. Enheten och protokollet som utvecklats kan bedöma cellernas reaktion på olika stamregimer.

Abstract

Yttre krafter är en viktig faktor i vävnadsbildning, utveckling och underhåll. Effekterna av dessa krafter studeras ofta med hjälp av specialiserade in vitro-stretchingmetoder. Olika tillgängliga system använder 2D-substratbaserade bårar, medan tillgängligheten till 3D-tekniker för att spänna mjuka hydrogeler är mer begränsad. Här beskriver vi en metod som möjliggör extern sträckning av mjuka hydrogeler från deras omkrets, med hjälp av en elastisk silikonremsa som provbärare. Stretchsystemet som används i detta protokoll är konstruerat av 3D-printade delar och billig elektronik, vilket gör det enkelt och enkelt att replikera i andra labb. Den experimentella processen börjar med polymerisering av tjocka (>100 μm) mjuka fibrinhydrogeler (Elastisk Modulus på ~ 100 Pa) i en utskärning i mitten av en silikonremsa. Silikongelkonstruktioner fästs sedan på den tryckta sträckningsanordningen och placeras på det konfokala mikroskopstadiet. Under levande mikroskopi aktiveras sträckanordningen och gelerna avbildas med olika stretchstorlekar. Bildbehandling används sedan för att kvantifiera de resulterande geldeformationerna, vilket visar relativt homogena stammar och fiberjustering genom hela geléns 3D-tjocklek(Z-axel). Fördelarna med denna metod inkluderar förmågan att spänna extremt mjuka hydrogeler i 3D medan du utför in situ-mikroskopi och friheten att manipulera provets geometri och storlek enligt användarens behov. Dessutom, med korrekt anpassning, denna metod kan användas för att sträcka andra typer av hydrogeler (t.ex. kollagen, polyakrylamid eller polyetylenglykol) och kan möjliggöra analys av celler och vävnadsrespons på yttre krafter under mer biomimetiska 3D-förhållanden.

Introduction

Vävnadsrespons på mekaniska krafter är en integrerad del av ett brett spektrum av biologiska funktioner, inklusivegenuttryck 1, cell differentiering2, och vävnadsrenovering3. Dessutom kan kraftinducerade förändringar i den extracellulära matrisen (ECM) såsom fiberjustering och förtätning påverka cellbeteende och vävnadsbildning4,5,6. ECM: s fibrösa nätstruktur har spännande mekaniska egenskaper, såsom icke-linjär elasticitet, icke-affindeformation och plastdeformationer7,8,9,10,11,12. Dessa egenskaper påverkar hur celler och deras omgivande mikromiljö reagerar på yttre mekaniska krafter13,14. Att förstå hur ECM och vävnader reagerar på mekaniska krafter kommer att möjliggöra framsteg inom vävnadsteknik och i utvecklingen av mer exakta beräknings- och teoretiska modeller.

De vanligaste metoderna för att mekaniskt sträcka prover har fokuserat på cellbelastade 2D-substrat för att utforska effekterna på cellbeteendet. Dessa inkluderar till exempel att applicera stam på pdms-substrat (polydimethylsiloxane) och analysera cellreorienteringsvinklar i förhållande till sträckriktningen15,16,17,18,19. Ändå är metoder som undersöker 3D-cellinbäddade hydrogelers svar på yttre stretch, en situation som närmare efterliknar vävnadsmikromiljö, mer begränsade. Framsteg mot 3D-sträckningsmetoder är av särskild betydelse eftersom celler beter sig annorlunda på 2D-substrat jämfört med 3D-matriser20. Dessa beteenden inkluderar cellulär omjustering, proteinuttrycksnivåer och migreringsmönster21,22,23.

Metoder och anordningar som möjliggör 3D-provsträckning inkluderar bådekommersiellt tillgängliga 24,25,26,27,28 och de som utvecklats för laboratorieforskning29. Dessa metoder använder distensible silikonrör30,multi-well kammare31,klämmor26,32,bioreaktorer11,33,cantilevers34,35,36, och magneter37,38. Vissa tekniker genererar sträckning som lokalt deformerar 3D-hydrogeler, till exempel genom att dra nålar från två enda punkter i gelén5, medan andra tillåter deformation av hela huvuddelen av gelén16. Dessutom fokuserar de flesta av dessa system på analys av belastningsfältet i X-Y-planet, med begränsad information om belastningsfältet i Z-riktningen. Dessutom kan endast en handfull av dessa enheter mikroskopisk in situ-avbildning. Den största utmaningen med in situ-avbildning med hög förstoring (t.ex. konfokalt mikroskop) är det begränsade arbetsavståndet på några hundra mikrometer från objektivlinsen till provet. Anordningar som tillåter levande avbildning under stretch offrar enhetligheten av belastningen i Z-axelneller är relativt komplexa och svåra att reproducera i andralaboratorier 39,40.

Detta tillvägagångssätt för att sträcka 3D hydrogeler möjliggör statisk eller cyklisk enaxial stam under levande confocal mikroskopi. Sträckanordningen (kallad Smart Cyclic Uniaxial Stretcher – SCyUS) är konstruerad med 3D-utskrivna delar och billig hårdvara, vilket möjliggör enkel reproduktion i andra laboratorier. Fäst vid enheten är ett kommersiellt tillgängligt silikongummi med en geometrisk utskärning i mitten. Hydrogelkomponenter polymeriseras för att fylla utskärningen. Under polymerisationen fäster biologiska hydrogeler, såsom fibrin eller kollagen, naturligt på skärningens innerväggar. Med hjälp av SCyUS är silikonremsan uniaxiellt sträckt och överför kontrollerade stammar till den inbäddade 3D-hydrogelen41.

Detta system möjliggör en unik kombination av funktioner och fördelar jämfört med andra befintliga metoder. För det första tillåter systemet enaxial sträckning av tjocka 3D mjuka hydrogeler (>100 μm tjock, <1 kPa styvhet) från periferin, med Z-homogendeformation i hela hydrogelen. Dessa hydrogeler är för mjuka för att greppas och sträckas av konventionella draghållfasta tekniker. För det andra kan sträckningsenheten enkelt replikeras i andra laboratorier eftersom 3D-utskrift är lätt tillgänglig för forskare och elektroniken som används i designen är billig. För det tredje, och kanske den mest attraktiva funktionen, kan geometrin och storleken på utskärningen i silikonremsan lätt manipuleras, vilket möjliggör tunable stamgradienter och gränsförhållanden samt användning av en mängd olika provvolymer, ner till några mikroliter.

Det presenterade protokollet består av gjutning fibrin gel i ~ 2 mm diameter skivor i 0,5 mm tjocka silikon gummiremsor som fortsätter av enaxial stretch under levande confocal mikroskopi. Följande diskuterar i detalj de experimentella förfarandena för att mäta och analysera stammarna som verkar på den geometriska utskärningen, de inre stammarna som utvecklats i hydrogelen, samt resulterande fiberjustering efter olika sträckmanipulationer. Slutligen diskuteras möjligheten att bädda in celler i hydrogelen och utsätta dem för kontrollerad extern sträckning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Lösningsberedning (ska utföras i förväg)

  1. Fibrinogen märkning
    OBS: Märkningssteget krävs endast om du vill analysera deformationen av fibringelen. För cellulära experiment är det möjligt att använda en omärkt gel.
    1. Tillsätt 38 μL 10 mg/ml succinimidylesterinfluensa (upplöst i DMSO) till 1,5 ml 15 mg/mL fibrinogenlösning (molarförhållande på 5:1) i ett 50 mL centrifugerör och placera på en skakapparat i 1 timme vid rumstemperatur. Placera därefter röret i centrifugen i 3 minuter vid 800 x g (rumstemperatur).
    2. Filtrera supernatanten från föregående steg genom en avsaltningskolonn packad med dextrangelharts (Table of Materials) för att separera det oredovisade färgämnet,42 genom att följa dessa steg.
      1. Förtvätta kolonnen med 25 ml fibrinogenbuffert.
      2. Injicera långsamt den märkta fibrinogenen från steg 1.1.1 i kolumnen och se till att det inte finns några bubblor som kommer in i filtret. Kassera den första ~0,3 ml eluterade lösningen (4-6 droppar svagfärgad vätska). Samla sedan in följande 1,0-1,5 ml renad lösning (följ tillverkarens protokoll för mer specifika detaljer).
      3. Avsluta filtreringsprocessen genom att sterilisera den resulterande renade lösningen med ett sprutdrivet filter (0,22-0,45 μm).
      4. För att rengöra och återvinna kolonnen, tvätta med 20 ml fibrinogenbuffert och förvara sedan i 25 ml 20% etanol.
  2. Efter eluering, dela den resulterande renade märkta-fibrinogenen i små alikvoter på ~ 7-50 μL, beroende på önskat antal sträckta geler. För varje sträckt cirkelgel med diametern 2 mm, förbered ca 3,5 μL fibrinogen (2,5 μL kommer att användas per gel + 1 μL för rörfel).
    1. Förvara alikvoterna i en -20 °C frys. De kan användas upp till ungefär ett år (det rekommenderas inte att tina och frysa igen).
    2. För återstoden av detta protokoll, förvara cirka 7 μL av den renade märkta fibrinogenen i kylskåpet (4 °C) till steg 4. Denna volym är avsedd för skapande av två sträckta geler (2,5 μL behövs per gel, och en extra volym på 1 μL används för att ta hänsyn till fel i provberedningen).
      OBS: Denna filtreringsprocedur späder vanligtvis ut den ursprungliga 15 mg/mL fibrinogenlösningen till en slutlig koncentration på ca 10 mg/ml. Utspädningsfaktorn beror på den ursprungliga volymen och koncentrationen av fibrinogen, enligt tillverkarens protokoll.
  3. Bered 7 μL trombinlösning (späd med trombinbuffert till 2 enheter/ml, materialförteckning)och förvara i kylskåpet (4 °C) till steg 4. Denna volym är avsedd att fylla utskärningarna av två sträckta geler.
    OBS: För att utföra inre belastningsanalys bör fluorescerande sfäriska pärlor med diametern 1 μm (inköpta som fjädring [2 % fasta ämnen] i vatten plus 2 mM NaN3) tillsättas trombinlösningen (förhållandet 1:25 v/v % pärla:trombin rekommenderas för ett 40x-mål). Pärlor bör endast inkluderas när interna stammätningar önskas, antingen i närvaro eller frånvaro av celler.

2. Silikonremsa beredning

  1. Hämta det 0,5 mm tjocka silikongummit och skär det i 15 x 80 mm2 remsor med ett hål med diametern 2 mm i mitten av remsan (Figur 1). Använd om möjligt en programmerbar laserskärare för hög precision. Om programmerbara maskiner inte finns tillgängliga är saxen tillräcklig för att klippa remskonturen och en liten hålslagning är tillräcklig för mittskärningen.
    OBS: Kommersiellt silikongummi köps vanligtvis med plastfolie på båda sidor. Förvara om möjligt originalplastbeläggning på båda sidor av silikonet. Om du återanvänder silikonremsor från ett tidigare experiment, behandla dem med trypsin i 0,5 timme, blötlägg i 0,2 M NaOH i 0,5 timme och blötlägg sedan i 70% etanol i 1 timme. Låt dem torka före användning.
  2. Förbered tätningsfilm (hydrofobiska) lager med dimensioner på minst 20 × 30 mm2, så att de är bredare än silikonremsan och därmed gör det möjligt för en tätning att bildas över hela den geometriska utskärningen.
  3. Tvätta en 10 cm skål med 70% etanol och torka sedan och torka med icke-linting känsliga uppgiftsservetter (för både sterila och icke-sterila experiment). Detta steg är viktigt eftersom det gör det möjligt för tätningsfilmlagren att bättre hålla sig till plattan och begränsa provets rörelse under beredningsprocessen.
  4. Placera tätningsfilmlagren i den tvättade 10 cm skålen så att det finns tillräckligt med utrymme för att placera två remsor i varje skål sida vid sida (Figur 2A).
    1. Ta bort plastfolien från ena sidan av silikonlisten och placera den exponerade sidan på tätningsfilmskiktet så att utskärningen omges helt av tätningsfilmskiktet (Figur 2B). Tryck sedan försiktigt på silikonet mot tätningsfilmskiktet för att försegla området kring utskärningen med rena handskfingrar.
      OBS: Se till att det inte finns några luftfickor mellan silikonet och tätningsfilmen, särskilt runt utskärningen. Gör detta genom att undersöka bottensidan av skålen (figur 2C).

Figure 1
Figur 1: Hydrogels ansträngande metod. A)15 × 80 mm2 silikonlist med en 2 mm diameter utskärning i mitten av remsan(B)En silikonremsa med cirkulär utskärning med inbäddad fibringel. För illustrativt ändamål är utskärningen i silikonet större än i de faktiska experimenten(C)Schematisk för sträckningsmetoden med silikonremsan (orange), cirkulär gel (utskuren i mitten) och tygförlängare (grön) som förbinder silikonet med sträckanordningen. Förstorat område av gelén indikerar deformationen av gelén, som svar på enaxial sträckning av silikonet. För enkelhetens skull visas inte kompressionen längs gelens tjocklek (Z-axeln)i illustrationen. Figurerna 1B & 1C har anpassats från Roitblat Riba m.fl.41Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Exempel på korrekt placering av en silikonremsa på ett tätningsfilmskikt före gelpolymerisering. a)Placering av två tätningsfilmlager i en 10 cm skål (B)Placering av silikonremsor på tätningsfilmskikten(C)Bottenvy av skålen, med lufttätning mellan silikonet och tätningsfilmskiktet. Vänster: Korrekt tätning av tätningsfilmskiktet till silikonremsan runt utskärningen utan luftfickor. Höger:Felaktig tätning av tätningsfilmskiktet till silikonremsan utskuren med luftfickor runt kanten av utskärningen. Detta kommer att leda till läckage av hydrogelkomponenterna under silikonet. Röd pil pekar mot ett område där en luftficka bildades. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

3. Förbereda trombin med celler

OBS: Utför detta steg endast om inbäddning av celler i hydrogelen önskas och under sterila förhållanden i en biologisk huva (Materialförteckning).

  1. Sterilisering: Dagen före cellprovet, placera silikonremsorna & tätningsfilmlagren i 70% etanol över natten och utför sedan UV-sterilisering i 30 minuter på varje sida (om 10 cm-diskarna inte redan är sterila bör de också steriliseras under UV-ljus i 30 minuter efter en 70% etanoltvätt). UV-systemet som används i protokollet är det som är inbyggt i den biologiska huven.
    OBS: Alternativt kan en steriliseringscykel för autoklaver (140 °C) utföras på silikonremsorna eftersom de är resistenta mot upp till 260 °C.
  2. Utför ett cellantal för att bestämma cellkoncentrationen och centrifugera och suspendera cellpelleten med 7 μL trombin (2 enheter/ml) i ett 1,5 ml centrifugeringsrör. Vi rekommenderar en cellkoncentration på 800 celler/μL trombin. Håll cellerna kylda tills de används (överskrid inte mer än en halvtimme för att undvika att skada cellerna).

4. Polymerisation av fibrin geler

  1. Hämta 2 Unit/mL trombin & 10 mg/ml märkta fibrinogenlösningar från kylskåpet (framställda i steg 1) och placera dem på is där de kommer att vara tillgängliga.
    OBS: Lösningar hålls kalla före blandningsprocessen för att bromsa polymerisationsreaktionskinetiken. Detta möjliggör mer homogen blandning av proteinerna.
  2. Med skålen(es) inställd (steg 2), extrahera 2,5 μL märkt fibrinogen och pipett det enhetligt i silikonutskärningen (med tätningsfilmskiktet fäst på undersidan) så att hela omkretsen av utskärningen är i kontakt med fibrinogen. Var noga med att inte låta luftfickor eller bubblor bildas någonstans i lösningen, var särskilt uppmärksam på utskärningens nederkanter (gränssnittet mellan tätningsfilmskiktet och silikonet).
  3. Ta omedelbart 2,5 μL trombin (med eller utan celler/pärlor) och pipetten direkt i fibrinogenlösningen i utskärningen (når slutlig volym på 5 μL fibrin). Blanda sedan snabbt de två lösningarna genom att försiktigt leda upp och ner ~ 10 gånger. Under blandningsprocessen flyttar du spetsen runt hela volymen för att skapa en så homogen lösning som möjligt.
  4. Tillsätt en mycket liten mängd fosfatbuffert saltlösning (PBS) [alternativt cellmedium för cellexperiment, Materialförteckning] längs kanten av varje maträtt så att hydrogelen inte torkar ut under polymerisationsprocessen. Se till att det inte finns någon kontakt mellan PBS/cellmediet och proverna eftersom detta kommer att skada provet.
  5. Täck skålen(es) och placera dem i inkubatorn vid 37 °C i 30 minuter.
    OBS: Den erforderliga inkubationstiden beror på gelens volym. Om större volymer används bör inkubationstiden öka.
  6. Ta bort skålen(es) från inkubatorn och tillsätt PBS/cellsmedium till skålen och sänk ner hela gel-silikonkonstruktionen.
  7. Lyft försiktigt provet en i taget från skålen och se till att tätningsfilmskiktet förblir fäst vid remsan. Lossa långsamt tätningsfilmskiktet från silikonet genom att försiktigt peka från ena änden av silikonet till den andra (figur 3). Undvik att dra från områden nära utskärningen där stresskoncentrationer kan förekomma (detta är främst viktigt för icke-cirkulära geometrier). Undvik all kontakt med utskärningen eftersom det kommer att skada provet.
  8. Placera remsan i skålen igen med PBS/cellmedium så att remsan flyter i skålen. Ta sedan skålen(es) till ett standardcellkulturmikroskop för att kvalitativt bedöma tillståndet för varje prov. Geler måste vara enhetliga, kontinuerliga under hela utskärningen, och inga bubblor bör vara närvarande. Använd figur 4 som vägledning och välj de bästa proverna för vidare analys.

Figure 3
Figur 3: Korrekt avlägsnande av tätningsfilmskiktet från silikonremsans botten. Avlägsnandeprocessen bör göras långsamt så att hydrogelen inte sliter eller bryter sin vidhäftning med utskärningens innerväggar. Den vita pilen visar borttagningsriktningen. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 4
Figur 4: Mikroskopisk observation av fibringeler i silikonskuret. (A) Två exempel på en korrekt polymeriserad fibringel. Lägg märke till gelens relativa homogenitet och full vidhäftning till kanterna på utskärningen (B) Två exempel på provpolymeriseringsfel. Överkant: Lägg märke till de många bubblorna och aggregaten som bildas på nedre vänstra sidan. Botten: Lägg märke till att gelén slits sönder från utskärningskanterna och aggregaten i den nedre vänstra delen av utskärningen. Skalbar = 300 μm Klicka här för att se en större version av denna siffra.

5. Provladdning på SCyUS-enheten

  1. Fyll badet med PBS/cellsmedium (figur 5) och placera silikonremsan som bär provgelen över toppen så att ändarna sitter på varje sida av badet. Badet är avsett att undvika torkning av gelén. Placera och dra åt klämmorna (lila) tillsammans med tygremsorna (gröna) så att alla bitar är anslutna till en rak remsa med utskärningen i mitten (bild 5).
  2. Hämta SCyUS-enheten och fäst aluminiumvätskan väl och 22 mm x 40 mm rektangulärt glaslock (nr 1 eller 1,5) (Figur 6Aiii). Fäst täckspjutet på brunnens botten med tätningsmaterial (t.ex. vakuumfett) så att brunnen kan fyllas med vätska utan läckage.
    1. Fyll brunnen med ~1-2 ml PBS/cellsmedium och placera remsan + tyget + gelkonstruktionen (Bild 6B) i enheten. Kläm fast tygremsan (2) i fästet (1) så att utskärningen + gelén (5) är i mitten som visas, placera sedan försiktigt pin-downinsatsen (4) i enheten och lås den på plats.
    2. Sätt sedan in den andra tygsidan på spindeln (utan att fästa servomotorn) och lås den i spindeln (Bild 6C).
  3. För in SCyUS-anordningen med det bifogade provet i mikroskopets stadium (figur 6C). Anslut mikrokontrollern(Table of Materials)till datorn via en USB-kabel och anslut servomotorn till mikrokontrollern. Öppna SCyUS-styrmodulen på datorn. Provet är nu klart för avbildning för att kontrollera tillräckligheten av geléns tjocklek och fiberhomogenitet under det konfokala mikroskopet.

Figure 5
Figur 5: A) Jigg som innehåller ett PBS-bad (3D-utskrivet) (B) Stripplacering på jiggen för att säkerställa korrekt in-line fastsättning av fästen (i lila) och förhindra torkning av gelén. Denna siffra har ändrats med tillstånd från Roitblat Riba et al.41Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Bild 6: SCyUS sträckningsanordning. (A) Flera vyer av en CAD-modell av SCyUS huvuddelar: spindel ansluten till servo (blå), statiskt ankare (rött), skär som fäster silikonremsan nedåt (lila) och fixare som förhindrar att insatsen stiger upp (gulgrön). En övre vy över systemet (Ai), en klippt vy över systemet (Aii) som visar remsans väg (orange linje) och en bottenvy (Aiii) av aluminiumvätskan väl med ett glaslock. Vätskebrunnen kan flyttas upp och ner med en skruv monterad i den stora gängningen. Aluminiumbrunnens uppåtgående rörelse begränsas av den lila insatsens sidovingar, vilket visas av de vita pilarna(B)Det faktiska systemet: (1) statiskt ankare (2) grönt icke-töjbart tyg ( 3 )skruvför aluminiumvätskans brunnshöjdskontroll (4) röd pin-down-insats (5) en silikonremsa med en cirkulär utskärning (6) blå anslutningsklämmor (C) Sträcksystemet placerat på ett konfokalt mikroskop. Servomotorn och spindeln visas med pilar. Denna siffra har ändrats med tillstånd från Roitblat Riba et al.41Klicka här för att se en större version av denna siffra.

6. Se till att gelen är tillräcklig för provtagning

  1. Använd det konfokala mikroskopet(Table of Materials)ta en lågförstoring (10×), lågupplöst (~ 1,4 μm x 1,4 μm pixelstorlek) konfokal Z-stack (≤10 Z-skivor med ett steg storlek på cirka 10 μm är tillräcklig) kakelbild av hela gelén med hjälp av lasrar på 488/543/561 för att undersöka homogenitet och vidhäftning vid omkretsen av den geometriska utskärningen genom silikonets tjocklek (figur 7A-B). Använd den här Z-stack-bilden som karta för följande steg.
  2. Med hjälp av högupplöst liveavbildning skannar du gelén och bestämmer det lägsta Z-lägetdär full vidhäftning till utskärningens innerväggar är uppenbar utan tårar eller bubblor och notera mikroskopets Z-placering(Zl). För att bestämma gelens fulla vidhäftning till silikonet under hela omkretsen, skanna gränssnittet för gelens fluorescerande etikett och silikonremsan (mörk bakgrund) under mikroskopet (Figur 7C).
  3. Flytta upp i Z-riktningentills det inte längre finns kontinuitet i gelén och notera Z-positionen( Zu):
  4. SubtraheraZ-riktningensövre gräns ( Zu ) från den nedre gränsen (Zl). Detta är provets referenstjocklek (Zo):
    Equation 1
    Om Zo ≥ 100 μm anses gelén vara tillfredsställande för analys. Observera att silikonskärningens tjocklek är ca 500 μm, men gelpolymerisering i utskärningen resulterar vanligtvis i en mindre geltjocklek. 100 μm är den minsta rekommenderade tjockleken för att säkerställa en stabil sträckningsprocess, utan revor eller lossning av gelén från silikonskärningen.
    OBS: På olika XY-platser kan gelens tjocklek variera. Detta avsnitt i protokollet mäter geléns minsta tjocklek, så att vi kan bestämma gelkvaliteten och ange om det är tillräckligt för sträckning. Dessutom ger att hitta mitten av gelén en referenspunkt för att återgå till eftersträckning, oavsett om den är statisk eller dynamisk.

Figure 7
Figur 7: Gel homogenitet. Kakelbilder togs och syddes med hjälp av den konfokala mikroskopprogramvaran (Table of Materials) (A) En enda sydd kakel Z-skivabild av ett fibrin gel prov med relativt inhomogeneous fiber densitet på grund av felaktig trombin och fibrinogen blandning pre-polymerisation. Denna gel kommer inte att ge en tillförlitlig analys (B) En enda sydd kakel Z-skivabild av ett fibrin gel prov med relativt homogen fibertäthet. Detta är en acceptabel gel för stretching experiment. Skalstreck för bilder A & B är 200 μm (C) Zooma in av gränssnittet mellan den fluorescerande märkta gelén (röd) och silikonet (svart bakgrund). Skalstång = 100 μm. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

7. SCyUS drift, stretching & bildbehandling

  1. Nu när provet har bedömts vara av tillfredsställande kvalitet och är korrekt inställt på SCyUS-enheten bestämmer du provets försträckta position. Detta uppnås genom att använda levande avbildning under det konfokala mikroskopet (liknar steg 6.2).
    1. Kontrollera att servomotorn är i nollläge genom att klicka på knappen Gå till noll Servo Pos (Klicka på bild 8A och se till att bild 8B visar noll) och fäst den på sträckningsenheten enligt figur 6C.
      OBS: Gör detta steg långsamt och noggrant för att inte sätta någon överspänning på provet.
    2. När du avbildar provet, flytta motorn en grad (bild 8C) i taget i medurs riktning genom att klicka på +1-knappen tills höger sida av utskärningen observeras för att röra sig. Vänd sedan rörelsen (Bild 8D) tillbaka till den näst sista stegpositionen genom att klicka på -1-knappen. Detta verifierar att provet är under minimal spänning. Klicka på knappen Ställ in Min ServoPosition (Bild 8E) för att ställa in referenspositionen. Det är möjligt att när som helst återgå till referenspositionen genom att klicka på knappen Gå till min servoposition ( Bild8F).
      OBS: Vi rekommenderar att du använder ett mål med hög förstoring (≥40×) för det här steget för att minimera fel.
    3. Fånga en högförstoring (40×), högupplöst (~ 0,2 μm × 0,2 μm pixelstorlek), en Z-skiva panelbild av hela gelområdet. Detta kommer att användas som referensbild för efterbehandlingsanalys. Det rekommenderas att fånga en enda Z-skivabild i mitten av geltjockleken (med hjälp av Zo från Eq. 1), detta gör det möjligt att återgå till ungefär samma Z-positionefter sträckning. Ta också hänsyn till att högupplösta kakelbilder av hela gelområdet tar lång tid (~ 20-30 min).
    4. Nu är provet redo för statisk sträckning. Justera servomotorn till önskad stretchstorlek genom att flytta fram en grad (figur 8C) åt gången i gui (utför detta långsamt, ca 1 grad/sekund).
  2. Vid varje stretchstorlek där analys önskas, fånga en enda Z-skiva högupplöst kakelbild av hela gelområdet för analys efter bearbetning. I likhet med steg 6.2, kontrollera att gelén inte har lossnat från silikonet under hela omkretsen genom att skanna gränssnittet mellan gelén (röd) och silikonet (mörk bakgrund), och leta efter förändringar i vidhäftningen från den tidigare stretchstorleken.
    OBS: Använd levande bildbehandling under aktiveringen av motorn för att följa gelplatsen i X-Y (med lågupplösta, lågförstoringsinställningar). Gelén upplever en Z-Poisson-effekt där geléns botten stiger, därför bör mikroskopets Z-positionockså justeras till geltjocklekens ungefärliga centrum för varje stretchstorlek. Detta kan uppnås genom att beräkna om Zo (Eq. 1) för varje sträcka magnitud. Eftersom sträckning i Z-riktningen är relativt homogen är det inte viktigt att hitta gelens exakta mittdjup.

Figure 8
Bild 8: GUI för SCyUS-styrmodulen. A)Motorns placering i grader. Värdet varierar från -90° till 90° (B) "Set Minimum Servo Position". Denna knapp möjliggör ett förinställt minimiläge, för att ställa in en ny referensposition som skiljer sig från Zero Servo Position (C) "Plus 1 ° " -knappen flyttar servomotorn en grad medurs (D) "Minus 1 ° " -knappen flyttar servomotorn en--grad moturs (E) "Gå till nollläge" -knappen ställer servomotorns läge till 0° ([A] kommer att ställas in på noll) (F) "Gå till minsta servoposition" -knappen flyttar servomotorn till den användardefinierade "Min" -positionen. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

8. Efterbearbetning av externa stammätningar

  1. För att mäta de effektiva påfrestningarna på utskärningsgränserna, mät längden från kant till kant isträckriktningen (X-axeln)i mitten av Y-axeln(figur 9A).
    1. Ladda upp försträckningsprogrammet till bildbehandlingsprogramvaran (ImageJ FIJI43)och mät det största avståndet från kant till kant som definieras som hålets axiella längd ( Equation 8 ) i mitten.
    2. Definiera det största avståndet uppifrån och ned som vinkelrätt avstånd ( Equation 6 ).
    3. Upprepa denna process för alla sträckintervallsbilder och beräkna de Equation 7 axiella ( ) och vinkelräta ( Equation 5 ) avstånden i den utskurna periferin (figur 9A, botten) och utför sedan följande beräkningar för att hitta stammarna i utskärningskanterna:

Equation 2

Equation 3

Figure 9
Figur 9: Gelstammar på grund av yttre sträckning av silikonremsan. (A) X-Y tvärsnitt av en osträckt fibringel (överst) och efter applicering av εhål = 64% belastning längs x-riktningen (botten). Gelén är inbäddad med fluorescerande pärlor. De relevanta längderna d och l som används för beräkning av ε-hål anges i bilderna (B) Zoombilder av det streckade kvadratiska området märkt i A (C) Illustration av de belastningstyper som beaktas i denna studie: ε hål är den axiella belastningen på utskärningen med maximal diameter, och εgel är den axiella stammen i mitten av gelén (mätt med pärlaggregatplatserna) (D) Ett linjärt förhållande hittades mellan εhål och εgel i både xx riktning (röd linje) och yy riktning (grön linje). Denna siffra har anpassats med tillstånd från Roitblat Riba m.fl.41Klicka här för att se en större version av denna siffra.

9. Fiberorienteringsanalys

  1. Använd kvantifiering av fiberjustering för att karakterisera den fibrösa geléns strukturella respons för att öka omfattningen av stretch. Ladda upp högupplösta bilder till ImageJ FIJI-programvara (NIH)43 och analysera sedan med modulen OrientationJ (EPFL)44 (Inställningar: Gaussian gradient och 3-pixelfönster, bild 10).
    1. Beräkna NOP (2D Nematic Order Parameter) för orienterings histogrammet som:45
      Equation 4
      OBS: Ett värde på NOP = 1 indikerar perfekt inriktning längs axiell riktning (vinkel noll) och NOP = 0 indikerar isotropi. Orienteringsvinkeln, θ, är fibervinkeln i förhållande till den belastningsaxel (x-axel) som erhålls genom bildanalys och definieras exakt i OrientationJ-dokumentationen. 44 (på 2000)

Figure 10
Bild 10: Fiberorienteringsanalys med hjälp av FIJI ImageJ-programvara. (A) Huvudmeny för ImageJ med en pil som anger platsen för "Plugins" rullgardinsmenyn där "OrientationJ" finns. Klicka på alternativet "OrientationJ Distribution"(B)OrientationJ:s distributionsmodul under den utökade menyn "OrientationJ". Ställ in "Lokalt σ" på 3 pixlar och "Övertoning" till "Gaussian". Tryck sedan på knappen "Kör" (röd pil). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

10. Manuell analys av inre gelstammar

  1. Medan du utför levande högförstoringsavbildning av en hydrogel med inbäddade pärlor, lokalisera manuellt en region av intresse (ROI) med lätt igenkännliga funktioner (t.ex. aggregat av pärlor), för att återgå till samma plats efter varje sträcka magnitud.
    OBS: Komprimering i Z-riktning (Poisson-effekten) kan leda till en ökning av pärltätheten när stretchen ökar, därför föreslår vi att du väljer pärlaggregat tillräckligt stora, så de är tydligt identifierbara. Detta protokoll kräver analys av den centrala regionen av fibrin gel, även om någon region kan väljas.
  2. I läget före sträckning (steg 6) tar du en högupplöst Z-stackbildav den valda AVKASTNINGEN. Efter varje önskat sträckintervall återgår du till samma ROI och upprepar bildinspelningsprocessen.
  3. Ta bilderna och importera dem till ImageJ. I ROI spelar du in X-Y-pixelplatsen för varje synlig pärlaaggregat. Överför inspelade data till ett kalkylblad.
  4. Mät avstånden mellan varje par aggregat och jämför dem med avstånden för samma par i referensbilden, vilket gör det möjligt att beräkna stammar i X- och Y-riktningarna.
    OBS: Om en kontinuerlig realtidsfilm spelas in medan gelén sträcks ut (i stället för statisk bildinspelning) kan en automatisk analys av stammar utföras med digitala bild- eller volymkorrelationer (DIC/DVC) -metoder, som tidigare visats46,47. Det bör dock noteras att automatisk DIC/ DVC-analys är utmanande i denna inställning, eftersom Z-stacken inte bara rör sig i X-Y-planet utan också i Z-riktningenpå grund av Poisson-effekten (komprimeringen), som står för betydande drifter under den inspelade filmen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Representativa data från statisk sträcka av ökande magnitud som appliceras på silikonremsan med en 3D-fibrinhydrogel, inbäddad med 1 μm fluorescerande pärlor, visas i figur 9. Analysen visar effekten av silikonsträcka på geometriska förändringar av utskärningen samt de utvecklade stammarna i gelén. Z-stackbilder av hela gelén används för att utvärdera deformationen av den ursprungliga cirkelformade utskärningen till den elliptiska geometrin (figur 9A). Dessa bilder används för att beräkna εxx(hål) (Ekvation 2). Genom att zooma in och manuellt spåra flera pärlaggregat(figur 9B)under gelsträckning, kan man beräkna lokala gelstammar i mitten, i axlarna εxx(gel)och vinkelräta εyy(gel)riktningar (figur 9C,D). Axiella stammar förökar sig relativt linjärt från silikonutskärningskanten till gelens mitt och är större än de tryckande vinkelräta stammarna (figur 9D).

Högförstoringsbilder av den fluorescerande märkta gelén möjliggör observation och kvantifiering av fiberjustering, inducerad av silikonsträckan. Figur 11 visar representativa inzoomningsbilder av en typisk osträckt och relativt isotropisk hydrogel (figur 11A) och en hydrogel under hög 80% utskuren stam som visar mycket justerade fibrer i sträckriktningen (Figur 11B). Analys av fiberomorientering med ImageJ visade ungefär linjärt beroende mellan fiberjustering (NOP) och den yttre belastningenpå utskärningen (ε-hålet)upp till stammar på 40%, med måttlig mättnad vid stammar över 40% (Figur 11D). En detaljerad analys av fiberjusteringen i olika Z-skivorvisas i figur 12. Här beräknas histogram av fiberjustering för varje Z-skiva(figur 12A), liksom deras motsvarande NOP (Figur 12B)och den genomsnittliga NOP över alla Z-skivorför varje yttre stamstorlek på utskärningen (Figur 12C). När εökar ökar fiberjusteringen, efter en övergripande icke-linjär kurva som visas i figur 12C. Observera att gelén drar ihop sig längs Z-axelnpå grund av Poisson-effekten, representerad av de kortare linjerna vid högre stammar i figur 12B.

Eftersom det har visat sig svårt att utföra djupgående analyser av de inre stammarna i hela gelén, ger vi här preliminära resultat av finita elementsimuleringar (FE) som utförs på 2D kontinuerligt material med tanke på fibrins mekaniska egenskaper (Figur 13). Den yttre belastningen av utskärningen är ~ 40% och färgkartan representerar det stretchinducerade stamfältet. Färgkartan sträcker sig från 38%-42%, vilket indikerar att gelstammar är relativt homogena i hela det cirkulära gelområdet. Vi noterar att om andra gelgeometrier används kan gradienter i stam uppstå, och detta är ett ämne för framtida studier.

För att visa att inbäddade fibringeler kan upprätthålla vidhäftning till silikonremsan vid höga stammar (0 till +30%) och frekvenser (upp till 1 Hz), körde vi preliminära tester (protokollet för detta test ingår inte i detta arbete) som inte visar några lossningar av gelerna från de inre väggarna i utskärningen. Tre geler testades, gel 1 för en total varaktighet av ~87 minuter, gel 2 i 60 minuter & gel 3 för 30 min totalt (Tabell 1). I alla tre av dessa fall fibrin hydrogels behöll sin vidhäftning till silikonet.

Figure 11
Figur 11: Gelfiberjustering som svar på extern sträckning. Bilder tagna i mitten av en fluorescerande märkt gel medan (A) obesträckt och (B) efter applicering av εhål= 80% (C) Genomsnittliga histogram av fiberorienteringar under ökande εhål [%] stammar. Grå felstaplar indikerar skillnader mellan 40 skivor i z-stacken som bedömts för varje testad stam(D)Genomsnittlig nematisk orderparameter (NOP) som en funktion av ε hål för tre olika gelprover (inklusive "Gel 1" som analyseras i figur 11A-C). Felstaplar anger skillnader mellan segment i Z-stapeln för varje sträckas storlek. Denna siffra har anpassats med tillstånd från Roitblat Riba m.fl.41Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 12
Figur 12: Analys av fiberorientering med hjälp av OrientationJ44-verktyget (ImageJ-programvara)43 (A) 3D histogram av fiberorientering för olika Z-skivor. Visas är exempel på två histogram beräknade för sträckta (εhål = 17,6%, överst) och osträckta (nedre) geler. Histogrammet normaliseras så att området under kurvan är lika med 1 (B) Resulterande NOP kontra Z-djup; Diagrammet visar beräkningarna av NOP för varje histogram som en funktion av Z-djup(C) Medel NOP som en funktion av εhål. Felstaplar representerar standardavvikelsen för NOP för alla Z-skivori en enskild stretchstorlek vid samma XY-punkt i samma gel. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 13
Figur 13: 2D-finita element (FE) simulering av en sträckt gel. Gel sträcks ut( εhål ≈ 40%) av en silikonbärare. Stamfält presenteras med värden av maximal huvudstam där mindre gradienter observeras. Cirkeln som representeras av den prickade linjen är hålets för ansträngda geometri, den ursprungliga längden (lo) är mittlängden längs x-axeln innan sträckningen appliceras, och den sträckta längden (l) är mittlängden längs x-axeln efter sträckning tillämpas. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Gel #1 Dynamisk stamamlitud (frekvens 1 Hz) Dynamisk sträckningstid (min)
0-37% 0.1
1
5
15
30
0-48% 1
5
30
Total tid under dynamisk sträcka 87 min
Gel #2 Dynamisk stamamlitud (frekvens 1 Hz) Dynamisk sträckningstid (min)
0-30% 0
10
20
30
0-50% 30
Total tid under dynamisk sträcka 60 min
Gel #3 Dynamisk stamamlitud (frekvens 1 Hz) Dynamisk sträckningstid (min)
0-30% 10
20
30
Total tid under dynamisk sträcka 30 min

Tabell 1: Representativa resultat av dynamiska sträckning bevis på koncept. Tre geler var inbäddade i silikonremsor och sträcktes dynamiskt (1 Hz) under olika varaktigheter. Stammarna varierade från noll till olika magnitud över 30%. Alla tre gelerna höll framgångsrikt sin vidhäftning till innerväggarna i den cirkulära utskärningen av silikonremsan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metoden och protokollet som presenteras häri är till stor del baserade på vår tidigare studie av Roitblat Riba et al.41 Vi inkluderar här den fullständiga datorstödda designen (CAD), Python och mikrokontrollerkoderna för SCyUS-enheten.

De stora fördelarna med den presenterade metoden jämfört med befintliga metoder inkluderar möjligheten att spänna mycket mjuka 3D-hydrogeler (Elastic Modulus på ~ 100 Pa) från deras omkrets och under levande konfokal avbildning. Andra metoder är vanligtvis begränsade i sin förmåga att applicera stamfält i Z-axelnoch kan inte tillhandahålla mikroskopibilder med hög förstoring på plats under sträckning, främst på grund av begränsningar på arbetsavstånd från provet till objektivlinsen. De flesta tillgängliga system är baserade på 2D-substratsträckning, som är begränsade i härma fysiologiska vävnadsmiljöer.

Begränsningar av systemet inkluderar potentiell inkonsekvent homogenitet av fibertätheten hos gelen postpolymerisering (Figur 7A), särskilt när stora gelvolymer eller komplexa geometrier används. Sådana icke-homogeniteter kan leda till icke-enhetliga stammar och fiberjustering i gelén. Dessutom kan optiska begränsningar vid relativt djupa Z-sektioner (>30 μm) ge upphov till fel i analysen av fiberorientering.

Kritiska steg i 3D-sträckningsprotokollet inkluderar följande (i) Se till att provgeler har uppnått fullständig vidhäftning till innerväggarna i den geometriska utskärningen i silikonet, utan bubblor eller tårar, särskilt längs Z-riktningen. Fullständig vidhäftning och kontinuitet i provet med en tjocklek av minst 100 μm (Eq. 1) är avgörande för att på ett tillförlitligt sätt sträcka provet till önskad stam (ii) Korrekt fästa provet på SCyUS-enheten före sträckning. Det är nödvändigt att fästa silikonremsan på fästena och de icke-elastiska tyglängdsförlängarna med hjälp av den 3D-utskrivna jiggen(figur 5A)och att validera att alla delar är fästa i linje, vilket säkerställer att belastningen induceras i gelén symmetriskt. Detta gäller även korrekt lastning av enhetens spindel (figur 6B-C)( iii) Fånga noggrant provets referensposition (pre-stretch). Om referensbilden tas medan provet redan är spänt (t.ex. på grund av fastsättningen av servomotorn före detta steg) kommer alla belastningsmätningar att vara felaktiga.

Potentiella framtida tillämpningar och ändringar av det presenterade protokollet inkluderar följande:

i) Ett cykliskt sträcksystem kan tillämpas på cellinbäddade hydrogeler. Eftersom motorns dynamiska rörelse kodas av mikrokontrollerprogramvaran kan alla cykliska profiler programmeras, begränsas endast av upplösningen och rotationshastigheten för den motor som används i systemet (mer information finns i Roitblat Riba et al.41). I detta arbete visade vi att fibringel kan upprätthålla vidhäftning under dynamisk stretch(tabell 1). Även om ytterligare testning är nödvändig, skulle tillämpningen av cyklisk belastning ge insikter om hydrogelens dynamiska svar och inbäddade celler.

ii) Silikonskurets geometri och volym kan ändras. I det nuvarande protokollet fokuserade vi bara på geler i en cirkulär geometri. Under sådana förhållanden är inre stammar relativt homogena i hela gelén, vilket förutspås av våra FE-simuleringar (figur 13). Men om andra gelgeometrier kommer att övervägas genom att ändra utskärningsdelen av silikonet, kommer gradienter att dyka upp. Till exempel kan en "diamant" formad utskärning potentiellt leda till en lutning i gelstammarna på grund av en gradvis förändring av den ursprungliga längden på utskärningen längs sträckriktningen. Denna metod för gelstamkontroll är särskilt tilltalande, eftersom olika formade utskärningar är relativt triviala att tillverka. Dessutom kan silikonskurningens tjocklek och yta enkelt ändras så att gelvolymerna kan justeras, från miniatyrvolymer på några mikroliter till större volymer i samband med mm-cm-gelstorlekar. Dessutom är det möjligt att inkludera flera utskärningar i samma silikonremsa, vilket möjliggör sträckning av flera geler samtidigt.

iii) Celler kan bäddas in i hydrogelen. Det finns några utmaningar som bör beaktas vid inbäddning av celler i de sträckta hydrogelerna. De flesta celler inbäddade i 3D-hydrogeler applicerar betydande dragkrafter på matrisen, samt försämrar matrisen över tid. Detta kan resultera i global sammandragning och matsmältning av gelén, vilket kan leda till frånkoppling av gelén från silikon utskuren innervägg vid långvarig inkubationstid. Ett möjligt sätt att hantera denna situation är att använda låga cellkoncentrationer och begränsa tiden för cellulära experiment till ett intervall som gelkontraktion och nedbrytning är minimala. Vi har tidigare visat möjligheten att odla fibroblastceller i fibrin gel under statisk sträcka av 10%, under en period av 5 timmar, utan några bevis på gel riva eller frånkoppling från silikon utskärning41.

iv) Denna inställning bör också testas med andra typer av hydrogeler, särskilt syntetiska sådana som polyakrylamid (PAA) eller polyetylenglykol (PEG)-baserade hydrogeler, som ofta används för cellkultur. Den naturliga vidhäftningen av dessa hydrogeler till silikon utskärningen bör undersökas, och om det visar sig vara otillräckligt för gel stretching, bör tekniker för att uppmuntra vidhäftning användas. Användningen av biologiska lim48,49 eller kemiska behandlingar50,51,52 till den utskurna ytan bör övervägas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Några siffror som ingår här har anpassats med tillstånd från Copyright Clearance Center: Springer Nature, Annals of Biomedical Engineering. A. Roitblat Riba, S. Natan, A. Kolel, H. Rushkin, O. Tchaicheeyan, A. Lesman, Copyright© (2019) sila 3D-hydrogeler med enhetliga z-axelstammar samtidigt som de möjliggör levande mikroskopiavbildning.

https://doi.org/10.1007/s10439-019-02426-7

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 546 carboxylic acid, succinimidyl ester Invitrogen A20002
Cell Medium (DMEM High Glucose) Biological Industries 01-052-1A Add 10% FBS, 1% PNS, 1% L-Glutamine, 1% Sodium Pyruvate
Cover Slip #1.5 Bar-Naor Ltd. BN72204-30 22×40 mm
DIMETHYL SULPHOXIDE 99.5% GC DMSO Sigma-Aldrich Inc. D-5879-500 ML
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Biological Industries 02-023-1A
EVICEL Fibrin Sealant (Human) Omrix Biopharmaceuticals 3902 Fibrinogen: 70 mg/mL, Thrombin: 800-1200 IU/mL
Fibrinogen Buffer N/A Recipe for 1L: 7g NaCl, 2.94g trisodium citrate dihydrate, 9g glycine, 20g arginine hydrochloride & 0.15g calcium chloride dihydrate. Bring final volume to 1L with PuW (pH 7.0-7.2)
Fluorescent micro-beads FluoSpheres (1 µm) Invitrogen F8820 Orange (540/560)
Provided as suspension (2% solids) in water plus 2 mM sodium azide
High-Temperature Silicone Rubber McMaster-Carr 3788T41 580 µm-thick
E = 1.5 Mpa
Poisson Ratio = 0.48
Tensile Strength = 4.8 MPa
Upper limit of stretch = +300% engineering strain
HiTrap desalting column 5 mL (Sephadex G-25 packed) GE Healthcare 17-1408-01
HIVAC-G High Vacuum Sealing Compound Shin-Etsu Chemical Co., Ltd. HIVAC-G 100
ImageJ FIJI software39 National Institute of Health, Bethesda, MD Version 1.8.0_112
Microcontroller (Adruino Uno + Adafruit Motorshield v2.3) Arduino/Adafruit Arduino-DK001/Adafruit-1438
MicroVL 21R Centrifuge Thermo Scientific 75002470
Parafilm Bemis PM-996
Primovert Light Microscope Carl Zeiss Suzhou Co., Ltd. 491206-0011-000
SCyUS CAD (Solidworks) Dassault Systèmes N/A
SCyUS Code37 N/A N/A
Servomotor - TowerPro SG-5010 Adafruit 155
SL 16R Centrifuge Thermo Scientific 75004030 For 50 mL tubes
Sterile 10 cm non-culture plates Corning 430167
Thrombin buffer N/A Recipe for 1L: 20g mannitol, 8.77g NaCl, 2.72g sodium acetate trihydrate, 24 mL 25% Human Serum Albumin, 5.88g calcium chloride. Bring final volume to 1L with PuW (pH 7.0)
Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%) Biological Industries 03-052-1B
USB Cable (Type B Male to Type A Male) N/A N/A
Zeiss LSM 880 Confocal Microscope Carl Zeiss AG 2811000417
ZEN 2.3 SP1 FP3 (black) Carl Zeiss AG Release Version 14.0.0.0

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bleuel, J., Zaucke, V., Bruggemann, G. P., Niehoff, A. Effects of cyclic tensile strain on chondrocyte metabolism: a systematic review. PLoS ONE. 10, 0119816 (2015).
  2. Pennisi, C. P., Olesen, C. G., de Zee, M., Rasmussen, J., Zachar, V. Uniaxial cyclic strain drives assembly and differentiation of skeletal myocytes. Tissue Engineering Part A. 17, 2543-2550 (2011).
  3. Grodzinsky, A. J., Levenston, M. E., Jin, M., Frank, E. H. Cartilage Tissue Remodeling in Response to Mechanical Forces. Annual Review of Biomedical Engineering. 2 (1), 691-713 (2000).
  4. Munster, S., et al. Strain history dependence of the nonlinear stress response of fibrin and collagen networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110, 12197-12202 (2013).
  5. Vader, D., Kabla, A., Weitz, D., Mahadevan, L. Strain-induced alignment in collagen gels. PLoS ONE. 4, 5902 (2009).
  6. Badylak, S. F. The extracellular matrix as a scaffold for tissue reconstruction. Seminars in Cell & Developmental Biology. 13 (5), 377-383 (2002).
  7. Natan, S., Koren, Y., Shelah, O., Goren, S., Lesman, A. Molecular Biology of the Cell. 31 (14), 1474-1485 (2020).
  8. Ban, E., et al. Mechanisms of Plastic Deformation in Collagen Networks Induced by Cellular Forces. Biophysical Journal. 114 (2), 450-461 (2018).
  9. Kim, J., et al. Stress-induced plasticity of dynamic collagen networks. Nature Communications. 8, 842 (2017).
  10. Storm, C., Pastore, J. J., MacKintosh, F. C., Lubensky, T. C., Janmey, P. A. Nonlinear elasticity in biological gels. Nature. 435, 191-194 (2005).
  11. Wen, Q., Basu, A., Janmey, P. A., Yodh, A. G. Non-affine deformations in polymer hydrogels. Soft Matter. 8, 8039-8049 (2012).
  12. Muiznieks, L. D., Keeley, F. W. Molecular assembly and mechanical properties of the extracellular matrix: A fibrous protein perspective. Biochimica et Biophysica Acta. 1832, 866-875 (2012).
  13. Brown, A. E. X., Litvinov, R. I., Discher, D. E., Purohit, P. K., Weisel, J. W. Multiscale mechanics of fibrin polymer: gel stretching with protein unfolding and loss of water. Science. 325, 741-744 (2009).
  14. Carroll, S. F., Buckley, C. T., Kelly, D. J. Cyclic tensile strain can play a role in directing both intramembranous and endochondral ossification of mesenchymal stem cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 5, 73 (2017).
  15. Livne, A., Bouchbinder, E., Geiger, B. Cell reorientation under cyclic stretching. Nature Communications. 5, 3938 (2014).
  16. Wang, L., et al. Patterning cellular alignment through stretching hydrogels with programmable strain gradients. ACS Applied Materials & Interfaces. 7, 15088-15097 (2015).
  17. Xu, G. K., Feng, X. Q., Gao, H. Orientations of Cells on Compliant Substrates under Biaxial Stretches: A Theoretical Study. Biophysical Journal. 114 (3), 701-710 (2017).
  18. Chagnon-Lessard, S., Jean-Ruel, H., Godin, M., Pelling, A. E. Cellular orientation is guided by strain gradients. Integrative Biology (United Kingdom). 9 (7), 607-618 (2013).
  19. Lu, J., et al. Cell orientation gradients on an inverse opal substrate. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (19), 10091-10095 (2015).
  20. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension - 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125, 3015-3024 (2012).
  21. Bono, N., et al. Unraveling the role of mechanical stimulation on smooth muscle cells: a comparative study between 2D and 3D models. Biotechnology and Bioengineering. 113, 2254-2263 (2016).
  22. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 839-845 (2007).
  23. Riehl, B. D., Park, J. H., Kwon, I. K., Lim, J. Y. Mechanical stretching for tissue engineering: two-dimensional and three-dimensional constructs. Tissue Engineering Part B: Reviews. 18, 288-300 (2012).
  24. Flexcell. Linear Tissue Train Culture Plate. Flexcell. , (2019).
  25. Flexcell. Tissue Train. Flexcell. , (2019).
  26. CellScale. MCT6 Stretcher. CellScale. , (2019).
  27. STREX. STB-150. STREX. , (2019).
  28. STREX. Stretch Chambers. STREX. , (2019).
  29. Kamble, H., Barton, M. J., Jun, M., Park, S., Nguyen, N. T. Cell stretching devices as research tools: engineering and biological considerations. Lab on a Chip. 16, 3193-3203 (2016).
  30. Weidenhamer, N. K., Tranquillo, R. T. Influence of cyclic mechanical stretch and tissue constraints on cellular and collagen alignment in fibroblast-derived cell sheets. Tissue Engineering Part C: Methods. 19, 386-395 (2013).
  31. Yung, Y. C., Vandenburgh, H., Mooney, D. J. Cellular strain assessment tool (CSAT): precision-controlled cyclic uniaxial tensile loading. Journal of Biomechanics. 42, 178-182 (2009).
  32. Chen, K., et al. Role of boundary conditions in determining cell alignment in response to stretch. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 115, 986-991 (2018).
  33. Heher, P., et al. A novel bioreactor for the generation of highly aligned 3D skeletal muscle-like constructs through orientation of fibrin via application of static strain. Acta Biomaterialia. 24, 251-265 (2015).
  34. Foolen, J., Deshpande, V. S., Kanters, F. M. W., Baaijens, F. P. T. The influence of matrix integrity on stress-fiber remodeling in 3D. Biomaterials. 33, 7508-7518 (2012).
  35. Walker, M., Godin, M., Pelling, A. E. A vacuum-actuated microtissue stretcher for long-term exposure to oscillatory strain within a 3D matrix. Biomedical Microdevices. 20, 43 (2018).
  36. Zhao, R. G., Boudou, T., Wang, W. G., Chen, C. S., Reich, D. H. Decoupling cell and matrix mechanics in engineered microtissues using magnetically actuated microcantilevers. Advanced Materials. 25, 1699-1705 (2013).
  37. Li, Y. H., et al. Magnetically actuated cell-laden micro-scale hydrogels for probing strain-induced cell responses in three dimensions. NPG Asia Materials. 8, 238 (2016).
  38. Li, Y. H., et al. An approach to quantifying 3D responses of cells to extreme strain. Scientific Reports. 6, 19550 (2016).
  39. Humphrey, J. D., et al. A theoretically-motivated biaxial tissue culture system with intravital microscopy. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 7, 323-334 (2008).
  40. Niklason, L. E., et al. Enabling tools for engineering collagenous tissues integrating bioreactors, intravital imaging, and biomechanical modeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 107, 3335-3339 (2010).
  41. Roitblat Riba, A., et al. Straining 3D hydrogels with uniform z-axis strains while enabling live microscopy imaging. Annals of Biomedical Engineering. , (2019).
  42. Gomez, D., Natan, S., Shokef, Y., Lesman, A. Mechanical interaction between cells facilitates molecular transport. Advanced Biosystems. 3 (12), 1900192 (2019).
  43. Schindelin, J., et al. Fiji: an open- source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
  44. EPFL Switzerland. OrientationJ plug in. EPFL Switzerland. , (2019).
  45. Goren, S., Koren, Y., Xu, X., Lesman, A. Elastic anisotropy governs the decay of cell-induced displacements. Biophysical Journal. 118 (5), 1152-1164 (2019).
  46. Notbohm, J., Lesman, A., Tirrell, D. A., Ravichandran, G. Quantifying cell-induced matrix deformation in three dimensions based on imaging matrix fibers. Integrative Biology. 7 (10), 1186-1195 (2015).
  47. Lesman, A., Notbohm, J., Tirrell, D. A., Ravichandran, G. Contractile forces regulate cell division in three-dimensional environments. Journal of Cell Biology. 205 (2), 155-162 (2014).
  48. Cha, C. Y., et al. Tailoring Hydrogel Adhesion to Polydimethylsiloxane Substrates Using Polysaccharide Glue. Angewandte Chemie International Edition. 52, 6949-6952 (2019).
  49. Wirthl, D., et al. Instant tough bonding of hydrogels for soft machines and electronics. Science Advances. 3, (2017).
  50. Juarez-Moreno, J. A., Avila-Ortega, A., Oliva, A. I., Aviles, F., Cauich-Rodriguez, J. V. Effect of wettability and surface roughness on the adhesion properties of collagen on PDMS films treated by capacitively coupled oxygen plasma. Applied Surface Science. 349, 763-773 (2015).
  51. Kim, H. T., Jeong, O. C. PDMS surface modification using atmospheric pressure plasma. Microelectronic Engineering. 88, 2281-2285 (2011).
  52. Prasad, B. R., et al. Controlling cellular activity by manipulating silicone surface roughness. Colloids and Surfaces. 78, 237-242 (2010).

Tags

Bioengineering utgåva 166 Hydrogel Extracellulär matris Mekanobiologi Cellmekanik Mekanisk kraft Extern sträckning Fibröst nätverk Fiberjustering
Kontrollerad stam av 3D-hydrogeler under levande mikroskopiavbildning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kolel, A., Roitblat Riba, A., Natan, … More

Kolel, A., Roitblat Riba, A., Natan, S., Tchaicheeyan, O., Saias, E., Lesman, A. Controlled Strain of 3D Hydrogels under Live Microscopy Imaging. J. Vis. Exp. (166), e61671, doi:10.3791/61671 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter