Summary
Här beskriver vi protokoll för att utföra levande avbildning och kvantitativ analys av kemoattractant receptordynamik i zebrafiskneutrofiler
Abstract
Leukocytvägledning genom kemiska gradienter är avgörande för immunsvar. Neutrofiler är de första cellerna som rekryteras till platser för vävnadsskador där de utför viktiga antimikrobiella funktioner. Deras handel med dessa loci orkestreras av flera inflammatoriska kemoattractanter, inklusive kemokiner. På molekylär nivå regleras kemoattractant signalering av den intracellulära handeln med motsvarande receptorer. Det är emellertid fortfarande oklart hur subcellulära förändringar i kemokinreceptorer påverkar leukocytmigrationsdynamiken på cell- och vävnadsnivå. Här beskriver vi en metodik för live imaging och kvantitativ analys av kemokinreceptordynamiken hos neutrofiler under inflammatoriska reaktioner på vävnadsskador. Dessa verktyg har avslöjat att differentiell kemokinreceptorhandel i zebrafiskneutrofiler samordnar neutrofila kluster och spridning på platser för vävnadsskada. Detta har konsekvenser för vår förståelse av hur inflammatoriska svar är självupplösta. De beskrivna verktygen kan användas för att förstå neutrofila migrationsmönster i en mängd olika fysiologiska och patologiska inställningar och metodiken kan utvidgas till andra signalreceptorer.
Introduction
Leukocytmigration är av största vikt för immunsvar. Immunceller är prototypiska migrationsceller, som är anmärkningsvärt kapabla att korsa vävnader och blodkärl och känna av en rad kemiska vägledningssignaler för att migrera riktningsvis mot mikrober eller andra värdceller av betydelse. Korrekt vägledning bygger på erkännande av kemoattractants, bland vilka kemokiner representerar den mest framträdande kategorin1. Kemokiner känns igen av mycket specifika sju-transmembran G-proteinkopplade receptorer. Vid kemokinbindning förändrar kemokinreceptorer konformation vilket leder till aktivering av associerade trimeriska G-proteiner och deras dissociation i funktionella signalunderenheter som främjar cytoskelettförändringar och riktad migration1. För det andra fosforyleras kemokinreceptorer, och denna modifiering leder till desensibilisering för att attrahera, vilket kan följas av snabb återsensibilisering / återvinning eller intracellulär nedbrytning och nedreglering från cellytan2. Dessa receptordynamiker påverkar varaktigheten och dosen av signalering som cellerna mottar, men hur de påverkar leukocytmigrationsbeteendet har varit svårt att belysa in vivo.
Att spåra receptordynamiken i levande leukocyter i traditionella däggdjurssystem står inför flera utmaningar. För levande studier måste receptorfusioner med fluorescerande proteiner uttryckas i cellerna. Detta är utmanande i primära leukocyter, särskilt hos neutrofiler, och studier har hittills använt surrogatneutrofila cellinjer för att uttrycka kemokinreceptorer 3,4. Generering av transgena musmodeller, där leukocyter uttrycker en fluorescerande receptor eller mutantreceptorer med informativa traffickingdefekter 5,6, innebär betydande investeringar i tid och resurser. Även i dessa fall kan bildupplösningen och kontrasten för avbildningsreceptordynamiken hos det levande djuret begränsas och studier har använt immunohistokemi på fasta vävnadssektioner5. Med tanke på dessa tekniska utmaningar är vår förståelse för hur kemoattractant receptordynamik påverkar cellbeteende i en levande vävnadsinställning för närvarande begränsad.
Här tillhandahåller vi en metod för att övervaka receptorhandel med zebrafiskneutrofiler. Zebrafiskar är genetiskt lätthanterliga, som möss, men transgenes är relativt enklare genom användning av effektiva transposonsystem och direkt zygotmanipulation7. Den genomskinliga larven är idealiskt mottaglig för avbildning. Kemokinreceptordynamiken har visualiserats i ursprungliga könsceller och laterallinjen primordium genom uttryck av motsvarande fusioner med fluorescerande reportrar 8,9,10. Zebrafisklarver är utrustade med mogna neutrofiler som har mycket bevarade genetiska och cellulära egenskaper med avseende på däggdjursneutrofiler. Subcellulär signaldynamik såsom cytoskelettdynamik och polaritetsregulatorer har visualiserats i dessa celler genom generering av motsvarande transgena linjer 11,12,13. Nyligen visualiserade och funktionellt analyserade vi kemokinreceptordynamiken hos neutrofiler under inflammatoriska reaktioner på vävnadsskador14. Här beskriver vi genereringen av transgena reporterlinjer för kemokinsignalering i neutrofiler, beredning av embryon för levande avbildning, en såranalys för att studera neutrofilsignalering och protokollet för förvärv och analys av bilder. Vi tillhandahåller också ett sidoprotokoll för att testa kemokinreceptorsvar på kandidatligander, vilket är användbart när man försöker fastställa ligandigenkänningsmönster i okarakteriserade receptorer. Dessa tekniker kan användas i kombination med ytterligare genetiska manipulationer, såsom hämning av endogent kemokinuttryck eller generering av mutantreceptorer med förändrad ligandinducerad handel, för att undersöka hur specifik signaldynamik påverkar leukocytbeteende in vivo. De transgena linjerna som uttrycker fluorescerande märkta kemokinreceptorer kan också användas som reportrar för endogena kemokingradienter, som annars är svåra att detektera genom direkt antikroppsfärgning. Den beskrivna metoden ger utrymme för att utöka genereringen av reportrar till andra immunsignalreceptorer.
Protocol
OBS: Alla zebrafiskar hölls enligt ARRIVE-riktlinjerna och UK Home Office-förordningarna, UK Animals (Scientific Procedures) Act 1986.
1. Generering av transgena reporter zebrafisklarver för avbildning av receptorhandel i leukocyter
- Generera Tol2-baserad konstruktion för vävnadsspecifikt uttryck av den fluorescerande märkta receptorn av intresse. För neutrofiler, använd promotorsekvenser från lysozymC15 och myeloperoxidasgenen16. Konstruktionen kan utformas som en fusion med ett enda fluorescerande protein (t.ex. GFP), en tandemfluorescerande timer (t.ex. en snabbvikande GFP och en långsammare mognad tagRFP 8,14,17) eller ett bicistroniskt uttryck av reporter GFP och en kontrollmembranmarkör9 (se Diskussion för överväganden vid val av tillvägagångssätt).
OBS: Denna konstruktion rekapitulerar inte endogena nivåer av receptoruttryck men är användbar för att erhålla hög nivå av receptoruttryck i celltypen av intresse. Konsultera litteraturen om liknande receptorer 3,5,6,8,9,10,14 för att bestämma positionen för den fluorescerande taggen. - Sätt upp en tank som innehåller vuxna män och honor av vild typ enligt standardhållningspraxis18, åtskilda av en barriär dagen före ägglek.
- På dagen för ägggytning, förbered transgenesblandning för mikroinjektion innehållande 12,5 ng / μL Tol2 DNA-konstruktion och 17,5 ng / μL transposas mRNA7. Lyft barriärer från fisktankar strax efter att lamporna kommer på morgonen (detta kan variera i olika fiskanläggningar) och samla ägg inom 15 minuter för mRNA-injektion.
OBS: Se till att DNA-lösningen är RNasfri för att undvika nedbrytning av transposas-mRNA i blandningen. Ett alternativ för att kringgå detta är att injicera ägg med separata lösningar av Tol2-konstruktion och transposas. - Följ standardprotokoll för transgenes och mikroinjektion av zebrafiskägg19.
- Injicera 1 nL av lösningen i cellen av embryon i encellssteg.
OBS: Uttrycksresultaten är mer konsekventa när man injicerar inuti cellen och kasserar injektionerna som kanske inte är tydligt inne i cellen. Embryon i encellsstadium är avsedda för på grund av variationen i volyminjektion per cell vid injektion av 2-16 cellstegsembryon. Ett alternativ skulle vara att separera injektionerna i encellssteg från satser av senare injektioner, om dessa har olika effekt. - Kontrollera de injicerade embryona senare på dagen och ta bort obefruktade eller döda ägg för att hålla kopplingen frisk.
- Vid 3 dagar efter befruktning (dpf), screena larver under ett fluorescerande mikroskop. Markören kommer att vara synlig hos neutrofiler, särskilt i den kaudala hematopoetiska vävnaden (CHT), som är rik på dessa celler.
OBS: Andelen celler märkta varierar med olika konstruktioner, men vanligtvis förväntas 20-60% av neutrofilerna uttrycka konstruktionen. Lägre procentsatser förutspår vanligtvis mer screening på vuxenstadiet. Det är en bra praxis att också verifiera korrekt lokalisering av receptorn vid membranet, med en högre upplösning av avbildningsmetoden, i ett prov av dessa embryon innan fisken odlas. - Odla positiva larver enligt standardhållningsmetoder20. Dessa representerar F0-generationen.
- Vid 3 månaders ålder, screena F0 fisk för grundare. Korsa enskilda fiskar med en icke-transgen vild typ och screena deras avkommor vid 3 dpf för uttryck av receptorn genom att titta under dissekeringsomfattningen. Beroende på transgenesframgången, som varierar med varje konstruktion, observera en procentandel av positiva avkommor i en delmängd av korsen.
OBS: För god transgenes kommer ungefär en tredjedel till hälften av vuxna att ge positiva avkommor. Andelen avkommor som är positiva i en koppling varierar med kopieringsantal transgener som sätts in och kan vara mellan 10-60%. Det är bra att hålla reda på mendeliska förhållanden i kopplingarna för att identifiera transgena för enstaka införingar (dessa identifieras lättare i F2-kopplingar genom att leta efter ett 50% förhållande av positiva larver)20. - Växa de positiva avkommorna, som representerar F1-generationen.
- Vid 3 månaders ålder, screena F1 vuxna på samma sätt för att upprätta stabil F2 transgen linje.
- Utför experiment på F2-larver efter validering av det neutrofila specifika uttrycket av transgenen.
OBS: Under transgenesen kan man observera varierande nivåer av receptoruttryck och det är lämpligt att hålla olika transgena kopplingar för att få den lämpligaste uttrycksnivån för de biologiska frågorna. Initiala resultat kan erhållas i F0- eller F1-larver.
2. Samla zebrafiskembryon för att bedöma leukocytsårsvar
- Efter att ha etablerat en stabil transgen reporterlinje, sätt upp en korsning mellan vuxen och kvinnlig transgen fisk och samla ägg nästa morgon.
- Odla embryon vid 28,5 °C i E3-medium (eller äggvatten18).
- Eventuellt, vid 24 hpf, inkubera embryon i ett centrifugrör innehållande 50 ml E3-medium kompletterat med 0,003% blekmedel i 5 min. Skölj sedan 3 gånger i E3-medium genom att låta röret stå i ett par minuter så att embryona kan sätta sig i botten och sedan dekantera och ersätta mediet.
OBS: Detta ger en nivå av kontroll över larvernas infektionsexponering, vilket kan påverka leukocyternas beteende under sårning. - Efter blekning, håll embryon i E3-medium kompletterat med 0,003% av 1-fenyl-2-thiourea för att förhindra melaninsyntes. Metylenblå, som ofta används för att förhindra svampinfektioner, tillsätts inte här för att minimera vävnadens autofluorescens.
- Låt larver kläckas naturligt och använd vid 3 dpf när neutrofiler är rikliga21.
3. Ventralfena sår av larver
- Förbered larver för sårning. Använd larver vid 2,5-3,5 dpf, när rikliga neutrofiler observeras. Överför larver till E3-medium kompletterat med 160-200 mg/L trikain MS222.
OBS: Koncentrerade lösningar av trikain bör beredas och frysas i alikvoter i förväg och tinas på dagen. - Låt larverna stå i E3+trikainmedium i 15 min för att säkerställa att de sövs. Kontrollera deras svar genom att försiktigt röra vid en liten pensel eller liknande verktyg.
- Välj larver med transgent receptoruttryck under ett fluorescerande dissekeringsomfång.
- Överför larver till en 120 mm petriskål i E3 + trikain för sår. Med hjälp av en steril skalpell skär larvens ventrala fena, medan du observerar under dissekeringsomfånget (Figur 1).
OBS: Tanken är att utföra ett tillräckligt djupt snitt för att orsaka betydande neutrofilrekrytering men utan att skära kärlen i CHT. Snittet görs vinkelrätt mot CHT-axeln så att snittet nästan når CHT: s kärl. Detta kräver viss övning och bör först utföras med övervakning av larver som inte genereras för detta ändamål (t.ex. överskott av larver från ett annat experiment).
4. Beredning av larver för levande avbildning
- Lös upp låg smältpunkt (LMP) agaros i E3-medium genom upphettning för att erhålla en flytande 2% agaroslösning.
- Låt denna lösning svalna till 60 °C.
OBS: Förvara en kolv eller ett rör med agaros i en inkubator vid 60 °C för att undvika agarosinställningen mellan monteringen av olika larver. - Pipett 0,5 ml av den flytande LMP + E3 i en glasbottenskål för mikroskopiavbildning.
- Pipettera en sårad, sövd zebrafisklarv tillsammans med 0,5 ml E3 + 2x trikain i glasskålen.
- Blanda försiktigt de två lösningarna för att få en 1% LMP / 1x Tricaine agaros / E3-lösning, för att undvika generering av bubblor. Orientera embryot i sidled och tryck försiktigt ner så att fiskens kaudala del är så nära glaset som möjligt.
OBS: Vävnaden som ska avbildas måste vara så nära glasbotten som möjligt vid avbildning med ett inverterat mikroskop. Inställningen av orientering för larven måste vara snabb så att agarosen inte sätter sig innan larven är placerad. - Låt agaroslösningen svalna och stelna i 5-10 min. Testa om agarosen är inställd genom att försiktigt röra agarosgelen med en liten pensel eller spets.
- När agarosen är fast, tillsätt 2 ml E3 kompletterat med 0,2 mg / ml trikain till bildplattan.
5. Levande konfokal avbildning
OBS: Bildembryon på ett snurrande skivkonfokalmikroskop eller motsvarande (Figur 2). Ett laserskanningsmikroskop kan också användas men dynamikens tidsmässiga upplösning blir mer begränsande. Förbered bildinställningarna innan du tar med den sårade larven, så att svaret kan avbildas så snabbt som möjligt efter sår. Neutrofiler anländer till såret inom 5 minuter och receptorer i de första ankommande cellerna kan internaliseras inom denna tidsram. Med övning är det möjligt att avbilda så tidigt som 15 min efter sår.
- Slå på mikroskopet: laser, kamera och dator enligt tillverkarens instruktioner.
- Använd förvärvsprogramvara för att ställa in bildinställningarna. Välj lasrar för lämpliga fluoroforer och ungefärliga exponeringstider baserat på tidigare experiment (skaffa GFP med 488 nm och tagRFP med 561 nm laser).
- Överför plattan med det monterade embryot, så snart som möjligt efter agarosuppsättningar, till den konfokala bildspinnskivan.
- Använd mikroskopets ögonstycke för att hitta fisken i skålen med hjälp av scenjoysticken.
- Fokusera på sårområdet med hjälp av fokuseringsknappen.
OBS: För att hitta intresseområdet kan det vara lättare att använda ett luftmål med låg förstoring (10x). - Välj fältet som ska avbildas runt såret. Använd ett 30x/40x mål med hög numerisk bländare för att få tillräcklig upplösning.
- Använd programvaruknapparna för att justera exponeringstiden så att den fluorescerande markören kan ses med god kontrast men utan att mätta signalen.
OBS: Exponeringstiden måste vara så låg som möjligt för att minimera fluorescerande exponering och maximera tidsupplösningen under tidsfördröjningen. Lasereffekten beror på laserns tillstånd men måste justeras till en nivå som tillåter tillräckligt låg exponeringstid för dynamisk bildbehandling. - Använd programvaruknapparna för att välja volymen som ska avbildas som en z-stack
- Ställ in en tidsfördröjning var 30: e sekund för önskad varaktighet.
OBS: För sterila ventrala fensår observeras den maximala rekryteringen med 2-3 timmar. - Innan du startar timelapse, ta en ljus fältögonblicksbild för att dokumentera synfältet. Om möjligt, skaffa ljust fält i time-lapse-filmen.
6. Kvantifiering av receptor internalisering i zebrafiskneutrofiler
- Registrera tidsintervallet för bildförvärv och bildens pixelstorlek. Håll ett register över hur många minuter efter sårandet avbildningen startade.
- Öppna bilddatauppsättningarna med Fiji genom att dra bilden till programvarugränssnittet, välj en representativ ram av intresse för varje datauppsättning med hjälp av tidsreglaget, t.ex. vid 1-1,5 h efter sårning och spara den.
- Fortsätt med MATLAB för att bearbeta bilddatauppsättningen.
- Skapa ett nytt skript och inkludera funktioner för bildläsning (rad 6 i skript som heter "select_neutrophils.m" för centroiddefinition i tilläggsfil 1), öppning (rad 11 i tilläggsfil 1) och manuellt urval av punkter på bilden (rad 12 i tilläggsfil 1).
- Öppna ramen av intresse genom att köra detta skript (kompletterande fil 1), identifiera neutrofilerna som ska analyseras genom visuell inspektion, klicka på dem och registrera en uppskattning av deras centroider, både i det ventrala fensåret och i CHT.
OBS: De icke-mobiliserade neutrofilerna i CHT fungerar som en intern referens för neutrofiler vars receptorfördelning förblir konstant. Detta möjliggör normalisering av kontrastvärden för celler vid såret till en intern referens. - Fortsätt med segmentering av neutrofilerna i varje ram med hjälp av aktiv konturteknik22 enligt beskrivningen i stegen nedan.
- Skapa en funktion för att inkludera de metadata som krävs för segmentering efter aktiva konturer (dvs. antal iterationer, konturbias, uppskattad centroid etc.) 22 (se "sårdata.m" i kompletterande akt 2).
- Skapa ett skript som anropar funktionen "wound_data.m" för att mata in nödvändig information för segmentering av varje neutrofil (rad 28 i skript som heter "calc_contrast.m" i tilläggsfil 3).
- Inkludera i skriptkommandona för bildläsning (rad 32 i tilläggsfil 3).
- Lägg till genereringen av en svart bild (dvs. bild där pixelvärdena är nollor) med samma storlek som ingångsbilden (rad 44 i tilläggsfil 3) och definitionen av en kvadrat på 10 × 10 pixlar runt centroiden för varje neutrofil (rad 45 i tilläggsfil 3).
- Inkludera neutrofilsegmentering med aktiva konturer (raderna 48–49 i tilläggsfil 3) och borttagning av små falskt upptäckta objekt (rad 52 i tilläggsfil 3).
OBS: Den initiala segmenteringskonturen är kvadraten runt centroiden, som utvecklas genom aktiv konturteknik baserat på pixelintensiteterna, antalet iterationer och konturens bias. Resultatet av segmentering är en binär mask där alla pixlar har värdet 0 förutom neutrofiområdet vars pixlar har värdet 1. - Inkludera multiplikationen av den segmenterade binära bilden med den ursprungliga för att endast få neutrofilens pixelintensiteter, med resten av bilden som inte är ett tal, så det bidrar inte till beräkningar (raderna 56-57 i tilläggsfil 3).
- Lägg till beräkningen av grånivåmatrisen för varje neutrofil (GLCM)14,23 (rad 61 i tilläggsfil 3). GLCM är en annan representation av bilden som visar relativ position för pixlar när det gäller pixelintensitet.
- Inkludera beräkningen av neutrofilens kontrast baserat på GLCM (raderna 62,65 i tilläggsfil 3). Kontrastmåttet mäter skillnader i intensitet mellan angränsande pixlar. Pixlar jämförs med pixlar med ett visst avstånd från varandra, vilket kan justeras empiriskt baserat på storleken på lokala toppar i intensitet. Som en indikation, för bilderna, med en pixelstorlek på 0,389 μm, när receptorn visade vesikulär fördelning var varje ljus prick i intervallet 5 pixlar. Därför jämfördes intensiteterna i pixlar med 5 pixlars mellanrum.
- Lägg till kommandon för att spara värdena separat för enskilda neutrofiler i ventralfenan (rad 68 i tilläggsfil 3).
- Inkludera beräkningen av det genomsnittliga neutrofila kontrastvärdet från alla CHT-neutrofiler på samma sätt som för neutrofiler vid såret (raderna 72-119 i tilläggsfil 3). För CHT-neutrofiler, kalla funktionen "cht_data.m" (rad 77 i tilläggsfil 4).
- Inkludera normaliseringen av kontrastvärdet för enskilda neutrofiler vid såret till den genomsnittliga kontrasten mellan CHT-neutrofiler beräknade ovan i steg 6.16 (dvs. division) (rad 122 i tilläggsfil 3). Detta ger en normaliserad kontrast som återspeglar hur "prickig" receptorns utseende är i enskilda svarande celler i förhållande till kontroll icke-svarande celler (figur 3 och figur 4).
- Kör skriptet (tilläggsfil 3) genom att klicka på körningssymbolen i programvaran.
- Upprepa alla steg för olika förhållanden.
- Använd statistisk programvara (se Materialtabell) för att importera resultaten för de olika förhållandena genom att skapa en kolumntabell, plotta resultaten och utföra statistiskt test för att kontrollera signifikansen av skillnaden mellan medelvärdena.
OBS: Koderna för analysen finns också i GitHub på https://github.com/LeukocyteMotionAndDynamics/ReceptorTraffic
7. Kemokinresponsanalyser i tidiga embryon
OBS: Detta är ett valfritt sidoexperiment som möjliggör testning av receptorfördelningsförändringar som svar på en kandidatkemokin och är oberoende av de experiment som beskrivs ovan angående neutrofila uttryck av receptorkonstruktionerna. Skillnader i ligandinducerad handel mellan receptorer är svåra att fastställa med denna teknik eftersom ligandnivåerna är mättande14. Men om man ser ligand-internalisering av en receptor i detta system kan detta vara en indikation på att liganden känns igen av receptorn i fall där ligandidentiteten är oklar. Detta är användbart, eftersom uttryck av kemokinreceptorer i etablerade cellinjer såsom HEK293T-celler14 kan vara besvärligt.
- Sätt upp ett kors av vild fisk (t.ex. AB) och samla ägg nästa morgon strax efter att ha lyft separatorerna (som beskrivits ovan).
- Injicera 100 pg fluorescerande märkt receptor-mRNA (t.ex. Cxcr1-FT), tillsammans med 100 pg mRNA för en membranmarkör (t.ex. membran CFP). Inkludera i blandningen varierande doser av mRNA för kemokinligand.
OBS: Som en indikation gav 150 pg Cxcl8a mRNA en framträdande internalisering av fluorescerande Cxcr1-FT (se figur 5). - Skölj embryon med E3-medium och inkubera vid 28 °C.
- Vid ca 7 hpf, testa uttrycket av mRNA på ett fluorescerande dissekeringsomfång och välj embryon till bild.
- Förbered 0,8 % LMP-agaros i förväg och förvara i glasrör i ett värmeblock vid 60 °C. Använd en glaspipett för att manipulera embryon. Dechorionate embryon försiktigt med ett par pincett i varje hand.
- Aspirera ett individuellt dechorionerat embryo med glaspipetten så att inga bubblor är i spetsen. Släpp försiktigt embryot i röret av agaros så att det kan sjunka in i röret.
- Aspirera embryot från agarosröret och samla lite flytande agaros längs vägen. Släpp försiktigt embryot på mitten av en glasbottnad bildskål. Rotera snabbt embryot så att djurpolen är vänd mot botten av skålen (denna sida måste vara närmast målet när du använder ett inverterat mikroskop).
OBS: Man kan behöva justera embryonernas orientering medan agarosen fortfarande är inramning. - Efter att agarosen är inställd, komplettera med 2 ml E3-medium.
OBS: Embryona i detta skede är mycket ömtåliga i jämförelse med larver och det tar lite övning att dechorionate och montera. Det är viktigt att aspirera och släppa så försiktigt som möjligt för att undvika embryobrott. - Upprepa processen som syftar till att ladda 3-5 embryon per maträtt.
- Bildembryon på ett inverterat konfokalmikroskop (se Materialtabell). Använd ett oljemål på 40x/1,3 NA för att få tillräckligt hög upplösning. Visualisera mCFP, sfGFP och tagRFP med 405, 488 respektive 552 nm i omfånget. Justera filter och inställningar för att få hög kontrast samtidigt som du undviker mättnad och minimerar läckage mellan kanalerna.
- Upprepa monteringen och avbildningen under olika förhållanden.
Representative Results
Ventral fensårning följs av snabb neutrofil mobilisering från CHT till ventralfenan och kluster vid sårmarginalen inom 30-60 min (Figur 1). Vi visualiserade fördelningen av två kemokinreceptorer, Cxcr1 och Cxcr2, som uttrycks av zebrafiskneutrofiler24 och känner igen Cxcl8a och Cxcl8b14, med hjälp av konfokalmikroskopi av spinnskivor. Vi genererade två motsvarande transgena linjer, Tg (lyz: Cxcr1-FT) och Tg (lyz: Cxcr2-FT), där neutrofiler uttrycker en fluorescerande timer (FT) konstruktion av receptorn, dvs en fusion med en tandem av sfGFP och tagRFP (Figur 2 och referens14). Användningen av de två fluoroforerna var avsedd att möjliggöra övervakning av ett brett spektrum av receptoröden och ge uppskattningar av proteinomsättningstiden vid plasmamembranet, eftersom nyligen syntetiserade receptorer skulle fluoresce i grönt och gradvis bli röda när de åldras 8,14. Dessa receptorer visade sig emellertid ha snabb konstitutiv omsättning vid neutrofila plasmamembranet och att uppehållstiden var kortare än mognadstiden för tagRFP, med sfGFP som visade membranlokalisering och tagRFP som visade vesikulär lokalisering vid steady state (kompletterande video 1 och ref14). Därför fokuserade vi på distributionen av sfGFP för att övervaka ligandinducerad internalisering vid vävnadsskador. Mönstret för receptorfördelning kvantifierades med hjälp av kontrastmetriken, som rapporterar skillnader i intensitet mellan angränsande pixlar. Motiveringen är att när receptorfördelningen är membranös och jämn är kontrastvärdet lågt. När receptorfördelningen är vesikulär och mer punktlig är kontrastvärdet högt (figur 3).
En alternativ metod är att kvantifiera förhållandet mellan receptornivåer (sfGFP-intensitet) över nivåerna av en kontrollmembranmarkör, t.ex. membran CFP (mCFP) (figur 3). Båda metoderna kan detektera receptor internalisering, vilket indikeras av mer vesikulärt receptorfördelningsmönster globalt i cellen (högre kontrastvärde) eller lägre receptornivåer vid membranet (lägre sfGFP / mCFP-förhållande). Kontrastmetriken kunde emellertid också detektera receptor internalisering i neutrofila kluster vid såret, där membransegmentering var mindre exakt och inte tillämplig (Figur 3). Med hjälp av detta mått kunde vi kvantifiera synliga skillnader mellan Cxcr1 och Cxcr2 handel med neutrofiler vid sår (Figur 4 och kompletterande video 2). Cxcr1-FT internaliserades i celler belägna vid såret medan Cxcr2-FT förblev membranös hos neutrofiler vid såret (Figur 4A-C, Kompletterande video 2 och kompletterande video 3). Undertryckande av Cxcl8a och Cxcl8b, genom morfolinobehandling, påverkade differentiellt Cxcr1-FT-internalisering vid sår (Figur 4C,D). För att ytterligare validera att Cxcr1-FT svarar på Cxcl8a utförde vi kemokinresponsanalyser i tidiga embryon. Vi fann att Cxcr1-FT markant internaliserades i embryon där Cxcl8a uttrycktes samtidigt (figur 5). Sammantaget indikerar dessa resultat att de beskrivna metoderna kan användas för att mäta kemokininducerad receptor internalisering i neutrofiler och fastställa identiteten hos liganden som förmedlar dessa effekter.
Figur 1: Neutrofil migration till ventrala fensår. (A) (Vänster) Tecknad film av 3 dpf larv som visar placeringen av den kaudala hematopoietiska vävnaden (CHT), venuscirkulationen (VC, blå), ventralfenan (VF) och sårplatsen. (Höger) Tecknad film som visar sårets område (W) med neutrofiler som mobiliseras från CHT och kluster vid såret. Cht-vävnadens kaudala venplexus (CVP) dras i blått. (B) Ljus fältbild (vänster) och konfokal projektion (höger) som visar det ventrala fensåret och fördelningen av neutrofiler i Tg (mpx: GFP) larver vid 2 timmar efter sårning. Streckade linjer visar VF- och CHT-konturer. Skalstång = 25 μm. Tecknad och fluorescerande bild modifierad från ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Levande avbildning av kemokinreceptorhandel med neutrofiler. A) Konstruktioner som används för neutrofilspecifikt transgent uttryck av Cxcr1-FT (fluorescerande timer) och Cxcr2-FT. Konfokala projektioner av neutrofiler i huvudet på en 3 dpf transgen larv (Tg(lyz:Cxcr1-FT), topp. Tg(lyz:Cxcr2-FT), nederst) som visar kanalerna tRFP (magenta) och sfGFP (gröna). Skala bar = 20 μm. (B) Anatomiskt schema med 3 dpf larv som i figur 1A. Under larven finns scheman som visar sårets område (W) med neutrofiler som mobiliseras från CHT (överst) eller utför kemotaxis när de kommer in i ventralfenan (botten). Streckad kvadrat anger område som avbildats i ögonblicksbilder till höger. (C) Neutrofiler i Tg (lyz: Cxcr1-FT) larver (sfGFP visas) vid mobilisering från CHT (topppaneler) eller kemotaxis mot såret (bottenpaneler). Pilar visar samma celler över tid. Tidpunkter på den högra bilden är minuter som förfluter efter bilden till vänster. Skala bar = 10 μm. (D) Schematisk representation av experimentell metod för levande avbildning av kemokinreceptorhandel. Panelerna A-C modifierade från ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Kvantifieringsexempel på receptordynamik. Enstaka (blå) eller grupperade neutrofiler (gröna) vid sår eller icke-mobiliserade neutrofiler i CHT (röd, orange) segmenterades och analyserades med olika metoder för att jämföra resultaten. Samma exempelceller som visades analyserades med två metoder för att relatera det som ses i bilden med det extraherade värdeintervallet. (A) Ytan på de valda exempelcellerna segmenterades baserat på konturdefinition i sfGFP-kanalen. (B) Kontrast beräknades från exempelcellerna som visas i A. (C) Membranet i de utvalda exempelcellerna segmenterades baserat på konturdefinition i CFP-kanalen. Ratiometrisk analys av sfGFP/CFP följde. (D) Förhållandet mellan sfGFP/CFP beräknades på exempelcellerna som visas i C. Felstaplar representerar S.E.M. från enskilda celler, i fall av n>1 användes värden här inte för statistisk analys utan endast för att exemplifiera mätningar som erhållits med de olika kvantifieringsmetoderna. Skalstång = 10 μm. Figuren ändrad från ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Differentiell dynamik för Cxcr1 och Cxcr2 som svar på sårning. (A) Konfokal projektion av neutrofiler i Tg(lyz:Cxcr1-FT) eller Tg(lyz:Cxcr2-FT)larver vid såret vid 80 min efter sårningen (sfGFP-kanal visas). Skalstång = 10 μm. (B) Förstorad Cxcr1-FT neutrofil (vänster) och Cxcr2-FT (höger) vid såret. Grön receptor visas i grått. Skalstång = 5 μm. (C) Normaliserad kontrast (kontrast per enskild neutrofil normaliserad till den genomsnittliga kontrasten för icke-mobiliserade celler i CHT). cxcl8a avser injektion av en skarvblockering tillsammans med en översättningsblockerande morfolino för cxcl8a. cxcl8b avser injektion med en skarvblockerande morfolino för cxcl8b. För Tg (lyz: Cxcr1-FT): n = 24 celler (CHT), n = 47 celler (sår) från 8 larver. För Tg(lyz:Cxcr1-FT) med morfolinos: n=28 celler (Cxcl8a-MO) från 5 larver, n=16 celler (Cxcl8b-MO) från 5 larver. För Tg (lyz: Cxcr2-FT): n = 10 celler (CHT) och n = 20 celler (sår) från 3 larver. Data samlades från oberoende larver som förvärvats i 1-5 bildsessioner. Kruskal-Wallis-test med Dunns multipeljämförelsetest för Tg (lyz: Cxcr1-FT), två-tailed unpaired Mann-Whitney-test för Tg (lyz: Cxcr2-FT). (D) Konfokal projektion av neutrofiler i Tg(lyz:Cxcr1-FT) transgena larver behandlade med cxcl8a morpholino (MO) (vänster) och cxcl8b MO (höger) som svarar på fensår (sfGFP-kanal visas i grönt). Ögonblicksbild tagen vid tidpunkter för motsvarande neutrofilackumulering (85 min eftersårning i vänster bild och 45 min eftersårning i höger bild). Skalstång = 10 μm. Figur ändrad från ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Kemokinresponsanalys i tidiga embryon. Laserskanning av konfokala skivor av gastrulerande embryon som visar uttryck och distribution av Cxcr1-FT. 100 pg Cxcr1-FT mRNA injicerades i ägg i ett cellstadium med eller utan 150 pg Cxcl8a mRNA. Gröna och röda receptorer visas i separata kanaler. Kontrollmembran CFP-markör (mCFP) visas i cyankanalen. Skalstång = 20 μm. Figuren ändrad från ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande film 1: Transgena neutrofiler i huvudet på en Tg(lyz:Cxcr1-FT) (vänster) och Tg(lyz:Cxcr2-FT) (höger) larv vid 3 dpf. sfGFP(grön), tagRFP (magenta). Ramintervallet är 30 sek och bildhastigheten är 5 fps. Skalstång = 20 μm. Videon kommer från ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Klicka här för att ladda ner den här videon.
Kompletterande film 2: Neutrofiler i Tg (lyz: Cxcr1-FT) (vänster) och Tg (lyz: Cxcr2-FT) (höger) transgena larver som svarar på fensår. Filmen börjar inom 10 min efter sårningen och varar 60 min. sfGFP (grön), tagRFP (magenta). Ramintervallet är 30 sek och bildhastigheten är 10 fps. CHT = kaudal hematopoetisk vävnad. VF = ventralfena. Skalstång = 25 μm. Videon kommer från ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Klicka här för att ladda ner den här videon.
Kompletterande film 3. Ytterligare exempel på neutrofiler från en sårad Tg (lyz: Cxcr1- FT) transgen larv (annan larv än den som visas i video 2), förvärvad vid högre upplösning, som visar receptor internalisering (sfGFP-kanal som visas i grönt) vid mobilisering i CHT eller vid inträde och kemotaxis i ventralfenan. Ramintervallet är 30 sekunder och bildhastigheten är 2 fps. Skalstång = 10 μm. Videon kommer från ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Klicka här för att ladda ner den här videon.
Kompletterande fil 1: Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 2: Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 3: Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 4: Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Den beskrivna metoden möjliggör levande avbildning av receptordynamiken som svar på endogena ligander in situ under ett inflammatoriskt svar på vävnadsskada. Användningen av Cxcr1 / Cxcr2 neutrofila reportrar kan utvidgas till andra fysiologiska inställningar, såsom infektion, tumörmodeller eller andra typer av vävnadsskador 14,25,26,27. Dessutom kan transgena räddningslinjer, där den endogena receptorn undertrycks och räddas av en exogen mutantreceptor, ge användbara verktyg för att dissekera vikten av specifika neutrofila migrationsmönster i immunsvar. Till exempel orsakar Cxcr1-receptormutanter som har nedsatt desensibilisering mer framträdande neutrofila kluster vid inflammatoriska platser14. Denna förstärkning av funktionsfenotyp kan användas för att förstå rollen som neutrofil församling i olika fysiologiska processer, t.ex. sårreparation, infektionssjukdom eller tumörutveckling och komplettera receptor knockdown / knockout-experiment. Metoden ger också en grund för att utöka utbudet av tillgängliga reportrar. Valet av fluorescerande reporter är viktigt att överväga och beror på den biologiska frågan. Vi fann att den konstitutiva omsättningen av dessa kemokinreceptorer i neutrofiler var hög, jämfört med epitelceller, och att reportrar med snabb mognad (t.ex. sfGFP) var skyldiga att rapportera membrannivåer vid steady state och lösa skillnader vid neutrofilstimulering 8,14. Således är membranförhållanden för sfGFP / tagRFP inte tillämpliga för mätning av ligandinducerad internalisering i denna celltyp, men mönstret för tagRFP möjliggör spårning av receptorns intracellulära öden, vilket kan vara användbart i vissa studier. Vi fann också att den mer koncentrerade intracellulära signalen av tagRFP är användbar för screening av enskilda larver. Ett alternativt tillvägagångssätt för att mäta receptornivåer vid plasmamembranet skulle vara att samuttrycka en fluorescerande membranmarkör hos neutrofiler antingen i samma transgen9 eller i en oberoende transgen14. I det förra scenariot skulle transgenen ge ytterligare ett sätt att screena fisken och uttrycksnivåerna skulle vara jämförbara mellan markören och receptorn. Det senare tillvägagångssättet skulle vara mer modulärt, eftersom en zebrafisklinje med en receptorreporter kunde kombineras med olika reporterlinjer. I båda fallen är det värt att notera att membrankvantifiering av receptornivåerna är utmanande i klusterade neutrofiler (se nedan). Slutligen noterar vi att en möjlig förlängning av detta protokoll skulle vara att följa upp den levande avbildningen genom immunohistokemi för mer detaljerade lokaliseringsanalyser.
Tol2-transgenessystemet är väl etablerat7 och lysozym C-promotorn har använts i stor utsträckning för neutrofila uttryck11,15. Transgenesmetoden är därför relativt enkel och uttrycksnivån som uppnås med denna promotor är tillräckligt hög för att ge tillräcklig kontrast för analys av receptordynamik. En möjlig begränsning är att uttrycksnivån inte rekapitulerar endogena receptoruttrycksnivåer. Ny CRISPR-teknik skulle kunna användas för att upprätta knock-in-linjer för receptorer av särskilt intresse28. Dessa tekniker är fortfarande besvärliga och kanske inte garanterar de nödvändiga uttrycksnivåerna för subcellulär avbildning, men deras framgångsrika utveckling skulle vara ett viktigt genombrott för att förstå endogen signaldynamik. Funktionella valideringar är viktiga för att tolka data med transgena receptorkonstruktioner. Till exempel kan ligandigenkänningsanalyser användas för att fastställa att det fluorescerande fusionsproteinet är funktionellt och räddning av knockout-fenotyper kan användas för att fastställa att de transgena neutrofila uttrycksnivåerna är kompatibla med funktionalitet14. Slutligen skulle ett mer direkt sätt att validera receptorfusionen vara att använda en in vitro-funktionell analys med märkt receptor tillsammans med icke-märkta versioner14.
Kvantifieringsmetoden behandlar specifika svårigheter vid exakt membransegmentering hos neutrofiler in vivo. I celler av epitelial natur kan kvantifiering av receptornivåer utföras automatiskt genom normalisering av membranreceptornivåer till en kontrollmarkör, som kan uttryckas i tandem eller separat9. Vi har faktiskt tillämpat ett sådant tillvägagångssätt när vi använder ligandigenkänningsanalysen i gastrulerande embryon14. Neutrofiler genomgår emellertid komplexa, snabba förändringar i cellform in vivo, vilket gör membransegmenteringen svår både i 2D och 3D14. Detta är ännu mer utmanande när neutrofiler kluster, vilket förekommer i många fysiologiska miljöer29. Kontrastmåttet övervinner denna begränsning eftersom det inte kräver membransegmentering utan istället återspeglar det övergripande tillståndet för receptorfördelning i cellen (membranös / slät vs vesikulär / prickig). Det är viktigt att notera att kontrastmått kan påverkas av bildens totala kontrast, så normalisering av enskilda cellvärden till en intern referens krävs för att ta hänsyn till signalens variabilitet i olika embryon / prover. Till exempel använde vi det genomsnittliga cellkontrastvärdet för icke-responsiva neutrofiler i CHT (dvs. neutrofiler som förblir stationära och inte migrerar in i ventralfenan)14. En ytterligare möjlighet skulle vara att normalisera med kontrastvärden för en kontrollmarkör i samma cell. Detta skulle ge en lösning när en intern referens av icke-svarande celler inte är tillgänglig och sannolikt kan lösa finare kvantitativa skillnader i receptordynamik mellan olika tillstånd.
Placeringen av avbildning är en annan variabel att tänka på. Anledningen till att välja det ventrala fensåret här, i motsats till den vanligare svansfensårmodellen 16,30, beror på att sårplatsen ligger i närheten av platsen för neutrofil bostad / migrerande ursprung. Detta påskyndar analysens tidslinje, eftersom det tar relativt lite tid för neutrofiler att komma fram. Dessutom ger det möjlighet att fånga cellbeteende både vid migrationens ursprung (CHT) och målplatsen av intresse (sår). Detta är relevant här, eftersom den rumsliga och tidsmässiga upplösningen som krävs för subcellulär avbildning är svår att kombinera med ett stort synfält eller skanning med flera positioner. Således tillåter den ventrala fensåranalysen spårning av utvecklingen av det migrerande svaret från migrationsursprunget och samtidig infångning av ospecifika receptorfluktuationer i celler som inte svarar. Som nämnts ovan är det senare användbart för kvantifieringsändamål eftersom det ger en intern referens för ospecifik dynamik. I andra system kanske det inte är möjligt att ha en sådan intern referens, i vilket fall kontrastvärdena för en samuttryckt membranmarkör skulle ge en alternativ kontroll.
Sammanfattningsvis räknar vi med att metoden är tillämplig på andra system och kan användas för en mängd olika ändamål. Till exempel kan samma reportrar användas i andra inflammatoriska inställningar, såsom infektionsinställningar eller andra sjukdomsmodeller. Repertoaren av zebrafiskreceptorreporterlinjer kan utvidgas till andra signalreceptorer, för att förstå signalmekanismer eller rapportera liganddynamik in vivo. Tillvägagångssättet kan kombineras med knockdown / knockout-tekniker för att förhöra den mekanistiska grunden för observerad dynamik. Exempelvis kan störning av liganduttryck indikera ligandberoendet för observerad receptordynamik. I framtiden ser vi framför oss att systemet skulle kunna förfinas ytterligare för att inkludera knock-in-insättning av reportrar. I slutändan skulle fynd som använder denna metod ge nya insikter som är värdefulla bortom zebrafisksamhället, med tanke på bevarandet av dessa signalreceptorer hos däggdjur och den relativa utmaningen att genomföra dessa studier i större organismer.
Disclosures
Författarna förklarar ingen intressekonflikt
Acknowledgments
Vi tackar Christine Holt och Bill Harris för hjälp med konfokalmikroskopi. Vi tackar Darren Gilmour för de fluorescerande timerryggradskonstruktionerna och Anna Huttenlocher för Tol2-Lyz ryggradsvektor. Vi tackar Steve Renshaw för Tg(mpx:GFP)i114-linjen . Detta arbete stöddes av MRC (MR/L019523/1), Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] och ett Isaac Newton Trust-bidrag 19.23(n). C.C. stöddes av en MRC DTP-studentskap och delvis av Wellcome Trust [204845 /Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] bidrag. H.W. stöddes av en MRC DTP Studentship. H.P. stöddes av ett Wellcome Trust-doktorandbidrag (105391/Z/14/Z) och delvis av ett Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] bidrag och MRC (MR/L019523/1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-phenyl-2-thiourea | Sigma-Aldrich | P7629-25G | |
| 50mL CellStar Centrifuge Tube | Grenier Bio-One Limited | 210270 | |
| Clark capillary glass | Harvard Apparatus | 30-0020 | |
| Cleanline Thin Bleach | Scientific Laboratory Supplies | CLE0301 | |
| Dissecting scope | Nikon | SMZ645 | |
| Dri Block heater | Techne | FDB02AD | |
| Fiji | National Institutes of Health, Bethesda, MD | ||
| Forceps, Jewelers Dumont No. 5 | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| Glass bottom microwell dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Glass pasteur pipette | Fisherbrand | 11795098 | |
| Invitrogen Ambion mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Invitrogen | 10391175 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica | N/A | |
| Low melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
| Magnetic stand | Narishige | GJ-1 | |
| MATLAB | The MathWorks, Inc., Natick, MA | ||
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140-25G | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-2643 | |
| Microinjection system | Parker | Picospritzer III | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micromanipulator | Narishige | M-152 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Company | Flaming/Brown P-97 | |
| Microscope slide | Thermo-Scientific | J1800AMNZ | |
| PerkinElmer Spinning Disk UltraVIEW ERS, Olympus IX81 spinnng disk confocal microscope | Olympus | N/A | |
| Petri dish (120mm) | Grenier Bio-One Limited | 632180 | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
| Poly(A) Tailing Kit | Invitrogen | AM1350 | |
| Prism | GraphPad Software | ||
| Small paintbrush | N/A | ||
| Spectral Applied Research LMM5 laser module | N/A | ||
| Surgical Scalpel Blade No. 23 | Swann-Morton | 233-5528 | |
| Tricaine MS222 | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
| Volocity software | N/A | ||
| Yokogawa CSU10 spinning disc confocal scanner | Yokogawa | N/A |
References
- Rot, A., von Andrian, U. H. Chemokines in innate and adaptive host defense: basic chemokinese grammar for immune cells. Annual Review of Immunology. 22, 891-928 (2004).
- Cotton, M., Claing, A. G protein-coupled receptors stimulation and the control of cell migration. Cellular Signalling. 21 (7), 1045-1053 (2009).
- Liu, X., et al. Bidirectional regulation of neutrophil migration by mitogen-activated protein kinases. Nature Immunology. 13 (5), 457-464 (2012).
- Wen, X., Jin, T., Xu, X. Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells. Journal of Visualized Experiments. (115), e54511 (2016).
- Arnon, T. I., et al. GRK2-dependent S1PR1 desensitization is required for lymphocytes to overcome their attraction to blood. Science. 333 (6051), 1898-1903 (2011).
- Jung, H., Mithal, D. S., Park, J. E., Miller, R. J. Localized CCR2 Activation in the Bone Marrow Niche Mobilizes Monocytes by Desensitizing CXCR4. PloS One. 10 (6), 0128387 (2015).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Donà, E., et al. Directional tissue migration through a self-generated chemokine gradient. Nature. 503 (7475), 285-289 (2013).
- Venkiteswaran, G., et al. Generation and dynamics of an endogenous, self-generated signaling gradient across a migrating tissue. Cell. 155 (3), 674-687 (2013).
- Minina, S., Reichman-Fried, M., Raz, E. Control of receptor internalization, signaling level, and precise arrival at the target in guided cell migration. Current Biology. 17 (13), 1164-1172 (2007).
- Yoo, S. K., et al. The role of microtubules in neutrophil polarity and migration in live zebrafish. Journal of Cell Science. 125, Pt 23 5702-5710 (2012).
- Yoo, S. K., et al. Differential regulation of protrusion and polarity by PI3K during neutrophil motility in live zebrafish. Developmental Cell. 18 (2), 226-236 (2010).
- Buchan, K. D., et al. A transgenic zebrafish line for in vivo visualisation of neutrophil myeloperoxidase. PLoS One. 14 (4), 0215592 (2019).
- Coombs, C., et al. Chemokine receptor trafficking coordinates neutrophil clustering and dispersal at wounds in zebrafish. Nature Communications. 10 (1), 5166 (2019).
- Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).
- Renshaw, S. A., et al. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
- Khmelinskii, A., et al. Tandem fluorescent protein timers for in vivo analysis of protein dynamics. Nature Biotechnology. 30 (7), 708-714 (2012).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2007).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. Journal of Visualized Experiments. (25), 1115 (2009).
- Detrich, H. W., Zon, L. I., Westerfield, M. The Zebrafish: Genetics, Genomics and Informatics. , Elsevier. Burlington. (2004).
- Le Guyader, D., et al. Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish. Blood. 111 (1), 132-141 (2008).
- Chan, T. F., Vese, L. A. Active contours without edges. IEEE Transactions on Image Processing. 10 (2), 266-277 (2001).
- Haralick, R. M., Shanmugam, K., Dinstein, I. Textural features for image Classification. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. SMC-3 (6), 610-621 (1973).
- Deng, Q., et al. Localized bacterial infection induces systemic activation of neutrophils through Cxcr2 signaling in zebrafish. Journal of Leukocyte Biology. 93 (5), 761-769 (2013).
- Torraca, V., Mostowy, S. Zebrafish infection: From pathogenesis to cell biology. Trends in Cell Biology. 28 (2), 143-156 (2018).
- Feng, Y., Santoriello, C., Mione, M., Hurlstone, A., Martin, P. Live imaging of innate immune cell sensing of transformed cells in zebrafish larvae: parallels between tumor initiation and wound inflammation. PLoS Biology. 8 (12), 1000562 (2010).
- Poplimont, H., et al. Neutrophil swarming in damaged tissue is orchestrated by connexins and cooperative calcium alarm signals. Current Biology. 30 (14), 2761-2776.e7 (2020).
- Cornet, C., Di Donato, V., Terriente, J. Combining Zebrafish and CRISPR/Cas9: Toward a more efficient drug discovery pipeline. Frontiers in Pharmacology. 9, 703 (2018).
- Kienle, K., Lämmermann, T. Neutrophil swarming: an essential process of the neutrophil tissue response. Immunological Reviews. 273 (1), 76-93 (2016).
- Lisse, T. S., Brochu, E. A., Rieger, S. Capturing tissue repair in zebrafish larvae with time-lapse brightfield stereomicroscopy. Journal of Visualized Experiments. (95), e52654 (2015).
