Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

זיהוי SERS כמותי של חומצת שתן באמצעות היווצרות של ננו-צווים פלסמוניים מדויקים בתוך אגרגטים של ננו-חלקיקי זהב ו-Cucurbit[n]uril

Published: October 3, 2020 doi: 10.3791/61682

Summary

קומפלקס מארח-אורח של cucurbit[7]uril וחומצת שתן נוצר בתמיסה מימית לפני שהוסיף כמות קטנה לתמיסת Au NP עבור חישת ספקטרוסקופיית ראמאן (SERS) כמותית משופרת על פני השטח באמצעות ספקטרומטר מודולרי.

Abstract

עבודה זו מתארת שיטה מהירה ורגישה מאוד לזיהוי כמותי של סמן ביולוגי חשוב, חומצת שתן (UA), באמצעות ספקטרוסקופיית ראמאן משופרת על פני השטח (SERS) עם מגבלת זיהוי נמוכה של ~ 0.2 מיקרומטר עבור פסגות אופייניות מרובות באזור טביעת האצבע, באמצעות ספקטרומטר מודולרי. סכמת ביוסנסינג זו מתווכת על-ידי קומפלקס בין קומפלקס בין מקרו-מחזור, cucurbit[7]uril (CB7) ו-UA, וההיווצרות שלאחר מכן של ננו-צווים פלסמוניים מדויקים בתוך Au NP המורכב מעצמו: ננו-אגרגטים של CB7. סינתזת Au NP facile של גדלים רצויים עבור מצעי SERS בוצעה גם היא על סמך גישת הפחתת הציטראט הקלאסית עם אפשרות להקלה באמצעות סינתיסייזר אוטומטי שנבנה במעבדה. ניתן להרחיב פרוטוקול זה בקלות לזיהוי מרובב של סמנים ביולוגיים בנוזלי גוף ליישומים קליניים.

Introduction

חומצת שתן, שהיא התוצר הסופי של חילוף החומרים של נוקלאוטידים פורין, היא סמן ביולוגי חשוב בסרום הדם ובשתן לאבחון מחלות כגון שיגדון, רעלת הריון, מחלות כליות, יתר לחץ דם, מחלות לב וכלי דם וסוכרת 1,2,3,4,5. השיטות הנוכחיות לזיהוי חומצות שתן כוללות בדיקות אנזימטיות צבעוניות, כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים ואלקטרופורזה נימית, שהן גוזלות זמן רב, יקרות ודורשות הכנת דגימה מתוחכמת 6,7,8,9.

ספקטרוסקופיית ראמאן המשופרת על פני השטח היא טכניקה מבטיחה לאבחון נקודתי שגרתי, שכן היא מאפשרת זיהוי סלקטיבי של ביו-מולקולות באמצעות טביעות האצבעות של הרטט שלהן ומציעה יתרונות רבים כגון רגישות גבוהה, תגובה מהירה, קלות שימוש והכנת דגימה ללא דגימה או מינימלית. מצעי SERS המבוססים על ננו-חלקיקי מתכת אצילים (לדוגמה, Au NPs) יכולים לשפר את אותות הראמן של מולקולות האנאליט ב-4 עד 10 סדרי גודל10 באמצעות שיפור אלקטרומגנטי חזק הנגרם על ידי תהודת פלסמון פני השטח11. ניתן לסנתז בקלות Au NPs בגדלים מותאמים אישית, בניגוד לייצור הגוזל זמן רב של ננו-קומפוזיטים מתכתיים מורכבים12, ולכן נעשה בהם שימוש נרחב ביישומים ביו-רפואיים בשל תכונותיהם המעולות 13,14,15,16. חיבור של מולקולות מקרוציקליות, cucurbit[n]urils (CBn, כאשר n = 5-8, 10), על פני השטח של Au NPs יכול לשפר עוד יותר את אותות ה-SERS של מולקולות האנאליטים, שכן מולקולות ה-CB הסימטריות והנוקשות ביותר יכולות לשלוט במרווח המדויק בין ה-Au NPs ולמקם את מולקולות האנאליט במרכז או בסמיכות לנקודות החמות הפלסמוניות באמצעות היווצרות של קומפלקסים מארחים-אורחים (איור 1)17, 18,19,20. דוגמאות קודמות למחקרי SERS שהשתמשו ב-Au NP: CBn nanoaggregates כוללים ניטרו-אקספלוזיבים, ארומטיים פוליציקליים, דיאמינוסטילבן, מוליכים עצביים וקריאטינין 21,22,23,24,25, כאשר מדידות ה-SERS מבוצעות בקובטה או על ידי העמסת טיפה קטנה על מחזיק דגימה מותאם אישית. ערכת זיהוי זו שימושית במיוחד לכימות מהיר של סמנים ביולוגיים במטריצה מורכבת עם יכולת שכפול גבוהה.

כאן, הודגמה שיטה פזיזה ליצירת קומפלקסים מארחים-אורחים של CB7 ו-UA חשוב של סמנים ביולוגיים, ולכימות UA עם מגבלת זיהוי של 0.2 μM באמצעות צבירה בתיווך CB7 של Au NPs במדיה מימית באמצעות ספקטרומטר מודולרי, המבטיח ליישומים אבחוניים וקליניים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. סינתזה של Au NPs

  1. סינתזה של זרעי Au בשיטת טורקביץ ' הקונבנציונלית26
    1. הכן 10 מ"ל של 25 mM תמיסת HAuCl4 על ידי המסת 98.5 מ"ג של HAuCl4· 3H2O מבשר עם 10 מ"ל של מים deionized בבקבוקון זכוכית.
      הערה: העבר כמות קטנה של מבשר HAuCl4 לתוך סירת שקילה והשתמש במרית פלסטיק במקום במרית מתכתית כדי לשקול את הגבישים מכיוון שמבשר HAuCl4 יתאים לכלי מעבדה ממתכת. שלב השקילה צריך להתבצע במהירות האפשרית, שכן HAuCl4 הוא היגרוסקופי ולכן יגדיל את משקלו לאורך זמן על ידי ספיגת מים מהאטמוספרה. HAuCl4 הוא קורוזיבי מאוד ועלול לגרום לכוויות עור קשות ולפגיעה בעיניים. היזהרו במיוחד כשאתם מטפלים בו.
    2. להכין 0.5 מ"ל של תמיסת נתרן ציטראט 500 mM על ידי המסת 64.5 מ"ג של אבקת נתרן ציטראט עם 0.5 מ"ל של מים deionized בבקבוקון זכוכית.
    3. דילול 1 מ"ל של תמיסת HAuCl4 של 25 mM עם 99 מ"ל מים בבקבוק עם פקק כחול של 250 מ"ל כדי לתת 100 מ"ל של תמיסת HAuCl4 של 0.25 mM.
    4. הוסיפו 99.5 מ"ל של תמיסת HAuCl4 של 0.25 מ"מ לתוך בקבוקון בעל תחתית עגולה בעלת שלושה מ"ל עם שלושה מ"ל המצוידים במעבה. מחממים את התמיסה ל-90 מעלות צלזיוס תחת ערבוב נמרץ ושומרים על הטמפרטורה במשך 15 דקות.
    5. להזריק 0.5 מ"ל של תמיסת נתרן ציטראט 500 mM לתוך תערובת התגובה ולשמור על הטמפרטורה והערבוב עד שצבע התמיסה הופך לאדום-אודם.
      הערה: התגובה אורכת כ-30 דקות.
  2. צמיחה נזרעת של Au NPs באמצעות השיטה הנשלטת באופן קינטי13
    1. מצננים את תמיסת זרעי Au המסונתזת ל-70 מעלות צלזיוס.
    2. מכינים 10 מ"ל של תמיסת נתרן ציטראט של 60 מ"מ על ידי המסת 154.8 מ"ג של אבקת נתרן ציטראט עם 10 מ"ל של מים שעברו דה-יוניזציה בבקבוקון זכוכית.
    3. הזריקו 0.67 מ"ל של תמיסת HAuCl4 של 25 mM ו-0.67 מ"ל של תמיסת הנתרן ציטראט של 60 mM לזרעי Au עם מרווח זמן של 2 דקות.
    4. חזור על שלב 1.2.3 כדי להגדיל בהדרגה את הגודל של Au NPs ל- 40 ננומטר.
      הערה: נדרשים כ-10 צעדי גדילה כדי להגיע ל-40 ננומטר. מספר הצעדים הדרוש בפועל עשוי להיות תלוי בהגדרה המדויקת.
  3. צמיחה נזרעת של Au NPs באמצעות סינתיסייזר אוטומטי (איור 2)
    1. העבר 25 מ"ל של תמיסת זרעי Au שהוכנה בקטע 1 לצינור צנטריפוגה חרוטית של 50 מ"ל וקרירה ל-70 מעלות צלזיוס בתרמומיקסר.
      הערה: עקוב אחר הטמפרטורה בתוך התרמומיקסר באמצעות מדחום thermocouple הממוקם בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל המכיל 25 מ"ל מים.
    2. מלאו מזרק חד פעמי של מנעול Luer 3 מ"ל עם 2.5 מ"ל של תמיסת HAuCl4 של 25 mM. מלאו עוד מזרק חד פעמי של 3 מ"ל Luer lock עם 2.5 מ"ל של תמיסת נתרן ציטראט 60 מ"ל.
    3. הניחו את המזרקים במשאבות המזרקים והשתמשו במתאמי Luer-to-MicroTight כדי לחבר את צינורות PEEK (קוטר פנימי של 150 מיקרומטר) למזרקים. הכנס את הצינורות לתוך צינור הצנטריפוגה המכיל את תמיסת זרעי Au בתרמומיקסר.
    4. הגדר את שתי משאבות המזרק לחלוקת 0.1675 מ"ל של תמיסה מעל 20 דקות (8.357 μL לדקה).
    5. הגדר את מהירות הסיבוב של התרמומיקסר ל-700 סל"ד ולחץ על התחל במשאבת המזרק המכילה את פתרון HAuCl4 של 25 mM.
    6. לאחר 2 דקות, לחץ על התחל במשאבת המזרק המכילה את תמיסת הנתרן ציטראט 60 mM.
    7. 30 דקות לאחר תחילת הזרקת תמיסת HAuCl4 , הסר aliquot של פתרון Au NP לניתוח.
    8. חזור על שלבים 1.3.5 – 1.3.7 כדי להגדיל בהדרגה את קוטר ה- Au NPs עד 40 ננומטר.
      הערה: ניתן להשתמש בהגדרה זו כדי להגדיל את Au NPs עד 40 ננומטר בשלב אחד על ידי הגדלת נפח המגיבים שנוספו בשלב 1.3.4. זה מושג על ידי הגדלת זמן החלוקה תוך שמירה על אותו קצב של הזרקה.

2. אפיון של Au NPs

  1. ספקטרוסקופיה UV-Vis
    1. הוסף 1 מ"ל של תמיסת Au NP לקובט חצי מיקרו קוורץ.
    2. הפעל את הספקטרומטר.
    3. הגדר את טווח אורכי הגל ל- 400 - 800 ננומטר.
    4. רכוש את ספקטרום UV-Vis עבור כל דגימה.
  2. פיזור אור דינמי (DLS)
    1. סנן את התמיסה לדוגמה לתוך קובט חצי מיקרו-מיקרו מפלסטיק עם מסנן 0.22 מיקרומטר.
    2. הפעל את מכשיר ה- DLS.
    3. הגדר את הטמפרטורה ל- 25 ° C ושווי משקל במשך 60 שניות.
    4. מדוד את הגודל ההידרודינמי של כל דגימה.
  3. מיקרוסקופיית אלקטרונים תמסורת (TEM)
    1. טיפה יצוקה טיפה של 5 μL של תמיסת הדגימה על רשת 300 Cu מצופה C וייבוש באוויר.
      הערה: יש צורך בדילול עבור דגימות תמיסות Au NP מרוכזות יותר כדי לקבל Au NPs מפוזרים היטב ברשת TEM.
    2. השג תמונות TEM מרובות עבור כל דגימה באמצעות TEM במתח האצה של 200 קילו-וולט.
    3. מדוד את הקוטר של 200 Au NPs עבור כל דגימה באמצעות ImageJ כדי לחשב את הגודל הממוצע וסטיית התקן.

3. היווצרות מתחמי CB7-UA

  1. הכנת תמיסת 0.4 mM CB7
    1. הוסיפו 4.65 מ"ג של CB7 לבקבוקון זכוכית של 15 מ"ל.
      הערה: כמות ה- CB7 מחושבת על סמך משקל הנוסחה של CB7 (= 1163 Da) אשר שימשה את רוב הדוחות בספרות. עם זאת, דגימות מוצקות של CB7 מכילות בדרך כלל מים, HCl, מתנול ומלחים אחרים שנותרו משלבי הסינתזה והטיהור, מה שתורם למשקל מת של כ-10 - 20% בדגימה. לא ניתן היה להסיר את הממסים והמלחים הכלואים על ידי חימום בתנור ואקום או באמצעים אחרים. הכמויות שלהם משתנות בין קבוצות שונות של דגימות, אך ניתן לכמת אותן באמצעות ניתוח אלמנטים. עם זאת, הפרוטוקול המוצג אינו רגיש לנוכחות כמות בלתי מסויגת של ממסים ומלחים בדגימות CB7.
    2. מוסיפים 10 מ"ל מים לבקבוקון ומהדקים את המכסה.
    3. נקו את הדגימה בטמפרטורת החדר עד שמוצק CB7 יתמוסס לחלוטין.
      הערה: CB7 סונתז על פי ספרות27 אך הוא גם זמין מסחרית.
  2. הכנת פתרון 0.4 mM UA
    1. הוסף 2.69 מ"ג של UA לצינור צנטריפוגה 50 מ"ל.
    2. מוסיפים 40 מ"ל מים לצינור ומהדקים את המכסה.
    3. השתמש בתרמומיקסר כדי לסובב את תמיסת הדגימה על ידי הגדרת הטמפרטורה ל-70 מעלות צלזיוס, מהירות ל-800 סל"ד וזמן ל-2 שעות. אפשרו לפתרון להתקרר לטמפרטורת החדר.
      הערה: ל-UA יש מסיסות נמוכה במים (0.40 מ"מ)5. מערבולת למשך זמן רב יותר אם אבקת ה-UA לא הומסה לחלוטין. לחלופין, ניתן להשתמש באולטרה-סוניזציה כדי להקל על הפירוק.
  3. דילולים רציפים של פתרון 0.4 mM UA
    1. דילול 5 מ"ל של תמיסת UA 0.4 mM עם 5 מ"ל מים בבקבוקון זכוכית 15 מ"ל כדי לתת 10 מ"ל של תמיסת UA 0.2 mM. הדקו את הכובע וסוניקציה במשך 30 שניות.
    2. חזור על שלב 3.3.1 באמצעות כמות מתאימה של UA ומים כמתואר בטבלה 1.
  4. הכנת מתחמי CB7-UA
    1. הוסף 0.75 מ"ל של תמיסת CB7 של 0.4 mM ו- 0.75 מ"ל של תמיסת UA של 0.4 mM לתוך צינור 1.5 מ"ל. אבטחו את המכסה וסוניקציה במשך 30 שניות.
    2. המתן במשך 30 דקות כדי להבטיח את היווצרותם של מתחמי מארח-אורח.
    3. חזור על שלב 3.4.1 – 3.4.2 באמצעות תמיסת UA בריכוזים שונים.

4. חישת SERS של UA

  1. מערך ניסיוני של מערכת ראמאן (איור 3)
    1. הפעל את לייזר He-Ne 633 ננומטר (22.5 mW).
    2. הפעילו את הספקטרומטר המודולרי של ראמאן.
    3. הפעל את המחשב והפעל את התוכנה.
    4. לחץ על סמל אשפי יישומים ספקטרוסקופיים ולאחר מכן בחר ראמאן.
    5. התחל רכישה חדשה. הגדר את זמן האינטגרציה ל- 30 שניות, סריקות לממוצע ל- 5 ו- boxcar ל- 0.
    6. אחסן את ספקטרום הרקע והזן את אורך הגל של הלייזר (כלומר, 633 ננומטר).
      הערה: זמן האינטגרציה הוא הזמן עבור כל סריקה, סריקות לממוצע הוא מספר הסריקות הממוצע ליצירת כל ספקטרום ו- boxcar הוא מספר הפיקסלים השכנים בממוצע28.
  2. היווצרות מצעי ה-SERS
    1. הוסף 0.9 מ"ל של תמיסת Au NP של 40 ננומטר ו- 0.1 מ"ל של הפתרון המורכב CB7-UA שנוצר מראש לצינור 1.5 מ"ל. מאבטחים את המכסה ומסתננים עד שהתמיסה משתנה מאדום-אודם לסגול.
      הערה: ניתן להשתמש גם בדגימות מסחריות של תמיסת Au NP המיוצבת על ידי ציטראט 40 ננומטר. בדרך כלל, הצפיפות האופטית של שיא התהודה המקומית של פלסמון המשטח (LSPR) מותאמת ל-1 באמצעות דילול מדגימות של תמיסות מלאי מרוכזות. ריכוז הציטראט בדגימה נשמר בדרך כלל כ-2 mM.
    2. העבר את הפתרון לדוגמה למיקרו-קובט למחצה. מכניסים את הקובט למחזיק הדגימה של ראמאן וסוגרים את העטיפה.
    3. התחל את המדידה.
    4. הגדר את החיסכון האוטומטי כדי לרשום חמישה ספקטרום SERS רצופים.
    5. עצור את המדידה ושנה את המדגם.
    6. חזור על שלב 4.2.1 – 4.2.5 באמצעות תמיסת CB7-UA בריכוזים שונים.
      הערה: זמן הצבירה נמצא כתלוי בריכוז של UA בננו-אגרגטים, החל מ-30 שניות עבור 0.1 μM UA ועד 30 דקות עבור 20 μM UA, בשל ההבדל בריכוז של CB7 ריק שיש לו תרומה גדולה לתיווך הצבירה של Au NPs. עבור קומפלקס CB7-UA, פורטל אחד נחסם על ידי מולקולת ה-UA המגושמת, מה שהופך אותו ללא זמין לקשירתו למשטח Au NP ולכן אינו מסוגל לתווך את צבירת ה-NP21. הדגימה מוכנה למדידה כאשר צבע התמיסה משתנה מאדום-אודם לסגול.

5. ניתוח נתונים

  1. עיבוד נתונים
    1. הורד והתקן את קו הבסיס עם תוסף ריבועים לפחות אסימטריים (ALS) לתוך Origin.
      הערה: תוסף ה-ALS דורש את OriginPro.
    2. הכנס את הנתונים הגולמיים למקור.
    3. חשב ערך ממוצע מתוך חמשת ספקטרום ה-SERS של כל דגימה. חלקו את הערך בעוצמת הלייזר (כלומר, 22.5 mW) ובזמן האינטגרציה (כלומר, 30 שניות).
    4. לחץ על סמל ALS כדי לפתוח את תיבת הדו-שיח. הגדר את הגורם האסימטרי ל- 0.001, את הסף ל- 0.03%, את גורם ההחלקה ל- 2 ואת מספר האיטרציות ל- 20 כדי לתקן את הבסיס של כל ספקטרום ממוצע.
    5. תרשים ספקטרום SERS של ריכוזי UA שונים באמצעות קווים מוערמים על ידי קיזוזים y. הפלט צריך להיות בעוצמה (סופר s-1 mW-1) כנגד הסטת ראמאן (cm-1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בסינתזת Au NP שהוצגה, ספקטרום ה-UV-Vis מראה תזוזה של פסגות ה-LSPR מ-521 ננומטר ל-529 ננומטר לאחר 10 צעדי גדילה (איור 4A,B) בעוד שנתוני ה-DLS מראים התפלגות גודל צרה כאשר הגודל של Au NPs גדל מ-25.9 ננומטר ל-42.8 ננומטר (איור 4C,D). הגדלים הממוצעים של G0, G5 ו-G10 שנמדדו מתמונות TEM (איור 4E) הם 20.1 ± 2.1 ננומטר, 32.5 ± 2.3 ננומטר ו-40.0 ± 2.2 ננומטר בהתאמה, כאשר 200 חלקיקים נספרים בכל מקרה. תוצאות אלה מצביעות על כך שפרוטוקול זה יעיל בסינתזה של Au NPs אחידים ומפוזרים באופן צר.

במחקרי SERS שהוצגו, קומפלקסים מארחים-אורחים של CB7 ו-UA נוצרו עם CB7 ריק המתווך את היווצרותם של ננו-צווים פלסמוניים מדויקים בתוך ה-Au NP: ננו-צוברים של CB7, כפי שנתמך על ידי אותות ה-UA האופייניים בספקטרום ה-SERS (איור 5A).

ההקצאות עבור פסגות ראמאן של CB (המסומנות על ידי +) ו- UA (המסומנות על ידי *) מוצגות בטבלה 2. לעומת זאת, לא ניתן לראות אותות SERS של UA בהיעדר CB7, מה שממחיש את תפקיד המפתח של CB7 בהפעלת הצבירה של Au NPs.

ריכוז קבוע של CB7 של 20 μM שימש בטיטרציה של SERS של UA לאורך כל הדרך כדי להבטיח היווצרות in situ של ננו-מבנים פלסמוניים הניתנים לשחזור (כלומר, מצעי SERS). הרגישות הגבוהה של ערכת הגילוי המוצגת בפרוטוקול זה הודגמה על ידי תצפית על אותות SERS ברורים מפסגות ה-UA ב-640 ס"מ-1 ו-1130 סמ"ק-1 (המיוחסים לעיוות טבעת השלד ולרטט C-N בהתאמה) עד ל-~0.2 מיקרומטר (איור 5B−D), הידועה כמגבלת הגילוי. בנוסף, קורלציות חזקות מאוד (R2 > 0.98) בין עוצמת ה-SERS לריכוז הלוג של UA התקבלו על פי חוק ההספק עבור שתי הפסגות, כאשר אזורים ליניאריים נמצאו בטווח של 0.2 עד 2 מיקרומטר (איור 5E,F). יש לציין כי ניתן להעריך קורלציות ליניאריות בין עוצמת ה-SERS לריכוז הלוג עבור טווח צר של ריכוזי אנאליטים, בעוד שאות ה-SERS מתקרב ל-0 כאשר ריכוז הלוג מתקרב לאינסוף שלילי (כלומר, ריכוז האנאליטים מתקרב ל-0), כפי שנצפה בנתונים שלנו. אותות ה-SERS גם ניתנים לשחזור רב, כפי שמעידים פסי השגיאה הקטנים המוצגים באיור 5E,F.

Figure 1
איור 1: המחשה סכמטית של הננו-צווים הפלסמוניים המדויקים בתוך Au NP בהרכבה עצמית: ננו-צוברים של CB7. Inset מראה זום-אין של הננו-צווים הפלסמוניים שבהם הצבירה מתווכת על ידי CB7 ריק בעוד ש-UA מועשר על פני השטח של Au NPs באמצעות קומפלקס של מארח-אורח. צוין כי התוכנית אינה נמשכת לקנה מידה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: (א) איור סכמטי ו-(ב) תצלום של הסינתיסייזר האוטומטי Au NP. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: איור סכמטי של מערכת ראמאן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: אפיון מייצג של Au NPs. (A) ספקטרום UV-Vis של Au NPs ו-(B) ספקטרום זום-אין המציג את ההסטה של ה-LSPR מגיע לשיא ככל שמספר הצעדים הגדלים גדל ל-10. (C) גודל הידרודינמי של Au NPs ו-(D) תרשים תואם של גודל החלקיקים כפונקציה של מספר צעדי הגידול. (E) תמונות TEM של Au NPs, המציגות גדלים של זרעי Au ו- Au NPs לאחר 5 ו- 10 שלבי גידול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: תוצאות SERS מייצגות של זיהוי UA בתוך Au NP: ננו-אגרגטים של CB7. (A) ספקטרום SERS של UA בנוכחות או בהיעדרו של CB7. פסגות ראמאן של CB7 ו- UA מסומנות על ידי + ו- * בהתאמה. (B) טווח מלא, (C) 600 - 700 ס"מ-1 זום-אין ו-(D) 1100 - 1180 ס"מ-1 ספקטרום SERS של UA עם ריכוזים של 0 עד 20 מיקרומטר. פסגות רמאן הראשיות של UA מסומנות על ידי *. הספקטרום תוקן וקודם לצורך בהירות. (ה,ו) חלקות מקבילות של עוצמת השיא של SERS כנגד ריכוז של UA. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Conc. של פתרון מלאי UA (μM) כרך של פתרון מלאי UA נוסף (mL) כרך של מים שנוספו (מ"ל) Conc. של פתרון מלאי חדש של UA (μM)
400 5 5 200
200 5 5 100
100 4 6 40
40 5 5 20
20 5 5 10
10 4 6 4
4 5 5 2

טבלה 1: דילולים רציפים של פתרון UA.

CB7 UA
פסגת SERS (cm-1) משימת שיא פסגת SERS (cm-1) משימת שיא
446 מצב מספריים טבעת 491 רטט טבעת C-N-C
831 עיוות טבעת 640 דפורמציה של טבעת השלד
1375 מתיחה סימטרית C-N 896 כיפוף N-H
1420 מתיחה אסימטרית C-N 1020 רטט טבעת
- - 1130 רטט C-N
- - 1202 N-C-C מתיחה וכיפוף

טבלה 2: הקצאות לפסגות ראמאן של CB7 ו-UA 2,4,29.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שיטת הסינתזה האוטומטית המתוארת בפרוטוקול מאפשרת ל- Au NPs בגדלים הולכים וגדלים להיות מסונתזים באופן רנדוקטיבי. למרות שיש כמה אלמנטים שעדיין צריכים להתבצע באופן ידני, כגון הוספה מהירה של נתרן ציטראט במהלך סינתזת הזרעים ובדיקה מעת לעת כדי להבטיח כי צינורות PEEK מאובטחים, שיטה זו מאפשרת Au NPs של גדלים גדולים (עד 40 ננומטר), אשר בדרך כלל ידרוש זריקות ידניות מרובות של HAuCl4 ונתרן ציטראט, להיות מסונתזים באמצעות הוספה רציפה על פני תקופה ארוכה של זמן.

ניתן לבצע אפיון נוסף כדי להבהיר את התכונה הבסיסית של קומפלקסי CB. לדוגמה, ניתן בדרך כלל לאשר את היווצרותם של קומפלקסים מארחים-אורחים באמצעות תהודה מגנטית גרעינית של 1H (NMR), שאמורה להראות הסטת שדה והרחבה של אותות במקרה של קומפלקסציה 21,22,25. עם זאת, 1H NMR אינו חל על UA בשל היעדר פרוטונים שאינם ניתנים להחלפה. ניתן להשתמש גם בטכניקות חלופיות כגון 13C NMR וספקטרומטריית מסות כדי לאפיין את המורכבות. ניתן למדוד קבועי קשירה בין CB7 ל-UA באמצעות טכניקות טיטרציה, כגון טיטרציה של ספקטרוסקופיה UV-Vis וקלורימטריה של טיטרציה איזותרמית (ITC)21,22,25. בינתיים ניתן לחשב מודלים מולקולריים המבוססים על מודלים של תאוריית כוח-שדה וצפיפות פונקציונלית (DFT) כדי לקבל תובנות תיאורטיות על הגיאומטריה המחייבת של קומפלקסים מארח-אורח 21,22,25,29. יתר על כן, ניתן לחשב את ספקטרום IR ו- Raman על ידי חישובי תדרים 21,25,29.

SERS היא טכניקה אנליטית רגישה וסלקטיבית ביותר המאפשרת זיהוי של עקבות אנליטיים באמצעות טביעות האצבעות הוויברציוניות הספציפיות למולקולה שלהם. SERS צובר תחומי עניין בדיסציפלינות מדעיות שונות, במיוחד במחקרים ביו-רפואיים, בשל האותות המשופרים מאוד שלו, זמן רכישה קצר בהרבה וסובלנות גבוהה למים נוזליים (המתאימים לחישה בביו-פלואידים)30,31,32,33,34,35. בניגוד לדיווחים קודמים על חישת UA 1,2,3,3,4,36,37, המבנה הנוקשה של CB7 מגדיר ריווח מדויק של 0.9 ננומטר בין Au NPs באמצעות קשירת פורטל קרבוניל, בעוד שה-CB7 הקשור לפני השטח יכול לכלוא מולקולות UA בתוך החלל שלו (איור 1 התוצאה היא נקודות חמות פלסמוניות חזקות ומקומיות, ומכאן האותות הרגישים ביותר (עד ~0.2 μM) ואותות SERS הניתנים לשחזור (בתוך שגיאה של 2%) של UA עם קורלציות חזקות מאוד (R2 > 0.98) בין עוצמת SERS לריכוז הלוג (איור 5).

בניסיון לייעל את הריכוז של CB7, נציין כי 20 μM CB7 שימש כדי להבטיח היווצרות של מצעי SERS הניתנים לשחזור. בפרט, הריכוז המוחלט של CB7 שבו נעשה שימוש תלוי במערכת הכוללת (כלומר, Au NPs, אנליטים ומולקולות רקע, אם בכלל)18,22. יש להשתמש בריכוז גבוה יותר של CB7 אם הצבירה של Au NPs איטית מדי. לעומת זאת, יש להשתמש בריכוז נמוך יותר של CB7 אם תמיסת הדגימה מזרזת במהירות ומובילה לחלונות מדידה קצרים יותר. הצבירה של Au NPs בתיווך CB7 במסגרת הניסוי שלנו צפויה לעקוב אחר הקינטיקה הקולואידית המוגבלת בדיפוזיה (DLCA)19, שבה מבנים פתוחים ומוארכים דמויי שרשרת נוצרו במהירות בתחילה לפני שהתחברו יחד כרשת מעין פרקטלית. קינטיקה DLCA מתרחשת בדרך כלל ביחס גבוה של CB: Au NP (לפי מספר), השווה ל- 106:1 במקרה שלנו. יש לציין כי חומצת שתן קיימת בנוזלי הגוף (למשל, סרום דם, שתן) בריכוז גבוה יותר. לדוגמה, הריכוז התקין של חומצת שתן הוא 3.5 – 7.0 מ"ג/ד"ל בסרום הדם38 ו-16 – 100 מ"ג/ד"ל בשתן2 בהתאמה (ריכוז מעל או מתחת לריכוז הנורמלי ידוע כהיפרוריקמיה והיפואוריקמיה)39. לכן, רק כמות קטנה מאוד של דגימה נדרשת לזיהוי סמנים ביולוגיים בסכימה רגישה מאוד זו שבה גורם דילול גבוה משמש להורדת ריכוז הדגימה לטווח מתאים. זה חשוב במיוחד לניטור נקודתי של חולים סופניים שהפרשת השתן שלהם נמוכה מאוד. דגימות מדוללות מאוד גורמות לנפחי דגימה גדולים יותר ובכך מפחיתות טעויות בכימות של סמנים ביולוגיים עקב אידוי מים ואובדן דגימות עקב העברת נוזלים, תוך מתן יתרונות אחרים כולל מזעור השפעות המטריצה25. בשל האופי הסלקטיבי של שיטת בדיקה זו, היא מוגבלת למולקולות אנאליט שיכולות ליצור קומפלקסים מארחים-אורחים עם CB. יש לציין כי ניתן לצפות בהתאבכויות ממולקולות אחרות מכיוון ש-CB יכול להיקשר למולקולות אורחות שונות. עם זאת, ניתן לבצע טיהור דגימות כגון אלקטרופורזה של ג'ל ו- HPLC לפני מדידת SERS.

לסכמת הגילוי המודגמת בפרוטוקול זה יש פוטנציאל לזיהוי מרובב של סמנים ביולוגיים במטריצה מורכבת ליישומים קליניים כאשר היא מוצמדת לטכניקות ניתוח נתונים מתקדמות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

TCL אסירת תודה על התמיכה ממענק המחקר של החברה המלכותית 2016 R1 (RG150551) ופרס המנהיג העתידי של UCL BEAMS הממומן באמצעות פרס החסות המוסדית על ידי EPSRC (EP/P511262/1). WIKC, TCL ו- IPP אסירי תודה לסטודנטיות הממומנת על ידי תוכנית ההתקשרות למחקר A *STAR-UCL באמצעות EPSRC M3S CDT (EP/L015862/1). GD ו- TJ רוצים להודות ל- EPSRC M3S CDT (EP / L015862/1) על מתן חסות לסטודנטיות שלהם. TJ ו-TCL מודים ל-Camtech Innovations על תרומה לסטודנטיות של TJ. כל הכותבים אסירי תודה לקרן הגישה הפתוחה של UCL.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
40 nm gold nanoparticles NanoComposix AUCN40-100M NanoXact, 0.05 mg/ mL, bare (citrate)
Centrifuge tube Corning Falcon 14-432-22 50 mL volume
Cucurbit[7]uril Lab-made see ref. 19
Gold(III) chloride trihydrate Sigma aldrich 520918 ≥99.9% trace metals basis
Luer lock disposable syringe Cole-Parmer WZ-07945-15 3 mL volume
Luer-to-MicroTight adapter LuerTight P-662 360 μm outer diameter Tubing to Luer Syringe
PEEK tubing IDEX 1572 360 μm outer diameter, 150 μm inner diameter
PEEK tubing cutter IDEX WZ-02013-30 Capillary Polymer Chromatography Tubing Cutter For 360 µm to 1/32" OD tubing
Raman spectrometer Ocean Optics QE pro
Sodium citrate tribasic dihydrate Sigma aldrich S4641 ACS reagent, ≥99.0%
Sonicator
Standard Probe Digi-Sense WZ-08516-55 Type-K
Syringe pump Aladdin ALADDIN2-220 2 syringes, maximum syringe volume 60 mL
Thermocouple thermometer Digi-Sense WZ-20250-91 Single-Input Thermocouple Thermometer with NIST-Traceable Calibration
ThermoMixer Eppendorf 5382000031 With an Eppendorf SmartBlock for 50 mL tubes
Uric acid Sigma aldrich U2625 ≥99%, crystalline

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Villa, J. E. L., Poppi, R. J. A portable SERS method for the determination of uric acid using a paper-based substrate and multivariate curve resolution. Analyst. 141 (6), 1966-1972 (2016).
  2. Westley, C., et al. Absolute Quantification of Uric Acid in Human Urine Using Surface Enhanced Raman Scattering with the Standard Addition Method. Analytical Chemistry. 89 (4), 2472-2477 (2017).
  3. Zhao, L., Blackburn, J., Brosseau, C. L. Quantitative Detection of Uric Acid by Electrochemical-Surface Enhanced Raman Spectroscopy Using a Multilayered Au/Ag Substrate. Analytical Chemistry. 87 (1), 441-447 (2015).
  4. Goodall, B. L., Robinson, A. M., Brosseau, C. L. Electrochemical-surface enhanced Raman spectroscopy (E-SERS) of uric acid: a potential rapid diagnostic method for early preeclampsia detection. Physical Chemistry Chemical Physics. 15 (5), 1382-1388 (2013).
  5. Lytvyn, Y., Perkins, B. A., Cherney, D. Z. I. Uric Acid as a Biomarker and a Therapeutic Target in Diabetes. Canadian Journal of Diabetes. 39 (3), 239-246 (2015).
  6. Ali, S. M. U., Ibupoto, Z. H., Kashif, M., Hashim, U., Willander, M. A Potentiometric Indirect Uric Acid Sensor Based on ZnO Nanoflakes and Immobilized Uricase. Sensors. 12 (3), 2787-2797 (2012).
  7. Yu, J., Wang, S., Ge, L., Ge, S. A novel chemiluminescence paper microfluidic biosensor based on enzymatic reaction for uric acid determination. Biosensors and Bioelectronics. 26 (7), 3284-3289 (2011).
  8. Yang, Y. D. Simultaneous determination of creatine, uric acid, creatinine and hippuric acid in urine by high performance liquid chromatography. Biomedical Chromatography. 12 (2), 47-49 (1999).
  9. Zhao, S., Wang, J., Ye, F., Liu, Y. M. Determination of uric acid in human urine and serum by capillary electrophoresis with chemiluminescence detection. Analytical Biochemistry. 378 (2), 127-131 (2008).
  10. Fang, Y., Seong, N. H., Dlott, D. D. Measurement of the Distribution of Site Enhancements in Surface-Enhanced Raman Scattering. Science. 321 (5887), 388-392 (2008).
  11. Jeong, H. H., et al. Dispersion and shape engineered plasmonic nanosensors. Nature Communications. 7, 11331 (2016).
  12. Alula, M. T., et al. Preparation of silver nanoparticles coated ZnO/Fe3O4 composites using chemical reduction method for sensitive detection of uric acid via surface-enhanced Raman spectroscopy. Analytica Chimica Acta. 1073, 62-71 (2019).
  13. Bastús, N. G., Comenge, J., Puntes, V. Kinetically Controlled Seeded Growth Synthesis of Citrate-Stabilized Gold Nanoparticles of up to 200 nm: Size Focusing versus Ostwald Ripening. Langmuir. 27 (17), 11098-11105 (2011).
  14. Jeong, H. H., et al. Selectable Nanopattern Arrays for Nanolithographic Imprint and Etch-Mask Applications. Advanced Science. 2 (7), 1500016 (2016).
  15. Loh, X. J., Lee, T. C., Dou, Q., Deen, G. R. Utilising inorganic nanocarriers for gene delivery. Biomaterials Science. 4 (1), 70-86 (2016).
  16. Celiz, A. D., Lee, T. C., Scherman, O. A. Polymer-Mediated Dispersion of Gold Nanoparticles: Using Supramolecular Moieties on the Periphery. Advanced Materials. 21 (38), 3937-3940 (2009).
  17. Lee, T. C., Scherman, O. A. Formation of Dynamic Aggregates in Water by Cucurbit[5]uril Capped with Gold Nanoparticles. ChemComm. 46 (14), 2438-2440 (2010).
  18. Lee, T. C., Scherman, O. A. A Facile Synthesis of Dynamic Supramolecular Aggregates of Cucurbit[n]uril (n = 5-8) Capped with Gold Nanoparticles in Aqueous Media. Chemistry-A European Journal. 18 (6), 1628-1633 (2012).
  19. Taylor, R. W., et al. Precise Subnanometer Plasmonic Junctions for SERS within Gold Nano- particle Assemblies Using Cucurbit[n]uril "Glue". ACS Nano. 5 (5), 3878-3887 (2011).
  20. Peveler, W. J., et al. Cucurbituril-mediated quantum dot aggregates formed by aqueous self-assembly for sensing applications. ChemComm. 55 (38), 5495-5498 (2019).
  21. Chio, W. I. K., et al. Selective Detection of Nitroexplosives Using Molecular Recognition within Self-Assembled Plasmonic Nanojunctions. The Journal of Physical Chemistry C. 123 (25), 15769-15776 (2019).
  22. Kasera, S., Biedermann, F., Baumberg, J. J., Scherman, O. A., Mahajan, S. Quantitative SERS Using the Sequestration of Small Molecules Inside Precise Plasmonic Nanoconstructs. Nano Letters. 12 (11), 5924-5928 (2012).
  23. Taylor, R. W., et al. In Situ SERS Monitoring of Photochemistry within a Nanojunction Reactor. Nano Letters. 13 (12), 5985-5990 (2013).
  24. Kasera, S., Herrmann, L. O., Barrio, J. d, Baumberg, J. J., Scherman, O. A. Quantitative Multiplexing with Nano-Self-Assemblies in SERS. Scientific Reports. 4, 6785 (2014).
  25. Chio, W. I. K., et al. Dual-triggered nanoaggregates of cucurbit[7]uril and gold nanoparticles for multi-spectroscopic quantification of creatinine in urinalysis. Journal of Materials Chemistry C. 8, 7051-7058 (2020).
  26. Turkevich, J., Stevenson, P. C., Hillier, J. A study of the nucleation and growth processes in the synthesis of colloidal gold. Discussions of the Faraday Society. 11, 55-75 (1951).
  27. Lagona, J., Mukhopadhyay, P., Chakrabarti, S., Issacs, L. The cucurbit[n]uril family. Angewandte Chemie International Edition. 44 (31), 4844-4870 (2005).
  28. OceanView Installation and Operation Manual. , Available from: https://www.oceaninsight.com/globalassets/catalog-blocks-and-images/manuals--instruction-old-logo/software/oceanviewio.pdf (2013).
  29. Mahajan, S., et al. Raman and SERS spectroscopy of cucurbit[n]urils. Physical Chemistry Chemical Physics. 12 (35), 10429-10433 (2010).
  30. Langer, J., et al. Present and Future of Surface-Enhanced Raman Scattering. ACS Nano. 14 (1), 28-117 (2020).
  31. Pilot, R., et al. A Review on Surface-Enhanced Raman Scattering. Biosensors. 9 (2), 57 (2019).
  32. Bantz, K. C., et al. Recent progress in SERS biosensing. Physical Chemistry Chemical Physics. 13 (24), 11551-11567 (2011).
  33. Moore, T. J., et al. In Vitro and In Vivo SERS Biosensing for Disease Diagnosis. Biosensors. 8 (2), 46 (2018).
  34. Bonifacio, A., Cervo, S., Sergo, V. Label-free surface-enhanced Raman spectroscopy of biofluids: fundamental aspects and diagnostic applications. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (27), 8265-8277 (2015).
  35. Jeong, H. H., Choi, E., Ellis, E., Lee, T. C. Recent advances in gold nanoparticles for biomedical applications: from hybrid structures to multi-functionality. Journal of Materials Chemistry B. 7 (22), 3480-3496 (2019).
  36. Premasiri, W. R., Clarke, R. H., Womble, M. E. Urine Analysis by Laser Raman Spectroscopy. Lasers in Surgery and Medicine. 28 (4), 330-334 (2001).
  37. Lu, Y., et al. Superhydrophobic silver film as a SERS substrate for the detection of uric acid and creatinine. Biomedical Optics Express. 9 (10), 4988-4997 (2018).
  38. Feig, D. I., et al. Serum Uric Acid: A Risk Factor and a Target for Treatment. Journal of the American Society of Nephrology. 17 (4), 69-73 (2006).
  39. Maiuolo, J., Oppedisano, F., Gratteri, S., Muscoli, C., Mollace, V. Regulation of uric acid metabolism and excretion. International Journal of Cardiology. 213, 8-14 (2016).

Tags

כימיה גיליון 164 ננו-חלקיקי זהב סינתיסייזר אוטומטי cucurbit[n]uril קומפלקס מארח-אורח הרכבה עצמית ספקטרוסקופיית ראמאן משופרת על פני השטח חיישן סמנים ביולוגיים אבחון מחלות
זיהוי SERS כמותי של חומצת שתן באמצעות היווצרות של ננו-צווים פלסמוניים מדויקים בתוך אגרגטים של ננו-חלקיקי זהב ו-Cucurbit[<em>n</em>]uril
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chio, W. I. K., Davison, G., Jones,More

Chio, W. I. K., Davison, G., Jones, T., Liu, J., Parkin, I. P., Lee, T. C. Quantitative SERS Detection of Uric Acid via Formation of Precise Plasmonic Nanojunctions within Aggregates of Gold Nanoparticles and Cucurbit[n]uril. J. Vis. Exp. (164), e61682, doi:10.3791/61682 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter