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Bioengineering

Tensão controlada de hidrogéis 3D sob imagem de microscopia ao vivo

Published: December 4, 2020 doi: 10.3791/61671
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 2, 3,4
1Department of Biomedical Engineering, Faculty of Engineering, Tel-Aviv University, 2Department of Materials Science and Engineering, Faculty of Engineering, Tel-Aviv University, 3School of Mechanical Engineering, Faculty of Engineering, Tel-Aviv University, 4Center for the Physics and Chemistry of Living Systems, Tel-Aviv University

Summary

O método apresentado envolve alongamento uniaxial de hidrogéis macios 3D embutidos na borracha de silicone, permitindo microscopia confocal ao vivo. Demonstra-se a caracterização das cepas de hidrogel externos e internos, bem como o alinhamento de fibras. O dispositivo e o protocolo desenvolvidos podem avaliar a resposta das células a vários regimes de tensão.

Abstract

As forças externas são um fator importante na formação, desenvolvimento e manutenção de tecidos. Os efeitos dessas forças são frequentemente estudados usando métodos especializados de alongamento in vitro. Vários sistemas disponíveis usam macas à base de substrato 2D, enquanto a acessibilidade de técnicas 3D para coar hidrogéis macios, é mais restrita. Aqui, descrevemos um método que permite alongamento externo de hidrogéis macios a partir de sua circunferência, usando uma tira de silicone elástica como portador da amostra. O sistema de alongamento utilizado neste protocolo é construído a partir de peças impressas em 3D e eletrônicos de baixo custo, tornando-o simples e fácil de replicar em outros laboratórios. O processo experimental começa com hidrogéis de fibrina macia polimerizador (>100 μm) (Elastic Modulus de ~100 Pa) em um recorte no centro de uma tira de silicone. As construções de gel de silicone são então anexadas ao dispositivo de alongamento impresso e colocadas no estágio do microscópio confocal. Sob microscopia ao vivo, o dispositivo de alongamento é ativado, e os géis são imageados em várias magnitudes de estiramento. O processamento de imagem é então usado para quantificar as deformações de gel resultantes, demonstrando cepas relativamente homogêneas e alinhamento de fibras ao longo da espessura 3D do gel (eixoZ). As vantagens deste método incluem a capacidade de coar hidrogéis extremamente macios em 3D durante a execução da microscopia in situ, e a liberdade de manipular a geometria e o tamanho da amostra de acordo com as necessidades do usuário. Além disso, com a devida adaptação, este método pode ser usado para esticar outros tipos de hidrogéis (por exemplo, colágeno, poliacrilamida ou polietileno glicol) e pode permitir a análise de células e resposta tecidual a forças externas em condições 3D mais biomiméticas.

Introduction

A resposta tecidual às forças mecânicas é parte integrante de uma ampla gama de funções biológicas, incluindo expressão genética1,diferenciação celular2e remodelação tecidual3. Além disso, alterações induzidas por força na matriz extracelular (ECM), como alinhamento de fibras e adensamento, podem impactar o comportamento celular e a formação tecidual4,5,6. A estrutura de malha fibrosa do ECM possui propriedades mecânicas intrigantes, como elasticidade não linear, deformação não afine e deformações plásticas7,8,9,10,11,12. Essas propriedades impactam como as células e seu microambiente circundante respondem às forças mecânicas externas13,14. Entender como o ECM e os tecidos respondem às forças mecânicas permitirá o progresso no campo da engenharia de tecidos e no desenvolvimento de modelos computacionais e teóricos mais precisos.

Os métodos mais comuns para esticar amostras mecanicamente se concentraram em substratos 2D carregados de células para explorar os efeitos no comportamento celular. Estes incluem, por exemplo, a aplicação de cepa a substratos de polidimetilatilaxano (PDMS) e análise de ângulos de reorientação celular em relação à direção de estiramento15,16,17,18,19. No entanto, os métodos que investigam a resposta de hidrogéis embutidos em células 3D ao trecho externo, uma situação que imita mais de perto o microambiente tecidual, são mais limitados. Os avanços em direção aos métodos de alongamento 3D são de particular importância porque as células se comportam de forma diferente em substratos 2D quando comparadas às matrizes 3D20. Esses comportamentos incluem realinhamento celular, níveis de expressão proteica e padrões de migração21,22,23.

Os métodos e dispositivos que permitem o alongamento da amostra 3D incluem ambos comercialmente disponíveis24,25,26,27,28 e aqueles desenvolvidos para pesquisa laboratorial29. Estes métodos utilizam tubos de silicone distensíveis30,câmaras multi-poço31,grampos26,32, bioreatores11,33, cantilevers34,35,36, e ímãs37,38. Algumas técnicas geram trecho que deforma localmente hidrogéis 3D, por exemplo, puxando agulhas de dois pontos únicos no gel5,enquanto outras permitem a deformação de toda a maior parte do gel16. Além disso, a maioria desses sistemas se concentra na análise do campo de tensão no plano X-Y, com informações limitadas sobre o campo de tensão na direção Z. Além disso, apenas um punhado desses dispositivos são capazes de imagens microscópicas in situ. O principal desafio com imagens de alta ampliação in situ (por exemplo, microscópio confocal) é a distância de trabalho limitada de algumas centenas de mícrons da lente objetiva para a amostra. Dispositivos que permitem imagens vivas durante o sacrifício de estiramento a uniformidade da tensão no eixo Zou são relativamente complexos e difíceis de reproduzir em outros laboratórios39,40.

Esta abordagem para esticar hidrogéis 3D permite a tensão uniaxial estática ou cíclica durante a microscopia confocal ao vivo. O dispositivo de alongamento (conhecido como 'Smart Cyclic Uniaxial Stretcher – SCyUS') é construído usando peças impressas em 3D e hardware de baixo custo, permitindo fácil reprodução em outros laboratórios. Anexado ao dispositivo está uma borracha de silicone comercialmente disponível com um recorte geométrico em seu centro. Os componentes do hidrogel são polimerizados para preencher o recorte. Durante a polimerização, hidrogéis biológicos, como fibrina ou colágeno, naturalmente aderem às paredes internas do recorte. Usando o SCyUS, a tira de silicone é esticada não axisiomente, transferindo cepas controladas para o hidrogel 3D incorporado41.

Este sistema permite uma combinação única de recursos e vantagens em comparação com outros métodos existentes. Primeiro, o sistema permite alongamento uniaxial de hidrogéis macios 3D espessos (> 100 μm de espessura, <1 kPa rigidez) de sua periferia, com deformação Z-homogênea em todo o hidrogel. Estes hidrogéis são muito macios para serem agarrados e esticados por técnicas convencionais de tração. Em segundo lugar, o dispositivo de alongamento pode ser facilmente replicado em outros laboratórios, uma vez que a impressão 3D está prontamente disponível para os pesquisadores e os eletrônicos usados no design são de baixo custo. Em terceiro lugar, e talvez a característica mais atraente, a geometria e o tamanho do recorte na tira de silicone podem ser facilmente manipulados, permitindo gradientes de tensão e condições de limite, bem como o uso de uma variedade de volumes de amostra, até alguns microliters.

O protocolo apresentado consiste em moldar gel de fibrina em discos de ~2 mm de diâmetro em tiras de borracha de silicone de 0,5 mm de espessura procedidas por estiramento uniaxial sob microscopia confocal ao vivo. O seguinte discute detalhadamente os procedimentos experimentais para medição e análise das cepas que atuam no recorte geométrico, as cepas internas desenvolvidas no hidrogel, bem como o alinhamento de fibras resultante após várias manipulações de estiramento. Por fim, discute-se a possibilidade de incorporar células no hidrogel e expô-las a trechos externos controlados.

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Protocol

1. Preparação da solução (a ser realizada com antecedência)

  1. Rotulagem fibrinogênio
    NOTA: A etapa de rotulagem só é necessária se a análise da deformação do gel de fibrina for desejada. Para experimentos celulares, é possível usar um gel sem rótulo.
    1. Adicione 38 μL de 10 mg/mL de corante fluorescente de éster succinimidil (dissolvido em DMSO) a 1,5 mL de solução fibrinogênio de 15 mg/mL (razão molar de 5:1) em um tubo centrífuga de 50 mL e coloque em um agitador por 1 hora à temperatura ambiente. Depois, coloque o tubo na centrífuga por 3 minutos a 800 x g (temperatura ambiente).
    2. Filtre o supernatante da etapa anterior através de uma coluna de desalagem embalada com resina de gel dextran(Tabela de Materiais)para separar o corante não redigido,42 seguindo estas etapas.
      1. Pré-lave a coluna com 25 mL de tampão fibrinogênico.
      2. Injete lentamente o fibrinogênio rotulado da etapa 1.1.1 na coluna, certificando-se de que não há bolhas entrando no filtro. Descarte o primeiro ~0,3 mL de solução elucidada (4-6 gotas de líquido colorido fraco). Em seguida, colete os seguintes 1,0-1,5 mL de solução purificada (siga o protocolo do fabricante para obter detalhes mais específicos).
      3. Finalize o processo de filtragem esterilizando a solução purificada resultante usando um filtro acionado por seringa (0,22-0,45 μm).
      4. Para limpar e reciclar a coluna, lave com 20 mL de tampão fibrinogênio e, em seguida, armazene em 25 mL de 20% de etanol.
  2. Após a elução, divida o fibrinogênio rotulado purificado resultante em pequenas alíquotas de ~7-50 μL, dependendo do número desejado de géis esticados. Para cada gel de círculo de 2 mm de diâmetro esticado, prepare cerca de 3,5 μL de fibrinogênio (2,5 μL será usado por gel + 1 μL para erros de pipetação).
    1. Guarde as alíquotas em um congelador de -20 °C. Eles podem ser usados até cerca de um ano (não é recomendado descongelar e congelar novamente).
    2. Para o restante deste protocolo, mantenha aproximadamente 7 μL do fibrinogênio rotulado purificado na geladeira (4 °C) até o passo 4. Este volume destina-se à criação de dois géis esticados (2,5 μL é necessário por gel, e um volume extra de 1 μL é usado para explicar erros na preparação da amostra).
      NOTA: Este procedimento de filtragem normalmente dilui a solução fibrinogênio inicial de 15 mg/mL para uma concentração final de cerca de 10 mg/mL. O fator de diluição depende do volume inicial e concentração de fibrinogênio, conforme especificado no protocolo do fabricante.
  3. Prepare 7 μL de solução de trombina (diluir usando tampão de trombina para 2 unidades/mL, Tabela de Materiais) e mantenha na geladeira (4 °C) até o passo 4. Este volume destina-se a preencher os recortes de dois géis esticados.
    NOTA: Para realizar a análise interna da tensão, as contas esféricas fluorescentes de 1 μm de diâmetro (compradas como suspensão [2% de sólidos] em água mais 2 mM NaN3) devem ser adicionadas à solução de trombina (uma razão de 1:25 v/v % de contas:trombbina é recomendada para um objetivo de 40x). As contas só devem ser incluídas quando forem desejadas medidas internas de tensão, seja na presença ou ausência de células.

2. Preparação de tiras de silicone

  1. Recupere a borracha de silicone de 0,5 mm de espessura e corte-a em tiras de 15 x 80 mm2 com um orifício de 2 mm de diâmetro no centro da tira(Figura 1). Se possível, use um cortador de laser programável para alta precisão. Se o maquinário programável não estiver disponível, a tesoura é suficiente para cortar o contorno da tira e um pequeno furo é adequado para o recorte central.
    NOTA: A borracha de silicone comercial geralmente é comprada com plástico em ambos os lados. Mantenha a cobertura de plástico original em ambos os lados do silicone, se possível. Se reutilizar tiras de silicone de um experimento anterior, trate-as com trippsina por 0,5 hora, mergulhe em 0,2 M NaOH por 0,5 hora e, em seguida, mergulhe em 70% de etanol por 1 hora. Deixe-os secar antes de usar.
  2. Prepare camadas de filme de vedação (hidrofóbica) com dimensões de pelo menos 20 × 30 mm2,para que sejam mais largas que a tira de silicone e, assim, permitindo que uma vedação se forme sobre todo o recorte geométrico.
  3. Lave um prato de 10 cm com 70% de etanol e, em seguida, limpe e seque com lenços de tarefa delicados não-linting (tanto para experimentos estéreis quanto não estéreis). Esta etapa é importante, pois permite que as camadas de filme de vedação se ater melhor à placa e restringir o movimento da amostra durante o processo de preparação.
  4. Coloque as camadas de filme de vedação no prato lavado de 10 cm para que haja espaço suficiente para colocar duas tiras em cada prato lado a lado(Figura 2A).
    1. Remova o plástico de um lado da tira de silicone e coloque o lado exposto na camada de filme de vedação para que o recorte seja cercado inteiramente pela camada de filme de vedação(Figura 2B). Em seguida, pressione suavemente o silicone contra a camada de filme de vedação, a fim de selar a área ao redor do recorte, usando dedos de luvas limpos.
      NOTA: Certifique-se de que não há bolsas de ar entre o silicone e o filme de vedação, especialmente em torno do recorte. Faça isso examinando o lado inferior do prato(Figura 2C).

Figure 1
Figura 1: Abordagem de tensão de hidrogel. (A) 15 × tira de silicone de 80 mm2 com um recorte de 2 mm de diâmetro no centro da tira (B) Uma tira de silicone com um recorte circular com gel de fibrina embutido. Para fins ilustrativos, o recorte no silicone é maior do que nos experimentos reais (C) Esquema da abordagem de alongamento com a tira de silicone (laranja), gel circular (recortado no meio) e extensores de tecido (verde) que conectam o silicone ao dispositivo de alongamento. A área ampliada do gel indica a deformação do gel, em resposta ao alongamento uniaxial do silicone. Para simplificar, a compressão ao longo da espessura do gel (eixoZ)não é mostrada na ilustração. Figuras 1B & 1C foram adaptadas de Roitblat Riba et al.41Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Exemplo de colocação adequada de uma tira de silicone em uma camada de filme de vedação antes da polimerização do gel. (A) Colocação de duas camadas de filme de vedação em um prato de 10 cm (B) Colocação de tiras de silicone nas camadas de filme de vedação(C) Vista inferior do prato, exibindo o selo de ar entre o silicone e a camada de filme de vedação. Esquerda: Vedação adequada da camada de filme de vedação para a tira de silicone ao redor do recorte sem bolsas de ar. Direito: Vedação inadequada da camada de filme de vedação para o recorte da tira de silicone com bolsas de ar ao redor da borda do recorte. Isso levará ao vazamento dos componentes do hidrogel sob o silicone. A flecha vermelha aponta para uma área onde um bolsão de ar foi formado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Preparando trombina com células

NOTA: Realize esta etapa somente se desejar a incorporação de células no hidrogel, e em condições estéreis em uma capa biológica(Tabela de Materiais).

  1. Esterilização: um dia antes do experimento celular, coloque as tiras de silicone e selamento de camadas de filme em 70% de etanol durante a noite e, em seguida, realize a esterilização UV por 30 minutos de cada lado (se os pratos de 10 cm ainda não estiverem estéreis, eles também devem ser esterilizados sob luz UV por 30 minutos após uma lavagem de 70% de etanol). O sistema UV utilizado no protocolo é aquele embutido no capô biológico.
    NOTA: Alternativamente, um ciclo de esterilização autoclave (140 °C) pode ser realizado nas tiras de silicone, uma vez que são resistentes a até 260 °C.
  2. Realize uma contagem de células para determinar a concentração celular e, em seguida, centrífuga e suspenda novamente a pelota celular com 7 μL de trombina (2 unidades/mL) em um tubo de centrífuga de 1,5 mL. Recomendamos uma concentração celular de 800 células/μL de trombina. Mantenha as células refrigeradas até o uso (não exceda mais de meia hora para evitar danificar as células).

4. Polimerização de géis de fibrina

  1. Recupere as soluções de trombbina de 2 Unidades/mL e 10 mg/mL de fibrinogen rotulado da geladeira (preparada na etapa 1) e coloque-as no gelo onde serão acessíveis.
    NOTA: As soluções são mantidas frias antes do processo de mistura, a fim de diminuir a cinética de reação de polimerização. Isso permite uma mistura mais homogênea das proteínas.
  2. Com o prato(es) configurado (passo 2), extrair 2,5 μL de fibrinogen rotulado e pipeta-lo uniformemente no recorte de silicone (com a camada de filme de vedação presa ao seu lado inferior) de modo que toda a circunferência do recorte esteja em contato com fibrinogênio. Tenha cuidado para não permitir que nenhum bolsão de ar ou bolhas se formem em qualquer lugar da solução, prestando especial atenção às bordas inferiores do recorte (a interface entre a camada de filme de vedação e o silicone).
  3. Pegue imediatamente 2,5 μL de trombina (com ou sem células/contas) e pipeta diretamente na solução fibrinogênio no recorte (atingindo o volume final de 5 μL fibrin). Em seguida, misture rapidamente as duas soluções, pipetando cuidadosamente para cima e para baixo ~10 vezes. Durante o processo de mistura, mova a ponta em torno de todo o volume para criar uma solução o mais homogênea possível.
  4. Adicione uma quantidade muito pequena de Salina Tampão fosfato (PBS) [alternativamente meio celular para experimentos celulares, Tabela de Materiais] ao longo da borda de cada prato para que o hidrogel não seque durante o processo de polimerização. Certifique-se de que não há contato entre o meio PBS/célula e as amostras, pois isso danificará a amostra.
  5. Cubra o prato e coloque-os na incubadora a 37 °C por 30 minutos.
    NOTA: O tempo de incubação necessário depende do volume do gel. Se forem utilizados volumes maiores, o tempo de incubação deve aumentar.
  6. Retire o prato da incubadora e adicione PBS/meio de célula ao prato, submergindo toda a construção gel-silicone.
  7. Levante cuidadosamente as construções de amostra uma de cada vez do prato certificando-se de que a camada de filme de vedação permanece aderida à tira. Desprende lentamente a camada de filme de vedação do silicone, pealing suavemente de uma extremidade do silicone para a outra (Figura 3). Evite retirar áreas próximas ao recorte onde podem existir concentrações de estresse (isso é importante principalmente para geometrias não circulares). Evite qualquer contato com o recorte, pois danificará a amostra.
  8. Coloque a tira de volta no prato com pbs/meio celular de tal forma que a tira está flutuando no prato. Em seguida, leve o prato(es) para um microscópio padrão de cultura celular para avaliar qualitativamente a condição de cada amostra. Os géis devem ser uniformes, contínuos durante todo o recorte, e nenhuma bolha deve estar presente. Usando a Figura 4 como guia, selecione as melhores amostras para análise posterior.

Figure 3
Figura 3: Remoção adequada da camada de filme de vedação da parte inferior da tira de silicone. O processo de remoção deve ser feito lentamente para que o hidrogel não rasgue ou quebre sua adesão com as paredes internas do recorte. A seta branca mostra a direção da remoção. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Observação microscópica de géis de fibrina no recorte de silicone. (A) Dois exemplos de um gel de fibrina polimerizado adequadamente. Observe a homogeneidade relativa do gel e a adesão total às bordas do recorte (B) Dois exemplos de falha de polimerização amostral. Topo: Observe as muitas bolhas e os agregados formados no lado inferior esquerdo. Inferior: Observe o rasgo do gel das bordas recortados e os agregados na região inferior esquerda do recorte. Barra de escala = 300 μm Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. Carregamento de amostras no dispositivo SCyUS

  1. Encha o banho com pbs/meio celular(Figura 5) e coloque a tira de silicone carregando o gel de amostra através da parte superior para que as extremidades estejam sentadas em cada lado do banho. O banho é feito para evitar qualquer secagem do gel. Coloque e aperte os grampos (roxo) junto com as tiras de tecido (verde) para que todas as peças sejam conectadas para formar uma tira reta com o recorte no centro(Figura 5).
  2. Recupere o dispositivo SCyUS e conecte o poço líquido de alumínio e a tampa de vidro retangular de 22 mm x 40 mm (nº 1 ou 1,5)(Figura 6Aiii). Fixar o deslizamento da tampa na parte inferior do poço usando material de vedação (por exemplo, graxa a vácuo) para que o poço possa ser preenchido com líquido sem vazamento.
    1. Encha o poço com ~1-2 mL de PBS/cell medium e coloque a tira + construção de tecido + gel(Figura 6B) no dispositivo. Fixar a tira de tecido (2) no suporte (1) de modo que o recorte + gel (5) esteja no centro como mostrado, em seguida, coloque cuidadosamente a inserção pin-down(4) no dispositivo e bloqueie-a no lugar.
    2. Em seguida, insira o outro lado do tecido no eixo (sem anexar o servomotor) e tranque-o no eixo(Figura 6C).
  3. Insira o dispositivo SCyUS com a amostra anexada no estágio do microscópio (Figura 6C). Conecte o microcontrolador(Tabela de Materiais)ao computador através de um cabo USB e conecte o servomotor ao microcontrolador. Abra o módulo de controle SCyUS no computador. A amostra está agora pronta para imagens para verificar a adequação da espessura do gel e homogeneidade de fibras sob o microscópio confocal.

Figure 5
Figura 5: (A) Gabarito contendo um banho PBS (impresso em 3D) (B) Despir a colocação no gabarito para garantir a fixação adequada em linha de suportes (em roxo) e evitar a secagem do gel. Esta figura foi modificada com permissão de Roitblat Riba et al.41Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Dispositivo de alongamento SCyUS. (A) Várias vistas de um modelo CAD das principais partes do SCyUS: fuso conectado ao servo (azul), âncora estática (vermelho), inserção que prende a tira de silicone para baixo (roxo) e fixadores que impedem a inserção de subir (verde-amarelo). Uma visão superior do sistema (Ai),uma visão cortada do sistema (Aii) mostrando o caminho da tira (linha laranja), e uma vista inferior(Aiii)do poço líquido de alumínio com uma mancha de vidro. O poço líquido pode ser movido para cima e para baixo com a virada de um parafuso encaixado na rosca principal. O movimento ascendente do poço de alumínio é limitado pelas asas laterais da inserção roxa, como mostrado pelas setas brancas (B) O sistema real: (1) âncora estática(2) tecido verde não elástico(3) parafuso para controle de altura do poço líquidode alumínio (4)inserir pin-down vermelho(5) uma tira de silicone com um recorte circular(6)grampos de conexão azul(C)O sistema de alongamento colocado em um microscópio de confocal. O servomotor e o eixo são mostrados com setas. Esta figura foi modificada com permissão de Roitblat Riba et al.41Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

6. Garanta o gel adequado para a amostragem

  1. Usando o microscópio confocal(Tabela de Materiais) tome uma baixa ampliação (10×), baixa resolução (~1,4 μm x 1,4 μm tamanho de pixel) confocal Z-stack (≤10 Z-slices com tamanho de passo de aproximadamente 10 μm é suficiente) imagem de azulejo de todo o gel usando lasers de 488/543/561 para examinar a homogeneidade e a adesão à circunferência do recorte geométrico ao longo da espessura do silicone(Figura 7A-B). Use esta imagem Z-stackcomo um mapa para as seguintes etapas.
  2. Usando imagens ao vivo de baixa resolução, escaneie o gel e determine a posição Zmais baixa onde a adesão total às paredes internas do recorte é aparente sem lágrimas ou bolhas e observe a localização Zdo microscópio(Zl). Para determinar a adesão total do gel ao silicone ao longo de sua circunferência, escaneie a interface do rótulo fluorescente do gel e da tira de silicone (fundo escuro) sob o microscópio(Figura 7C).
  3. Mova-se na direção Zaté que não haja mais continuidade no gel e observe a posição Z(Zu):
  4. Subtrair o limite superior(Zu)da direção Za partir do limite inferior(Zl). Esta é a espessura de referência da amostra (Zo):
    Equation 1
    Se Zo ≥ 100 μm, então o gel é considerado satisfatório para análise. Note que a espessura do recorte de silicone é de cerca de 500 μm, mas a polimerização de gel no recorte normalmente resulta em uma espessura de gel menor. 100 μm é a espessura mínima recomendada para garantir um processo de alongamento estável, sem lágrimas ou desprendimento do gel do recorte de silicone.
    NOTA: Em diferentes locais XY, a espessura do gel pode variar. Esta seção do protocolo mede a espessura mínima do gel, permitindo determinar a qualidade do gel e indicar se ele é suficiente para alongamento. Além disso, encontrar o centro do gel fornece um ponto de referência para retornar ao pós-alongamento, seja estático ou dinâmico.

Figure 7
Figura 7: Homogeneidade de gel. As imagens de ladrilhos foram capturadas e costuradas utilizando-se o software de microscópio confocal (Tabela de Materiais) (A) Uma única imagem de corte de azulejo z-slicede uma amostra de gel de fibrina com densidade de fibra relativamente inhomogênea devido à intercalação de trombina e fibrinogen misturando pré-polimerização. Este gel não fornecerá uma análise confiável (B) Uma única imagem de corte de azulejos Zde uma amostra de gel de fibrina com densidade de fibra relativamente homogênea. Este é um gel aceitável para experimentos de alongamento. Barra de escala para imagens A & B é de 200 μm (C) Zoom na interface entre o gel fluorescente rotulado (vermelho) e o silicone (fundo preto). Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

7. Operação SCyUS, alongamento e imagem

  1. Agora que a amostra foi determinada como de qualidade satisfatória e está configurada corretamente no dispositivo SCyUS, determine a posição pré-esticada da amostra. Isso é conseguido usando imagens vivas sob o microscópio confocal (semelhante ao passo 6.2).
    1. Certifique-se de que o servomotor está na posição zero clicando no botão Go To Zero Servo Pos (Clique na Figura 8A e certifique-se de que a Figura 8B exibe zero) e conecte-o ao dispositivo de alongamento, como visto na Figura 6C.
      NOTA: Faça este passo devagar e com cuidado para não colocar qualquer excesso de tensão na amostra.
    2. Ao fotografar a amostra, mova o motor um grau(Figura 8C) de cada vez no sentido horário clicando no botão +1 até que o lado direito do recorte seja observado para se mover. Em seguida, reverta o movimento (Figura 8D) de volta à penúltima posição de passo clicando no botão -1. Isso verifica que a amostra está sob tensão mínima. Clique no botão Definir Min Servo Position (Figura 8E) para definir a posição de referência. É possível retornar à posição de referência a qualquer momento clicando no botão Ir Para Min Servo Position ( Figura8F).
      NOTA: Recomenda-se usar um objetivo de alta ampliação (≥40×) para esta etapa para minimizar o erro.
    3. Capture uma alta ampliação (40×), alta resolução (~0,2 μm × tamanho de pixel de 0,2 μm), imagem de azulejo de fatia Z única de toda a área de gel. Esta será usada como imagem de referência para análise pós-processamento. Recomenda-se capturar uma única imagem de fatia Zno meio da espessura do gel (usando Zo de Eq. 1), isso permitirá o retorno para aproximadamente a mesma posição Zapós o alongamento. Além disso, leve em consideração que imagens de ladrilhos de alta resolução de toda a área de gel levam um tempo considerável (~20-30 min).
    4. Agora a amostra está pronta para alongamento estático. Ajuste o servomotor à magnitude do trecho desejado avançando um grau(Figura 8C) de cada vez na GUI (realize lentamente, cerca de 1 grau/segundo).
  2. Em cada magnitude de trecho onde a análise é desejada, capture uma única imagem de azulejo de alta resolução de fatia Z de toda a área de gel para análise pós-processamento. Semelhante ao passo 6.2, verifique se o gel não se desprendeu do silicone ao longo de sua circunferência, escaneando a interface entre o gel (vermelho) e o silicone (fundo escuro), buscando mudanças na adesão da magnitude do trecho anterior.
    NOTA: Durante a ativação do motor, use imagens ao vivo para acompanhar a localização do gel em X-Y (com configurações de baixa resolução e baixa ampliação). O gel experimenta um efeito Z-Poissononde a parte inferior do gel sobe, portanto a posição Zdo microscópio também deve ser ajustada ao centro aproximado da espessura do gel para cada magnitude de estiramento. Isso pode ser conseguido recalculando Zo (Eq. 1) para cada magnitude de estiramento. Uma vez que o alongamento na direção Zé relativamente homogêneo, não é fundamental encontrar a profundidade central exata do gel.

Figure 8
Figura 8: GUI para o módulo de controle SCyUS. (A) Posição do motor em graus. O valor varia de -90° a 90°(B)'Definir posição de servo mínimo'. Este botão permite uma posição mínima pré-definida, para definir uma nova posição de referência diferente do botão Zero Servo Position (C) 'Plus 1°' move o servo motor de um grau no sentido horário(D)'Menos 1°' move o servo motor um no sentido anti-horário (E)O botão 'Ir para a posição zero' define a posição servomotor para 0° ([A]será definido como zero) (F) Botão 'Ir para a posição de servo mínimo' move o servomotor para a posição 'Min' definida pelo usuário. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

8. Medições de tensão externa pós-processamento

  1. Para medir as cepas eficazes dos limites de corte, meça os comprimentos de borda a borda na direção de estiramento(eixo X)no centro do eixo Y(Figura 9A).
    1. Carregue a imagem pré-esticada para o software de processamento de imagem (ImageJ FIJI43) e meça a maior distância de borda a borda que é definida como o comprimento axial do orifício ( Equation 8 ) no centro.
    2. Defina a maior distância de cima para baixo como a distância perpendicular ( Equation 6 ).
    3. Repita este processo para todas as imagens de intervalo de estiramento e calcule as Equation 7 distâncias axiais ( ) e perpendiculares da Equation 5 periferia recorada(Figura 9A, inferior) e, em seguida, realize os seguintes cálculos para encontrar as cepas das bordas recorte:

Equation 2

Equation 3

Figure 9
Figura 9: O gel se esforça devido ao alongamento externo da tira de silicone. (A) Seção transversal X-Y de um gel de fibrina não esticada (superior), e após a aplicação de εorifício = 64% de tensão ao longo da direção x (inferior). O gel é embutido com contas fluorescentes. Os comprimentos relevantes de d e l utilizados para cálculo de εorifício são indicados nas imagens (B) Imagens zoom-in da área quadrada tracejada marcada em A (C) Ilustração dos tipos de cepa considerados neste estudo: εorifício é a cepa axial do recorte em seu diâmetro máximo, e εgel é a cepa axial no centro do gel (medida pelos locais agregados de contas) (D) Uma relação linear foi encontrada entre εorifício e εgel na direção xx (linha vermelha) e yy direção (linha verde). Esta figura foi adaptada com permissão de Roitblat Riba et al.41Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

9. Análise de orientação de fibras

  1. Use a quantificação do alinhamento de fibras para caracterizar a resposta estrutural do gel fibroso ao aumento das magnitudes do estiramento. Carregue imagens de alta resolução para o software ImageJ FIJI (NIH)43 e, em seguida, analise usando o módulo OrientationJ (EPFL)44 (Configurações: gradiente gaussiano e janela de 3 pixels, Figura 10).
    1. Calcule o Parâmetro de Ordem Nemática 2D (NOP) do histograma de orientação como:45
      Equation 4
      NOTA: Um valor de NOP = 1 indica alinhamento perfeito ao longo da direção axial (ângulo zero) e NOP = 0 indica isotropia. O ângulo de orientação, φ, é o ângulo de fibra em relação ao eixo de tensão (eixo x) obtido através da análise de imagem e precisamente definido na documentação do OrientationJ. 44

Figure 10
Figura 10: Análise de orientação de fibra usando o software FIJI ImageJ. (A) Menu principal do ImageJ com uma seta indicando a localização do menu pulldown 'Plugins' onde o 'OrientationJ' pode ser encontrado. No menu estendido do 'OrientationJ', clique na opção 'OrientaçãoJ Distribuição'(B)Módulo de Distribuição do R. Defina 'janela local σ' para 3 pixels e 'Gradiente' para 'Gaussian'. Em seguida, pressione o botão 'Executar' (seta vermelha). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

10. Análise manual da tensão do gel interno

  1. Ao realizar imagens vivas de alta ampliação de um hidrogel com contas incorporadas, localize manualmente uma região de interesse (ROI) com características facilmente reconhecíveis (por exemplo, agregados de contas), a fim de retornar ao mesmo local após cada magnitude de estiramento.
    NOTA: A compressão na direção Z (efeito Poisson) pode levar a um aumento na densidade das contas à medida que o estiramento aumenta, por isso sugerimos a escolha de agregados de contas grandes o suficiente, por isso eles são claramente identificáveis. Este protocolo exige a análise da região central do gel de fibrina, embora qualquer região possa ser escolhida.
  2. Na posição pré-estiramento (etapa 6), capture uma imagem de alta resolução Z-stackdo ROI selecionado. Após cada intervalo de estiramento desejado, retorne ao mesmo ROI e repita o processo de captura de imagem.
  3. Pegue as imagens e importe-as para o ImageJ. No ROI, registo a localização do pixel X-Y de cada agregado de contas visível. Transfira os dados gravados para uma planilha.
  4. Meça as distâncias entre cada par de agregados e compare-as com as distâncias dos mesmos pares na imagem de referência, permitindo o cálculo das cepas nas direções X e Y.
    NOTA: Se um filme contínuo em tempo real for gravado enquanto o gel estiver esticado (em vez de captura de imagem estática), uma análise automática das cepas pode ser realizada com métodos de correlações de imagem digital ou volume (DIC/DVC), como demonstrado anteriormente46,47. No entanto, deve-se notar que a análise automática de DIC/DVC é desafiadora neste cenário, já que a pilha Znão está apenas se movendo no plano X-Y, mas também na direção Zdevido ao efeito Poisson (compressão), contabilizando derivas consideráveis durante o filme gravado.

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Representative Results

Dados representativos de trecho estático de magnitudes crescentes aplicadas à tira de silicone carregando um hidrogel fibrina 3D, embutido com contas fluorescentes de 1 μm, são mostrados na Figura 9. A análise demonstra o efeito do estiramento do silicone nas alterações geométricas do recorte, bem como as cepas desenvolvidas dentro do gel. Imagensde pilha de Z de todo o gel são usadas para avaliar a deformação do recorte em forma de círculo original para a geometria elíptica(Figura 9A). Estas imagens são usadas para calcular εxx(buraco) (Equação 2). O zoom e o acompanhamento manual de vários agregados de contas(Figura 9B) durante o alongamento do gel, permite o cálculo de cepas de gel locais no centro, nas direções axial εxx(gel) e perpendicular εyy(gel)(Figura 9C,D). As cepas axiais propagam-se relativamente linearmente da borda recorte de silicone até o centro do gel e são maiores que as cepas perpendiculares compressivas(Figura 9D).

Imagens de alta ampliação do gel fluorescentemente rotulado permitem observação e quantificação do alinhamento de fibras, induzido pelo estiramento de silicone. A Figura 11 mostra imagens representativas de zoom de um hidrogel típico não esticado e relativamente isotrópica(Figura 11A) e de um hidrogel sob alta tensão recorada de 80% representando fibras altamente alinhadas na direção do trecho(Figura 11B). A análise da reorientação de fibras utilizando ImageJ revelou uma dependência aproximadamente linear entre o alinhamento de fibras (NOP) e a tensão externa no recorte (εorifício)até cepas de 40%, com saturação moderada em cepas acima de 40%(Figura 11D). Uma análise detalhada do alinhamento de fibras em diferentes fatias Zé mostrada na Figura 12. Aqui, os histogramas de alinhamento de fibras são calculados para cada fatia Z(Figura 12A),bem como seu NOP correspondente (Figura 12B)e o NOP médio sobre todas as fatias Zpara cada magnitude de tensão externa do recorte(Figura 12C). À medida que oorifício ε aumenta, o alinhamento da fibra aumenta, seguindo uma curva não linear global, como mostrado na Figura 12C. Observe que o gel contrai ao longo do eixo Zdevido ao efeito Poisson, representado pelas linhas mais curtas em cepas mais altas na Figura 12B.

Uma vez que tem se mostrado difícil realizar uma análise aprofundada das cepas internas em todo o gel, fornecemos aqui resultados preliminares de simulações de elemento finito (FE) realizadas em material contínuo 2D dadas as propriedades mecânicas da fibrina (Figura 13). A tensão externa do recorte é de ~40% e o mapa de cores representa o campo de tensão induzido por estiramento. O mapa de cores varia de 38%a 42%, indicando que as cepas de gel são relativamente homogêneas em toda a área de gel circular. Notamos que, se outras geometrias de gel forem usadas, gradientes em cepa podem surgir, e este é um tópico para estudos futuros.

Para demonstrar que os géis de fibrina embarcados podem sustentar a adesão à tira de silicone em cepas altas (0 a +30%) e frequências (até 1 Hz), fizemos testes preliminares (o protocolo para este teste não está incluído neste trabalho) não mostrando descolamentos dos géis das paredes internas do recorte. Três géis foram testados, gel 1 por uma duração total de ~87 minutos, gel 2 por 60 minutos & gel 3 por 30 min total(Tabela 1). Em todos esses três casos, hidrogéis de fibrina mantiveram sua adesão ao silicone.

Figure 11
Figura 11: Alinhamento da fibra de gel em resposta ao estiramento externo. Imagens tiradas no centro de um gel fluorescente, enquanto (A) não esticada e (B) após a aplicação de εfuro= 80% (C) Histogramas médios de orientações de fibras sob tensões crescentes de εfuros [%]. As barras de erro cinza indicam diferenças entre 40 fatias na pilha z avaliadas para cada cepa testada(D) Parâmetro de Ordem Nemática Medial (NOP) em função de εorifício para três amostras de gel diferentes (incluindo "Gel 1" que é analisado na Figura 11A-C). As barras de erro indicam diferenças entre as fatias na pilha Zde cada magnitude de estiramento. Esta figura foi adaptada com permissão de Roitblat Riba et al.41Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 12
Figura 12: Análise da orientação de fibras utilizando a ferramenta OrientationJ44 (software ImageJ)43 (A) histogramas 3D de orientação de fibras para diferentes fatias Z. São mostrados exemplos de dois histogramas calculados para géis esticados (εfuro = 17,6%, superior) e géis não esticados (inferior). O histograma é normalizado de modo que a área sob a curva seja igual a 1 (B) Resultando NOP versus Z-profundidade; o gráfico mostra os cálculos de NOP de cada histograma em função de Z-depth(C) NoP médio em função de εburaco. As barras de erro representam o desvio padrão de NOP para todas as fatias Zem uma magnitude de estiramento individual no mesmo ponto XY no mesmo gel. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 13
Figura 13: Simulação de elementos finitos 2D (FE) de um gel esticado. O gel é esticado(εorifício ≈ 40%) por um portador de silicone. O campo de tensão é apresentado com valores de cepa principal máxima onde são observados gradientes menores. O círculo representado pela linha pontilhada é a geometria pré-tensa do orifício, o comprimento original (lo) é o comprimento central ao longo do eixo x antes da aplicação do trecho, e o comprimento esticado(l) é o comprimento central ao longo do eixo x após a aplicação do trecho. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

#1 gel Amplitude dinâmica da tensão (Frequência 1 Hz) Duração dinâmica do estiramento (min)
0-37% 0.1
1
5
15
30
0-48% 1
5
30
Tempo total sob estiramento dinâmico 87 min.
#2 gel Amplitude dinâmica da tensão (Frequência 1 Hz) Duração dinâmica do estiramento (min)
0-30% 0
10
20
30
0-50% 30
Tempo total sob estiramento dinâmico 60 min.
#3 gel Amplitude dinâmica da tensão (Frequência 1 Hz) Duração dinâmica do estiramento (min)
0-30% 10
20
30
Tempo total sob estiramento dinâmico 30 min.

Tabela 1: Resultados representativos da prova dinâmica de esticado de conceito. Três géis foram embutidos em tiras de silicone e estendidos dinamicamente (1 Hz) por várias durações. As cepas variaram de zero a várias magnitudes acima de 30%. Todos os três géis sustentaram com sucesso sua adesão às paredes internas do recorte circular da tira de silicone.

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Discussion

O método e o protocolo aqui apresentados são em grande parte baseados em nosso estudo anterior por Roitblat Riba et al.41 Incluímos aqui o design completo auxiliado por computador (CAD), Python e códigos microcontroladores do dispositivo SCyUS.

As principais vantagens do método apresentado sobre as abordagens existentes incluem a possibilidade de esticar hidrogéis 3D muito macios (Módulo Elástico de ~100 Pa) de sua circunferência, e sob imagens confocal ao vivo. Outros métodos são geralmente limitados em sua capacidade de aplicar campos de tensão no eixo Ze são incapazes de fornecer imagens in situ de microscopia de alta ampliação durante o alongamento, principalmente devido a limitações de distância de trabalho da amostra para a lente objetiva. A maioria dos sistemas disponíveis são baseados no alongamento do substrato 2D, que são limitados na imitação de ambientes fisiológicos de tecido.

As limitações do sistema incluem a potencial homogeneidade inconsistente da densidade de fibras do gel pós-polimerização (Figura 7A), especialmente quando grandes volumes de gel ou geometrias complexas são usados. Tais não homogeneidades podem levar a cepas não uniformes e alinhamento de fibras no gel. Além disso, restrições ópticas em seções Zrelativamente profundas (>30 μm) podem dar origem a erros na análise da orientação de fibras.

Passos críticos no protocolo de alongamento 3D incluem o seguinte (i) Garantir que os géis de amostra tenham alcançado total adesão às paredes internas do recorte geométrico dentro do silicone, sem bolhas ou lágrimas, especialmente ao longo da direção Z. A adesão completa e a continuidade da amostra com uma espessura de pelo menos 100 μm (Eq. 1) é crucial para esticar a amostra de forma confiável a uma cepa desejada(ii) Anexar adequadamente a amostra ao dispositivo SCyUS antes do alongamento. É necessário fixar a tira de silicone aos suportes e extensores de comprimento de tecido não elásticos usando o gabarito impresso em 3D(Figura 5A)e validar que todas as peças estão presas em linha, garantindo que a tensão seja induzida no gel simetricamente. Isso também se aplica ao carregamento correto do eixo do dispositivo(Figura 6B-C)(iii) Capture cuidadosamente a posição de referência (pré-estiramento) da amostra. Se a imagem de referência for tirada enquanto a amostra já estiver sob tensão (por exemplo, devido ao apego do servomotor antes desta etapa), todas as medidas de tensão serão imprecisas.

As possíveis aplicações futuras e modificações do protocolo apresentado incluem:

i Um regime de estiramento cíclico pode ser aplicado aos hidrogéis incorporados da célula. Como o movimento dinâmico do motor é codificado pelo software microcontrolador, qualquer perfil cíclico pode ser programado, limitado apenas pela resolução e pela velocidade de rotação do motor empregado no sistema (mais detalhes disponíveis no Roitblat Riba et al.41). Neste trabalho, demonstramos que o gel de fibrina pode sustentar a adesão sob estiramento dinâmico(Tabela 1). Embora mais testes seja necessário, a aplicação do carregamento cíclico forneceria insights sobre a resposta dinâmica do hidrogel e células incorporadas.

(ii) A geometria e o volume do recorte de silicone podem ser modificados. No protocolo atual, focamos apenas em géis em uma geometria circular. Nessas condições, as cepas internas são relativamente homogêneas em todo o gel, como previsto pelas nossas simulações fe(Figura 13). No entanto, se outras geometrias de gel serão consideradas modificando a seção de recorte do silicone, surgirão gradientes. Por exemplo, um recorte em forma de diamante poderia potencialmente levar a um gradiente nas cepas de gel devido a uma mudança gradual no comprimento inicial do recorte ao longo da direção do trecho. Este método de controle de tensão de gel é especialmente atraente, já que diferentes recortes em forma são relativamente triviais de fabricação. Além disso, a espessura e a área do recorte de silicone poderiam ser facilmente alteradas permitindo ajustes nos volumes de gel, desde volumes em miniatura de alguns microliters até volumes maiores associados aos tamanhos de gel de escala mm-cm. Além disso, é possível incluir vários recortes na mesma tira de silicone, permitindo o alongamento de vários géis simultaneamente.

(iii) As células podem ser incorporadas no hidrogel. Existem alguns desafios que devem ser levados em consideração ao incorporar células nos hidrogéis esticados. A maioria das células embutidas em hidrogéis 3D aplicam forças de tração consideráveis na matriz, bem como degradam a matriz ao longo do tempo. Isso pode resultar em contração global e digestão do gel, o que pode levar à desconexão do gel da parede interna recorada de silicone em tempos prolongados de incubação. Uma maneira possível de lidar com essa situação é usar baixas concentrações celulares e limitar o tempo de experimentos celulares a um intervalo que a contração e a degradação do gel são mínimas. Já demonstramos anteriormente a possibilidade de cultivo de células fibroblastos no gel de fibrina sob estiramento estático de 10%, durante um período de 5 horas, sem qualquer evidência de rasgo ou desconexão do gel cortado41.

(iv) Esta configuração também deve ser testada com outros tipos de hidrogéis, em particular os sintéticos, como os hidrâneos à base de poliacrilamida (PAA) ou polietilenoglicol (PEG), que são comumente utilizados para a cultura celular. A adesão natural desses hidrogéis ao recorte de silicone deve ser examinada, e se for considerada insuficiente para alongamento de gel, então devem ser utilizadas técnicas para incentivar a adesão. Deve-se considerar o uso de colas biológicas48,49 ou tratamentos químicos50,51,52 na superfície de corte.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Algumas figuras incluídas aqui foram adaptadas por permissão do Centro de Liberação de Direitos Autorais: Springer Nature, Annals of Biomedical Engineering. Esticando hidrogéis 3D com cepas uniformes de eixo Z ao permitir imagens de microscopia ao vivo, A. Roitblat Riba, S. Natan, A. Kolel, H. Rushkin, O. Tchaicheeyan, A. Lesman, Copyright© (2019).

https://doi.org/10.1007/s10439-019-02426-7

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 546 carboxylic acid, succinimidyl ester Invitrogen A20002
Cell Medium (DMEM High Glucose) Biological Industries 01-052-1A Add 10% FBS, 1% PNS, 1% L-Glutamine, 1% Sodium Pyruvate
Cover Slip #1.5 Bar-Naor Ltd. BN72204-30 22×40 mm
DIMETHYL SULPHOXIDE 99.5% GC DMSO Sigma-Aldrich Inc. D-5879-500 ML
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Biological Industries 02-023-1A
EVICEL Fibrin Sealant (Human) Omrix Biopharmaceuticals 3902 Fibrinogen: 70 mg/mL, Thrombin: 800-1200 IU/mL
Fibrinogen Buffer N/A Recipe for 1L: 7g NaCl, 2.94g trisodium citrate dihydrate, 9g glycine, 20g arginine hydrochloride & 0.15g calcium chloride dihydrate. Bring final volume to 1L with PuW (pH 7.0-7.2)
Fluorescent micro-beads FluoSpheres (1 µm) Invitrogen F8820 Orange (540/560)
Provided as suspension (2% solids) in water plus 2 mM sodium azide
High-Temperature Silicone Rubber McMaster-Carr 3788T41 580 µm-thick
E = 1.5 Mpa
Poisson Ratio = 0.48
Tensile Strength = 4.8 MPa
Upper limit of stretch = +300% engineering strain
HiTrap desalting column 5 mL (Sephadex G-25 packed) GE Healthcare 17-1408-01
HIVAC-G High Vacuum Sealing Compound Shin-Etsu Chemical Co., Ltd. HIVAC-G 100
ImageJ FIJI software39 National Institute of Health, Bethesda, MD Version 1.8.0_112
Microcontroller (Adruino Uno + Adafruit Motorshield v2.3) Arduino/Adafruit Arduino-DK001/Adafruit-1438
MicroVL 21R Centrifuge Thermo Scientific 75002470
Parafilm Bemis PM-996
Primovert Light Microscope Carl Zeiss Suzhou Co., Ltd. 491206-0011-000
SCyUS CAD (Solidworks) Dassault Systèmes N/A
SCyUS Code37 N/A N/A
Servomotor - TowerPro SG-5010 Adafruit 155
SL 16R Centrifuge Thermo Scientific 75004030 For 50 mL tubes
Sterile 10 cm non-culture plates Corning 430167
Thrombin buffer N/A Recipe for 1L: 20g mannitol, 8.77g NaCl, 2.72g sodium acetate trihydrate, 24 mL 25% Human Serum Albumin, 5.88g calcium chloride. Bring final volume to 1L with PuW (pH 7.0)
Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%) Biological Industries 03-052-1B
USB Cable (Type B Male to Type A Male) N/A N/A
Zeiss LSM 880 Confocal Microscope Carl Zeiss AG 2811000417
ZEN 2.3 SP1 FP3 (black) Carl Zeiss AG Release Version 14.0.0.0

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Bioengenharia Edição 166 Hidrogel Matriz Extracelular Mecanobiologia Mecânica Celular Força Mecânica Alongamento Externo Rede Fibrosa Alinhamento de Fibras
Tensão controlada de hidrogéis 3D sob imagem de microscopia ao vivo
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Kolel, A., Roitblat Riba, A., Natan, … More

Kolel, A., Roitblat Riba, A., Natan, S., Tchaicheeyan, O., Saias, E., Lesman, A. Controlled Strain of 3D Hydrogels under Live Microscopy Imaging. J. Vis. Exp. (166), e61671, doi:10.3791/61671 (2020).

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