Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Kontrolleret stamme af 3D Hydrogels under Live Mikroskop imaging

Published: December 4, 2020 doi: 10.3791/61671
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 2, 3,4
1Department of Biomedical Engineering, Faculty of Engineering, Tel-Aviv University, 2Department of Materials Science and Engineering, Faculty of Engineering, Tel-Aviv University, 3School of Mechanical Engineering, Faculty of Engineering, Tel-Aviv University, 4Center for the Physics and Chemistry of Living Systems, Tel-Aviv University

Summary

Den præsenterede metode indebærer uniaxial strækning af 3D bløde hydrogels indlejret i silikone gummi og samtidig tillade levende confocal mikroskopi. Karakterisering af de eksterne og interne hydrogelstammer samt fiberjustering demonstreres. Den udviklede enhed og protokol kan vurdere cellernes reaktion på forskellige stammeregimer.

Abstract

Eksterne kræfter er en vigtig faktor i vævsdannelse, udvikling og vedligeholdelse. Virkningerne af disse kræfter studeres ofte ved hjælp af specialiserede in vitro-stretching metoder. Forskellige tilgængelige systemer bruger 2D substrat-baserede bårer, mens tilgængeligheden af 3D-teknikker til at belaste bløde hydrogels, er mere begrænset. Her beskriver vi en metode, der tillader ekstern strækning af bløde hydrogels fra deres omkreds ved hjælp af en elastisk silikonestribe som prøvebærer. Det strækningssystem, der bruges i denne protokol, er konstrueret af 3D-printede dele og billig elektronik, hvilket gør det enkelt og nemt at replikere i andre laboratorier. Den eksperimentelle proces begynder med polymerisering tyk (> 100 μm) bløde fibrin hydrogels (Elastic Modulus på ~ 100 Pa) i en udskæring i midten af en silikone strimmel. Silikone-gel konstruktioner er derefter fastgjort til den trykte-stretching enhed og placeres på confocal mikroskop fase. Under levende mikroskopi aktiveres strækkeenheden, og gelerne afbildes på forskellige strækstyrker. Billedbehandling bruges derefter til at kvantificere de resulterende gel deformationer, der viser relativt homogene stammer og fiberjustering i hele gelens 3D-tykkelse (Z-akse). Fordelene ved denne metode omfatter evnen til at belaste ekstremt bløde hydrogels i 3D, mens du udfører in situ mikroskopi, og friheden til at manipulere geometri og størrelse af prøven i henhold til brugerens behov. Derudover kan denne metode med korrekt tilpasning bruges til at strække andre typer hydrogeler (f.eks. kollagen, polyacrylamid eller polyethylenglycol) og kan give mulighed for analyse af celler og vævsrespons på eksterne kræfter under mere biomimetiske 3D-forhold.

Introduction

Vævsrespons på mekaniske kræfter er en integreret del af en lang række biologiske funktioner , herunder genekspression1, celledifferentiering2og vævsgenopbygning3. Desuden kan kraftinducerede ændringer i den ekstracellulære matrix (ECM) såsom fiberjustering og fortætning påvirke celleadfærd og vævsdannelse4,5,6. ECM's fibernetstruktur har spændende mekaniske egenskaber, såsom ikke-lineær elasticitet, ikke-affin deformation og plastdeformationer7,8,9,10,11,12. Disse egenskaber påvirker , hvordan celler og deres omgivende mikromiljø reagerer på eksterne mekaniske kræfter13,14. En forståelse af, hvordan ECM og væv reagerer på mekaniske kræfter, vil gøre det muligt at gøre fremskridt inden for vævsteknik og med hensyn til udvikling af mere nøjagtige beregningsmæssige og teoretiske modeller.

De mest almindelige metoder til mekanisk strækprøver har fokuseret på cellebelastede 2D-substrater for at udforske virkningerne på celleadfærd. Disse omfatter for eksempel at anvende belastning på polydimethylsiloxan (PDMS) substrater og analysere cellereorienteringsvinkler i forhold til strækretningen15,16,17,18,19. Men metoder, der undersøger reaktionen fra 3D-celle-indlejrede hydrogels til eksterne stretch, en situation, der i højere grad efterligner væv mikromiljø, er mere begrænset. Fremskridt mod 3D-stretchingmetoder er af særlig betydning, fordi celler opfører sig anderledes på 2D-substrater sammenlignet med 3D-matricer20. Disse adfærdsmønstre omfatter cellulær justering, proteinudtryksniveauer og migrationsmønstre21,22,23.

Metoder og anordninger , der gør det muligt at strække 3D-prøven , omfatter både kommercielt tilgængelige24,25,26,27,28 og dem,der er udviklet til laboratorieforskning29. Disse metoder bruger distensible silikonerør30, multibrøndkamre31, klemmer26,32, bioreaktorer11,33, cantilevers34,35,36og magneter37,38. Nogle teknikker genererer strækning, der lokalt deformerer 3D hydrogels, for eksempel ved at trække nåle fra to enkeltpunkter i gel5, mens andre giver mulighed for deformation af hele hovedparten af gel16. Desuden fokuserer de fleste af disse systemer på analyse af stammefeltet i X-Y-flyet med begrænsede oplysninger om belastningsfeltet i Z-retningen. Derudover er kun en håndfuld af disse enheder i stand til mikroskopisk in situ-billeddannelse. Den største udfordring med in situ højforstørrelse billeddannelse (f.eks confocal mikroskop) er den begrænsede arbejdsafstand på et par hundrede mikron fra den objektive linse til prøven. Enheder, der tillader levende billeddannelse under strækoffer ensartetheden af belastningen i Z-aksen eller er relativt komplekse og vanskelige at reproducere i andrelaboratorier 39,40.

Denne tilgang til at strække 3D hydrogels giver mulighed for statisk eller cyklisk uniaxial stamme under levende konfokal mikroskopi. Strækenheden (kaldet 'Smart Cyclic Uniaxial Stretcher – SCyUS') er konstrueret ved hjælp af 3D-printede dele og billig hardware, hvilket gør det nemt at formere sig i andre laboratorier. Fastgjort til enheden er et kommercielt tilgængeligt silikonegummi med en geometrisk udskæring i midten. Hydrogel komponenter er polymeriseret til at fylde cut-out. Under polymerisering klæber biologiske hydrogeler, såsom fibrin eller kollagen, naturligt til de indvendige vægge i udskæringen. Ved hjælp af SCyUS er silikonestrimlen uniaxially strakt og overfører kontrollerede stammer til den indlejrede 3D hydrogel41.

Dette system giver mulighed for en unik kombination af funktioner og fordele sammenlignet med andre eksisterende metoder. For det første tillader systemet uniaxial strækning af tykke 3D bløde hydrogels (> 100 μm tyk, <1 kPa stivhed) fra deres periferi, med Z-homogendeformation i hele hydrogel. Disse hydrogels er for bløde til at blive grebet og strakt af konventionelle trækteknikker. For det andet kan strække enheden let replikeres i andre laboratorier, da 3D-udskrivning er let tilgængelig for forskere, og den elektronik, der bruges i designet, er billig. For det tredje, og måske den mest attraktive funktion, geometri og størrelsen af udskæringen i silikone strimlen let kan manipuleres, giver mulighed for tunable stamme gradienter og grænse betingelser samt brugen af en række prøve mængder, ned til et par mikroliter.

Den præsenterede protokol består af støbning fibrin gel i ~ 2 mm diameter diske i 0,5 mm tyk silikone gummi strimler udført af enaksial strækning under levende confocal mikroskopi. Følgende diskuterer i detaljer de eksperimentelle procedurer for måling og analyse af de stammer, der virker på den geometriske udskæring, de interne stammer udviklet i hydrogel, samt deraf følgende fiberjustering efter forskellige strækmanipulationer. Endelig diskuteres muligheden for at indlejre celler i hydrogelen og udsætte dem for kontrolleret ekstern strækning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Løsningsforberedelse (skal udføres på forhånd)

  1. Fibrinogen mærkning
    BEMÆRK: Mærkningstrinnet er kun påkrævet, hvis man ønsker at analysere deformationen af fibringelen. Til cellulære eksperimenter er det muligt at bruge en umærket gel.
    1. Der tilsættes 38 μL på 10 mg/mL succinimidylester fluorescerende farvestof (opløst i DMSO) til 1,5 ml 15 mg/mL fibrinogenopløsning (molarforhold på 5:1) i et 50 ml centrifugerør og anbringes på en shaker i 1 time ved stuetemperatur. Derefter placeres røret i centrifuge i 3 minutter ved 800 x g (stuetemperatur).
    2. Supernatanten filtreres fra det foregående trin gennem en afsaltningskolonne fyldt med dextrangelharpiks (Materialetabel) for at adskille det ureageredefarvestof, 42 ved at følge disse trin.
      1. Forvask kolonnen med 25 mL fibrinogenbuffer.
      2. Injicer langsomt det mærkede fibrinogen fra trin 1.1.1 ind i kolonnen, og sørg for, at der ikke kommer bobler ind i filteret. Kassér den første ~ 0,3 ml eluted opløsning (4-6 dråber svag farvet væske). Derefter indsamle følgende 1,0-1,5 ml renset opløsning (følg producentens protokol for mere specifikke detaljer).
      3. Filtreringsprocessen afsluttes ved at sterilisere den resulterende rensede opløsning ved hjælp af et sprøjtedrevet filter (0,22-0,45 μm).
      4. For at rengøre og genbruge kolonnen skal du vaske med 20 mL fibrinogenbuffer og derefter opbevare 25 mL 20% ethanol.
  2. Efter eluering opdeles det resulterende rensede mærkede fibrinogen i små aliquots på ~ 7-50 μL, afhængigt af det ønskede antal strakte geler. For hver strakt cirkelgel med en diameter på 2 mm fremstilles ca. 3,5 μL fibrinogen (der anvendes 2,5 μL pr. gel + 1 μL til pipetteringsfejl).
    1. Aliquots opbevares i en fryser på -20 °C. De kan bruges op til omkring et år (det anbefales ikke at optø og fryse igen).
    2. I resten af denne protokol opbevares ca. 7 μL af det rensede fibrinogen i køleskabet (4 °C) indtil trin 4. Dette volumen er beregnet til fremstilling af to strakte geler (der er behov for 2,5 μL pr. gel, og der anvendes et ekstra volumen på 1 μL for at tage højde for fejl i prøveforberedelsen).
      BEMÆRK: Denne filtreringsprocedure fortynder typisk den oprindelige fibrinogenopløsning på 15 mg/mL til en endelig koncentration på ca. 10 mg/mL. Fortyndingsfaktoren afhænger af det oprindelige volumen og koncentrationen af fibrinogen som angivet i producentens protokol.
  3. Der fremstilles 7 μL thrombinopløsning (fortyndes ved hjælp af thrombinbuffer til 2 enheder/mL, Materialetabel) og opbevares i køleskabet (4 °C) indtil trin 4. Dette volumen er beregnet til at fylde udskæringerne af to strakte geler.
    BEMÆRK: For at udføre intern stammeanalyse bør der tilsættes 1 μm diameter fluorescerende sfæriske perler (købt som suspension [2% faste stoffer] i vand plus 2 mM NaN3) til thrombinopløsningen (et forhold på 1:25 v/v % af perle:thrombin anbefales til et 40x mål). Perler bør kun medtages, når der ønskes interne stammemålinger, enten i nærvær eller fravær af celler.

2. Forberedelse af silikonestrimler

  1. Hent det 0,5 mm tykke silikonegummi, og skær det i 15 x 80 mm2 strimler med et hul med en diameter på 2 mm i midten af strimlen (Figur 1). Hvis det er muligt, skal du bruge en programmerbar laserskærer for høj præcision. Hvis programmerbare maskiner ikke er tilgængelige, saks er tilstrækkelige til at skære strimlen skitse og en lille hul-punch er tilstrækkelig til centrum cut-out.
    BEMÆRK: Kommerciel silikonegummi købes normalt med plastfolie på begge sider. Opbevar original plastbelægning på begge sider af silikonen, hvis det er muligt. Hvis du genbruger silikonestrimler fra et tidligere eksperiment, skal du behandle dem med trypsin i 0,5 time, suge i 0,2 M NaOH i 0,5 time og derefter suge i 70% ethanol i 1 time. Lad dem tørre før brug.
  2. Forbered tætningsfilm (hydrofobe) lag med dimensioner på mindst 20 × 30 mm2, så de er bredere end silikonestrimlen og giver således mulighed for, at der dannes en forsegling over hele den geometriske udskæring.
  3. Vask en 10 cm skål med 70% ethanol, og tør derefter og tør derefter med ikke-fnugning sarte opgaveservietter (til både sterile og ikke-sterile eksperimenter). Dette trin er vigtigt, da det gør det muligt for forseglingsfilmlagene bedre at holde sig til pladen og begrænse prøvens bevægelse under forberedelsesprocessen.
  4. Læg tætningsfilmlagene i den vaskede 10 cm skål, så der er plads nok til at placere to strimler i hver skål side om side (Figur 2A).
    1. Plastfolien fjernes fra den ene side af silikonestrimlen, og den eksponerede side placeres på tætningsfilmlaget, så udskæringen er omgivet udelukkende af tætningsfilmlaget (Figur 2B). Tryk derefter forsigtigt på silikonen mod tætningsfilmlaget for at forsegle området omkring udskæringen ved hjælp af rene behandskede fingre.
      BEMÆRK: Sørg for, at der ikke er luftlommer mellem silikonen og tætningsfilmen, især omkring udskæringen. Gør dette ved at undersøge bunden af skålen (Figur 2C).

Figure 1
Figur 1: Hydrogel belastende tilgang. (A) 15 × 80 mm2 silikonestribe med en udskæring med en diameter på 2 mm midt i strimlen (B) En silikonestribe med en cirkulær udskæring med indlejret fibringel. Til illustrative formål er udskæringen i silikonen større end i de faktiske eksperimenter (C) Skematisk over strækningsmetoden med silikonestrimlen (orange), cirkulær gel (udskæring i midten) og stofforlængere (grøn), der forbinder silikonen med strækenheden. Et udvidet område af gelen indikerer deformationen af gelen som reaktion på uniaxial strækning af silikonen. For nemheds skyld vises kompressionen langs gelens tykkelse (Z-akse) ikke i illustrationen. Figur 1B &1C er blevet tilpasset fra Roitblat Riba et al.41Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Eksempel på korrekt placering af en silikonestrimmel på et tætningsfilmlag før gelpolymerisering. (A) Placering af to tætningsfilmlag i en skål på 10 cm (B) Placering af silikonestrimler på tætningsfilmlagene (C) Bundbillede af skålen med angivelse af lufttætningen mellem silikonen og tætningsfilmlaget. Til venstre:Korrekt forsegling af tætningsfilmlaget til silikonestrimlen omkring udskæringen uden luftlommer. Til højre: Forkert forsegling af tætningsfilmlaget til silikonestrimlen skåret ud med luftlommer rundt om kanten af udskæringen. Dette vil føre til lækage af hydrogelkomponenterne under silikonen. Rød pil peger på et område, hvor der blev dannet en luftlomme. Klik her for at se en større version af dette tal.

3. Forberedelse thrombin med celler

BEMÆRK: Udfør kun dette trin, hvis der ønskes indlejring af celler i hydrogelen og under sterile forhold i en biologisk hætte (Tabel over materialer).

  1. Sterilisering: Dagen før cellulært eksperiment skal du placere silikonestrimlerne og forsegle filmlag i 70% ethanol natten over og derefter udføre UV-sterilisering i 30 minutter på hver side (hvis de 10 cm retter ikke allerede er sterile, skal de også steriliseres under UV-lys i 30 minutter efter en 70% ethanolvask). UV-systemet, der anvendes i protokollen, er det, der er indbygget i den biologiske hætte.
    BEMÆRK: Alternativt kan der udføres en autoklavesteriliseringscyklus (140 °C) på silikonestrimlerne, da de er modstandsdygtige over for op til 260 °C.
  2. Der udføres celleantal for at bestemme cellekoncentrationen, og centrifuge og suspendere cellepillen igen med 7 μL thrombin (2 enheder/mL) i et 1,5 mL centrifugerør. Vi anbefaler en cellekoncentration på 800 celler/μL thrombin. Hold cellerne kølet, indtil de bruges (må ikke overstige mere end en halv time for at undgå at beskadige cellerne).

4. Polymerisering af fibrin geler

  1. Hent de 2 Unit/mL thrombin & 10 mg/mL mærkede fibrinogenopløsninger fra køleskabet (tilberedt i trin 1) og læg dem på is, hvor de vil være tilgængelige.
    BEMÆRK: Opløsningerne holdes kolde før blandingsprocessen for at bremse polymeriseringsreaktionens kinetik. Dette giver mulighed for mere homogen blanding af proteinerne.
  2. Med parabol(e) sat op (trin 2), ekstrakt 2,5 μL af mærket-fibrinogen og pipette det ensartet ind i silikone cut-out (med forsegling film lag fastgjort til sin nederste side), således at hele omkredsen af udskæringen er i kontakt med fibrinogen. Pas på ikke at tillade luftlommer eller bobler at danne sig noget sted i opløsningen, idet der lægges særlig vægt på de nederste kanter af udskæringen (grænsefladen mellem tætningsfilmlaget og silikonen).
  3. Tag straks 2,5 μL thrombin (med eller uden celler/perler) og pipetter det direkte ind i fibrinogenopløsningen i udskæringen (og når det endelige volumen på 5 μL fibrin). Derefter blandes hurtigt de to løsninger ved omhyggeligt at pipette op og ned ~ 10 gange. Under blandingsprocessen skal du flytte spidsen rundt om hele volumenet for at skabe så homogen en opløsning som muligt.
  4. Tilføj en meget lille mængde fosfat buffer saltvand (PBS) [alternativt celle medium til celle eksperimenter, Tabel over materialer] langs kanten af hver skål, så hydrogel ikke tørre ud under polymeriseringsprocessen. Sørg for, at der ikke er kontakt mellem PBS/cellemediet og prøverne, da dette vil beskadige prøven.
  5. Skålen/skålene skal dækes og anbringes i inkubatoren ved 37 °C i 30 minutter.
    BEMÆRK: Den krævede inkubationstid afhænger af gelens volumen. Hvis der anvendes større mængder, skal inkubationstiden øges.
  6. Fjern skålen(e) fra inkubatoren og tilsæt PBS/cellemedie til skålen, og nedsænk hele gel-silikonekonstruktionen.
  7. Løft forsigtigt prøvekonstruktionerne en ad gangen fra skålen, og sørg for, at forseglingsfilmlaget forbliver klæbet til strimlen. Fjern langsomt forseglingsfilmlaget fra silikonen ved forsigtigt at pealing fra den ene ende af silikonen til den anden (Figur 3). Undgå at trække fra områder tæt på udskæringen, hvor der kan være stresskoncentrationer (dette er hovedsageligt vigtigt for ikke-cirkulære geometrier). Undgå enhver kontakt med udskæringen, da det vil beskadige prøven.
  8. Strimlen tilbage i fadet med PBS/cellemedie, så strimlen flyder i fadet. Derefter føres skålene til et standardcellekulturmikroskop for kvalitativt at vurdere hver enkelt prøves tilstand. Gelerne skal være ensartede, kontinuerlige i hele udskæringen, og der må ikke være bobler til stede. Brug figur 4 som vejledning til at vælge de bedste prøver til yderligere analyse.

Figure 3
Figur 3: Korrekt fjernelse af forseglingsfilmlaget fra bunden af silikonestrimlen. Fjernelsesprocessen skal udføres langsomt, så hydrogelen ikke river eller bryder vedhæftningen med de indre vægge i udskæringen. Den hvide pil viser retningen af fjernelse. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Mikroskopisk observation af fibrin geler i silikone cut-out. (A) To eksempler på en korrekt polymeriseret fibringel. Bemærk gelens relative homogenitet og den fulde vedhæftning til kanterne af udskæringen (B) To eksempler på svigt i prøvepolymerisationen. Øverst: Læg mærke til de mange bobler og aggregater dannet på nederste venstre side. Nederst: Bemærk gelens rive fra de udskårne kanter og aggregaterne i det nederste venstre område af udskæringen. Skalalinje = 300 μm Klik her for at se en større version af dette tal.

5. Prøvebelastning på SCyUS-enheden

  1. Fyld badet med PBS/cellemedium (Figur 5) og læg silikonestrimlen med prøvegelen hen over toppen, så enderne sidder på hver side af badet. Badet er beregnet til at undgå tørring af gelen. Placer og stram klemmerne (lilla) sammen med stofstrimlerne (grønne), så alle stykker er forbundet til at danne en lige strimmel med udskæringen i midten(Figur 5).
  2. SCyUS-enheden og fastgør aluminiumsvæsken godt og 22 mm x 40 mm rektangulær glasovertræk (nr. 1 eller 1.5)(figur 6Aiii). Dækslet fastgøres til bunden af brønden ved hjælp af tætningsmateriale (f.eks. vakuumfedt), så brønden kan fyldes med væske uden lækage.
    1. Fyld brønden med ~1-2 mL PBS/cellemedie og placer strimlen + stoffet + gelkonstruktionen (Figur 6B) i enheden. Klem stofstrimlen (2) ind i beslaget (1), så udskæringen + gelen (5) er i midten som vist, og placer derefter forsigtigt pin-down-indsatsen (4) i enheden og lås den på plads.
    2. Sæt derefter den anden stofside på spindlen (uden at fastgøre servomotoren) og lås den fast i spindlen (Figur 6C).
  3. Sæt SCyUS-enheden sammen med den vedhæftede prøve i mikroskopets stadie (Figur 6C). Tilslut mikrocontrolleren (Tabel over materialer) til computeren via et USB-kabel, og tilslut servomotoren til mikrocontrolleren. Åbn SCyUS-kontrolmodulet på computeren. Prøven er nu klar til billeddannelse for at kontrollere tilstrækkeligheden af gelens tykkelse og fiber homogenitet under konfokale mikroskop.

Figure 5
Figur 5: (A) Jig, der indeholder et PBS-bad (3D-printet) (B) Stripplacering på gelen for at sikre korrekt fastgørelse på linjen af beslag (i lilla) og forhindre tørring af gelen. Dette tal er blevet ændret med tilladelse fra Roitblat Riba et al.41Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: SCyUS-strækker sig. (A) Flere visninger af en CAD-model af de vigtigste dele af SCyUS: spindel forbundet til servo (blå), statisk anker (rød), indsætte, at stifter silikone strimlen ned (lilla) og fixere, der forhindrer indsatsen i at stige op (gul-grøn). En top view af systemet (Ai), en skåret visning af systemet (Aii), der viser stien til strimlen (orange linje), og en bundvisning (Aiii) af aluminium væske godt med et glas coverlip. Væskebrønden kan flyttes op og ned med en skrues drejning monteret i den store gevindskæring. Aluminiumbrøndens opadgående bevægelse er begrænset af det lilla indlægs sidevinger, som det fremgår af de hvide pile (B) Det faktiske system: (1) statisk anker (2) grønt ikke-strækbart stof (3) skrue til aluminium væskebrønd højdekontrol (4) rød pin-down skær (5) en silikone strimmel med en cirkulær udskæring (6) blå forbindelse klemmer (C) Stræksystemet placeret på et konfokalt mikroskop. Servomotoren og spindlen vises med pile. Dette tal er blevet ændret med tilladelse fra Roitblat Riba et al.41Klik her for at se en større version af dette tal.

6. Sørg for passende gel til prøveudtagning

  1. Brug af confocalmikroskopet (Tabel over materialer) tager en lav forstørrelse (10×), lav opløsning (~1,4 μm x 1,4 μm pixelstørrelse) confocal Z-stack (≤10 Z-skiver med en trinstørrelse 10 μm er tilstrækkeligt) flisebillede af hele gelen ved hjælp af lasere på 488/543/561 til at undersøge homogenitet og vedhæftning til omkredsen af den geometriske udskæring i hele silikonens tykkelse ( Figur7A-B). Brug dette Z-stack-billede som et kort til følgende trin.
  2. Brug levende billeddannelse med lav opløsning til at scanne gelen og bestemme den laveste Z-position, hvor fuld vedhæftning til udskæringens indre vægge er tydelig uden tårer eller bobler, og bemærk mikroskopets Z-placering(Zl). For at bestemme gelens fulde vedhæftning til silikonen under hele omkredsen skal du scanne grænsefladen mellem gelens fluorescerende etiket og silikonestrimlen (mørk baggrund) under mikroskopet (Figur 7C).
  3. Gå op i Z-retningen, indtil der ikke længere er kontinuitet i gelen, og noter Z-positionen(Zu):
  4. Fratræk den øvre grænse (Zu) i Z-retningenfra den nedre grænse ( Zl). Dette er prøvens referencetykkelse (Zo):
    Equation 1
    Hvis Zo ≥ 100 μm, anses gelen for tilfredsstillende til analyse. Bemærk, at tykkelsen af silikoneudskæringen er ca. 500 μm, men gelpolymerisering i udskæringen resulterer typisk i en mindre geltykkelse. 100 μm er den anbefalede minimumstykkelse for at sikre en stabil strækproces uden tårer eller løsrivelse af gelen fra silikoneudskæringen.
    BEMÆRK: På forskellige XY-steder kan gelens tykkelse variere. Dette afsnit af protokollen måler gelens mindste tykkelse, så vi kan bestemme gelkvaliteten og angive, om det er tilstrækkeligt til strækning. Derudover er det at finde midten af gelen et referencepunkt for at vende tilbage til post-stretching, hvad enten det er statisk eller dynamisk.

Figure 7
Figur 7: Gel homogenitet. Flisebilleder blev taget og syet ved hjælp af confocal mikroskop software (Tabel over materialer) (A) En enkelt syet flise Z-skivebillede af en fibrin gel prøve med relativt uopmæmmende fibertæthed på grund af forkert thrombin og fibrinogen blanding præ-polymerisering. Denne gel giver ikke en pålidelig analyse (B) Et enkelt syet flise Z-skivebillede af en fibrin gel prøve med relativt homogen fibertæthed. Dette er en acceptabel gel til strækning eksperimenter. Skalabjælken for billeder A &B er 200 μm (C) Zoom ind på grænsefladen mellem den fluorescerende mærkede gel (rød) og silikonen (sort baggrund). Skalastang = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

7. SCyUS-drift, strækning og billeddannelse

  1. Nu, hvor prøven er blevet bestemt til at være af tilfredsstillende kvalitet og er indstillet korrekt på SCyUS-enheden, bestemmes prøvens forstrakte position. Dette opnås ved at bruge levende billeddannelse under konfokalt mikroskop (svarende til trin 6.2).
    1. Sørg for, at servomotoren er på nulposition ved at klikke på knappen Gå til nul Servo Pos (Klik på Figur 8A, og sørg for, at Figur 8B viser nul) og fastgør den til strækenheden som set i Figur 6C.
      BEMÆRK: Gør dette trin langsomt og forsigtigt for ikke at sætte overskydende spænding på prøven.
    2. Mens du bebilleder prøven, skal du flytte motoren en grad (Figur 8C) ad gangen i urets retning ved at klikke på +1 knappen, indtil højre side af udskæringen observeres for at bevæge sig. Vend derefter bevægelsen (Figur 8D) tilbage til den næstsidste trinposition ved at klikke på knappen -1. Dette kontrollerer, at prøven er under minimal spænding. Klik på knappen Angiv Min Servo-position (Figur 8E) for at angive referencepositionen. Det er til enhver tid muligt at vende tilbage til referencepositionen ved at klikke på knappen Gå til min Servo-position (Figur 8F).
      BEMÆRK: Det anbefales at bruge en målsætning med høj forstørrelse (≥40×) til dette trin for at minimere fejl.
    3. Indfang en højforstørrelse (40×), høj opløsning (~0,2 μm × 0,2 μm pixelstørrelse), et enkelt Z-skive flisebillede af hele gelområdet. Dette vil blive brugt som referencebillede til efterbehandlingsanalyse. Det anbefales at tage et enkelt Z-skivebillede i midten af geltykkelsen (ved hjælp af Zo fra Eq. 1), dette vil give mulighed for at vende tilbage til omtrent samme Z-positionefter strækning. Også tage hensyn til, at høj opløsning flise billeder af hele gel-området tager lang tid (~ 20-30 min).
    4. Nu er prøven klar til statisk strækning. Juster servomotoren til den ønskede strækstyrke ved at rykke en grad(figur 8C)frem ad gangen i GUI(udfør dette langsomt, ca. 1 grad/sekund).
  2. På hver strækningsstyrke, hvor der ønskes analyse, skal du fange et enkelt Z-skive højopløsnings flisebillede af hele gelområdet til efterbehandlingsanalyse. I lighed med trin 6.2 skal du kontrollere, at gelen ikke er løsrevet fra silikonen under hele omkredsen ved at scanne grænsefladen mellem gelen (rød) og silikonen (mørk baggrund) på udkig efter ændringer i vedhæftning fra den tidligere strækstyrke.
    BEMÆRK: Brug livebilleder under aktiveringen af motoren til at følge gelplaceringen i X-Y (med indstillinger for lav opløsning og lav forstørrelse). Gelen oplever en Z-Poisson-effekt, hvor bunden af gelen stiger, derfor bør mikroskopets Z-positionogså justeres til det omtrentlige centrum af geltykkelsen for hver strækstyrke. Dette kan opnås ved at genberegne Zo (Eq. 1) for hver strækningsstyrke. Da stræk i Z-retningen er relativt homogen, er det ikke afgørende at finde den nøjagtige midterste dybde af gelen.

Figure 8
Figur 8: GUI for SCyUS-kontrolmodulet. (A)Motorens placering i grader. Værdien ligger mellem -90° og 90° (B) 'Angiv mindste Servo-position'. Denne knap giver mulighed for en forudindstillet minimumsposition, hvor servomotoren indstilles med en ny referenceposition, der er forskellig fra knappen Nul Servoposition (C) 'Plus 1°', flytter servomotoren med én grad med uret (D) 'Minus 1°' -knappen flytter servomotoren en-graders med uret (E) 'Gå til nul position' indstiller servomotorpositionen til 0° ([A]indstilles til nul) (F) 'Gå til mindste servoposition' knappen flytter servomotoren til den brugerdefinerede 'Min' position. Klik her for at se en større version af dette tal.

8. Eksterne stammemålinger efter behandling

  1. For at måle de effektive belastninger af udskæringsgrænserne skal du måle kant-til-kant-længderne i strækretningen (X-akse) i midten af Y-aksen( Figur9A).
    1. Overfør det forstrækningsbillede til billedbehandlingssoftwaren (ImageJ FIJI43), og mål den største kant-til-kant-afstand, der defineres som hullets aksiale længde ( Equation 8 ) i midten.
    2. Definer den største afstand fra top til bund som vinkelret afstand ( Equation 6 ).
    3. Gentag denne proces for alle billeder af strækintervallet, og beregn aksialafstandene Equation 7 ( ) og vinkelret ( ) af Equation 5 den udskårne periferi ( Figur9A, nederst), og udfør derefter følgende beregninger for at finde stammerne af de udskårne kanter:

Equation 2

Equation 3

Figure 9
Figur 9: Gelstammer på grund af ekstern strækning af silikonestrimlen. (A) X-Y tværsnit af en uudstrækt fibrin gel (top), og efter påføring af εhul = 64% stamme langs x retning (nederst). Gelen er indlejret med fluorescerende perler. De relevante længder af d og l, der anvendes til beregning af εhul, er angivet på billederne (B) Zoom-in-billeder af det stiplede firkantede område, der er markeret i A (C) Illustration af de stammetyper, der tages i betragtning i denne undersøgelse: εhul er udskæringens aksiale stamme med maksimal diameter og εgel er den aksiale stamme i midten af gelen (målt ved perleaggregatlokationerne) (D) Der blev fundet et lineært forhold mellem εhul og εgel i både xx retning (rød linje) og yy retning (grøn linje). Dette tal er blevet tilpasset med tilladelse fra Roitblat Riba et al.41Klik her for at se en større version af dette tal.

9. Analyse af fiberorientering

  1. Brug kvantificering af fiberjustering til at karakterisere fibergelens strukturelle respons på stigende strækstørrelser. Overfør billeder i høj opløsning til ImageJ FIJI-software (NIH)43, og analyser derefter ved hjælp af MODULET OrientationJ (EPFL)44 (Indstillinger: Gaussisk graduering og 3-pixel vindue, Figur 10).
    1. Beregn 2D Nematic Order Parameter (NOP) for retnings histogrammet som:45
      Equation 4
      BEMÆRK: En værdi på NOP = 1 angiver perfekt justering langs aksial retning (vinkel nul) og NOP = 0 angiver isotropi. Orienteringsvinklen, θ, er fibervinklen i forhold til stammeaksen (x-aksen), der opnås gennem billedanalyse og præcist defineret i OrienteringJ-dokumentationen. 44 år

Figure 10
Figur 10: Fiberorienteringsanalyse ved hjælp af FIJI ImageJ-software. (A) Billedmenuen med en pil, der angiver placeringen af rullemenuen 'Plugins', hvor 'OrientationJ' kan findes. Klik på indstillingen 'OrientationJ Distribution'(B) OrienteringJ's distributionsmodul under den udvidede menu 'OrientationJ'. Indstil 'Lokalt vindue σ' til 3 pixel og 'Graduering' til 'Gaussian'. Tryk derefter på knappen 'Kør' (rød pil). Klik her for at se en større version af dette tal.

10. Manuel intern gel stamme analyse

  1. Mens du udfører levende højforstørrelsesbilleddannelse af en hydrogel med indlejrede perler, skal du manuelt finde et interesseområde (ROI) med let genkendelige funktioner (f.eks. aggregater af perler) for at vende tilbage til det samme sted efter hver strækningsstørrelse.
    BEMÆRK: Kompression i Z-retning (Poisson effekt) kan føre til en stigning i perle tæthed som stretch stiger, derfor foreslår vi at vælge perle aggregater store nok, så de er klart identificerbare. Denne protokol kræver en analyse af den centrale region af fibrin gel, selv om enhver region kan vælges.
  2. I pre-stretch position (trin 6), fange en høj opløsning Z-stackbillede af den valgte ROI. Efter hvert ønsket strækinterval skal du vende tilbage til det samme investeringsafkast og gentage billedoptagelsesprocessen.
  3. Tag billederne og importere dem til ImageJ. I investeringsafkastet skal du registrere X-Y-pixelplaceringen for hvert synligt perleaggregat. Overfør de registrerede data til et regneark.
  4. Mål afstandene mellem hvert par aggregater, og sammenlign dem med afstandene for de samme par i referencebilledet, hvilket gør det muligt at beregne stammer i X- og Y-retningen.
    BEMÆRK: Hvis en kontinuerlig real-time film er optaget, mens gelen er strakt (i stedet for statisk billedoptagelse), en automatisk analyse af stammer kan udføres med digitale billede eller volumen korrelationer (DIC / DVC) metoder, som tidligere demonstreret46,47. Det skal dog bemærkes, at automatisk DIC / DVC-analyse er udfordrende i denne indstilling, da Z-stakkenikke kun bevæger sig i X-Y-flyet, men også i Z-retningenpå grund af Poisson-effekten (kompression), der tegner sig for betydelige driver under den optagede film.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I figur 9er repræsentative data fra statiske stræk af stigende størrelsesordener anvendt på silikonestrimlen med en 3D-fibrinhydrogel, indlejret med 1 μm fluorescerende perler . Analysen viser effekten af silikone stretch på geometriske ændringer af cut-out samt de udviklede stammer i gelen. Z-stakbilleder af hele gel bruges til at evaluere deformationen af den oprindelige cirkel formet cut-out til elliptisk geometri (Figur 9A). Disse billeder bruges til at beregne εxx(hul) (Equation 2). Zoome ind og manuelt spore flere perle aggregater (Figur 9B) under gel stretching, giver mulighed for beregning af lokale gel stammer i midten, i den aksiale εxx(gel)og vinkelret εyy(gel)retninger (Figur 9C, D). Aksialstammerne formerer sig relativt lineært fra silikoneudskæringskanten til gelens centrum og er større end de kompressive vinkelret stammer (Figur 9D).

Billeder med høj forstørrelse af den fluorescerende mærkede gel giver mulighed for observation og kvantificering af fiberjustering, induceret af silikonestrækningen. Figur 11 viser repræsentative zoom-in billeder af en typisk u-strakt og relativt isotropisk hydrogel (Figur 11A) og en hydrogel under høj 80% cut-out stamme skildrer stærkt justerede fibre i strækretningen (Figur 11B). Analyse af fiberreorientering ved hjælp af ImageJ afslørede omtrent lineær afhængighed mellem fiberjustering (NOP) og den eksterne belastning af udskæringen (εhul) op til stammer på 40%, med moderat mætning ved stammer over 40% (Figur 11D). En detaljeret analyse af fiberjustering i forskellige Z-skiverer vist i figur 12. Her beregnes histogrammer af fiberjustering for hver Z-skive(Figur 12A) samt deres tilsvarende NOP (Figur 12B) og den gennemsnitlige NOP over alle Z-skiverfor hver ekstern belastningsstyrke af udskæringen (Figur 12C). Efterhånden som εhul øges, øges fiberjusteringen efter en samlet ikke-lineær kurve som vist i figur 12C. Bemærk, at gelen trækker sig sammen langs Z-aksen på grund af Poisson-effekten, repræsenteret ved de kortere linjer ved højere stammer i figur 12B.

Da det har vist sig vanskeligt at udføre dybdegående analyse af de interne stammer i hele gelen, giver vi her foreløbige resultater af finite element (FE) simuleringer udført på 2D kontinuerligt materiale i betragtning af fibrins mekaniske egenskaber (Figur 13). Den eksterne stamme af cut-out er ~ 40%, og farvekortet repræsenterer stretch-induceret stamme felt. Farvekortet varierer fra 38%-42%, hvilket indikerer, at gelstammer er relativt homogene i hele det cirkulære gelområde. Vi bemærker, at hvis der anvendes andre gelgeometrier, kan der opstå stigninger i belastning, og dette er et emne for fremtidige undersøgelser.

For at demonstrere, at indlejrede fibrin geler kan opretholde vedhæftning til silikone strimlen ved høje stammer (0 til +30%) og frekvenser (op til 1 Hz), vi kørte indledende tests (protokol for denne test er ikke inkluderet i dette arbejde) viser ingen løsrivelse af gelerne fra de indvendige vægge af cut-out. Tre geler blev testet, gel 1 i en samlet varighed på ~ 87 minutter, gel 2 i 60 minutter & gel 3 i 30 min i alt (Tabel 1). I alle tre tilfælde fastholdt fibrin hydrogels deres vedhæftning til silikonen.

Figure 11
Figur 11: Gel fiber tilpasning som reaktion på eksterne stretch. Billeder taget i midten af en fluorescerende-mærket gel, mens (A) unstretched og (B) efter anvendelse af εhul= 80% (C) Gennemsnitlig histogrammer af fiber orienteringer under stigende εhul [%] stammer. Grå fejllinjer angiver forskelle mellem 40 skiver i den z-stak, der vurderes for hver testet stamme (D) Gennemsnitlig NEMATIC Order Parameter (NOP) som funktion af εhul for tre forskellige gelprøver (herunder "Gel 1", der analyseres i figur 11A-C). Fejllinjer angiver forskelle mellem udsnit i Z-stakken for hver strækstyrke. Dette tal er blevet tilpasset med tilladelse fra Roitblat Riba et al.41Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 12
Figur 12: Analyse af fiber orientering ved hjælp af OrientationJ44 værktøj (ImageJ software)43 (A) 3D histogrammer af fiber orientering for forskellige Z-skiver. Vist er eksempler på to histogrammer beregnet for strakte (εhul = 17,6%, top) og ustrakte (nederste) geler. Histogrammet normaliseres således, at området under kurven er lig med 1 (B) Resulterende NOP versus Z-dybde; grafen viser beregningerne af NOP for hvert histogram som funktion af Z-dybde(C) Middelværdi NOP som funktion af εhul. Fejllinjer repræsenterer STANDARDAFVIGelsen for NOP for alle Z-skiveri en individuel strækstyrke på samme XY-punkt i samme gel. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 13
Figur 13: 2D finite elements (FE) simulering af en strakt gel. Gel strækkes (εhul ≈ 40%) af en silikonebærer. Stammefelt præsenteres med værdier for maksimal hovedbelastning, hvor der observeres mindre stigninger. Den cirkel, der repræsenteres af den syrrede linje, er hullets forudindstillede geometri, den oprindelige længde (lo) er den midterste længde langs x-aksen, før stræk påføres, og den strakte længde (l) er den midterste længde langs x-aksen, når strækningen er påført. Klik her for at se en større version af dette tal.

Gel #1 Dynamisk belastningsforstærkning (Frekvens 1 Hz) Dynamisk strækvarighed (min.)
0-37% 0.1
1
5
15
30
0-48% 1
5
30
Samlet tid under dynamisk strækning 87 min
Gel #2 Dynamisk belastningsforstærkning (Frekvens 1 Hz) Dynamisk strækvarighed (min.)
0-30% 0
10
20
30
0-50% 30
Samlet tid under dynamisk strækning 60 min.
Gel #3 Dynamisk belastningsforstærkning (Frekvens 1 Hz) Dynamisk strækvarighed (min.)
0-30% 10
20
30
Samlet tid under dynamisk strækning 30 min.

Tabel 1: Repræsentative resultater af et dynamisk stræksikkert koncept. Tre geler blev indlejret i silikonestrimler og strakt dynamisk (1 Hz) i forskellige varigheder. Stammer varierede fra nul til forskellige størrelser over 30%. Alle tre geler opretholdt med succes deres vedhæftning til de indre vægge i den cirkulære udskæring af silikonestrimlen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den metode og protokol, der præsenteres heri, er i vid udstrækning baseret på vores tidligere undersøgelse af Roitblat Riba et al.41 Vi inkluderer her det fulde computerstøttede design (CAD), Python og mikrocontrollerkoder på SCyUS-enheden.

De største fordele ved den præsenterede metode i forhold til eksisterende tilgange omfatter muligheden for at stamme meget bløde 3D hydrogels (Elastic Modulus på ~ 100 Pa) fra deres omkreds, og under levende konfokale billeddannelse. Andre metoder er normalt begrænset i deres evne til at anvende stamme felter i Z-aksen og er ude af stand til at give in situ høj-forstørrelse mikroskopi billeder, mens stretching, hovedsagelig på grund af arbejdsafstand begrænsninger fra prøven til den objektive linse. De fleste tilgængelige systemer er baseret på 2D-substrat-stretching, som er begrænset i efterligne fysiologiske vævsmiljøer.

Systemets begrænsninger omfatter potentiel inkonsekvent homogenitet af fibertætheden af gelen efter polymerisering (Figur 7A), især når der anvendes store gelmængder eller komplekse geometrier. Sådanne ikke-homogeniteter kan føre til ikke-ensartede stammer og fiberjustering i gelen. Desuden kan optiske begrænsninger ved relativt dybe Z-sektioner(>30 μm) give anledning til fejl i analysen af fiberorientering.

Kritiske trin i 3D-strækningsprotokollen omfatter følgende (i) Sørg for, at prøvegeler har opnået fuldstændig vedhæftning til de indre vægge af den geometriske udskæring i silikonen uden bobler eller tårer, især langs Z-retningen. Fuldstændig vedhæftning og kontinuitet i prøven med en tykkelse på mindst 100 μm (Eq. 1) er afgørende for pålideligt at strække prøven til en ønsket stamme (ii) Fastgør prøven korrekt til SCyUS-enheden inden strækningen. Silikonestrimlen skal fastgøres til beslagene og de ikke-elastiske stoflængdeforlængere ved hjælp af den 3D-printede jig (Figur 5A) og for at validere, at alle stykker er fastgjort in-line, hvilket sikrer, at belastningen induceres symmetrisk i gelen. Dette gælder også for korrekt indlæsning af enhedens spindel (figur 6B-C) (iii) Indfang forsigtigt prøvens referenceposition (forstrækning). Hvis referencebilledet tages, mens prøven allerede er under spænding (f.eks. på grund af servomotorens fastgørelse før dette trin), vil alle belastningsmålinger være unøjagtige.

Potentielle fremtidige anvendelser og ændringer af den præsenterede protokol omfatter følgende:

i) Der kan anvendes et cyklisk strækregime på cellens indlejrede hydrogeler. Da motorens dynamiske bevægelse er kodet af mikrokontrollersoftwaren, kan enhver cyklisk profil programmeres, begrænset kun af opløsningen og rotationshastigheden for den motor, der er ansat i systemet (flere detaljer findes i Roitblat Riba et al.41). I dette arbejde viste vi, at fibringel kan opretholde vedhæftning under dynamisk strækning (tabel 1). Selv om yderligere test er nødvendig, vil anvendelsen af cyklisk belastning give indsigt i den dynamiske reaktion af hydrogel og indlejrede celler.

ii) Silikoneudskæringens geometri og volumen kan ændres. I den nuværende protokol fokuserede vi kun på geler i en cirkulær geometri. Under sådanne forhold er interne stammer relativt homogene i hele gelen, som forudsagt af vores FE-simuleringer (Figur 13). Men hvis andre gelgeometrier vil blive overvejet ved at ændre udskæringsafsnittet af silikonen, vil gradienter dukke op. For eksempel kan en 'diamant' formet udskæring potentielt føre til en gradient i gelstammerne på grund af en gradvis ændring i den oprindelige længde af udskæringen langs strækningsretningen. Denne metode til gel stamme kontrol er særligt tiltalende, da forskellige formede cut-outs er relativt trivielle at fremstille. Derudover kan tykkelsen og arealet af silikoneudskæringen let ændres, hvilket giver mulighed for justeringer i gelvolumener, fra miniaturevolumener af nogle få mikroliter til større mængder forbundet med mm-cm skala gelstørrelser. Desuden er det muligt at inkludere flere udskæringer i den samme silikonestrimmel, hvilket giver mulighed for strækning af flere geler samtidigt.

(iii) Celler kan indlejres i hydrogel. Der er et par udfordringer, der bør tages i betragtning, når indlejre celler i de strakte hydrogels. De fleste celler indlejret i 3D hydrogels anvende betydelige trækkraft kræfter på matrixen, samt nedværdigende matrix over tid. Dette kan resultere i global sammentrækning og fordøjelse af gelen, hvilket kan føre til frakobling af gelen fra silikoneudskæringens indre væg i længere tid med inkubation. En mulig måde at håndtere denne situation på er at bruge lave cellekoncentrationer og begrænse tiden for cellulære eksperimenter til et interval, hvor gelsammentrækning og nedbrydning er minimal. Vi har tidligere vist muligheden for at dyrke fibroblalastceller i fibringelen under statisk strækning på 10% over en periode på 5 timer uden tegn på gelflåning eller frakobling fra silikoneudskæringen41.

( iv) Denne opsætning bør også afprøves sammen med andre typer hydrogeler, navnlig syntetiske, såsom polyacrylamid (PAA) eller polyethylenglycol (PEG)-baserede hydrogeler, som almindeligvis anvendes til cellekultur. Den naturlige vedhæftning af disse hydrogels til silikoneudskæringen bør undersøges, og hvis det viser sig at være utilstrækkeligt til gel stretching, bør der anvendes teknikker til at tilskynde til vedhæftning. Brugen af biologisk lim48,49 eller kemiske behandlinger50,51,52 til udskæringsoverfladen bør overvejes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Nogle tal, der er inkluderet her, er blevet tilpasset med tilladelse fra Copyright Clearance Center: Springer Nature, Annals of Biomedical Engineering. Belastende 3D hydrogels med ensartede z-aksestammer, samtidig med at der muliggøres levende mikroskopibilleddannelse, A. Roitblat Riba, S. Natan, A. Kolel, H. Rushkin, O. Tchaicheeyan, A. Lesman, Copyright© (2019).

https://doi.org/10.1007/s10439-019-02426-7

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 546 carboxylic acid, succinimidyl ester Invitrogen A20002
Cell Medium (DMEM High Glucose) Biological Industries 01-052-1A Add 10% FBS, 1% PNS, 1% L-Glutamine, 1% Sodium Pyruvate
Cover Slip #1.5 Bar-Naor Ltd. BN72204-30 22×40 mm
DIMETHYL SULPHOXIDE 99.5% GC DMSO Sigma-Aldrich Inc. D-5879-500 ML
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Biological Industries 02-023-1A
EVICEL Fibrin Sealant (Human) Omrix Biopharmaceuticals 3902 Fibrinogen: 70 mg/mL, Thrombin: 800-1200 IU/mL
Fibrinogen Buffer N/A Recipe for 1L: 7g NaCl, 2.94g trisodium citrate dihydrate, 9g glycine, 20g arginine hydrochloride & 0.15g calcium chloride dihydrate. Bring final volume to 1L with PuW (pH 7.0-7.2)
Fluorescent micro-beads FluoSpheres (1 µm) Invitrogen F8820 Orange (540/560)
Provided as suspension (2% solids) in water plus 2 mM sodium azide
High-Temperature Silicone Rubber McMaster-Carr 3788T41 580 µm-thick
E = 1.5 Mpa
Poisson Ratio = 0.48
Tensile Strength = 4.8 MPa
Upper limit of stretch = +300% engineering strain
HiTrap desalting column 5 mL (Sephadex G-25 packed) GE Healthcare 17-1408-01
HIVAC-G High Vacuum Sealing Compound Shin-Etsu Chemical Co., Ltd. HIVAC-G 100
ImageJ FIJI software39 National Institute of Health, Bethesda, MD Version 1.8.0_112
Microcontroller (Adruino Uno + Adafruit Motorshield v2.3) Arduino/Adafruit Arduino-DK001/Adafruit-1438
MicroVL 21R Centrifuge Thermo Scientific 75002470
Parafilm Bemis PM-996
Primovert Light Microscope Carl Zeiss Suzhou Co., Ltd. 491206-0011-000
SCyUS CAD (Solidworks) Dassault Systèmes N/A
SCyUS Code37 N/A N/A
Servomotor - TowerPro SG-5010 Adafruit 155
SL 16R Centrifuge Thermo Scientific 75004030 For 50 mL tubes
Sterile 10 cm non-culture plates Corning 430167
Thrombin buffer N/A Recipe for 1L: 20g mannitol, 8.77g NaCl, 2.72g sodium acetate trihydrate, 24 mL 25% Human Serum Albumin, 5.88g calcium chloride. Bring final volume to 1L with PuW (pH 7.0)
Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%) Biological Industries 03-052-1B
USB Cable (Type B Male to Type A Male) N/A N/A
Zeiss LSM 880 Confocal Microscope Carl Zeiss AG 2811000417
ZEN 2.3 SP1 FP3 (black) Carl Zeiss AG Release Version 14.0.0.0

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bleuel, J., Zaucke, V., Bruggemann, G. P., Niehoff, A. Effects of cyclic tensile strain on chondrocyte metabolism: a systematic review. PLoS ONE. 10, 0119816 (2015).
  2. Pennisi, C. P., Olesen, C. G., de Zee, M., Rasmussen, J., Zachar, V. Uniaxial cyclic strain drives assembly and differentiation of skeletal myocytes. Tissue Engineering Part A. 17, 2543-2550 (2011).
  3. Grodzinsky, A. J., Levenston, M. E., Jin, M., Frank, E. H. Cartilage Tissue Remodeling in Response to Mechanical Forces. Annual Review of Biomedical Engineering. 2 (1), 691-713 (2000).
  4. Munster, S., et al. Strain history dependence of the nonlinear stress response of fibrin and collagen networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110, 12197-12202 (2013).
  5. Vader, D., Kabla, A., Weitz, D., Mahadevan, L. Strain-induced alignment in collagen gels. PLoS ONE. 4, 5902 (2009).
  6. Badylak, S. F. The extracellular matrix as a scaffold for tissue reconstruction. Seminars in Cell & Developmental Biology. 13 (5), 377-383 (2002).
  7. Natan, S., Koren, Y., Shelah, O., Goren, S., Lesman, A. Molecular Biology of the Cell. 31 (14), 1474-1485 (2020).
  8. Ban, E., et al. Mechanisms of Plastic Deformation in Collagen Networks Induced by Cellular Forces. Biophysical Journal. 114 (2), 450-461 (2018).
  9. Kim, J., et al. Stress-induced plasticity of dynamic collagen networks. Nature Communications. 8, 842 (2017).
  10. Storm, C., Pastore, J. J., MacKintosh, F. C., Lubensky, T. C., Janmey, P. A. Nonlinear elasticity in biological gels. Nature. 435, 191-194 (2005).
  11. Wen, Q., Basu, A., Janmey, P. A., Yodh, A. G. Non-affine deformations in polymer hydrogels. Soft Matter. 8, 8039-8049 (2012).
  12. Muiznieks, L. D., Keeley, F. W. Molecular assembly and mechanical properties of the extracellular matrix: A fibrous protein perspective. Biochimica et Biophysica Acta. 1832, 866-875 (2012).
  13. Brown, A. E. X., Litvinov, R. I., Discher, D. E., Purohit, P. K., Weisel, J. W. Multiscale mechanics of fibrin polymer: gel stretching with protein unfolding and loss of water. Science. 325, 741-744 (2009).
  14. Carroll, S. F., Buckley, C. T., Kelly, D. J. Cyclic tensile strain can play a role in directing both intramembranous and endochondral ossification of mesenchymal stem cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 5, 73 (2017).
  15. Livne, A., Bouchbinder, E., Geiger, B. Cell reorientation under cyclic stretching. Nature Communications. 5, 3938 (2014).
  16. Wang, L., et al. Patterning cellular alignment through stretching hydrogels with programmable strain gradients. ACS Applied Materials & Interfaces. 7, 15088-15097 (2015).
  17. Xu, G. K., Feng, X. Q., Gao, H. Orientations of Cells on Compliant Substrates under Biaxial Stretches: A Theoretical Study. Biophysical Journal. 114 (3), 701-710 (2017).
  18. Chagnon-Lessard, S., Jean-Ruel, H., Godin, M., Pelling, A. E. Cellular orientation is guided by strain gradients. Integrative Biology (United Kingdom). 9 (7), 607-618 (2013).
  19. Lu, J., et al. Cell orientation gradients on an inverse opal substrate. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (19), 10091-10095 (2015).
  20. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension - 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125, 3015-3024 (2012).
  21. Bono, N., et al. Unraveling the role of mechanical stimulation on smooth muscle cells: a comparative study between 2D and 3D models. Biotechnology and Bioengineering. 113, 2254-2263 (2016).
  22. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 839-845 (2007).
  23. Riehl, B. D., Park, J. H., Kwon, I. K., Lim, J. Y. Mechanical stretching for tissue engineering: two-dimensional and three-dimensional constructs. Tissue Engineering Part B: Reviews. 18, 288-300 (2012).
  24. Flexcell. Linear Tissue Train Culture Plate. Flexcell. , (2019).
  25. Flexcell. Tissue Train. Flexcell. , (2019).
  26. CellScale. MCT6 Stretcher. CellScale. , (2019).
  27. STREX. STB-150. STREX. , (2019).
  28. STREX. Stretch Chambers. STREX. , (2019).
  29. Kamble, H., Barton, M. J., Jun, M., Park, S., Nguyen, N. T. Cell stretching devices as research tools: engineering and biological considerations. Lab on a Chip. 16, 3193-3203 (2016).
  30. Weidenhamer, N. K., Tranquillo, R. T. Influence of cyclic mechanical stretch and tissue constraints on cellular and collagen alignment in fibroblast-derived cell sheets. Tissue Engineering Part C: Methods. 19, 386-395 (2013).
  31. Yung, Y. C., Vandenburgh, H., Mooney, D. J. Cellular strain assessment tool (CSAT): precision-controlled cyclic uniaxial tensile loading. Journal of Biomechanics. 42, 178-182 (2009).
  32. Chen, K., et al. Role of boundary conditions in determining cell alignment in response to stretch. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 115, 986-991 (2018).
  33. Heher, P., et al. A novel bioreactor for the generation of highly aligned 3D skeletal muscle-like constructs through orientation of fibrin via application of static strain. Acta Biomaterialia. 24, 251-265 (2015).
  34. Foolen, J., Deshpande, V. S., Kanters, F. M. W., Baaijens, F. P. T. The influence of matrix integrity on stress-fiber remodeling in 3D. Biomaterials. 33, 7508-7518 (2012).
  35. Walker, M., Godin, M., Pelling, A. E. A vacuum-actuated microtissue stretcher for long-term exposure to oscillatory strain within a 3D matrix. Biomedical Microdevices. 20, 43 (2018).
  36. Zhao, R. G., Boudou, T., Wang, W. G., Chen, C. S., Reich, D. H. Decoupling cell and matrix mechanics in engineered microtissues using magnetically actuated microcantilevers. Advanced Materials. 25, 1699-1705 (2013).
  37. Li, Y. H., et al. Magnetically actuated cell-laden micro-scale hydrogels for probing strain-induced cell responses in three dimensions. NPG Asia Materials. 8, 238 (2016).
  38. Li, Y. H., et al. An approach to quantifying 3D responses of cells to extreme strain. Scientific Reports. 6, 19550 (2016).
  39. Humphrey, J. D., et al. A theoretically-motivated biaxial tissue culture system with intravital microscopy. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 7, 323-334 (2008).
  40. Niklason, L. E., et al. Enabling tools for engineering collagenous tissues integrating bioreactors, intravital imaging, and biomechanical modeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 107, 3335-3339 (2010).
  41. Roitblat Riba, A., et al. Straining 3D hydrogels with uniform z-axis strains while enabling live microscopy imaging. Annals of Biomedical Engineering. , (2019).
  42. Gomez, D., Natan, S., Shokef, Y., Lesman, A. Mechanical interaction between cells facilitates molecular transport. Advanced Biosystems. 3 (12), 1900192 (2019).
  43. Schindelin, J., et al. Fiji: an open- source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
  44. EPFL Switzerland. OrientationJ plug in. EPFL Switzerland. , (2019).
  45. Goren, S., Koren, Y., Xu, X., Lesman, A. Elastic anisotropy governs the decay of cell-induced displacements. Biophysical Journal. 118 (5), 1152-1164 (2019).
  46. Notbohm, J., Lesman, A., Tirrell, D. A., Ravichandran, G. Quantifying cell-induced matrix deformation in three dimensions based on imaging matrix fibers. Integrative Biology. 7 (10), 1186-1195 (2015).
  47. Lesman, A., Notbohm, J., Tirrell, D. A., Ravichandran, G. Contractile forces regulate cell division in three-dimensional environments. Journal of Cell Biology. 205 (2), 155-162 (2014).
  48. Cha, C. Y., et al. Tailoring Hydrogel Adhesion to Polydimethylsiloxane Substrates Using Polysaccharide Glue. Angewandte Chemie International Edition. 52, 6949-6952 (2019).
  49. Wirthl, D., et al. Instant tough bonding of hydrogels for soft machines and electronics. Science Advances. 3, (2017).
  50. Juarez-Moreno, J. A., Avila-Ortega, A., Oliva, A. I., Aviles, F., Cauich-Rodriguez, J. V. Effect of wettability and surface roughness on the adhesion properties of collagen on PDMS films treated by capacitively coupled oxygen plasma. Applied Surface Science. 349, 763-773 (2015).
  51. Kim, H. T., Jeong, O. C. PDMS surface modification using atmospheric pressure plasma. Microelectronic Engineering. 88, 2281-2285 (2011).
  52. Prasad, B. R., et al. Controlling cellular activity by manipulating silicone surface roughness. Colloids and Surfaces. 78, 237-242 (2010).

Tags

Bioengineering Hydrogel Extracellular matrix Mekanobiologi Cellemekanik Mekanisk kraft Ekstern strækning Fiber netværk Fiber tilpasning
Kontrolleret stamme af 3D Hydrogels under Live Mikroskop imaging
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kolel, A., Roitblat Riba, A., Natan, … More

Kolel, A., Roitblat Riba, A., Natan, S., Tchaicheeyan, O., Saias, E., Lesman, A. Controlled Strain of 3D Hydrogels under Live Microscopy Imaging. J. Vis. Exp. (166), e61671, doi:10.3791/61671 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter