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Chemistry

सोने के नैनोकणों और Cucurbit[n] uril के समुच्चय के भीतर सटीक प्लास्मोनिक नैनोजंक्शन के गठन के माध्यम से यूरिक एसिड का मात्रात्मक SERS पता लगाना[n] uril

Published: October 3, 2020 doi: 10.3791/61682
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1,2
1Department of Chemistry, University College London (UCL), 2Institute for Materials Discovery, University College London (UCL)

Summary

एक मॉड्यूलर स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करके मात्रात्मक सतह-संवर्धित रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी (SERS) संवेदन के लिए Au NP समाधान में एक छोटी राशि जोड़ने से पहले एक जलीय घोल में cucurbit[7] यूरिल और यूरिक एसिड का एक मेजबान-अतिथि परिसर बनाया गया था।

Abstract

यह काम एक महत्वपूर्ण बायोमार्कर, यूरिक एसिड (यूए) का मात्रात्मक पता लगाने के लिए एक तेजी से और अत्यधिक संवेदनशील विधि का वर्णन करता है, सतह-संवर्धित रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी (एसईआरएस) के माध्यम से, एक मॉड्यूलर स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करके फिंगरप्रिंट क्षेत्र में कई विशेषता चोटियों के लिए ~ 0.2 μM की कम पहचान सीमा के साथ। इस बायोसेंसिंग योजना को एक मैक्रोसाइकिल, क्यूकरबिट [7] यूरिल (सीबी 7), और यूए के बीच मेजबान-अतिथि जटिलता द्वारा मध्यस्थता की जाती है, और स्व-इकट्ठे एयू एनपी के भीतर सटीक प्लास्मोनिक नैनोजंक्शन के बाद के गठन: सीबी 7 नैनोएग्रीगेट्स। SERS substrates के लिए वांछनीय आकारों का एक सरल Au NP संश्लेषण भी एक प्रयोगशाला-निर्मित स्वचालित सिंथेसाइज़र का उपयोग करके सुविधाजनक बनाने के विकल्प के साथ शास्त्रीय साइट्रेट-कमी दृष्टिकोण के आधार पर किया गया है। इस प्रोटोकॉल को नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए शरीर के तरल पदार्थों में बायोमार्कर का मल्टीप्लेक्स डिटेक्शन करने के लिए आसानी से बढ़ाया जा सकता है।

Introduction

यूरिक एसिड, जो प्यूरीन न्यूक्लियोटाइड्स के चयापचय का अंतिम उत्पाद है, गठिया, प्रीक्लेम्पसिया, गुर्दे की बीमारियों, उच्च रक्तचाप, हृदय रोगों और मधुमेह जैसे रोगों के निदान के लिए रक्त सीरम और मूत्र में एक महत्वपूर्ण बायोमार्कर है 1,2,3,4,5। यूरिक एसिड का पता लगाने के लिए वर्तमान तरीकों में colorimetric enzymatic assays, उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी और केशिका वैद्युतकणसंचलन शामिल हैं, जो समय लेने वाले, महंगे हैं और परिष्कृत नमूना तैयारी 6,7,8,9 की आवश्यकता होती है।

सतह-संवर्धित रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी नियमित बिंदु-देखभाल निदान के लिए एक आशाजनक तकनीक है क्योंकि यह उनके कंपन उंगलियों के निशान के माध्यम से बायोमोलेक्यूल्स का चयनात्मक पता लगाने की अनुमति देता है और उच्च संवेदनशीलता, तेजी से प्रतिक्रिया, उपयोग में आसानी और कोई या न्यूनतम नमूना तैयारी जैसे कई फायदे प्रदान करता है। महान धातु नैनोकणों (जैसे, एयू एनपी) पर आधारित एसईआरएस सब्सट्रेट सतह प्लास्मोन अनुनाद 11 के कारण मजबूत विद्युत चुम्बकीय वृद्धि के माध्यम से परिमाण 10 के 4 से10 आदेशों द्वारा विश्लेषक अणुओं के रमन संकेतों को बढ़ा सकतेहैं। अनुरूप आकार के एयू एनपी को जटिल धातु nanocomposites12 के समय लेने वाले निर्माण के विपरीत आसानी से संश्लेषित किया जा सकता है, और इस प्रकार उनके बेहतर गुणों के कारण जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों में व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है 13,14,15,16। मैक्रोसाइक्लिक अणुओं का लगाव, cucurbit[n]urils (CBn, जहां n = 5-8, 10), Au NPs की सतह पर विश्लेषक अणुओं के SERS संकेतों को और बढ़ा सकता है क्योंकि अत्यधिक सममित और कठोर CB अणु Au NPs के बीच सटीक रिक्ति को नियंत्रित कर सकते हैं और केंद्र में विश्लेषक अणुओं को स्थानीयकृत कर सकते हैं या मेजबान-अतिथि परिसरों के गठन के माध्यम से प्लास्मोनिक हॉटस्पॉट के करीब निकटता में (चित्रा 1)17, 18,19,20. Au NP का उपयोग करके SERS अध्ययनों के पिछले उदाहरण: CBn nanoaggregates नाइट्रोएक्सप्लोसिव्स, polycyclic aromatics, diaminostilbene, neurotransmitters और क्रिएटिनिन21,22,23,24,25 शामिल हैं, SERS माप या तो एक cuvette में प्रदर्शन किया जा रहा है या एक कस्टम-निर्मित नमूना धारक पर एक छोटी बूंद लोड करके। यह पता लगाने की योजना विशेष रूप से एक उच्च reproducibility के साथ एक जटिल मैट्रिक्स में biomarkers तेजी से मात्रा निर्धारित करने के लिए उपयोगी है।

इसमें, सीबी 7 और एक महत्वपूर्ण बायोमार्कर यूए के मेजबान-अतिथि परिसरों को बनाने के लिए एक सरल विधि, और जलीय मीडिया में एयू एनपी के सीबी 7-मध्यस्थता एकत्रीकरण के माध्यम से 0.2 μM की पहचान सीमा के साथ यूए को मापने के लिए एक मॉड्यूलर स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करके प्रदर्शित किया गया था, जो नैदानिक और नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए आशाजनक है।

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Protocol

1. Au NPs का संश्लेषण

  1. पारंपरिक Turkevich विधि26 के माध्यम से Au बीज का संश्लेषण
    1. HAuCl4 के 98.5 मिलीग्राम को भंग करके 25 mM HAuCl4 समाधान का 10 mL तैयार करें· 3H2एक कांच की शीशी में विआयनीकृत पानी के 10 मिलीलीटर के साथ ओ अग्रदूत।
      नोट: एक वजन नाव में HAuCl4 अग्रदूत की एक छोटी राशि हस्तांतरण और क्रिस्टल बाहर वजन करने के लिए धातु स्पैटुला के बजाय एक प्लास्टिक spatula का उपयोग करें क्योंकि HAuCl4 अग्रदूत धातु labware को नष्ट कर देगा। वजन चरण को यथासंभव तेजी से किया जाना चाहिए, क्योंकि HAuCl4 हाइग्रोस्कोपिक है और इसलिए वातावरण से पानी को अवशोषित करके समय के साथ अपना वजन बढ़ाएगा। HAuCl4 अत्यधिक संक्षारक है और गंभीर त्वचा जलने और आंखों की क्षति का कारण बन सकता है। इसे संभालते समय अतिरिक्त सावधानी बरतें।
    2. एक गिलास शीशी में 0.5 मिलीलीटर विआयनीकृत पानी के साथ 64.5 मिलीग्राम सोडियम साइट्रेट पाउडर को भंग करके 500 एमएम सोडियम साइट्रेट समाधान का 0.5 मिलीलीटर तैयार करें।
    3. 25 mM HAuCl 4 समाधान के 1 mLको 250 mL नीले-कैप्ड बोतल में 99 mL पानी के साथ पतला करें ताकि 0.25 mM HAuCl4 समाधान का 100 mL दिया जा सके।
    4. एक संघनित्र के साथ सुसज्जित एक 250 mL तीन गर्दन वाले गोल-तले वाले फ्लास्क में 0.25 mM HAuCl4 समाधान के 99.5 mL जोड़ें। जोरदार सरगर्मी के तहत समाधान को 90 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें और 15 मिनट के लिए तापमान बनाए रखें।
    5. प्रतिक्रिया मिश्रण में 500 mM सोडियम साइट्रेट समाधान के 0.5 mL इंजेक्ट करें और तापमान और सरगर्मी को बनाए रखें जब तक कि समाधान का रंग रूबी-लाल न हो जाए।
      नोट: प्रतिक्रिया में लगभग 30 मिनट लगते हैं।
  2. गतिज-नियंत्रित विधि13 के माध्यम से Au NPs की बीजवृद्धि
    1. के रूप में संश्लेषित Au बीज समाधान 70 डिग्री सेल्सियस करने के लिए ठंडा.
    2. एक गिलास शीशी में 10 मिलीलीटर विआयनीकृत पानी के साथ 154.8 मिलीग्राम सोडियम साइट्रेट पाउडर को भंग करके 60 एमएम सोडियम साइट्रेट समाधान का 10 मिलीलीटर तैयार करें।
    3. 25 mM HAuCl4 समाधान के 0.67 mL और 60 mM सोडियम साइट्रेट समाधान के 0.67 mL को 2 मिनट के समय अंतराल के साथ Au बीज में इंजेक्ट करें।
    4. धीरे-धीरे Au NPs के आकार को 40 nm तक बढ़ाने के लिए चरण 1.2.3 को दोहराएं।
      नोट: यह 40 एनएम तक पहुंचने के लिए लगभग 10 बढ़ते चरणों को लेता है। आवश्यक चरणों की वास्तविक संख्या सटीक सेट-अप पर निर्भर हो सकती है।
  3. स्वचालित सिंथेसाइज़र का उपयोग कर Au NPs की सीडेड वृद्धि (चित्रा 2)
    1. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार सेंट्रीफ्यूज ट्यूब के लिए अनुभाग 1 में तैयार Au बीज समाधान के 25 mL हस्तांतरण और एक thermomixer में 70 डिग्री सेल्सियस करने के लिए ठंडा।
      नोट: 25 मिलीलीटर पानी युक्त 50 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में रखे गए थर्मोकपल थर्मामीटर का उपयोग करके थर्मोमिक्सर के अंदर के तापमान की निगरानी करें।
    2. 25 mM HAuCl4 समाधान के 2.5 mL के साथ एक 3 mL Luer ताला डिस्पोजेबल सिरिंज भरें। 60 mM सोडियम साइट्रेट समाधान के 2.5 mL के साथ एक और 3 mL Luer ताला डिस्पोजेबल सिरिंज भरें।
    3. सिरिंज पंपों में सिरिंज जगह और Luer-to-MicroTight एडाप्टर का उपयोग करने के लिए PEEK टयूबिंग (150 μm आंतरिक व्यास) सिरिंज के लिए कनेक्ट करने के लिए. थर्मोमिक्सर में एयू बीज समाधान युक्त सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में टयूबिंग डालें।
    4. दोनों सिरिंज पंपों को 20 मिनट (8.357 μL प्रति मिनट) से अधिक समाधान के 0.1675 मिलीलीटर वितरित करने के लिए सेट करें।
    5. थर्मोमिक्सर रोटेशन की गति को 700 आरपीएम पर सेट करें और 25 mM HAuCl4 समाधान वाले सिरिंज पंप पर प्रारंभ करें दबाएं।
    6. 2 मिनट के बाद, 60 mM सोडियम साइट्रेट समाधान युक्त सिरिंज पंप पर प्रारंभ दबाएँ ।
    7. HAuCl4 समाधान इंजेक्शन शुरू करने के 30 मिनट बाद, विश्लेषण के लिए Au NP समाधान का एक एलीकोट निकालें।
    8. धीरे-धीरे Au NPs के व्यास को 40 nm तक बढ़ाने के लिए चरण 1.3.5 – 1.3.7 को दोहराएं।
      नोट:: इस सेटअप का उपयोग चरण 1.3.4 में जोड़े गए अभिकारकों की मात्रा बढ़ाकर एक चरण में 40 nm तक Au NPs को विकसित करने के लिए किया जा सकता है। यह इंजेक्शन की एक ही दर को बनाए रखते हुए वितरण समय को बढ़ाकर प्राप्त किया जाता है।

2. Au NPs के लक्षण वर्णन

  1. यूवी-विज़ स्पेक्ट्रोस्कोपी
    1. एक अर्ध माइक्रो क्वार्ट्ज क्यूवेट के लिए Au NP समाधान के 1 mL जोड़ें।
    2. स्पेक्ट्रोमीटर चालू करें।
    3. तरंग दैर्ध्य सीमा को 400 - 800 एनएम पर सेट करें।
    4. प्रत्येक नमूने के लिए यूवी-विज़ स्पेक्ट्रम प्राप्त करें।
  2. गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन (DLS)
    1. एक 0.22 μm फिल्टर के साथ एक प्लास्टिक अर्ध माइक्रो cuvette में नमूना समाधान फ़िल्टर.
    2. DLS उपकरण चालू करें।
    3. तापमान को 25 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें और 60 सेकंड के लिए संतुलित करें।
    4. प्रत्येक नमूने के हाइड्रोडायनामिक आकार को मापें।
  3. संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (TEM)
    1. ड्रॉप-कास्ट एक सी-लेपित 300-जाल Cu ग्रिड पर नमूना समाधान की एक 5 μL बूंद और हवा में सूखी.
      नोट:: एक TEM ग्रिड पर अच्छी तरह से बिखरे हुए Au NPs प्राप्त करने के लिए अधिक केंद्रित Au NP समाधान नमूनों के लिए कमजोर पड़ने की आवश्यकता है।
    2. 200 kV त्वरण वोल्टेज पर एक TEM का उपयोग कर प्रत्येक नमूने के लिए एकाधिक TEM छवियों का अधिग्रहण करें।
    3. औसत आकार और मानक विचलन की गणना करने के लिए ImageJ का उपयोग करके प्रत्येक नमूने के लिए 200 Au NPs के व्यास को मापें।

3. CB7-UA परिसरों का गठन

  1. 0.4 mM CB7 समाधान की तैयारी
    1. एक 15 मिलीलीटर कांच की शीशी के लिए CB7 के 4.65 मिलीग्राम जोड़ें।
      नोट: CB7 की मात्रा CB7 (= 1163 Da) के सूत्र वजन के आधार पर परिकलित की जाती है जिसे साहित्य में अधिकांश रिपोर्टों द्वारा नियोजित किया गया है। फिर भी, CB7 ठोस नमूनों में आमतौर पर संश्लेषण और शुद्धिकरण चरणों से छोड़े गए पानी, HCl, मेथनॉल और अन्य लवण होते हैं, जो नमूने में ~ 10 - 20% मृत वजन में योगदान देते हैं। फंसे हुए सॉल्वैंट्स और लवण को वैक्यूम ओवन या अन्य साधनों में गर्म करके नहीं हटाया जा सकता था। उनकी मात्रा नमूनों के विभिन्न बैचों के बीच भिन्न होती है लेकिन मौलिक विश्लेषण का उपयोग करके निर्धारित की जा सकती है। फिर भी, प्रस्तुत प्रोटोकॉल CB7 नमूनों में सॉल्वैंट्स और लवण की अपरिमाणित मात्रा की उपस्थिति के प्रति संवेदनशील नहीं है।
    2. शीशी में 10 मिली लीटर पानी डालें और कैप को कस लें।
    3. CB7 ठोस पूरी तरह से भंग हो जाता है जब तक कि कमरे के तापमान पर नमूने sonicate.
      नोट: CB7 को साहित्य27 के अनुसार संश्लेषित किया गया था, लेकिन यह व्यावसायिक रूप से भी उपलब्ध है।
  2. 0.4 mM UA समाधान की तैयारी
    1. एक 50 mL सेंट्रीफ्यूज ट्यूब के लिए यूए के 2.69 मिलीग्राम जोड़ें।
    2. ट्यूब में 40 मिलीलीटर पानी डालें और टोपी को कस लें।
    3. 70 डिग्री सेल्सियस के लिए तापमान, 800 आरपीएम के लिए गति और 2 घंटे के लिए समय सेट करके नमूना समाधान को घुमाने के लिए एक थर्मोमिक्सर का उपयोग करें। समाधान को कमरे के तापमान पर ठंडा होने दें।
      नोट: यूए में पानी में कम घुलनशीलता है (0.40 mM)5. लंबे समय तक घूमना यदि यूए पाउडर पूरी तरह से भंग नहीं किया गया है। वैकल्पिक रूप से, ultrasonication विघटन की सुविधा के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  3. 0.4 mM UA समाधान के अनुक्रमिक dilutions
    1. 0.2 mM UA समाधान के 10 mL देने के लिए 15 mL कांच की शीशी में 5 mL पानी के साथ 0.4 mM UA समाधान के 5 mL को पतला करें। टोपी कस और 30 s के लिए sonicate.
    2. तालिका 1 में वर्णित के रूप में UA और पानी की एक उचित मात्रा का उपयोग करके चरण 3.3.1 को दोहराएँ।
  4. CB7-UA परिसरों की तैयारी
    1. 0.4 mM CB7 समाधान के 0.75 mL और 1.5 mL ट्यूब में 0.4 mM UA समाधान के 0.75 mL जोड़ें। ढक्कन सुरक्षित और 30 s के लिए sonicate.
    2. मेजबान-अतिथि परिसरों के गठन को सुनिश्चित करने के लिए 30 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
    3. विभिन्न सांद्रता के यूए समाधान का उपयोग करके चरण 3.4.1 – 3.4.2 को दोहराएं।

4. यूए के SERS संवेदन

  1. रमन प्रणाली का प्रयोगात्मक सेट-अप (चित्र 3)
    1. 633 एनएम हे-ने लेजर (22.5 mW) पर स्विच करें।
    2. मॉड्यूलर रमन स्पेक्ट्रोमीटर पर स्विच करें।
    3. कंप्यूटर पर स्विच करें और सॉफ़्टवेयर प्रारंभ करें।
    4. स्पेक्ट्रोस्कोपी अनुप्रयोग विज़ार्ड चिह्न क्लिक करें, और उसके बाद रमनका चयन करें।
    5. एक नया अधिग्रहण शुरू करें। एकीकरण समय को 30 सेकंड पर सेट करें, 5 तक औसत करने के लिए स्कैन करता है और बॉक्सकार को 0 पर।
    6. पृष्ठभूमि स्पेक्ट्रम स्टोर करें और लेजर तरंग दैर्ध्य (यानी, 633 एनएम) दर्ज करें।
      नोट: एकीकरण समय प्रत्येक स्कैन के लिए समय है, औसत करने के लिए स्कैन स्कैन प्रत्येक स्पेक्ट्रम और boxcar औसत28 पड़ोसी पिक्सेल की संख्या है बनाने के लिए औसत स्कैन की संख्या है।
  2. SERS substrates का गठन
    1. 40 nm Au NP समाधान के 0.9 mL और एक 1.5 mL ट्यूब में पूर्व-गठित CB7-UA जटिल समाधान के 0.1 mL जोड़ें। ढक्कन सुरक्षित और sonicate जब तक समाधान रूबी-लाल से बैंगनी करने के लिए बदल जाता है.
      नोट: वाणिज्यिक साइट्रेट-स्थिर 40 एनएम एयू एनपी समाधान नमूनों का भी उपयोग किया जा सकता है। आमतौर पर, स्थानीयकृत सतह प्लास्मोन अनुनाद (एलएसपीआर) शिखर का ऑप्टिकल घनत्व केंद्रित स्टॉक समाधान नमूनों से कमजोर पड़ने के माध्यम से 1 में समायोजित किया जाता है। नमूने में साइट्रेट एकाग्रता आमतौर पर 2 mM के रूप में रखा जाता है।
    2. नमूना समाधान को एक अर्ध-सूक्ष्म क्यूवेट में स्थानांतरित करें। रमन नमूना धारक में cuvette जगह और कवर बंद.
    3. माप प्रारंभ करें.
    4. लगातार पांच SERS स्पेक्ट्रा रिकॉर्ड करने के लिए ऑटो-सेविंग सेट करें।
    5. माप रोकें और नमूना परिवर्तित करें।
    6. चरण 4.2.1 - 4.2.5 को विभिन्न सांद्रता के CB7-UA समाधान का उपयोग करके दोहराएं।
      नोट: एकत्रीकरण समय को नैनोएग्रीगेट्स में यूए की एकाग्रता पर निर्भर पाया जाता है, जो 0.1 μM UA के लिए 30 s से लेकर 20 μM UA के लिए 30 मिनट तक होता है, खाली CB7 की एकाग्रता में अंतर के कारण, जिसका Au NPs के एकत्रीकरण की मध्यस्थता करने में प्रमुख योगदान है। CB7-UA कॉम्प्लेक्स के लिए, एक पोर्टल को भारी यूए अणु द्वारा अवरुद्ध किया जाता है, जो इसे एयू एनपी सतह पर बाध्यकारी के लिए अनुपलब्ध बनाता है और इसलिए एनपी एकत्रीकरण21 की मध्यस्थता करने में असमर्थ होता है। नमूना माप के लिए तैयार है जब समाधान का रंग रूबी-लाल से बैंगनी में बदल जाता है।

5. डेटा विश्लेषण

  1. डेटा संसाधन
    1. डाउनलोड करें और मूल में असममित कम से कम वर्गों (ALS) प्लगइन के साथ आधार रेखा स्थापित करें।
      नोट: ALS प्लगइन OriginPro की आवश्यकता है।
    2. मूल में कच्चा डेटा सम्मिलित करें.
    3. प्रत्येक नमूने के पांच SERS स्पेक्ट्रा से एक औसत मान की गणना करें। मान को लेजर की शक्ति (यानी, 22.5 mW) और एकीकरण समय (यानी, 30 s) से विभाजित करें।
    4. संवाद खोलने के लिए ALS चिह्न क्लिक करें. असममित कारक को 0.001 पर सेट करें, थ्रेशोल्ड को 0.03% तक, 2 पर स्मूथिंग फैक्टर और प्रत्येक औसत स्पेक्ट्रम की आधार रेखा को सही करने के लिए पुनरावृत्तियों की संख्या को 20 पर सेट करें।
    5. Y ऑफसेट द्वारा स्टैक्ड लाइनों का उपयोग करके विभिन्न यूए सांद्रता के SERS स्पेक्ट्रा को प्लॉट करें। आउटपुट रमन शिफ्ट (सेमी -1) के खिलाफ तीव्रता (गिनती s-1 mW-1) होना चाहिए।

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Representative Results

प्रस्तुत Au NP संश्लेषण में, UV-Vis स्पेक्ट्रा 10 बढ़ते चरणों (चित्रा 4A, B) के बाद 521 nm से 529 nm तक LSPR चोटियों का एक बदलाव दिखाता है, जबकि DLS डेटा एक संकीर्ण आकार वितरण दिखाता है क्योंकि Au NPs का आकार 25.9 nm से 42.8 nm (चित्रा 4C,D) तक बढ़ जाता है। TEM छवियों (चित्रा 4E) से मापा गया G0, G5 और G10 का औसत आकार क्रमशः 20.1 ± 2.1 nm, 32.5 ± 2.3 nm और 40.0 ± 2.2 nm है, जिसमें प्रत्येक मामले में 200 कणों की गणना की जाती है। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि यह प्रोटोकॉल समान और संकीर्ण रूप से बिखरे हुए एयू एनपी को संश्लेषित करने में प्रभावी है।

प्रस्तुत SERS अध्ययनों में, CB7 और UA के होस्ट-गेस्ट कॉम्प्लेक्स का गठन खाली CB7 के साथ Au NP के भीतर सटीक प्लास्मोनिक नैनोजंक्शन के गठन की मध्यस्थता के साथ किया गया था: CB7 nanoagregates, जैसा कि SERS स्पेक्ट्रम (चित्रा 5A) में विशेषता UA संकेतों द्वारा समर्थित है।

CB (+द्वारा चिह्नित) और UA (*द्वारा चिह्नित) की रमन चोटियों के लिए असाइनमेंट तालिका 2 में दिखाए गए हैं। इसके विपरीत, CB7 की अनुपस्थिति में UA के कोई SERS संकेत नहीं देखे जा सकते हैं, जो Au NPs के एकत्रीकरण को ट्रिगर करने में CB7 की महत्वपूर्ण भूमिका को दर्शाते हैं।

20 μM की एक निरंतर CB7 एकाग्रता का उपयोग यूए के एसईआरएस अनुमापन में किया गया था ताकि पुनरुत्पादक प्लास्मोनिक नैनोस्ट्रक्चर (यानी, SERS सब्सट्रेट) के इन सीटू गठन को सुनिश्चित किया जा सके। इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत पहचान योजना की उच्च संवेदनशीलता को 640 सेमी -1 और 1130 सेमी -1 (कंकाल की अंगूठी विरूपण और सी-एन कंपन के लिए जिम्मेदार क्रमशः) पर यूए चोटियों से स्पष्ट एसईआरएस संकेतों के अवलोकन द्वारा प्रदर्शित किया गया था, जो ~ 0.2 μM (चित्रा 5बी-डी) तक नीचे था, जिसे पता लगाने की सीमा के रूप में जाना जाता है। इसके अलावा, SERS तीव्रता और UA की लॉग एकाग्रता के बीच बहुत मजबूत सहसंबंध (R2 > 0.98) दोनों चोटियों के लिए शक्ति कानून द्वारा प्राप्त किए गए थे, जिसमें रैखिक क्षेत्रों को 0.2 से 2 μM (चित्रा 5E,F) की सीमा में पाया गया था। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि SERS तीव्रता और लॉग एकाग्रता के बीच रैखिक सहसंबंध को विश्लेषक सांद्रता की एक संकीर्ण सीमा के लिए अनुमानित किया जा सकता है, जबकि SERS सिग्नल 0 तक पहुंचता है जब लॉग एकाग्रता नकारात्मक अनंतता (यानी, विश्लेषक एकाग्रता दृष्टिकोण 0) तक पहुंचती है, जैसा कि हमारे डेटा में देखा गया है। SERS संकेत भी अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं जैसा कि चित्रा 5ई, एफ में दिखाए गए छोटे त्रुटि सलाखों से स्पष्ट है।

Figure 1
चित्रा 1: स्व-इकट्ठे एयू एनपी के भीतर सटीक प्लास्मोनिक नैनोजंक्शन का योजनाबद्ध चित्रण: CB7 nanoagregates। इनसेट प्लास्मोनिक नैनोजंक्शन का एक ज़ूम-इन दिखाता है जहां एकत्रीकरण को खाली सीबी 7 द्वारा मध्यस्थता की जाती है जबकि यूए मेजबान-अतिथि जटिलता के माध्यम से एयू एनपी की सतह पर समृद्ध होता है। यह ध्यान दिया जाता है कि योजना पैमाने पर तैयार नहीं की गई है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: (ए) योजनाबद्ध चित्रण और (बी) स्वचालित एयू एनपी सिंथेसाइज़र की तस्वीर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: रमन प्रणाली का योजनाबद्ध चित्रण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: एयू एनपी के प्रतिनिधि लक्षण वर्णन। (ए) एयू एनपी के यूवी-विज़ स्पेक्ट्रा और (बी) ज़ूम-इन स्पेक्ट्रा एलएसपीआर चोटियों के स्थानांतरण को दिखाते हुए बढ़ते चरणों की संख्या 10 तक बढ़ जाती है। (सी) एयू एनपी का हाइड्रोडायनामिक आकार और (डी) बढ़ते चरणों की संख्या के एक समारोह के रूप में कण आकार के संबंधित भूखंड। (ई) एयू एनपी की टीईएम छवियां, 5 और 10 बढ़ते चरणों के बाद एयू बीज और एयू एनपी के आकार दिखाती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: Au NP के भीतर यूए का पता लगाने के प्रतिनिधि SERS परिणाम: CB7 nanoagregates. (ए) CB7 की उपस्थिति या अनुपस्थिति में यूए के SERS स्पेक्ट्रा। CB7 और UA की रमन चोटियों को क्रमशः + और * द्वारा चिह्नित किया गया है। (बी) पूर्ण रेंज, (सी) 600 - 700 सेमी -1 ज़ूम-इन और (डी) 1100 - 1180 सेमी -1 ज़ूम-इन एसईआरएस स्पेक्ट्रा यूए के 0 से 20 μM तक सांद्रता के साथ। यूए की मुख्य रमन चोटियों को * द्वारा चिह्नित किया गया है। स्पेक्ट्रा को बेसलाइन को सही किया गया था और स्पष्टता के लिए ऑफसेट किया गया था। (E,F) यूए की एकाग्रता के खिलाफ SERS चोटी तीव्रता के इसी भूखंडों. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

UA स्टॉक समाधान (μM) के Conc. यूए स्टॉक समाधान के Vol. जोड़ा (mL) पानी का Vol. जोड़ा गया (mL) नए यूए स्टॉक समाधान (μM) के Conc.
400 5 5 200
200 5 5 100
100 4 6 40
40 5 5 20
20 5 5 10
10 4 6 4
4 5 5 2

तालिका 1: यूए समाधान के अनुक्रमिक dilutions.

CB7 UA
SERS शिखर (सेमी-1) पीक असाइनमेंट SERS शिखर (सेमी-1) पीक असाइनमेंट
446 अंगूठी कैंची मोड 491 C-N-C अंगूठी कंपन
831 वलय विरूपण 640 कंकाल वलय विरूपण
1375 सममित सी-एन खींच 896 N-H झुकना
1420 असममित सी-एन खिंचाव 1020 वलय कंपन
- - 1130 C-N कंपन
- - 1202 एन-सी-सी खींच और झुकना

तालिका 2: CB7 और UA2,4,29 के रमन चोटियों के लिए असाइनमेंट।

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Discussion

प्रोटोकॉल में वर्णित स्वचालित संश्लेषण विधि बढ़ते आकार के एयू एनपी को पुन: संश्लेषित करने की अनुमति देती है। हालांकि कुछ तत्व हैं जिन्हें अभी भी मैन्युअल रूप से किए जाने की आवश्यकता है, जैसे कि बीज संश्लेषण के दौरान सोडियम साइट्रेट के तेजी से जोड़ना और यह सुनिश्चित करने के लिए समय-समय पर जांच करना कि पीक टयूबिंग सुरक्षित है, यह विधि बड़े आकार (40 एनएम तक) के एयू एनपी की अनुमति देती है, जिसे आमतौर पर HAuCl4 और सोडियम साइट्रेट के कई मैनुअल इंजेक्शन की आवश्यकता होती है, समय की एक लंबी अवधि में निरंतर इसके अलावा के माध्यम से संश्लेषित किया जा करने के लिए।

सीबी परिसरों की मौलिक संपत्ति को स्पष्ट करने के लिए आगे के लक्षण वर्णन किए जा सकते हैं। उदाहरण के लिए, मेजबान-अतिथि परिसरों के गठन की पुष्टि आमतौर पर 1एच परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) का उपयोग करके की जा सकती है, जिसे 21,22,25 के जटिलीकरण के मामले में अपफील्ड शिफ्ट और संकेतों के विस्तार को दिखाना चाहिए। फिर भी 1एच एनएमआर गैर-विनिमय योग्य प्रोटॉन की कमी के कारण यूए पर लागू नहीं होता है। 13सी एनएमआर और मास स्पेक्ट्रोमेट्री जैसी वैकल्पिक तकनीकों को भी जटिलता को चिह्नित करने के लिए नियोजित किया जा सकता है। CB7 और UA के बीच बाध्यकारी स्थिरांक को अनुमापन तकनीकों का उपयोग करके मापा जा सकता है, जैसे कि UV-Vis स्पेक्ट्रोस्कोपी अनुमापन और समतापीय अनुमापन कैलोरीमेट्री (ITC)21,22,25। इस बीच बल-क्षेत्र और घनत्व कार्यात्मक सिद्धांत (डीएफटी) मॉडल के आधार पर आणविक मॉडलिंग की गणना मेजबान-अतिथि परिसरों 21,22,25,29 की बाध्यकारी ज्यामिति में सैद्धांतिक अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए की जा सकती है। इसके अलावा आईआर और रमन स्पेक्ट्रा की गणना आवृत्तियों की गणना21,25,29 द्वारा की जा सकती है।

SERS एक अत्यधिक संवेदनशील और चयनात्मक विश्लेषणात्मक तकनीक है जो उनके अणु-विशिष्ट कंपन उंगलियों के निशान के माध्यम से ट्रेस एनालिस्ट की पहचान की अनुमति देती है। SERS विभिन्न विज्ञान विषयों में रुचियों को प्राप्त कर रहा है, विशेष रूप से बायोमेडिकल अध्ययनों में, इसके बहुत बढ़े हुए संकेतों के कारण, बहुत कम अधिग्रहण समय और तरल पानी के लिए उच्च सहिष्णुता (बायोफ्लुइड्स में संवेदन के लिए उपयुक्त) 30,31,32,33,34,35। यूए संवेदन 1,2,3,4,36,37 पर पिछली रिपोर्टों के विपरीत, CB7 की कठोर संरचना कार्बोनिल पोर्टल बाइंडिंग के माध्यम से Au NPs के बीच 0.9 nm की सटीक रिक्ति को परिभाषित करती है जबकि सतह-बाउंड CB7 अपनी गुहा के भीतर यूए अणुओं को फंसा सकता है (चित्रा 1) ), जिसके परिणामस्वरूप मजबूत और स्थानीयकृत प्लास्मोनिक हॉटस्पॉट होते हैं, और इसलिए अत्यधिक संवेदनशील (~ 0.2 μM तक नीचे) और पुन: प्रस्तुत करने योग्य (2% त्रुटि के भीतर) SERS तीव्रता और लॉग एकाग्रता (चित्रा 5) के बीच बहुत मजबूत सहसंबंध (R2 > 0.98) के साथ UA के SERS संकेत।

CB7 की एकाग्रता को अनुकूलित करने के प्रयास में, हम ध्यान दें कि 20 μM CB7 का उपयोग पुनरुत्पादक SERS substrates के गठन को सुनिश्चित करने के लिए किया गया था। विशेष रूप से, उपयोग की जाने वाली CB7 की पूर्ण एकाग्रता समग्र प्रणाली (यानी, Au NPs, analytes और पृष्ठभूमि अणुओं, यदि कोई हो) पर निर्भर करती है 18,22। CB7 की एक उच्च सांद्रता का उपयोग किया जाना चाहिए यदि Au NPs का एकत्रीकरण बहुत धीमा है। इसके विपरीत, CB7 की कम सांद्रता का उपयोग किया जाना चाहिए यदि नमूना समाधान जल्दी से अवक्षेपित होता है और कम माप खिड़कियों की ओर जाता है। हमारी प्रयोगात्मक सेटिंग में CB7 द्वारा मध्यस्थता किए गए Au NPs के एकत्रीकरण से प्रसार-सीमित कोलाइडल एकत्रीकरण (DLCA) कैनेटीक्स19 का पालन करने की उम्मीद है, जिसमें खुले और लम्बी श्रृंखला जैसी संरचनाओं को अर्ध-भग्न नेटवर्क के रूप में एक साथ जुड़ने से पहले शुरू में तेजी से बनाया गया था। डीएलसीए कैनेटीक्स आमतौर पर एक उच्च सीबी: एयू एनपी अनुपात (संख्या द्वारा) पर होता है, जो हमारे मामले में 106: 1 के बराबर है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि यूरिक एसिड शारीरिक तरल पदार्थों (जैसे, रक्त सीरम, मूत्र) में उच्च सांद्रता पर मौजूद है। उदाहरण के लिए, यूरिक एसिड की सामान्य सांद्रता रक्त सीरम38 और 16 में 3.5 - 7.0 मिलीग्राम / डीएल है - मूत्र2 में क्रमशः 100 मिलीग्राम / डीएल (सामान्य एकाग्रता के ऊपर या नीचे एकाग्रता को हाइपरयूरिसीमिया और हाइपोयूरिसीमिया के रूप में जाना जाता है)39। इसलिए, इस अत्यधिक संवेदनशील योजना में बायोमार्कर का पता लगाने के लिए केवल बहुत कम मात्रा में नमूने की आवश्यकता होती है जहां नमूने की एकाग्रता को एक उपयुक्त सीमा तक कम करने के लिए एक उच्च कमजोर पड़ने वाले कारक का उपयोग किया जाता है। यह विशेष रूप से गंभीर रूप से बीमार रोगियों की देखभाल की निगरानी के लिए महत्वपूर्ण है जिनके मूत्र उत्सर्जन बहुत कम है। अत्यधिक पतले नमूनों के परिणामस्वरूप बड़े नमूना मात्रा होती है और इस प्रकार पानी के वाष्पीकरण और तरल हस्तांतरण के कारण नमूनों के नुकसान के कारण बायोमाकर्स के परिमाणीकरण में त्रुटियों को कम किया जाता है, जबकि मैट्रिक्स प्रभाव को कम करने सहित अन्य लाभदिए जाते हैं। इस जांच विधि की चयनात्मक प्रकृति के कारण, यह विश्लेषक अणुओं तक सीमित है जो सीबी के साथ मेजबान-अतिथि परिसर बना सकते हैं। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि अन्य अणुओं से हस्तक्षेप का निरीक्षण करना संभव है क्योंकि सीबी विभिन्न अतिथि अणुओं से बंध सकता है। फिर भी, जेल वैद्युतकणसंचलन और एचपीएलसी जैसे नमूना शुद्धिकरण को एसईआरएस माप से पहले किया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल में प्रदर्शित पहचान योजना में नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए एक जटिल मैट्रिक्स में बायोमाकर्स का मल्टीप्लेक्स डिटेक्शन करने की क्षमता होती है जब इसे उन्नत डेटा विश्लेषण तकनीकों के साथ जोड़ा जाता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

टीसीएल रॉयल सोसाइटी रिसर्च ग्रांट 2016 आर 1 (आरजी 150551) और ईपीएसआरसी (ईपी / पी 511262 / 1) द्वारा संस्थागत प्रायोजन पुरस्कार के माध्यम से वित्त पोषित यूसीएल बीम्स फ्यूचर लीडर अवार्ड से समर्थन के लिए आभारी है। WIKC, TCL और IPP EPSRC M3S CDT (EP/L015862/1) के माध्यम से A* STAR-UCL Research Attachment Programme द्वारा वित्त पोषित Studentship के लिए आभारी हैं। जीडी और टीजे अपने छात्रों को प्रायोजित करने के लिए EPSRC M3S CDT (EP / L015862 / 1) को धन्यवाद देना चाहते हैं। टीजे और टीसीएल ने टीजे के छात्रत्व में योगदान के लिए कैमटेक इनोवेशन को स्वीकार किया। सभी लेखकों UCL ओपन एक्सेस फंड के लिए आभारी हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
40 nm gold nanoparticles NanoComposix AUCN40-100M NanoXact, 0.05 mg/ mL, bare (citrate)
Centrifuge tube Corning Falcon 14-432-22 50 mL volume
Cucurbit[7]uril Lab-made see ref. 19
Gold(III) chloride trihydrate Sigma aldrich 520918 ≥99.9% trace metals basis
Luer lock disposable syringe Cole-Parmer WZ-07945-15 3 mL volume
Luer-to-MicroTight adapter LuerTight P-662 360 μm outer diameter Tubing to Luer Syringe
PEEK tubing IDEX 1572 360 μm outer diameter, 150 μm inner diameter
PEEK tubing cutter IDEX WZ-02013-30 Capillary Polymer Chromatography Tubing Cutter For 360 µm to 1/32" OD tubing
Raman spectrometer Ocean Optics QE pro
Sodium citrate tribasic dihydrate Sigma aldrich S4641 ACS reagent, ≥99.0%
Sonicator
Standard Probe Digi-Sense WZ-08516-55 Type-K
Syringe pump Aladdin ALADDIN2-220 2 syringes, maximum syringe volume 60 mL
Thermocouple thermometer Digi-Sense WZ-20250-91 Single-Input Thermocouple Thermometer with NIST-Traceable Calibration
ThermoMixer Eppendorf 5382000031 With an Eppendorf SmartBlock for 50 mL tubes
Uric acid Sigma aldrich U2625 ≥99%, crystalline

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References

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रसायन विज्ञान अंक 164 गोल्ड नैनोकणों स्वचालित सिंथेसाइज़र cucurbit[n] uril मेजबान-अतिथि जटिलता आत्म-विधानसभा सतह-बढ़ाया रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी सेंसर biomarkers रोगों के निदान
सोने के नैनोकणों और Cucurbit[n] uril के समुच्चय के भीतर सटीक प्लास्मोनिक नैनोजंक्शन के गठन के माध्यम से यूरिक एसिड का मात्रात्मक SERS पता लगाना[<em>n</em>] uril
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