Summary
Modüler bir spektrometre kullanarak kantitatif yüzey ile geliştirilmiş Raman spektroskopisi (SERS) algılaması için Au NP çözeltisine az miktarda eklenmeden önce sulu bir çözeltide cucurbit[7]uril ve ürik asitten oluşan bir konakçı-konuk kompleksi oluşturulmuştur.
Abstract
Bu çalışma, modüler bir spektrometre kullanarak, parmak izi bölgesindeki çoklu karakteristik zirveler için ~ 0,2 μM'lik düşük algılama sınırına sahip yüzeyle geliştirilmiş Raman spektroskopisi (SERS) yoluyla önemli bir biyobelirteç olan ürik asidin (UA) kantitatif tespiti için hızlı ve oldukça hassas bir yöntemi açıklamaktadır. Bu biyosensing şemasına, bir makro döngü, cucurbit [7] uril (CB7) ve UA arasındaki konakçı-konuk kompleksi ve daha sonra kendi kendine monte edilmiş Au NP: CB7 nanoagregaları içinde hassas plazmonik nanokavşakların oluşumu aracılık eder. SERS substratları için arzu edilen boyutların basit bir Au NP sentezi, klasik sitrat indirgeme yaklaşımına dayanarak, laboratuar yapımı otomatik bir sentezleyici kullanılarak kolaylaştırılma seçeneği ile gerçekleştirilmiştir. Bu protokol, klinik uygulamalar için vücut sıvılarındaki biyobelirteçlerin çoklanmış tespitine kolayca genişletilebilir.
Introduction
Pürin nükleotidlerin metabolizmasının son ürünü olan ürik asit, gut, preeklampsi, böbrek hastalıkları, hipertansiyon, kardiyovasküler hastalıklar ve diyabet gibi hastalıkların tanısında kan serumu ve idrarda önemli bir biyobelirteçtir 1,2,3,4,5. Ürik asit tespiti için mevcut yöntemler arasında kolorimetrik enzimatik testler, yüksek performanslı sıvı kromatografisi ve kılcal elektroforez bulunmaktadır ve bunlar zaman alıcı, pahalı ve sofistike numune hazırlamagerektirir 6,7,8,9.
Yüzey ile geliştirilmiş Raman spektroskopisi, titreşim parmak izleri aracılığıyla biyomoleküllerin seçici tespitine izin verdiği ve yüksek hassasiyet, hızlı tepki, kullanım kolaylığı ve hiç veya minimum numune hazırlama gibi sayısız avantaj sunduğu için rutin bakım noktası teşhisi için umut verici bir tekniktir. Asil metal nanopartiküllere (örneğin, Au NP'ler) dayanan SERS substratları, yüzey plazmon rezonansı 11'in neden olduğu güçlü elektromanyetik iyileştirme yoluyla analit moleküllerinin Raman sinyallerini 4 ila10 büyüklük10 sırasına kadar artırabilir. Özel boyutlardaki Au NP'ler, karmaşık metal nanokompozitlerin zaman alıcı üretiminin aksine kolayca sentezlenebilir12 ve bu nedenle üstün özellikleri nedeniyle biyomedikal uygulamalarda yaygın olarak kullanılır13,14,15,16. Makrosiklik moleküllerin, cucurbit[n]urillerin (CB n, burada n = 5-8 , 10), Au NP'lerin yüzeyine bağlanması, yüksek simetrik ve sert CB molekülleri Au NP'ler arasındaki hassas aralığı kontrol edebildiğinden ve ana konakçı-misafir komplekslerinin oluşumu yoluyla merkezde veya plazmonik sıcak noktalara yakın yerlerde analize edebildiğinden, analit moleküllerinin SERS sinyallerini daha da artırabilir (Şekil 1)17, 18,19,20. Au NP: CBn nanoagregaları kullanan SERS çalışmalarının önceki örnekleri arasında nitropatlayıcılar, polisiklik aromatikler, diaminostilben, nörotransmiterler ve kreatinin21,22,23,24,25 bulunur ve SERS ölçümleri ya bir küvette ya da özel yapım bir numune tutucuya küçük bir damlacık yüklenerek gerçekleştirilir. Bu algılama şeması, yüksek tekrarlanabilirliğe sahip karmaşık bir matristeki biyobelirteçleri hızlı bir şekilde ölçmek için özellikle yararlıdır.
Burada, CB7'nin konakçı-misafir komplekslerini ve önemli bir biyobelirteç UA'yı oluşturmak ve sulu ortamda CB7 aracılı Au NP agregasyonları yoluyla 0.2 μM'lik bir tespit limiti ile UA'yı ölçmek için kolay bir yöntem, tanısal ve klinik uygulamalar için umut verici olan modüler bir spektrometre kullanılarak gösterilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Au NP'lerin Sentezi
- Au tohumlarının geleneksel Turkevich yöntemi ile sentezi26
- 98.5 mg HAuCl 4· çözerek 10 mL 25 mM HAuCl4 çözeltisi hazırlayın 3H2O bir cam şişede 10 mL deiyonize su içeren öncül.
NOT: Az miktarda HAuCl 4 öncüsünü bir tartım teknesine aktarın ve kristalleri tartmak için metalik spatula yerine plastik bir spatula kullanın, çünkü HAuCl4 öncüsü metal laboratuvar gereçlerini aşındıracaktır. HAuCl4 higroskopik olduğundan ve bu nedenle atmosferden su emerek zamanla ağırlığını artıracağından tartım adımı mümkün olduğunca hızlı bir şekilde gerçekleştirilmelidir. HAuCl4 oldukça aşındırıcıdır ve ciddi cilt yanıklarına ve göz hasarına neden olabilir. Kullanırken ekstra özen gösterin. - Bir cam şişede 0.5 mL deiyonize su ile 64.5 mg sodyum sitrat tozunu çözerek 0.5 mL 500 mM sodyum sitrat çözeltisi hazırlayın.
- 100 mL 0,25 mM HAuCl 4 çözeltisi vermek için 25 mM HAuCl4 çözeltisinin 1 mL'sini 250 mL mavi kapaklı bir şişede 99 mL su ile seyreltin.
- 0,25 mM HAuCl 4 çözeltisinin 99,5 mL'sini, bir kondenserle donatılmış 250 mL'lik üç boyunlu yuvarlak tabanlı bir şişeye ekleyin. Çözeltiyi kuvvetli bir şekilde karıştırarak 90 ° C'ye ısıtın ve sıcaklığı 15 dakika boyunca koruyun.
- 500 mM sodyum sitrat çözeltisinin 0,5 mL'sini reaksiyon karışımına enjekte edin ve çözeltinin rengi yakut kırmızısına dönene kadar sıcaklığı ve karıştırmayı koruyun.
NOT: Reaksiyon yaklaşık 30 dakika sürer.
- 98.5 mg HAuCl 4· çözerek 10 mL 25 mM HAuCl4 çözeltisi hazırlayın 3H2O bir cam şişede 10 mL deiyonize su içeren öncül.
- Kinetik olarak kontrol edilen yöntemle Au NP'lerin tohumlanmış büyümesi13
- Sentezlenmiş Au tohumu çözeltisini 70 °C'ye soğutun.
- Bir cam şişede 10 mL deiyonize su ile 154.8 mg sodyum sitrat tozu çözerek 10 mL 60 mM sodyum sitrat çözeltisi hazırlayın.
- 25 mM HAuCl4 çözeltisinin 0,67 mL'sini ve 60 mM sodyum sitrat çözeltisinin 0,67 mL'sini 2 dakikalık bir zaman aralığıyla Au tohumlarına enjekte edin.
- Au NP'lerin boyutunu kademeli olarak 40 nm'ye çıkarmak için adım 1.2.3'ü tekrarlayın.
NOT: 40 nm'ye ulaşmak için yaklaşık 10 büyüme adımı gerekir. Gerekli gerçek adım sayısı, kesin kuruluma bağlı olabilir.
- Otomatik sentezleyici kullanılarak Au NP'lerin tohumlanmış büyümesi (Şekil 2)
- Bölüm 1'de hazırlanan Au tohumu çözeltisinin 25 mL'sini 50 mL'lik bir konik santrifüj tüpüne aktarın ve bir termomikserde 70 °C'ye soğutun.
NOT: 25 mL su içeren 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirilmiş bir termokupl termometre kullanarak termomikserin içindeki sıcaklığı izleyin. - 3 mL Luer kilitli tek kullanımlık şırıngayı 2,5 mL 25 mM HAuCl4 çözeltisi ile doldurun. Başka bir 3 mL Luer kilit tek kullanımlık şırıngayı 2,5 mL 60 mM sodyum sitrat çözeltisi ile doldurun.
- Şırıngaları şırınga pompalarına yerleştirin ve PEEK borusunu (150 μm iç çap) şırıngalara bağlamak için Luer-to-MicroTight adaptörlerini kullanın. Boruyu, termomikserdeki Au tohumu çözeltisini içeren santrifüj tüpüne yerleştirin.
- Her iki şırınga pompasını da 20 dakika boyunca (dakikada 8,357 μL) 0,1675 mL çözelti dağıtacak şekilde ayarlayın.
- Termomikser dönüş hızını 700 rpm'ye ayarlayın ve 25 mM HAuCl 4 çözeltisini içeren şırınga pompasındaBaşlat'a basın.
- 2 dakika sonra, 60 mM sodyum sitrat çözeltisini içeren şırınga pompasında Başlat'a basın.
- HAuCl4 çözeltisi enjeksiyonuna başladıktan 30 dakika sonra, analiz için Au NP çözeltisinin bir aliquot'unu çıkarın.
- Au NP'lerin çapını kademeli olarak 40 nm'ye çıkarmak için 1.3.5 – 1.3.7 arasındaki adımları tekrarlayın.
NOT: Bu kurulum, adım 1.3.4'te eklenen reaktanların hacmini artırarak Au NP'leri bir adımda 40 nm'ye kadar büyütmek için kullanılabilir. Bu, aynı enjeksiyon oranını korurken dağıtım süresini artırarak elde edilir.
- Bölüm 1'de hazırlanan Au tohumu çözeltisinin 25 mL'sini 50 mL'lik bir konik santrifüj tüpüne aktarın ve bir termomikserde 70 °C'ye soğutun.
2. Au NP'lerin Karakterizasyonu
- UV-Vis spektroskopisi
- Yarı mikro kuvars küvete 1 mL Au NP çözeltisi ekleyin.
- Spektrometreyi açın.
- Dalga boyu aralığını 400 - 800 nm olarak ayarlayın.
- Her numune için UV-Vis spektrumunu edinin.
- Dinamik ışık saçılımı (DLS)
- Numune çözeltisini 0,22 μm filtreli plastik bir yarı mikro küvete filtreleyin.
- DLS cihazını açın.
- Sıcaklığı 25 ° C'ye ayarlayın ve 60 s için dengeleyin.
- Her numunenin hidrodinamik boyutunu ölçün.
- Transmisyon elektron mikroskobu (TEM)
- Numune çözeltisinin 5 μL'lik bir damlacığını C kaplı 300 mesh Cu ızgaraya damlatın ve havada kurutun.
NOT: Bir TEM ızgarasında iyi dağılmış Au NP'ler elde etmek üzere daha konsantre Au NP çözelti numuneleri için seyreltme gereklidir. - 200 kV hızlanma voltajında bir TEM kullanarak her numune için birden fazla TEM görüntüsü elde edin.
- Ortalama boyutu ve standart sapmayı hesaplamak için ImageJ kullanarak her numune için 200 Au NP çapını ölçün.
- Numune çözeltisinin 5 μL'lik bir damlacığını C kaplı 300 mesh Cu ızgaraya damlatın ve havada kurutun.
3. CB7-UA komplekslerinin oluşumu
- 0,4 mM CB7 çözeltisinin hazırlanması
- 15 mL'lik bir cam şişeye 4.65 mg CB7 ekleyin.
NOT: CB7 miktarı, literatürdeki çoğu raporda kullanılan CB7'nin (= 1163 Da) formül ağırlığına göre hesaplanır. Bununla birlikte, CB7 katı numuneleri tipik olarak sentez ve saflaştırma adımlarından kalan su, HCl, metanol ve diğer tuzları içerir ve numunede ~% 10 – 20 ölü ağırlığa katkıda bulunur. Sıkışmış çözücüler ve tuzlar, vakumlu fırında veya başka yollarla ısıtılarak uzaklaştırılamadı. Miktarları farklı numune partileri arasında değişir, ancak element analizi kullanılarak ölçülebilir. Bununla birlikte, sunulan protokol, CB7 numunelerinde ölçülmemiş miktarda çözücü ve tuz varlığına duyarlı değildir. - Şişeye 10 mL su ekleyin ve kapağı sıkın.
- CB7 katı tamamen çözünene kadar numuneyi oda sıcaklığında sonikleştirin.
NOT: CB7, literatür27'ye göre sentezlenmiştir, ancak ticari olarak da temin edilebilir.
- 15 mL'lik bir cam şişeye 4.65 mg CB7 ekleyin.
- 0,4 mM UA çözeltisinin hazırlanması
- 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne 2.69 mg UA ekleyin.
- Tüpe 40 mL su ekleyin ve kapağı sıkın.
- Sıcaklığı 70 °C'ye, hızı 800 rpm'ye ve zamanı 2 saate ayarlayarak numune çözeltisini döndürmek için bir termomikser kullanın. Çözeltinin oda sıcaklığına soğumasını bekleyin.
NOT: UA suda düşük çözünürlüğe sahiptir (0,40 mM)5. UA tozu tamamen çözülmemişse daha uzun süre girdap. Alternatif olarak, ultrasonication çözünmeyi kolaylaştırmak için kullanılabilir.
- 0,4 mM UA çözeltisinin sıralı seyreltmeleri
- 10 mL 0,2 mM UA çözeltisi vermek için 0,4 mM UA çözeltisinin 5 mL'sini 15 mL'lik bir cam şişede 5 mL su ile seyreltin. Kapağı sıkın ve 30 s boyunca sonikasyon yapın.
- Tablo 1'de açıklandığı gibi uygun miktarda UA ve su kullanarak adım 3.3.1'i yineleyin.
- CB7-UA komplekslerinin hazırlanması
- 1,5 mL'lik bir tüpe 0,4 mM CB7 çözeltisinin 0,75 mL'sini ve 0,75 mL'lik 0,4 mM UA çözeltisinin 0,75 mL'sini ekleyin. Kapağı sabitleyin ve 30 s boyunca sonikat yapın.
- Ev sahibi-misafir komplekslerinin oluşumunu sağlamak için 30 dakika bekleyin.
- Farklı konsantrasyonlarda UA çözeltisi kullanarak adım 3.4.1 - 3.4.2'yi tekrarlayın.
4. UA'nın SERS algılaması
- Raman sisteminin deneysel kurulumu (Şekil 3)
- 633 nm He-Ne lazeri (22,5 mW) açın.
- Modüler Raman spektrometresini açın.
- Bilgisayarı açın ve yazılımı başlatın.
- Spektroskopi Uygulama Sihirbazı Simgesi'ne tıklayın ve ardından Raman'ı seçin.
- Yeni bir satın alma işlemi başlatın. Entegrasyon süresini 30 sn'ye, taramaları ortalama 5 sn'ye ve boxcar'ı 0'a ayarlayın.
- Arka plan spektrumunu saklayın ve lazer dalga boyunu girin (yani, 633 nm).
NOT: Entegrasyon süresi her taramanın süresidir, ortalamaya göre taramalar her spektrumu oluşturmak için ortalama tarama sayısıdır ve boxcar ortalama28 komşu piksel sayısıdır.
- SERS substratlarının oluşumu
- 1,5 mL'lik bir tüpe 40 nm Au NP çözeltisinin 0,9 mL'sini ve önceden oluşturulmuş CB7-UA kompleks çözeltisinin 0,1 mL'sini ekleyin. Kapağı sabitleyin ve çözelti yakut kırmızısından mora değişene kadar sonikat yapın.
NOT: Ticari sitrat stabilize 40 nm Au NP çözelti numuneleri de kullanılabilir. Tipik olarak, lokalize yüzey plazmon rezonans (LSPR) zirvesinin optik yoğunluğu, konsantre stok çözeltisi numunelerinden seyreltme yoluyla 1'e ayarlanır. Numunedeki sitrat konsantrasyonu tipik olarak 2 mM olarak tutulur. - Numune çözeltisini yarı mikro bir küvete aktarın. Küveti Raman numune tutucusuna yerleştirin ve kapağı kapatın.
- Ölçümü başlatın.
- Beş ardışık SERS spektrumunu kaydetmek için otomatik kaydetmeyi ayarlayın.
- Ölçümü durdurun ve numuneyi değiştirin.
- Farklı konsantrasyonlarda CB7-UA çözeltisi kullanarak adım 4.2.1 - 4.2.5'i tekrarlayın.
NOT: Toplama süresinin, Au NP'lerin toplanmasına aracılık etmeye büyük katkısı olan boş CB7 konsantrasyonundaki fark nedeniyle, 0.1 μM UA için 30 s ile 20 μM UA için 30 dakika arasında değişen nanoagregalardaki UA konsantrasyonuna bağlı olduğu bulunmuştur. CB7-UA kompleksi için, bir portal hacimli UA molekülü tarafından bloke edilir, bu da onu Au NP yüzeyine bağlanmak için kullanılamaz hale getirir ve bu nedenle NP agregasyonu21'e aracılık edemez. Çözeltinin rengi yakut kırmızısından mora değiştiğinde numune ölçüm için hazırdır.
- 1,5 mL'lik bir tüpe 40 nm Au NP çözeltisinin 0,9 mL'sini ve önceden oluşturulmuş CB7-UA kompleks çözeltisinin 0,1 mL'sini ekleyin. Kapağı sabitleyin ve çözelti yakut kırmızısından mora değişene kadar sonikat yapın.
5. Veri analizi
- Bilgi işlem
- Asimetrik en küçük kareler (ALS) eklentisine sahip taban çizgisini indirin ve Origin'e yükleyin.
NOT: ALS eklentisi OriginPro gerektirir. - Ham verileri Origin'e ekleyin.
- Her numunenin beş SERS spektrumundan ortalama bir değer hesaplayın. Değeri lazerin gücüne (yani 22,5 mW) ve entegrasyon süresine (yani 30 sn) bölün.
- İletişim kutusunu açmak için ALS simgesine tıklayın. Her ortalama spektrumun taban çizgisini düzeltmek için asimetrik faktörü 0,001'e, eşiği %0,03'e, yumuşatma faktörünü 2'ye ve yineleme sayısını 20'ye ayarlayın.
- Farklı UA konsantrasyonlarının SERS spektrumlarını, y ofsetleri ile istiflenmiş çizgiler kullanarak çizin. Çıkış, Raman kaymasına (cm-1) karşı yoğunluk (s-1 mW-1 s-1 sayılır) olmalıdır.
- Asimetrik en küçük kareler (ALS) eklentisine sahip taban çizgisini indirin ve Origin'e yükleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sunulan Au NP sentezinde, UV-Vis spektrumları, 10 büyüme adımından sonra LSPR zirvelerinin 521 nm'den 529 nm'ye kaydığını gösterirken (Şekil 4 A, B), DLS verileri, Au NP'lerin boyutu 25.9 nm'den 42.8 nm'ye yükseldikçe dar bir boyut dağılımı göstermektedir (Şekil 4C, D). TEM görüntülerinden ölçülen G0, G5 ve G10'un ortalama boyutları (Şekil 4E) sırasıyla 20.1 ± 2.1 nm, 32.5 ± 2.3 nm ve 40.0 ± 2.2 nm'dir ve her durumda 200 parçacık sayılmaktadır. Bu sonuçlar, bu protokolün tekdüze ve dar dağılmış Au NP'lerin sentezlenmesinde etkili olduğunu göstermektedir.
Sunulan SERS çalışmalarında, CB7 ve UA'nın konakçı-konuk kompleksleri, SERS spektrumundaki karakteristik UA sinyalleri tarafından desteklendiği gibi, Au NP: CB7 nanoagregaları içinde hassas plazmonik nanokavşakların oluşumuna aracılık eden boş CB7 ile oluşturulmuştur (Şekil 5A).
CB (+ ile işaretlenmiş) ve UA (*) Raman zirveleri için atamalar Tablo 2'de gösterilmiştir. Tersine, CB7'nin yokluğunda UA'nın hiçbir SERS sinyali gözlenemez, bu da CB7'nin Au NP'lerin toplanmasını tetiklemedeki kilit rolünü gösterir.
UA'nın SERS titrasyonunda, tekrarlanabilir plazmonik nanoyapıların (yani SERS substratlarının) yerinde oluşumunu sağlamak için 20 μM'lik sabit bir CB7 konsantrasyonu kullanılmıştır. Bu protokolde sunulan algılama şemasının yüksek hassasiyeti, UA zirvelerinden gelen net SERS sinyallerinin 640 cm-1 ve 1130 cm-1'de (sırasıyla iskelet halkası deformasyonuna ve C-N titreşimine atfedilir) ~0.2 μM'ye (Şekil 5B-D) kadar gözlemlenmesiyle gösterilmiştir. Ek olarak, SERS yoğunluğu ve UA'nın log konsantrasyonu arasındaki çok güçlü korelasyonlar (R 2 > 0.98), her iki tepe için de güç yasası ile elde edildi ve doğrusal bölgeler 0.2 ila 2 μM aralığında bulundu (Şekil 5E, F). SERS yoğunluğu ve log konsantrasyonu arasındaki doğrusal korelasyonların dar bir analit konsantrasyonu aralığı için yaklaşılabileceği, oysa verilerimizde gözlemlendiği gibi, log konsantrasyonu negatif sonsuzluğa yaklaştığında (yani, analit konsantrasyonu 0'a yaklaştığında) SERS sinyalinin 0'a yaklaştığı belirtilmelidir. SERS sinyalleri, Şekil 5E, F'de gösterilen küçük hata çubuklarının kanıtladığı gibi yüksek oranda tekrarlanabilir.
Şekil 1: Kendi kendine monte edilmiş Au NP: CB7 nanoagregaları içindeki hassas plazmonik nanokavşakların şematik gösterimi. Inset, agregasyonun boş CB7 tarafından aracılık edildiği plazmonik nanokavşakların yakınlaştırılmasını gösterirken, UA, konakçı-konuk kompleksi yoluyla Au NP'lerin yüzeyinde zenginleştirilir. Şemanın ölçeğe çizilmediği belirtilmektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: (a) Şematik illüstrasyon ve (b) otomatik Au NP sentezleyicinin fotoğrafı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Raman sisteminin şematik gösterimi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Au NP'lerin temsili karakterizasyonu. (A) Au NP'lerin UV-Vis spektrumları ve (B) büyüyen adımların sayısı 10'a yükseldikçe LSPR zirvelerinin kaymasını gösteren yakınlaştırma spektrumları. (C) Au NP'lerin hidrodinamik boyutu ve (D) büyüyen adımların sayısının bir fonksiyonu olarak parçacık boyutunun karşılık gelen grafiği. (E) 5 ve 10 büyüme adımından sonra Au tohumlarının ve Au NP'lerin boyutlarını gösteren Au NP'lerin TEM görüntüleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Au NP: CB7 nanoagregaları içindeki UA tespitinin temsili SERS sonuçları. (A) CB7'nin varlığında veya yokluğunda UA'nın SERS spektrumları. CB7 ve UA'nın Raman zirveleri sırasıyla + ve * ile işaretlenmiştir. (B) Tam aralıklı, (C) 600 - 700 cm-1 yakınlaştırma ve (D) 1100 - 1180 cm-1 yakınlaştırmalı SERS spektrumları 0 ila 20 μM konsantrasyonlarında UA. UA'nın ana Raman zirveleri * ile işaretlenmiştir. Spektrumlar taban çizgisi düzeltildi ve netlik için ofset edildi. (E,F) UA konsantrasyonuna karşı SERS tepe yoğunluğunun karşılık gelen grafikleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| UA stok çözeltisi (μM) | UA stok çözümünün hacmi eklendi (mL) | Eklenen suyun hacmi (mL) | Yeni UA stok çözümü (μM) |
| 400 | 5 | 5 | 200 |
| 200 | 5 | 5 | 100 |
| 100 | 4 | 6 | 40 |
| 40 | 5 | 5 | 20 |
| 20 | 5 | 5 | 10 |
| 10 | 4 | 6 | 4 |
| 4 | 5 | 5 | 2 |
Tablo 1: UA çözeltisinin sıralı seyreltmeleri.
| CB7 Serisi | UA | ||
| SERS tepe noktası (cm-1) | En yüksek atama | SERS tepe noktası (cm-1) | En yüksek atama |
| 446 | Halka makas modu | 491 | C-N-C halka titreşimi |
| 831 | Halka deformasyonu | 640 | İskelet halkası deformasyonu |
| 1375 | Simetrik C-N germe | 896 | N-H bükme |
| 1420 | Asimetrik C-N germe | 1020 | Halka titreşimi |
| - | - | 1130 | C-N titreşimi |
| - | - | 1202 | N-C-C germe ve bükme |
Tablo 2: CB7 ve UA 2,4,29'un Raman zirveleri için atamalar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokolde açıklanan otomatik sentez yöntemi, artan boyutlardaki Au NP'lerin tekrarlanabilir şekilde sentezlenmesini sağlar. Tohum sentezi sırasında hızlı bir şekilde sodyum sitrat ilavesi ve PEEK borusunun güvenli olduğundan emin olmak için periyodik olarak kontrol edilmesi gibi hala manuel olarak yapılması gereken bazı elementler olmasına rağmen, bu yöntem genellikle HAuCl4 ve sodyum sitratın birden fazla manuel enjeksiyonunu gerektiren büyük boyutlarda (40 nm'ye kadar) Au NP'lere izin verir. uzun bir süre boyunca sürekli toplama yoluyla sentezlenebilir.
CB komplekslerinin temel özelliğini aydınlatmak için daha fazla karakterizasyon yapılabilir. Örneğin, ev sahibi-misafir komplekslerinin oluşumu tipik olarak 1H nükleer manyetik rezonans (NMR) kullanılarak doğrulanabilir, bu da21,22,25 kompleksleşmesi durumunda yukarı doğru kayma ve sinyallerin genişlemesini göstermelidir. Yine de 1H NMR, değiştirilemeyen protonların eksikliği nedeniyle UA için geçerli değildir. Kompleksleşmeyi karakterize etmek için 13C NMR ve kütle spektrometresi gibi alternatif teknikler de kullanılabilir. CB7 ve UA arasındaki bağlanma sabitleri, UV-Vis spektroskopisi titrasyonu ve izotermal titrasyon kalorimetrisi (ITC)21,22,25 gibi titrasyon teknikleri kullanılarak ölçülebilir. Bu arada, kuvvet-alan ve yoğunluk fonksiyonel teorisi (DFT) modellerine dayanan moleküler modelleme, konakçı-misafir komplekslerinin bağlanma geometrisi hakkında teorik bilgiler elde etmek için hesaplanabilir21,22,25,29. Ayrıca IR ve Raman spektrumları21,25,29 frekans hesaplamaları ile hesaplanabilir.
SERS, iz analitlerin moleküle özgü titreşimsel parmak izleri aracılığıyla tanımlanmasını sağlayan oldukça hassas ve seçici bir analitik tekniktir. SERS büyük ölçüde geliştirilmiş sinyalleri, çok daha kısa edinim süresi ve sıvı suya karşı yüksek toleransı (biyoakışkanlarda algılama için uygun) nedeniyle farklı bilim disiplinlerinde, özellikle biyomedikal çalışmalarda ilgi çekmektedir30,31,32,33,34,35. UA algılama 1,2,3,4,36,37 ile ilgili önceki raporların aksine, CB7'nin sert yapısı, karbonil portal bağlama yoluyla Au NP'ler arasında 0,9 nm'lik hassas aralığı tanımlarken, yüzeye bağlı CB7, UA moleküllerini boşluğunda yakalayabilir (Şekil 1 ), güçlü ve lokalize plazmonik sıcak noktalara ve dolayısıyla SERS yoğunluğu ile log konsantrasyonu arasında çok güçlü korelasyonlara (R 2 > 0.98) sahip UA'nın yüksek derecede hassas (~ 0.2μM'ye kadar) ve tekrarlanabilir (% 2 hata içinde) SERS sinyalleri ile sonuçlanır (Şekil 5).
CB7 konsantrasyonunu optimize etmek amacıyla, tekrarlanabilir SERS substratlarının oluşumunu sağlamak için 20 μM CB7'nin kullanıldığını not ediyoruz. Özellikle, kullanılan CB7'nin mutlak konsantrasyonu genel sisteme bağlıdır (yani, Au NP'ler, analitler ve varsa arka plan molekülleri)18,22. Au NP'lerin toplanması çok yavaşsa, daha yüksek bir CB7 konsantrasyonu kullanılmalıdır. Tersine, numune çözeltisi hızlı bir şekilde çökelirse ve daha kısa ölçüm pencerelerine yol açarsa, daha düşük bir CB7 konsantrasyonu kullanılmalıdır. CB7'nin aracılık ettiği Au NP'lerin deneysel ortamımızda toplanmasının, açık ve uzatılmış zincir benzeri yapıların başlangıçta yarı-fraktal ağ olarak bir araya gelmeden önce hızla oluştuğu difüzyon sınırlı kolloidal agregasyon (DLCA) kinetiği19'u takip etmesi beklenmektedir. DLCA kinetiği tipik olarak yüksek bir CB: Au NP oranında (sayıya göre) meydana gelir, bu da bizim durumumuzda 106: 1'e eşittir. Ürik asidin vücut sıvılarında (örneğin, kan serumu, idrar) daha yüksek bir konsantrasyonda bulunduğuna dikkat edilmelidir. Örneğin, normal ürik asit konsantrasyonu kan serumu38'de 3.5 – 7.0 mg / dL ve idrarda sırasıyla 16 – 100 mg / dL'dir2 (normal konsantrasyonun üstünde veya altında konsantrasyon hiperürisemi ve hipoürisemi olarak bilinir)39. Bu nedenle, numunenin konsantrasyonunu uygun bir aralığa düşürmek için yüksek bir seyreltme faktörünün kullanıldığı bu son derece hassas şemada biyobelirteç tespiti için sadece çok az miktarda numuneye ihtiyaç vardır. Bu, idrar atılımı çok düşük olan ölümcül hastaların bakım noktası izlemesi için özellikle önemlidir. Yüksek oranda seyreltilmiş numuneler, daha büyük numune hacimlerine neden olur ve böylece su buharlaşması nedeniyle biyobelirteçlerin miktarındaki hataları ve sıvı transferine bağlı numune kaybını azaltırken, matris etkilerini en aza indirmek de dahil olmak üzere diğer avantajlar sağlar25. Bu sondalama yönteminin seçici doğası nedeniyle, CB ile konakçı-konuk kompleksleri oluşturabilen analit molekülleri ile sınırlıdır. CB farklı konuk moleküllere bağlanabildiği için diğer moleküllerden gelen girişimleri gözlemlemenin mümkün olduğu belirtilmelidir. Bununla birlikte, SERS ölçümünden önce jel elektroforezi ve HPLC gibi numune saflaştırma yapılabilir.
Bu protokolde gösterilen tespit şeması, gelişmiş veri analizi tekniklerine bağlandığında, klinik uygulamalar için karmaşık bir matriste biyobelirteçlerin çoklanmış tespiti potansiyeline sahiptir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
TCL, Royal Society Research Grant 2016 R1 (RG150551) ve EPSRC (EP/P511262/1) tarafından Kurumsal Sponsorluk ödülü ile finanse edilen UCL BEAMS Geleceğin Lideri Ödülü'nün desteğine minnettardır. WIKC, TCL ve IPP, EPSRC M3S CDT (EP / L015862 / 1) aracılığıyla A*STAR-UCL Araştırma Ek Programı tarafından finanse edilen Öğrenciliğe minnettardır. GD ve TJ, EPSRC M3S CDT'YE (EP/L015862/1) öğrenciliklerine sponsor oldukları için teşekkür eder. TJ ve TCL, Camtech Innovations'ı TJ'nin öğrenciliğine katkılarından dolayı takdir eder. Tüm yazarlar UCL Açık Erişim Fonu'na minnettardır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40 nm gold nanoparticles | NanoComposix | AUCN40-100M | NanoXact, 0.05 mg/ mL, bare (citrate) |
| Centrifuge tube | Corning Falcon | 14-432-22 | 50 mL volume |
| Cucurbit[7]uril | Lab-made | see ref. 19 | |
| Gold(III) chloride trihydrate | Sigma aldrich | 520918 | ≥99.9% trace metals basis |
| Luer lock disposable syringe | Cole-Parmer | WZ-07945-15 | 3 mL volume |
| Luer-to-MicroTight adapter | LuerTight | P-662 | 360 μm outer diameter Tubing to Luer Syringe |
| PEEK tubing | IDEX | 1572 | 360 μm outer diameter, 150 μm inner diameter |
| PEEK tubing cutter | IDEX | WZ-02013-30 | Capillary Polymer Chromatography Tubing Cutter For 360 µm to 1/32" OD tubing |
| Raman spectrometer | Ocean Optics | QE pro | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma aldrich | S4641 | ACS reagent, ≥99.0% |
| Sonicator | |||
| Standard Probe | Digi-Sense | WZ-08516-55 | Type-K |
| Syringe pump | Aladdin | ALADDIN2-220 | 2 syringes, maximum syringe volume 60 mL |
| Thermocouple thermometer | Digi-Sense | WZ-20250-91 | Single-Input Thermocouple Thermometer with NIST-Traceable Calibration |
| ThermoMixer | Eppendorf | 5382000031 | With an Eppendorf SmartBlock for 50 mL tubes |
| Uric acid | Sigma aldrich | U2625 | ≥99%, crystalline |
References
- Villa, J. E. L., Poppi, R. J. A portable SERS method for the determination of uric acid using a paper-based substrate and multivariate curve resolution. Analyst. 141 (6), 1966-1972 (2016).
- Westley, C., et al. Absolute Quantification of Uric Acid in Human Urine Using Surface Enhanced Raman Scattering with the Standard Addition Method. Analytical Chemistry. 89 (4), 2472-2477 (2017).
- Zhao, L., Blackburn, J., Brosseau, C. L. Quantitative Detection of Uric Acid by Electrochemical-Surface Enhanced Raman Spectroscopy Using a Multilayered Au/Ag Substrate. Analytical Chemistry. 87 (1), 441-447 (2015).
- Goodall, B. L., Robinson, A. M., Brosseau, C. L. Electrochemical-surface enhanced Raman spectroscopy (E-SERS) of uric acid: a potential rapid diagnostic method for early preeclampsia detection. Physical Chemistry Chemical Physics. 15 (5), 1382-1388 (2013).
- Lytvyn, Y., Perkins, B. A., Cherney, D. Z. I. Uric Acid as a Biomarker and a Therapeutic Target in Diabetes. Canadian Journal of Diabetes. 39 (3), 239-246 (2015).
- Ali, S. M. U., Ibupoto, Z. H., Kashif, M., Hashim, U., Willander, M. A Potentiometric Indirect Uric Acid Sensor Based on ZnO Nanoflakes and Immobilized Uricase. Sensors. 12 (3), 2787-2797 (2012).
- Yu, J., Wang, S., Ge, L., Ge, S. A novel chemiluminescence paper microfluidic biosensor based on enzymatic reaction for uric acid determination. Biosensors and Bioelectronics. 26 (7), 3284-3289 (2011).
- Yang, Y. D. Simultaneous determination of creatine, uric acid, creatinine and hippuric acid in urine by high performance liquid chromatography. Biomedical Chromatography. 12 (2), 47-49 (1999).
- Zhao, S., Wang, J., Ye, F., Liu, Y. M. Determination of uric acid in human urine and serum by capillary electrophoresis with chemiluminescence detection. Analytical Biochemistry. 378 (2), 127-131 (2008).
- Fang, Y., Seong, N. H., Dlott, D. D. Measurement of the Distribution of Site Enhancements in Surface-Enhanced Raman Scattering. Science. 321 (5887), 388-392 (2008).
- Jeong, H. H., et al. Dispersion and shape engineered plasmonic nanosensors. Nature Communications. 7, 11331 (2016).
- Alula, M. T., et al. Preparation of silver nanoparticles coated ZnO/Fe3O4 composites using chemical reduction method for sensitive detection of uric acid via surface-enhanced Raman spectroscopy. Analytica Chimica Acta. 1073, 62-71 (2019).
- Bastús, N. G., Comenge, J., Puntes, V. Kinetically Controlled Seeded Growth Synthesis of Citrate-Stabilized Gold Nanoparticles of up to 200 nm: Size Focusing versus Ostwald Ripening. Langmuir. 27 (17), 11098-11105 (2011).
- Jeong, H. H., et al. Selectable Nanopattern Arrays for Nanolithographic Imprint and Etch-Mask Applications. Advanced Science. 2 (7), 1500016 (2016).
- Loh, X. J., Lee, T. C., Dou, Q., Deen, G. R. Utilising inorganic nanocarriers for gene delivery. Biomaterials Science. 4 (1), 70-86 (2016).
- Celiz, A. D., Lee, T. C., Scherman, O. A. Polymer-Mediated Dispersion of Gold Nanoparticles: Using Supramolecular Moieties on the Periphery. Advanced Materials. 21 (38), 3937-3940 (2009).
- Lee, T. C., Scherman, O. A. Formation of Dynamic Aggregates in Water by Cucurbit[5]uril Capped with Gold Nanoparticles. ChemComm. 46 (14), 2438-2440 (2010).
- Lee, T. C., Scherman, O. A. A Facile Synthesis of Dynamic Supramolecular Aggregates of Cucurbit[n]uril (n = 5-8) Capped with Gold Nanoparticles in Aqueous Media. Chemistry-A European Journal. 18 (6), 1628-1633 (2012).
- Taylor, R. W., et al. Precise Subnanometer Plasmonic Junctions for SERS within Gold Nano- particle Assemblies Using Cucurbit[n]uril "Glue". ACS Nano. 5 (5), 3878-3887 (2011).
- Peveler, W. J., et al. Cucurbituril-mediated quantum dot aggregates formed by aqueous self-assembly for sensing applications. ChemComm. 55 (38), 5495-5498 (2019).
- Chio, W. I. K., et al. Selective Detection of Nitroexplosives Using Molecular Recognition within Self-Assembled Plasmonic Nanojunctions. The Journal of Physical Chemistry C. 123 (25), 15769-15776 (2019).
- Kasera, S., Biedermann, F., Baumberg, J. J., Scherman, O. A., Mahajan, S. Quantitative SERS Using the Sequestration of Small Molecules Inside Precise Plasmonic Nanoconstructs. Nano Letters. 12 (11), 5924-5928 (2012).
- Taylor, R. W., et al. In Situ SERS Monitoring of Photochemistry within a Nanojunction Reactor. Nano Letters. 13 (12), 5985-5990 (2013).
- Kasera, S., Herrmann, L. O., Barrio, J. d, Baumberg, J. J., Scherman, O. A. Quantitative Multiplexing with Nano-Self-Assemblies in SERS. Scientific Reports. 4, 6785 (2014).
- Chio, W. I. K., et al. Dual-triggered nanoaggregates of cucurbit[7]uril and gold nanoparticles for multi-spectroscopic quantification of creatinine in urinalysis. Journal of Materials Chemistry C. 8, 7051-7058 (2020).
- Turkevich, J., Stevenson, P. C., Hillier, J. A study of the nucleation and growth processes in the synthesis of colloidal gold. Discussions of the Faraday Society. 11, 55-75 (1951).
- Lagona, J., Mukhopadhyay, P., Chakrabarti, S., Issacs, L. The cucurbit[n]uril family. Angewandte Chemie International Edition. 44 (31), 4844-4870 (2005).
- OceanView Installation and Operation Manual. , Available from: https://www.oceaninsight.com/globalassets/catalog-blocks-and-images/manuals--instruction-old-logo/software/oceanviewio.pdf (2013).
- Mahajan, S., et al. Raman and SERS spectroscopy of cucurbit[n]urils. Physical Chemistry Chemical Physics. 12 (35), 10429-10433 (2010).
- Langer, J., et al. Present and Future of Surface-Enhanced Raman Scattering. ACS Nano. 14 (1), 28-117 (2020).
- Pilot, R., et al. A Review on Surface-Enhanced Raman Scattering. Biosensors. 9 (2), 57 (2019).
- Bantz, K. C., et al. Recent progress in SERS biosensing. Physical Chemistry Chemical Physics. 13 (24), 11551-11567 (2011).
- Moore, T. J., et al. In Vitro and In Vivo SERS Biosensing for Disease Diagnosis. Biosensors. 8 (2), 46 (2018).
- Bonifacio, A., Cervo, S., Sergo, V. Label-free surface-enhanced Raman spectroscopy of biofluids: fundamental aspects and diagnostic applications. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (27), 8265-8277 (2015).
- Jeong, H. H., Choi, E., Ellis, E., Lee, T. C. Recent advances in gold nanoparticles for biomedical applications: from hybrid structures to multi-functionality. Journal of Materials Chemistry B. 7 (22), 3480-3496 (2019).
- Premasiri, W. R., Clarke, R. H., Womble, M. E. Urine Analysis by Laser Raman Spectroscopy. Lasers in Surgery and Medicine. 28 (4), 330-334 (2001).
- Lu, Y., et al. Superhydrophobic silver film as a SERS substrate for the detection of uric acid and creatinine. Biomedical Optics Express. 9 (10), 4988-4997 (2018).
- Feig, D. I., et al. Serum Uric Acid: A Risk Factor and a Target for Treatment. Journal of the American Society of Nephrology. 17 (4), 69-73 (2006).
- Maiuolo, J., Oppedisano, F., Gratteri, S., Muscoli, C., Mollace, V. Regulation of uric acid metabolism and excretion. International Journal of Cardiology. 213, 8-14 (2016).
![Altın Nanopartikülleri ve Cucurbit [<em>n</em>]uril Agregaları İçinde Hassas Plazmonik Nanokavşakların Oluşumu Yoluyla Ürik Asidin Kantitatif SERS Tespiti](https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/61682.jpg)
