Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Kvantitativ SERS-påvisning af urinsyre via dannelse af præcise plasmoniske nanojunktioner inden for aggregater af guldnanopartikler og cucurbit[n]uril

Published: October 3, 2020 doi: 10.3791/61682
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1,2
1Department of Chemistry, University College London (UCL), 2Institute for Materials Discovery, University College London (UCL)

Summary

Et værts-gæstekompleks af cucurbit[7]uril og urinsyre blev dannet i en vandig opløsning, før der blev tilført en lille mængde til Au NP-opløsning til kvantitativ overfladeforstærket Raman-spektroskopi (SERS) sensing ved hjælp af et modulært spektrometer.

Abstract

Dette arbejde beskriver en hurtig og meget følsom metode til kvantitativ påvisning af en vigtig biomarkør, urinsyre (UA), via overfladeforstærket Raman-spektroskopi (SERS) med en lav detektionsgrænse på ~ 0,2 μM for flere karakteristiske toppe i fingeraftryksområdet ved hjælp af et modulært spektrometer. Dette biosensing-skema formidles af værts-gæst-kompleksdannelsen mellem en makrocyklus, cucurbit[7]uril (CB7) og UA og den efterfølgende dannelse af præcise plasmoniske nanojunktioner inden for de selvmonterede Au NP: CB7 nanoaggregater. En let Au NP-syntese af ønskelige størrelser for SERS-substrater er også blevet udført baseret på den klassiske citratreduktionsmetode med en mulighed for at blive lettet ved hjælp af en laboratoriebygget automatiseret synthesizer. Denne protokol kan let udvides til multiplexeret påvisning af biomarkører i kropsvæsker til kliniske anvendelser.

Introduction

Urinsyre, som er slutproduktet af metabolisme af purinnukleotider, er en vigtig biomarkør i blodserum og urin til diagnosticering af sygdomme som gigt, præeklampsi, nyresygdomme, hypertension, hjerte-kar-sygdomme og diabetes 1,2,3,4,5. Nuværende metoder til detektion af urinsyre omfatter kolorimetriske enzymatiske assays, højtydende væskekromatografi og kapillær elektroforese, som er tidskrævende, dyre og kræver sofistikeret prøveforberedelse 6,7,8,9.

Overfladeforstærket Raman-spektroskopi er en lovende teknik til rutinemæssig point-of-care-diagnose, da den muliggør selektiv detektion af biomolekyler via deres vibrationsfingeraftryk og tilbyder adskillige fordele såsom høj følsomhed, hurtig respons, brugervenlighed og ingen eller minimal prøveforberedelse. SERS-substrater baseret på ædelmetalnanopartikler (f.eks. Au NP'er) kan forbedre Raman-signalerne fra analytmolekylerne med 4 til 10 størrelsesordener10 via stærk elektromagnetisk forbedring forårsaget af overfladeplasmonresonans11. Au NP'er i skræddersyede størrelser kan let syntetiseres i modsætning til den tidskrævende fremstilling af komplekse metalnanokompositter12 og anvendes således i vid udstrækning i biomedicinske applikationer på grund af deres overlegne egenskaber 13,14,15,16. Fastgørelse af makrocykliske molekyler, cucurbit[n]urils (CBn, hvor n = 5-8, 10), på overfladen af Au NP'er kan yderligere forbedre SERS-signalerne fra analytmolekylerne, da de meget symmetriske og stive CB-molekyler kan styre den præcise afstand mellem Au-IP'erne og lokalisere analytmolekylerne i midten eller i nærheden af de plasmoniske hotspots via dannelse af værts-gæstekomplekser (figur 1)17, 18,19,20. Tidligere eksempler på SERS-undersøgelser ved hjælp af Au NP: CBn nanoaggregater omfatter nitroexplosives, polycykliske aromater, diaminostilben, neurotransmittere og kreatinin 21,22,23,24,25, hvor SERS-målingerne enten udføres i en kuvette eller ved at lægge en lille dråbe på en specialfremstillet prøveholder. Denne detektionsordning er særlig nyttig til hurtigt at kvantificere biomarkører i en kompleks matrix med høj reproducerbarhed.

Heri blev en let metode til dannelse af værts-gæstekomplekser af CB7 og en vigtig biomarkør UA og til at kvantificere UA med en detektionsgrænse på 0,2 μM via CB7-medierede aggregeringer af Au NP'er i vandige medier demonstreret ved hjælp af et modulært spektrometer, hvilket er lovende til diagnostiske og kliniske anvendelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Syntese af Au NPs

  1. Syntese af Au frø via den konventionelle Turkevich metode26
    1. 10 ml 25 mM HAuCl4-opløsning fremstilles ved at opløse 98,5 mg HAuCl4· 3H2O-forløber med 10 ml deioniseret vand i et hætteglas af glas.
      BEMÆRK: Overfør en lille mængde HAuCl4-forløber til en vejebåd, og brug en plastikspatel i stedet for metalspatel til at veje krystallerne ud, fordi HAuCl4-forløberen korroderer metallabware. Vejningstrinnet bør udføres så hurtigt som muligt, da HAuCl4 er hygroskopisk og derfor vil øge sin vægt over tid ved at absorbere vand fra atmosfæren. HAuCl4 er stærkt ætsende og kan forårsage alvorlige hudforbrændinger og øjenskader. Vær ekstra forsigtig, når du håndterer det.
    2. Forbered 0,5 ml 500 mM natriumcitratopløsning ved at opløse 64,5 mg natriumcitratpulver med 0,5 ml deioniseret vand i et hætteglas af glas.
    3. Fortynd 1 ml af 25 mM HAuCl4-opløsningen med 99 ml vand i en 250 ml blåhættet flaske for at give 100 ml 0,25 mM HAuCl4-opløsning .
    4. 99,5 ml af 0,25 mM HAuCl4-opløsningen tilsættes i en 250 ml trehalset rundbundet kolbe udstyret med en kondensator. Opløsningen opvarmes til 90 °C under kraftig omrøring, og temperaturen holdes i 15 minutter.
    5. 0,5 ml af 500 mM natriumcitratopløsningen injiceres i reaktionsblandingen, og der opretholdes temperatur og omrøring, indtil opløsningens farve bliver rubinrød.
      BEMÆRK: Reaktionen tager ca. 30 min.
  2. Frøet vækst af Au NP'er via den kinetisk kontrollerede metode13
    1. Den assyntetiseret Au-frøopløsning afkøles til 70 °C.
    2. Forbered 10 ml 60 mM natriumcitratopløsning ved at opløse 154,8 mg natriumcitratpulver med 10 ml deioniseret vand i et hætteglas af glas.
    3. 0,67 ml af 25 mM HAuCl4-opløsningen og 0,67 ml af 60 mM natriumcitratopløsningen injiceres i Au-frøene med et tidsinterval på 2 minutter.
    4. Gentag trin 1.2.3 for gradvist at øge størrelsen på Au NPs til 40 nm.
      BEMÆRK: Det tager ca. 10 voksende trin at nå 40 nm. Det faktiske antal nødvendige trin kan afhænge af den præcise opsætning.
  3. Seedet vækst af Au NPs ved hjælp af automatiseret synthesizer (figur 2)
    1. 25 ml af Au-frøopløsningen fremstillet i punkt 1 overføres til et konisk centrifugerør på 50 ml og afkøles til 70 °C i en termomixer.
      BEMÆRK: Overvåg temperaturen inde i termomixeren ved hjælp af et termoelementtermometer anbragt i et 50 ml centrifugerør indeholdende 25 ml vand.
    2. Fyld en 3 ml Luer lås engangssprøjte med 2,5 ml 25 mM HAuCl4-opløsning . Fyld en anden 3 ml Luer lås engangssprøjte med 2,5 ml 60 mM natriumcitratopløsning.
    3. Anbring sprøjterne i sprøjtepumperne, og brug Luer-to-MicroTight-adaptere til at forbinde PEEK-slangen (150 μm indvendig diameter) til sprøjterne. Indsæt slangen i centrifugerøret, der indeholder Au-frøopløsningen, i termomixeren.
    4. Indstil begge sprøjtepumper til at dispensere 0,1675 ml opløsning over 20 minutter (8,357 μL pr. Minut).
    5. Indstil termomixerens rotationshastighed til 700 o / min, og tryk på Start på sprøjtepumpen, der indeholder 25 mM HAuCl4-opløsningen .
    6. Efter 2 minutter skal du trykke på Start på sprøjtepumpen, der indeholder 60 mM natriumcitratopløsningen.
    7. 30 minutter efter påbegyndelse af HAuCl 4-opløsningsinjektionen fjernes en alikvote af Au NP-opløsningen til analyse.
    8. Gentag trin 1.3.5 - 1.3.7 for gradvist at øge diameteren på Au NPs op til 40 nm.
      BEMÆRK: Denne opsætning kan bruges til at dyrke Au NPs op til 40 nm i et trin ved at øge mængden af reaktanter tilføjet i trin 1.3.4. Dette opnås ved at øge dispenseringstiden, samtidig med at den samme injektionshastighed opretholdes.

2. Karakterisering af Au NPs

  1. UV-Vis spektroskopi
    1. Tilsæt 1 ml Au NP-opløsning til en semi-mikro kvartskuvette.
    2. Tænd spektrometeret.
    3. Indstil bølgelængdeområdet til 400 - 800 nm.
    4. Anskaf UV-Vis-spektret for hver prøve.
  2. Dynamisk lysspredning (DLS)
    1. Prøveopløsningen filtreres i en halvmikrokuvette af plast med et filter på 0,22 μm.
    2. Tænd DLS-instrumentet.
    3. Indstil temperaturen til 25 °C og ligevægt i 60 s.
    4. Mål den hydrodynamiske størrelse af hver prøve.
  3. Transmissionselektronmikroskopi (TEM)
    1. Drop-cast en 5 μL dråbe af prøveopløsningen på et C-belagt 300-mesh Cu gitter og tør i luft.
      BEMÆRK: Fortynding er nødvendig for mere koncentrerede Au NP-opløsningsprøver for at opnå godt dispergerede Au NP'er på et TEM-gitter.
    2. Anskaf flere TEM-billeder for hver prøve ved hjælp af en TEM ved 200 kV accelerationsspænding.
    3. Mål diameteren på 200 Au NPs for hver prøve ved hjælp af ImageJ til at beregne den gennemsnitlige størrelse og standardafvigelsen.

3. Dannelse af CB7-UA-komplekser

  1. Fremstilling af 0,4 mM CB7-opløsning
    1. Tilsæt 4,65 mg CB7 til et hætteglas på 15 ml glas.
      BEMÆRK: Mængden af CB7 beregnes ud fra formelvægten af CB7 (= 1163 Da), som er blevet anvendt af de fleste rapporter i litteraturen. Ikke desto mindre indeholder CB7 faste prøver typisk vand, HCI, methanol og andre salte tilbage fra syntese- og oprensningstrinnene, hvilket bidrager til ~ 10- 20% dødvægt i prøven. De indespærrede opløsningsmidler og salte kunne ikke fjernes ved opvarmning i en vakuumovn eller på anden måde. Deres mængder varierer mellem forskellige partier af prøver, men kan kvantificeres ved hjælp af elementær analyse. Den præsenterede protokol er imidlertid ikke følsom over for tilstedeværelsen af ukvantificeret mængde opløsningsmidler og salte i CB7-prøverne.
    2. Tilsæt 10 ml vand til hætteglasset og stram hætten.
    3. Sonikere prøven ved stuetemperatur, indtil CB7-faste stof er fuldstændigt opløst.
      BEMÆRK: CB7 blev syntetiseret i henhold til litteratur27 , men det er også kommercielt tilgængeligt.
  2. Fremstilling af 0,4 mM UA-opløsning
    1. Tilsæt 2,69 mg UA til et 50 ml centrifugerør.
    2. Tilsæt 40 ml vand til røret og stram hætten.
    3. Brug en termomixer til at hvirvle prøveopløsningen ved at indstille temperaturen til 70 °C, hastigheden til 800 o/min og tiden til 2 timer. Lad opløsningen afkøle til stuetemperatur.
      BEMÆRK: UA har en lav opløselighed i vand (0,40 mM)5. Swirl i længere tid, hvis UA-pulveret ikke er opløst fuldstændigt. Alternativt kan ultralydbehandling bruges til at lette opløsningen.
  3. Sekventielle fortyndinger af 0,4 mM UA-opløsningen
    1. Fortynd 5 ml af 0,4 mM UA-opløsningen med 5 ml vand i et 15 ml glashætteglas for at give 10 ml 0,2 mM UA-opløsning. Stram hætten og sonikatet i 30 s.
    2. Gentag trin 3.3.1 ved hjælp af en passende mængde UA og vand som beskrevet i tabel 1.
  4. Forberedelse af CB7-UA-komplekserne
    1. Tilsæt 0,75 ml af 0,4 mM CB7-opløsningen og 0,75 ml 0,4 mM UA-opløsning i et 1,5 ml rør. Fastgør låget og sonikatet i 30 s.
    2. Vent i 30 minutter for at sikre dannelsen af værts-gæst komplekser.
    3. Gentag trin 3.4.1 – 3.4.2 ved hjælp af UA-opløsning i forskellige koncentrationer.

4. SERS-registrering af UA

  1. Forsøgsopstillelse af Raman-systemet (figur 3)
    1. Tænd for 633 nm He-Ne-laseren (22,5 mW).
    2. Tænd for det modulære Raman-spektrometer.
    3. Tænd for computeren, og start softwaren.
    4. Klik på ikonet Spektroskopi Application Wizards , og vælg derefter Raman.
    5. Start en ny erhvervelse. Indstil integrationstiden til 30 s, scanninger til gennemsnit til 5 og boxcar til 0.
    6. Opbevar baggrundsspektrum og indtast laserbølgelængden (dvs. 633 nm).
      BEMÆRK: Integrationstiden er tiden for hver scanning, scanninger til gennemsnit er antallet af scanninger i gennemsnit for at skabe hvert spektrum, og boxcar er antallet af nabopixels i gennemsnit28.
  2. Dannelse af SERS-substraterne
    1. Der tilsættes 0,9 ml af 40 nm Au NP-opløsningen og 0,1 ml af den præformede CB7-UA-komplekse opløsning i et 1,5 ml rør. Fastgør låget og sonikatet, indtil opløsningen skifter fra rubinrød til lilla.
      BEMÆRK: Kommercielle citratstabiliserede 40 nm Au NP-opløsningsprøver kan også anvendes. Typisk justeres den optiske densitet af den lokaliserede overfladeplasmonresonans (LSPR) top til 1 via fortynding fra koncentrerede stamopløsningsprøver. Citratkoncentrationen i prøven holdes typisk som 2 mM.
    2. Overfør prøveopløsningen til en semi-mikrokuvette. Anbring kuvetten i Raman-prøveholderen, og luk dækslet.
    3. Start målingen.
    4. Konfigurer den automatiske lagring til at optage fem på hinanden følgende SERS-spektre.
    5. Stop målingen, og skift prøven.
    6. Gentag trin 4.2.1 – 4.2.5 ved hjælp af CB7-UA-opløsning med forskellige koncentrationer.
      BEMÆRK: Aggregeringstiden viser sig at være afhængig af koncentrationen af UA i nanoaggregaterne, der spænder fra 30 s for 0,1 μM UA til 30 min for 20 μM UA på grund af forskellen i koncentrationen af tom CB7, som har et væsentligt bidrag til at formidle aggregeringen af Au NP'er. For CB7-UA-komplekset blokeres en portal af det omfangsrige UA-molekyle, hvilket gør det utilgængeligt for binding til Au NP-overfladen og derfor ikke i stand til at formidle NP-aggregeringen21. Prøven er klar til måling, når opløsningens farve skifter fra rubinrød til lilla.

5. Analyse af data

  1. Databehandling
    1. Download og installer basislinjen med ALS-plugin (asymmetriske mindste kvadrater) i Origin.
      BEMÆRK: ALS-pluginet kræver OriginPro.
    2. Indsæt de rå data i Origin.
    3. Beregn en gennemsnitsværdi ud fra de fem SERS-spektre for hver prøve. Del værdien med laserens effekt (dvs. 22,5 mW) og med integrationstiden (dvs. 30 s).
    4. Klik på ALS ikon for at åbne dialogboksen. Sæt den asymmetriske faktor til 0,001, tærsklen til 0,03 %, udjævningsfaktoren til 2 og antallet af iterationer til 20 for at korrigere basisscenariet for hvert gennemsnitligt spektrum.
    5. Plot SERS-spektrene af forskellige UA-koncentrationer ved hjælp af stablede linjer med y-forskydninger. Udgangen skal være intensitet (tæller s-1 mW-1) mod Raman-skift (cm-1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I den præsenterede Au NP-syntese viser UV-Vis-spektrene en forskydning af LSPR-toppe fra 521 nm til 529 nm efter 10 væksttrin (figur 4A,B), mens DLS-dataene viser en smal størrelsesfordeling, da størrelsen af Au NP'er stiger fra 25,9 nm til 42,8 nm (figur 4C,D). De gennemsnitlige størrelser af G0, G5 og G10 målt fra TEM-billeder (figur 4E) er henholdsvis 20,1 ± 2,1 nm, 32,5 ± 2,3 nm og 40,0 ± 2,2 nm, med 200 partikler talt i hvert tilfælde. Disse resultater indikerer, at denne protokol er effektiv til syntetisering af ensartede og snævert dispergerede Au-NP'er.

I de præsenterede SERS-undersøgelser blev værts-gæstekomplekser af CB7 og UA dannet med tom CB7, der medierede dannelsen af præcise plasmoniske nanojunktioner inden for Au NP: CB7 nanoaggregater, som understøttet af de karakteristiske UA-signaler i SERS-spektret (figur 5A).

Opgaverne for Raman-toppene af CB (markeret med +) og UA (markeret med *) er vist i tabel 2. Omvendt kan der ikke observeres SERS-signaler fra UA i fravær af CB7, hvilket illustrerer CB7's centrale rolle i at udløse aggregeringen af AU NP'er.

En konstant CB7-koncentration på 20 μM blev anvendt i SERS-titreringen af UA overalt for at sikre in situ-dannelsen af reproducerbare plasmoniske nanostrukturer (dvs. SERS-substrater). Den høje følsomhed af detektionsskemaet, der præsenteres i denne protokol, blev demonstreret ved observation af klare SERS-signaler fra UA-toppe ved henholdsvis 640 cm-1 og 1130 cm-1 (tilskrevet skeletringdeformation og C-N-vibrationer) ned til ~ 0,2 μM (figur 5B-D), som er kendt som detektionsgrænsen. Derudover blev der opnået meget stærke korrelationer (R2 > 0,98) mellem SERS-intensiteten og logkoncentrationen af UA ved effektlov for begge toppe, med lineære regioner fundet i området 0,2 til 2 μM (figur 5E,F). Det skal bemærkes, at lineære korrelationer mellem SERS-intensiteten og logkoncentrationen kan tilnærmes for et snævert interval af analytkoncentrationer, mens SERS-signalet nærmer sig 0, når logkoncentrationen nærmer sig negativ uendelighed (dvs. analytkoncentrationen nærmer sig 0), som observeret i vores data. SERS-signalerne er også meget reproducerbare, hvilket fremgår af de små fejlbjælker, der er vist i figur 5E,F.

Figure 1
Figur 1: Skematisk illustration af de præcise plasmoniske nanojunktioner inden for selvmonterede Au NP: CB7 nanoaggregater. Inset viser en zoom-in af de plasmoniske nanojunctions, hvor aggregeringen medieres af tom CB7, mens UA beriges på overfladen af Au NPs via værts-gæst-kompleksation. Det bemærkes, at ordningen ikke er trukket i skala. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: (a) Skematisk illustration og (b) fotografi af den automatiserede Au NP-synthesizer. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Skematisk illustration af Raman-systemet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Repræsentativ karakterisering af Au NPs. (A) UV-Vis-spektre af Au NP'er og (B) zoom-in-spektre, der viser forskydningen af LSPR-toppe, efterhånden som antallet af voksende trin stiger til 10. C) Hydrodynamisk størrelse af Au NP'er og (D) tilsvarende plot af partikelstørrelse som funktion af antallet af voksende trin. (E) TEM-billeder af Au-NP'er, der viser størrelser af Au-frø og Au-NP'er efter 5 og 10 voksende trin. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Repræsentative SERS-resultater af UA-detektion inden for Au NP: CB7 nanoaggregater. A) SERS-spektre af UA i nærvær eller fravær af CB7. Raman toppe af CB7 og UA er markeret med henholdsvis + og *. (B) Fuld rækkevidde, (C) 600 - 700 cm-1 zoom-in og (D) 1100 - 1180 cm-1 zoom-in SERS spektre af UA med koncentrationer fra 0 til 20 μM. De vigtigste Raman-toppe i UA er markeret med *. Spektre blev baseline korrigeret og forskudt for klarhedens skyld. (E,F) Tilsvarende afbildninger af SERS-spidsintensiteten mod koncentration af UA. Klik her for at se en større version af denne figur.

Konc. af UA-stamopløsning (μM) Vol. af tilsat UA-stamopløsning (ml) Vol. af tilsat vand (ml) Konc. af ny UA-stamopløsning (μM)
400 5 5 200
200 5 5 100
100 4 6 40
40 5 5 20
20 5 5 10
10 4 6 4
4 5 5 2

Tabel 1: Sekventielle fortyndinger af UA-opløsning.

Cb7 UA
SERS-top (cm-1) Spidsbelastning opgave SERS-top (cm-1) Spidsbelastning opgave
446 Ring saks tilstand 491 C-N-C ring vibrationer
831 Ring deformation 640 Deformation af skeletring
1375 Symmetrisk C-N strækning 896 N-H bøjning
1420 Asymmetrisk C-N strækning 1020 Ring vibrationer
- - 1130 C-N vibrationer
- - 1202 N-C-C strækning og bøjning

Tabel 2: Opgaver for Raman toppe af CB7 og UA 2,4,29.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den automatiserede syntesemetode, der er beskrevet i protokollen, gør det muligt at syntetisere Au NP'er af stigende størrelse reproducerbart. Selv om der er nogle elementer, der stadig skal udføres manuelt, såsom hurtig tilsætning af natriumcitrat under frøsyntesen og kontrol med jævne mellemrum for at sikre, at PEEK-slangen er sikker, tillader denne metode Au NP'er af store størrelser (op til 40 nm), hvilket normalt ville kræve flere manuelle injektioner af HAuCl4 og natriumcitrat, skal syntetiseres via kontinuerlig tilsætning over en lang periode.

Yderligere karakterisering kan udføres for at belyse CB-kompleksernes grundlæggende egenskab. For eksempel kan dannelsen af værts-gæstekomplekser typisk bekræftes ved hjælp af 1H nuklear magnetisk resonans (NMR), som skal vise upfield-skift og udvidelse af signaler i tilfælde af kompleksdannelse 21,22,25. Alligevel er 1H NMR ikke anvendelig på UA på grund af dens mangel på ikke-udskiftelige protoner. Alternative teknikker som 13C NMR og massespektrometri kan også anvendes til at karakterisere kompleksiteten. Bindingskonstanter mellem CB7 og UA kan måles ved hjælp af titreringsteknikker, såsom UV-Vis-spektroskopititrering og isotermisk titreringskalorimetri (ITC)21,22,25. I mellemtiden kan molekylær modellering baseret på kraftfelt- og densitetsfunktionel teori (DFT) modeller beregnes for at opnå teoretisk indsigt i bindingsgeometrien af værts-gæstekomplekserne 21,22,25,29. Desuden kan IR- og Raman-spektre beregnes ved frekvensberegninger 21,25,29.

SERS er en meget følsom og selektiv analytisk teknik, der gør det muligt at identificere sporanalytter via deres molekylespecifikke vibrationsfingeraftryk. SERS vinder interesser på tværs af forskellige videnskabelige discipliner, især biomedicinske studier, på grund af dets stærkt forbedrede signaler, meget kortere erhvervelsestid og høj tolerance over for flydende vand (egnet til sensing i biofluider)30,31,32,33,34,35. I modsætning til tidligere rapporter om UA-sensing 1,2,3,4,36,37 definerer CB7's stive struktur præcis afstand på 0,9 nm mellem Au-IP'er via carbonylportalbinding, mens den overfladebundne CB7 kan fange UA-molekyler i hulrummet (figur 1 ), hvilket resulterer i stærke og lokaliserede plasmoniske hotspots og dermed de meget følsomme (ned til ~ 0,2 μM) og reproducerbare (inden for 2% fejl) SERS-signaler fra UA med meget stærke korrelationer (R2 > 0,98) mellem SERS-intensiteten og logkoncentrationen (figur 5).

I et forsøg på at optimere koncentrationen af CB7 bemærker vi, at 20 μM CB7 blev brugt til at sikre dannelsen af reproducerbare SERS-substrater. Navnlig afhænger den absolutte koncentration af CB7, der anvendes, af det samlede system (dvs. Au NP'er, analytter og eventuelle baggrundsmolekyler)18,22. Der bør anvendes en højere koncentration af CB7, hvis aggregeringen af AU-NP'er er for langsom. Omvendt bør der anvendes en lavere koncentration af CB7, hvis prøveopløsningen udfældes hurtigt og fører til kortere målevinduer. Aggregeringen af Au NP'er medieret af CB7 i vores eksperimentelle omgivelser forventes at følge den diffusionsbegrænsede kolloide aggregeringskinetik (DLCA)19, hvor åbne og aflange kædelignende strukturer hurtigt blev dannet oprindeligt, før de sluttede sig sammen som kvasi-fraktalt netværk. DLCA-kinetik forekommer typisk ved et højt CB: Au NP-forhold (efter tal), hvilket er lig med 106: 1 i vores tilfælde. Det skal bemærkes, at urinsyre er til stede i kropsvæsker (f.eks. Blodserum, urin) i en højere koncentration. For eksempel er den normale koncentration af urinsyre 3,5 - 7,0 mg / dl i blodserum38 og 16 - 100 mg / dl i urin2 henholdsvis (koncentration over eller under den normale koncentration er kendt som hyperurikæmi og hypouricæmi)39. Der kræves derfor kun en meget lille mængde prøve til påvisning af biomarkører i dette meget følsomme skema, hvor der anvendes en høj fortyndingsfaktor til at sænke koncentrationen af prøven til et passende interval. Dette er især vigtigt for point-of-care overvågning af uhelbredeligt syge patienter, hvis urinudskillelse er meget lav. Stærkt fortyndede prøver resulterer i større prøvevolumener og reducerer dermed fejl i kvantificeringen af biomarkører på grund af vandfordampning og tab af prøver på grund af væskeoverførsel, samtidig med at matrixeffekterne minimeres25. På grund af den selektive karakter af denne sondemetode er den begrænset til analytmolekyler, der kan danne værts-gæstekomplekser med CB. Det skal bemærkes, at det er muligt at observere interferenser fra andre molekyler, fordi CB kan binde sig til forskellige gæstemolekyler. Ikke desto mindre kan prøverensning såsom gelelektroforese og HPLC udføres inden SERS-måling.

Det detektionsskema, der er demonstreret i denne protokol, har potentiale til multiplexeret påvisning af biomarkører i en kompleks matrix til kliniske anvendelser, når den er koblet til avancerede dataanalyseteknikker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

TCL er taknemmelig for støtten fra Royal Society Research Grant 2016 R1 (RG150551) og UCL BEAMS Future Leader Award finansieret gennem Institutional Sponsorship Award af EPSRC (EP/P511262/1). WIKC, TCL og IPP er taknemmelige for studentship finansieret af A * STAR-UCL Research Attachment Program gennem EPSRC M3S CDT (EP / L015862/1). GD og TJ vil gerne takke EPSRC M3S CDT (EP/L015862/1) for at sponsorere deres studieoptog. TJ og TCL anerkender Camtech Innovations for bidrag til TJ's studentertid. Alle forfattere er taknemmelige for UCL Open Access Fund.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
40 nm gold nanoparticles NanoComposix AUCN40-100M NanoXact, 0.05 mg/ mL, bare (citrate)
Centrifuge tube Corning Falcon 14-432-22 50 mL volume
Cucurbit[7]uril Lab-made see ref. 19
Gold(III) chloride trihydrate Sigma aldrich 520918 ≥99.9% trace metals basis
Luer lock disposable syringe Cole-Parmer WZ-07945-15 3 mL volume
Luer-to-MicroTight adapter LuerTight P-662 360 μm outer diameter Tubing to Luer Syringe
PEEK tubing IDEX 1572 360 μm outer diameter, 150 μm inner diameter
PEEK tubing cutter IDEX WZ-02013-30 Capillary Polymer Chromatography Tubing Cutter For 360 µm to 1/32" OD tubing
Raman spectrometer Ocean Optics QE pro
Sodium citrate tribasic dihydrate Sigma aldrich S4641 ACS reagent, ≥99.0%
Sonicator
Standard Probe Digi-Sense WZ-08516-55 Type-K
Syringe pump Aladdin ALADDIN2-220 2 syringes, maximum syringe volume 60 mL
Thermocouple thermometer Digi-Sense WZ-20250-91 Single-Input Thermocouple Thermometer with NIST-Traceable Calibration
ThermoMixer Eppendorf 5382000031 With an Eppendorf SmartBlock for 50 mL tubes
Uric acid Sigma aldrich U2625 ≥99%, crystalline

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Villa, J. E. L., Poppi, R. J. A portable SERS method for the determination of uric acid using a paper-based substrate and multivariate curve resolution. Analyst. 141 (6), 1966-1972 (2016).
  2. Westley, C., et al. Absolute Quantification of Uric Acid in Human Urine Using Surface Enhanced Raman Scattering with the Standard Addition Method. Analytical Chemistry. 89 (4), 2472-2477 (2017).
  3. Zhao, L., Blackburn, J., Brosseau, C. L. Quantitative Detection of Uric Acid by Electrochemical-Surface Enhanced Raman Spectroscopy Using a Multilayered Au/Ag Substrate. Analytical Chemistry. 87 (1), 441-447 (2015).
  4. Goodall, B. L., Robinson, A. M., Brosseau, C. L. Electrochemical-surface enhanced Raman spectroscopy (E-SERS) of uric acid: a potential rapid diagnostic method for early preeclampsia detection. Physical Chemistry Chemical Physics. 15 (5), 1382-1388 (2013).
  5. Lytvyn, Y., Perkins, B. A., Cherney, D. Z. I. Uric Acid as a Biomarker and a Therapeutic Target in Diabetes. Canadian Journal of Diabetes. 39 (3), 239-246 (2015).
  6. Ali, S. M. U., Ibupoto, Z. H., Kashif, M., Hashim, U., Willander, M. A Potentiometric Indirect Uric Acid Sensor Based on ZnO Nanoflakes and Immobilized Uricase. Sensors. 12 (3), 2787-2797 (2012).
  7. Yu, J., Wang, S., Ge, L., Ge, S. A novel chemiluminescence paper microfluidic biosensor based on enzymatic reaction for uric acid determination. Biosensors and Bioelectronics. 26 (7), 3284-3289 (2011).
  8. Yang, Y. D. Simultaneous determination of creatine, uric acid, creatinine and hippuric acid in urine by high performance liquid chromatography. Biomedical Chromatography. 12 (2), 47-49 (1999).
  9. Zhao, S., Wang, J., Ye, F., Liu, Y. M. Determination of uric acid in human urine and serum by capillary electrophoresis with chemiluminescence detection. Analytical Biochemistry. 378 (2), 127-131 (2008).
  10. Fang, Y., Seong, N. H., Dlott, D. D. Measurement of the Distribution of Site Enhancements in Surface-Enhanced Raman Scattering. Science. 321 (5887), 388-392 (2008).
  11. Jeong, H. H., et al. Dispersion and shape engineered plasmonic nanosensors. Nature Communications. 7, 11331 (2016).
  12. Alula, M. T., et al. Preparation of silver nanoparticles coated ZnO/Fe3O4 composites using chemical reduction method for sensitive detection of uric acid via surface-enhanced Raman spectroscopy. Analytica Chimica Acta. 1073, 62-71 (2019).
  13. Bastús, N. G., Comenge, J., Puntes, V. Kinetically Controlled Seeded Growth Synthesis of Citrate-Stabilized Gold Nanoparticles of up to 200 nm: Size Focusing versus Ostwald Ripening. Langmuir. 27 (17), 11098-11105 (2011).
  14. Jeong, H. H., et al. Selectable Nanopattern Arrays for Nanolithographic Imprint and Etch-Mask Applications. Advanced Science. 2 (7), 1500016 (2016).
  15. Loh, X. J., Lee, T. C., Dou, Q., Deen, G. R. Utilising inorganic nanocarriers for gene delivery. Biomaterials Science. 4 (1), 70-86 (2016).
  16. Celiz, A. D., Lee, T. C., Scherman, O. A. Polymer-Mediated Dispersion of Gold Nanoparticles: Using Supramolecular Moieties on the Periphery. Advanced Materials. 21 (38), 3937-3940 (2009).
  17. Lee, T. C., Scherman, O. A. Formation of Dynamic Aggregates in Water by Cucurbit[5]uril Capped with Gold Nanoparticles. ChemComm. 46 (14), 2438-2440 (2010).
  18. Lee, T. C., Scherman, O. A. A Facile Synthesis of Dynamic Supramolecular Aggregates of Cucurbit[n]uril (n = 5-8) Capped with Gold Nanoparticles in Aqueous Media. Chemistry-A European Journal. 18 (6), 1628-1633 (2012).
  19. Taylor, R. W., et al. Precise Subnanometer Plasmonic Junctions for SERS within Gold Nano- particle Assemblies Using Cucurbit[n]uril "Glue". ACS Nano. 5 (5), 3878-3887 (2011).
  20. Peveler, W. J., et al. Cucurbituril-mediated quantum dot aggregates formed by aqueous self-assembly for sensing applications. ChemComm. 55 (38), 5495-5498 (2019).
  21. Chio, W. I. K., et al. Selective Detection of Nitroexplosives Using Molecular Recognition within Self-Assembled Plasmonic Nanojunctions. The Journal of Physical Chemistry C. 123 (25), 15769-15776 (2019).
  22. Kasera, S., Biedermann, F., Baumberg, J. J., Scherman, O. A., Mahajan, S. Quantitative SERS Using the Sequestration of Small Molecules Inside Precise Plasmonic Nanoconstructs. Nano Letters. 12 (11), 5924-5928 (2012).
  23. Taylor, R. W., et al. In Situ SERS Monitoring of Photochemistry within a Nanojunction Reactor. Nano Letters. 13 (12), 5985-5990 (2013).
  24. Kasera, S., Herrmann, L. O., Barrio, J. d, Baumberg, J. J., Scherman, O. A. Quantitative Multiplexing with Nano-Self-Assemblies in SERS. Scientific Reports. 4, 6785 (2014).
  25. Chio, W. I. K., et al. Dual-triggered nanoaggregates of cucurbit[7]uril and gold nanoparticles for multi-spectroscopic quantification of creatinine in urinalysis. Journal of Materials Chemistry C. 8, 7051-7058 (2020).
  26. Turkevich, J., Stevenson, P. C., Hillier, J. A study of the nucleation and growth processes in the synthesis of colloidal gold. Discussions of the Faraday Society. 11, 55-75 (1951).
  27. Lagona, J., Mukhopadhyay, P., Chakrabarti, S., Issacs, L. The cucurbit[n]uril family. Angewandte Chemie International Edition. 44 (31), 4844-4870 (2005).
  28. OceanView Installation and Operation Manual. , Available from: https://www.oceaninsight.com/globalassets/catalog-blocks-and-images/manuals--instruction-old-logo/software/oceanviewio.pdf (2013).
  29. Mahajan, S., et al. Raman and SERS spectroscopy of cucurbit[n]urils. Physical Chemistry Chemical Physics. 12 (35), 10429-10433 (2010).
  30. Langer, J., et al. Present and Future of Surface-Enhanced Raman Scattering. ACS Nano. 14 (1), 28-117 (2020).
  31. Pilot, R., et al. A Review on Surface-Enhanced Raman Scattering. Biosensors. 9 (2), 57 (2019).
  32. Bantz, K. C., et al. Recent progress in SERS biosensing. Physical Chemistry Chemical Physics. 13 (24), 11551-11567 (2011).
  33. Moore, T. J., et al. In Vitro and In Vivo SERS Biosensing for Disease Diagnosis. Biosensors. 8 (2), 46 (2018).
  34. Bonifacio, A., Cervo, S., Sergo, V. Label-free surface-enhanced Raman spectroscopy of biofluids: fundamental aspects and diagnostic applications. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (27), 8265-8277 (2015).
  35. Jeong, H. H., Choi, E., Ellis, E., Lee, T. C. Recent advances in gold nanoparticles for biomedical applications: from hybrid structures to multi-functionality. Journal of Materials Chemistry B. 7 (22), 3480-3496 (2019).
  36. Premasiri, W. R., Clarke, R. H., Womble, M. E. Urine Analysis by Laser Raman Spectroscopy. Lasers in Surgery and Medicine. 28 (4), 330-334 (2001).
  37. Lu, Y., et al. Superhydrophobic silver film as a SERS substrate for the detection of uric acid and creatinine. Biomedical Optics Express. 9 (10), 4988-4997 (2018).
  38. Feig, D. I., et al. Serum Uric Acid: A Risk Factor and a Target for Treatment. Journal of the American Society of Nephrology. 17 (4), 69-73 (2006).
  39. Maiuolo, J., Oppedisano, F., Gratteri, S., Muscoli, C., Mollace, V. Regulation of uric acid metabolism and excretion. International Journal of Cardiology. 213, 8-14 (2016).

Tags

Kemi udgave 164 Guldnanopartikler automatiseret synthesizer cucurbit[n]uril værts-gæst-kompleksdannelse selvmontering overfladeforstærket Raman-spektroskopi sensor biomarkører sygdomsdiagnose
Kvantitativ SERS-påvisning af urinsyre via dannelse af præcise plasmoniske nanojunktioner inden for aggregater af guldnanopartikler og cucurbit[<em>n</em>]uril
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chio, W. I. K., Davison, G., Jones,… More

Chio, W. I. K., Davison, G., Jones, T., Liu, J., Parkin, I. P., Lee, T. C. Quantitative SERS Detection of Uric Acid via Formation of Precise Plasmonic Nanojunctions within Aggregates of Gold Nanoparticles and Cucurbit[n]uril. J. Vis. Exp. (164), e61682, doi:10.3791/61682 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter