Summary
Um complexo hospedeiro-convidado de cucurbit[7]uril e ácido úrico foi formado em uma solução aquosa antes de adicionar uma pequena quantidade em solução Au NP para a espectróscopia raman (SERS) com visão quantitativa de Raman (SERS) com um espectrômetro modular.
Abstract
Este trabalho descreve um método rápido e altamente sensível para a detecção quantitativa de um importante biomarcador, ácido úrico (UA), via espectrescopia raman aumentada pela superfície (SERS) com um baixo limite de detecção de ~0,2 μM para múltiplos picos característicos na região da impressão digital, usando um espectrômetro modular. Este esquema de biosensação é mediado pela complexidade hospedeira-hóspede entre um macrociclo, cucurbit[7]uril (CB7) e UA, e a subsequente formação de nanojunções plasmônicas precisas dentro do Au NP auto-montado: nanoaggregados CB7. Uma síntese fácil de Au NP de tamanhos desejáveis para substratos SERS também foi realizada com base na abordagem clássica de redução de citratos com uma opção a ser facilitada usando um sintetizador automatizado construído em laboratório. Este protocolo pode ser facilmente estendido à detecção multiplexada de biomarcadores em fluidos corporais para aplicações clínicas.
Introduction
O ácido úrico, que é o produto final do metabolismo de nucleotídeos de purina, é um importante biomarcador no soro sanguíneo e na urina para o diagnóstico de doenças como gota, pré-eclâmpsia, doenças renais, hipertensão, doenças cardiovasculares e diabetes 1,2,3,4,5. Os métodos atuais para detecção de ácido úrico incluem ensaios enzimáticos colorimétricos, cromatografia líquida de alto desempenho e eletroforese capilar, que são demorados, caros e requerem uma preparação amostral sofisticada 6,7,8,9.
A espectroscopia raman aprimorada na superfície é uma técnica promissora para o diagnóstico rotineiro de ponto de cuidado, pois permite a detecção seletiva de biomoléculas através de suas impressões digitais de vibração e oferece inúmeras vantagens como alta sensibilidade, resposta rápida, facilidade de uso e sem preparação ou mínima de amostras. Substratos sers baseados em nanopartículas metálicas nobres (por exemplo, NPs Au) podem aumentar os sinais de Raman das moléculas de analito em 4 a 10 ordens de magnitude10 através de forte aprimoramento eletromagnético causado pela ressonância de plasmon de superfície11. Os Au NPs de tamanhos sob medida podem ser facilmente sintetizados em oposição à fabricação demorada de nanocompositos metálicos complexos12, e, portanto, são amplamente utilizados em aplicações biomédicas devido às suas propriedades superiores 13,14,15,16. Apego de moléculas macrocíclicas, cucurbit[n]urils (CBn, onde n = 5-8, 10), na superfície dos NPs Au podem melhorar ainda mais os sinais sers das moléculas de analito, pois as moléculas de CB altamente simétricas e rígidas podem controlar o espaçamento preciso entre os Au NPs e localizar as moléculas de analito no centro ou nas proximidades dos hotspots plasmônicos através da formação de complexos hospedeiros-convidados (Figura 1)17, 18,19,20. Exemplos anteriores de estudos do SERS utilizando Au NP: CBn nanoagreguras incluem nitroexplosivos, aromáticos policíclicos, diaminostilbena, neurotransmissores e creatinina 21,22,23,24,25, com as medidas sers sendo realizadas em uma cuvette ou carregando uma pequena gota em um portador de amostra personalizado. Este esquema de detecção é particularmente útil para quantificar rapidamente biomarcadores em uma matriz complexa com uma alta reprodutibilidade.
Aqui, um método fácil para formar complexos hospedeiros-convidados de CB7 e um importante biomarcador UA, e quantificar UA com um limite de detecção de 0,2 μM via agregações mediadas por CB7 de Au NPs em mídia aquosa foi demonstrado usando um espectrômetro modular, o que é promissor para aplicações diagnósticas e clínicas.
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Protocol
1. Síntese de Au NPs
- Síntese de sementes de Au através do método turkevich convencional26
- Prepare 10 mL de solução HAuCl4 de 25 mM dissolvendo 98,5 mg de HAuCl4· 3H2O precursor com 10 mL de água deionizada em um frasco de vidro.
NOTA: Transfira uma pequena quantidade de precursor do HAuCl4 em um barco de pesagem e use uma espátula de plástico em vez de espátula metálica para pesar os cristais porque o precursor HAuCl4 irá corroer o labware metálico. A etapa de pesagem deve ser realizada o mais rápido possível, uma vez que o HAuCl4 é higroscópico e, portanto, aumentará seu peso ao longo do tempo absorvendo água da atmosfera. O HAuCl4 é altamente corrosivo e pode causar queimaduras graves na pele e danos nos olhos. Tome cuidado extra ao manuseá-lo. - Prepare 0,5 mL de solução de citrato de sódio de 500 mM dissolvendo 64,5 mg de pó de citrato de sódio com 0,5 mL de água desionizada em um frasco de vidro.
- Diluir 1 mL da solução HAuCl4 de 25 mM com água de 99 mL em uma garrafa de tampa azul de 250 mL para dar 100 mL de solução HAuCl4 de 0,25 mM.
- Adicione 99,5 mL da solução HAuCl4 de 0,25 mM em um frasco de três pescoços de três pescoços equipado com um condensador. Aqueça a solução a 90 °C sob agitação vigorosa e mantenha a temperatura por 15 minutos.
- Injete 0,5 mL da solução de citrato de sódio de 500 mM na mistura de reação e mantenha a temperatura e mexendo até que a cor da solução fique vermelho-rubi.
NOTA: A reação leva cerca de 30 minutos.
- Prepare 10 mL de solução HAuCl4 de 25 mM dissolvendo 98,5 mg de HAuCl4· 3H2O precursor com 10 mL de água deionizada em um frasco de vidro.
- Crescimento semeado de NPs Au através do método cineticamente controlado13
- Esfrie a solução de sementes Au sintetizada a 70 °C.
- Prepare 10 mL de solução citrato de sódio de 60 mM dissolvendo 154,8 mg de pó de citrato de sódio com 10 mL de água desionizada em um frasco de vidro.
- Injete 0,67 mL da solução de 25 mM HAuCl4 e 0,67 mL da solução de citrato de sódio de 60 mM para as sementes de Au com intervalo de tempo de 2 min.
- Repita o passo 1.2.3 para aumentar gradualmente o tamanho de Au NPs para 40 nm.
NOTA: É preciso cerca de 10 passos de crescimento para chegar a 40 nm. O número real de etapas necessárias pode depender da configuração precisa.
- Crescimento semeado de NPs Au usando sintetizador automatizado (Figura 2)
- Transfira 25 mL da solução de sementes Au preparada na seção 1 para um tubo de centrífuga cônica de 50 mL e esfrie a 70 °C em um termomixer.
NOTA: Monitore a temperatura dentro do termomixer usando um termômetro termopar colocado em um tubo de centrífuga de 50 mL contendo 25 mL de água. - Encha uma seringa descartável Luer de 3 mL com 2,5 mL de solução HAuCl4 de 25 mM. Encha outra seringa descartável luer de 3 mL com 2,5 mL de solução de citrato de sódio de 60 mM.
- Coloque as seringas nas bombas de seringa e use adaptadores Luer-to-MicroTight para conectar o tubo PEEK (150 μm de diâmetro interno) às seringas. Insira a tubulação no tubo centrífuga contendo a solução de sementes de Au no termomixer.
- Coloque ambas as bombas de seringa para dispensar 0,1675 mL de solução acima de 20 min (8.357 μL por minuto).
- Defina a velocidade de rotação do termomixer para 700 rpm e pressione Inicie a bomba de seringa contendo a solução HAuCl4 de 25 mM.
- Após 2 min, pressione Inicie a bomba de seringa contendo a solução de citrato de sódio de 60 mM.
- 30 min após iniciar a injeção da solução HAuCl4 , remova uma alíquota da solução Au NP para análise.
- Repetir as etapas 1.3.5 – 1.3.7 para aumentar gradualmente o diâmetro dos Au NPs até 40 nm.
NOTA: Esta configuração pode ser usada para crescer NPs Au até 40 nm em um passo, aumentando o volume de reagentes adicionados na etapa 1.3.4. Isso é conseguido aumentando o tempo de dispensação, mantendo a mesma taxa de injeção.
- Transfira 25 mL da solução de sementes Au preparada na seção 1 para um tubo de centrífuga cônica de 50 mL e esfrie a 70 °C em um termomixer.
2. Caracterização de NPs Au
- Espectroscopia UV-Vis
- Adicione 1 mL da solução Au NP a um cuvette de quartzo semi-micro.
- Ligue o espectrômetro.
- Defina o comprimento de onda para 400 - 800 nm.
- Adquira o espectro UV-Vis para cada amostra.
- Dispersão dinâmica de luz (DLS)
- Filtre a solução amostral em uma cuvette semi-micro de plástico com um filtro de 0,22 μm.
- Ligue o instrumento DLS.
- Coloque a temperatura em 25 °C e equilibre para 60 s.
- Meça o tamanho hidrodinâmico de cada amostra.
- Microscopia eletrônica de transmissão (TEM)
- Coloque uma gota de 5 μL da solução de amostra em uma grade revestida de 300 malhas C e seque no ar.
NOTA: A diluição é necessária para amostras de solução Au NP mais concentradas para obter NPs Au bem dispersos em uma grade TEM. - Adquira várias imagens TEM para cada amostra usando um TEM a 200 kV de aceleração.
- Meça o diâmetro de 200 NPs Au para cada amostra usando ImageJ para calcular o tamanho médio e o desvio padrão.
- Coloque uma gota de 5 μL da solução de amostra em uma grade revestida de 300 malhas C e seque no ar.
3. Formação de complexos CB7-UA
- Preparação da solução CB7 de 0,4 mM
- Adicione 4,65 mg de CB7 a um frasco de vidro de 15 mL.
NOTA: O valor do CB7 é calculado com base no peso da fórmula de CB7 (= 1163 Da) que tem sido empregado pela maioria dos relatórios na literatura. No entanto, as amostras sólidas cb7 normalmente contêm água, HCl, metanol e outros sais deixados a partir das etapas de síntese e purificação, contribuindo para ~10 – 20% de peso morto na amostra. Os solventes e sais presos não puderam ser removidos por aquecimento em um forno a vácuo ou outros meios. Suas quantidades variam entre diferentes lotes de amostras, mas podem ser quantificadas por meio de análise elementar. No entanto, o protocolo apresentado não é sensível à presença de quantidade não quantificada de solventes e sais nas amostras do CB7. - Adicione 10 mL de água ao frasco e aperte a tampa.
- Sonicar a amostra à temperatura ambiente até que o sólido CB7 seja completamente dissolvido.
NOTA: O CB7 foi sintetizado de acordo com a literatura27 , mas também está disponível comercialmente.
- Adicione 4,65 mg de CB7 a um frasco de vidro de 15 mL.
- Preparação de solução UA de 0,4 mM
- Adicione 2,69 mg de UA a um tubo de centrífuga de 50 mL.
- Adicione 40 mL de água ao tubo e aperte a tampa.
- Use um termomixer para rodar a solução amostral, definindo a temperatura para 70 °C, velocidade de 800 rpm e tempo para 2h. Deixe a solução esfriar até a temperatura ambiente.
NOTA: A UA tem baixa solubilidade na água (0,40 mM)5. Gire por mais tempo se o pó UA não tiver sido completamente dissolvido. Alternativamente, a ultrassonização pode ser usada para facilitar a dissolução.
- Diluições sequenciais da solução UA de 0,4 mM
- Diluir 5 mL da solução UA de 0,4 mM com água de 5 mL em um frasco de vidro de 15 mL para dar 10 mL de solução UA de 0,2 mM. Aperte a tampa e sonicate por 30 s.
- Repita a etapa 3.3.1 usando uma quantidade apropriada de UA e água conforme descrito na Tabela 1.
- Preparação dos complexos CB7-UA
- Adicione 0,75 mL da solução CB7 de 0,4 mM e 0,75 mL de solução UA de 0,4 mM em um tubo de 1,5 mL. Fixar a tampa e sonicar por 30 s.
- Aguarde 30 min para garantir a formação de complexos hospedeiros-convidados.
- Repita o passo 3.4.1 – 3.4.2 usando a solução UA de diferentes concentrações.
4. Sensoriamento sers de UA
- Configuração experimental do sistema Raman (Figura 3)
- Ligue o laser He-Ne de 633 nm (22,5 mW).
- Ligue o espectrômetro modular Raman.
- Ligue o computador e inicie o software.
- Clique no ícone de assistente de aplicativo spectroscopia e selecione Raman.
- Comece uma nova aquisição. Defina o tempo de integração para 30 s, as varreduras para a média de 5 e o boxcar a 0.
- Armazene espectro de fundo e digite o comprimento de onda laser (ou seja, 633 nm).
NOTA: O tempo de integração é o tempo para cada varredura, as varreduras a média é o número de varreduras médias para criar cada espectro e o boxcar é o número de pixels vizinhos em média28.
- Formação dos substratos sers
- Adicione 0,9 mL da solução Au NP de 40 nm e 0,1 mL da solução do complexo CB7-UA pré-formada em um tubo de 1,5 mL. Fixar a tampa e sonicar até que a solução mude de vermelho-rubi para roxo.
NOTA: Também podem ser utilizadas amostras de solução Au NP estabilizadas por citrato comercial de 40 nm. Normalmente, a densidade óptica do pico de ressonância de plasmon de superfície localizada (LSPR) é ajustada para 1 através de diluição de amostras concentradas de solução de estoque. A concentração de citrato na amostra é tipicamente mantida como 2 mM. - Transfira a solução amostral para um semi-micro cuvette. Coloque a cuvette no suporte de amostra Raman e feche a tampa.
- Comece a medição.
- Configure a economia automática para registrar cinco espectros sers consecutivos.
- Pare a medição e altere a amostra.
- Repita o passo 4.2.1 – 4.2.5 usando a solução CB7-UA de diferentes concentrações.
NOTA: O tempo de agregação é considerado dependente da concentração de UA nos nanoagregados, variando de 30 s para 0,1 μM UA a 30 min para 20 μM UA, devido à diferença na concentração de CB7 vazio que tem grande contribuição para mediar a agregação de Au NPs. Para o complexo CB7-UA, um portal é bloqueado pela molécula UA volumosa, tornando-o indisponível para ligação à superfície Au NP e, portanto, incapaz de mediar a agregação NP21. A amostra está pronta para medição quando a cor da solução mudar de vermelho-rubi para roxo.
- Adicione 0,9 mL da solução Au NP de 40 nm e 0,1 mL da solução do complexo CB7-UA pré-formada em um tubo de 1,5 mL. Fixar a tampa e sonicar até que a solução mude de vermelho-rubi para roxo.
5. Análise de dados
- Processamento de dados
- Baixe e instale a linha de base com plugin assimétrico de quadrados mínimos (ALS) no Origin.
NOTA: O plugin ALS requer OriginPro. - Insira os dados brutos na Origem.
- Calcule um valor médio a partir dos cinco espectros SERS de cada amostra. Divida o valor pela potência do laser (ou seja, 22,5 mW) e pelo tempo de integração (ou seja, 30 s).
- Clique no ícone ALS para abrir a caixa de diálogo. Defina o fator assimétrico para 0,001, limiar para 0,03 %, fator de suavização para 2 e número de iterações para 20 para corrigir a linha de base de cada espectro médio.
- Plote o espectro SERS de diferentes concentrações de UA usando linhas empilhadas por y deslocamentos. A saída deve ser intensidade (conta s-1 mW-1) contra o câmbio Raman (cm-1).
- Baixe e instale a linha de base com plugin assimétrico de quadrados mínimos (ALS) no Origin.
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Representative Results
Na síntese de Au NP apresentada, os espectros UV-Vis mostram uma mudança dos picos de LSPR de 521 nm para 529 nm após 10 passos de crescimento (Figura 4A,B) enquanto os dados do DLS mostram uma distribuição de tamanho estreito à medida que o tamanho dos NPs Au aumenta de 25,9 nm para 42,8 nm (Figura 4C,D). Os tamanhos médios de G0, G5 e G10 medidos a partir de imagens TEM (Figura 4E) são de 20,1 ± 2,1 nm, 32,5 ± 2,3 nm e 40,0 ± 2,2 nm, respectivamente, com 200 partículas contadas em cada caso. Esses resultados indicam que este protocolo é eficaz na sintetização uniforme e por pouco disperso Au NPs.
Nos estudos apresentados do SERS, os complexos hospedeiros-convidados de CB7 e UA foram formados com CB7 vazio mediando a formação de nanojunções plasmônicas precisas dentro do Au NP: nanoagregadores CB7, como suportado pelos sinais ua característicos no espectro SERS (Figura 5A).
As atribuições para os picos Raman de CB (marcado por +) e UA (marcados por *) são mostradas na Tabela 2. Por outro lado, nenhum sinal sers de UA pode ser observado na ausência de CB7, ilustrando o papel-chave do CB7 no desencadeamento da agregação de NPs Au.
Uma concentração cb7 constante de 20 μM foi utilizada na titulação sers de UA em todo o modo de garantir a formação in situ de nanoestruturas plasmônicas reprodutíveis (ou seja, substratos SERS). A alta sensibilidade do esquema de detecção apresentado neste protocolo foi demonstrada pela observação de sinais sers claros dos picos ua a 640 cm-1 e 1130 cm-1 (atribuído à deformação do anel esquelético e vibração C-N, respectivamente) até ~0,2 μM (Figura 5B−D), que é conhecido como o limite de detecção. Além disso, correlações muito fortes (R2 > 0,98) entre a intensidade do SERS e a concentração de troncos dos UA foram obtidas por lei de energia para ambos os picos, com regiões lineares encontradas na faixa de 0,2 a 2 μM (Figura 5E,F). Deve-se notar que correlações lineares entre a intensidade do SERS e a concentração de troncos podem ser aproximadas para uma faixa estreita de concentrações de analito, enquanto o sinal SERS se aproxima de 0 quando a concentração de tronco se aproxima do infinito negativo (ou seja, a concentração de analito se aproxima 0), como observado em nossos dados. Os sinais SERS também são altamente reprodutíveis, como evidenciado pelas pequenas barras de erro mostradas na Figura 5E,F.
Figura 1: Ilustração esquemática das nanojunções plasmônicas precisas dentro de Au NP auto-montado: nanoagregadores CB7. O inset mostra um zoom das nanojunções plasmônicas onde a agregação é mediada por CB7 vazio, enquanto o UA é enriquecido na superfície de Au NPs via complexação host-guest. Nota-se que o esquema não é atraído para escala. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: (a) Ilustração esquemática e (b) fotografia do sintetizador Au NP automatizado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Ilustração esquemática do sistema Raman. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Caracterização representativa de Au NPs. (A) Espectros UV-Vis de Au NPs e (B) espectros de zoom-in mostrando a mudança dos picos de LSPR à medida que o número de passos crescentes aumenta para 10. (C) Tamanho hidrodinâmico de NPs Au e (D) parcela correspondente do tamanho das partículas em função do número de etapas crescentes. (E) Imagens TEM de Au NPs, mostrando tamanhos de sementes de Au e NPs Au após 5 e 10 passos de crescimento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Resultados representativos do SERS da detecção de UA dentro de Au NP: nanoagregados CB7. (A) Espectros sers de UA na presença ou ausência de CB7. Os picos de Raman de CB7 e UA são marcados por + e * respectivamente. (B) Espectro de alcance completo, (C) 600 - 700 cm-1 zoom-in e (D) 1100 - 1180 cm-1 espectro sers zoom-in de UA com concentrações de 0 a 20 μM. Os picos principais de Raman da UA são marcados por *. Os espectros foram corrigidos e compensados para clareza. (E,F) Parcelas correspondentes da intensidade máxima do SERS contra a concentração de UA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Conc. da solução de ações UA (μM) | Vol. de solução de ações da UA adicionada (mL) | Vol. de água adicionada (mL) | Conc. da nova solução de ações da UA (μM) |
| 400 | 5 | 5 | 200 |
| 200 | 5 | 5 | 100 |
| 100 | 4 | 6 | 40 |
| 40 | 5 | 5 | 20 |
| 20 | 5 | 5 | 10 |
| 10 | 4 | 6 | 4 |
| 4 | 5 | 5 | 2 |
Tabela 1: Diluições sequenciais da solução UA.
| CB7 | UA | ||
| Pico sers (cm-1) | Atribuição de pico | Pico sers (cm-1) | Atribuição de pico |
| 446 | Modo tesoura de anel | 491 | Vibração do anel C-N-C |
| 831 | Deformação do anel | 640 | Deformação do anel esquelético |
| 1375 | Alongamento Symmetric C-N | 896 | Dobra de N-H |
| 1420 | Alongamento assimétrico C-N | 1020 | Vibração do anel |
| - | - | 1130 | Vibração C-N |
| - | - | 1202 | Alongamento e dobra de N-C-C |
Tabela 2: Atribuições para os picos raman de CB7 e UA 2,4,29.
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Discussion
O método de síntese automatizada descrito no protocolo permite que os Au NPs de tamanhos crescentes sejam reproduzidos. Embora existam alguns elementos que ainda precisam ser realizados manualmente, como a rápida adição de citrato de sódio durante a síntese de sementes e a verificação periódica para garantir que a tubulação PEEK seja segura, este método permite NPs Au de grandes tamanhos (até 40 nm), o que normalmente exigiria múltiplas injeções manuais de HAuCl4 e citrato de sódio, para ser sintetizado através de adição contínua durante um longo período de tempo.
Outra caracterização pode ser realizada para elucidar a propriedade fundamental dos complexos do CB. Por exemplo, a formação de complexos hospedeiros-convidados pode ser normalmente confirmada usando ressonância magnética nuclear de 1H (RMN), que deve mostrar mudança de campo e ampliação de sinais em caso de complexidade 21,22,25. No entanto, o NMR 1H não é aplicável à UA devido à sua falta de prótons não recaáveis. Técnicas alternativas como 13C NMR e espectrometria de massa também poderiam ser empregadas para caracterizar a complexidade. As constantes de ligação entre CB7 e UA podem ser medidas utilizando técnicas de titulação, como titulação de espectroscopia UV-Vis e calimetria de titulação isotérmica (ITC)21,22,25. Enquanto isso, a modelagem molecular baseada em modelos de teoria funcional de campo de força e densidade (DFT) pode ser calculada para obter insights teóricos sobre a geometria vinculante dos complexos hospedeiros-convidados 21,22,25,29. Além disso, os espectros ir e raman podem ser computados pelos cálculos de frequências 21,25,29.
SERS é uma técnica analítica altamente sensível e seletiva que permite a identificação de traços analitos através de suas impressões vibracionais específicas da molécula. A SERS está ganhando interesses em diferentes disciplinas científicas, em particular estudos biomédicos, devido aos seus sinais muito aprimorados, tempo de aquisição muito menor e alta tolerância à água líquida (adequado para detectar biofluidos)30,31,32,33,34,35. Em contraste com os relatórios anteriores sobre ua sentindo 1,2,3,3,36,37, a estrutura rígida do CB7 define espaçamento preciso de 0,9 nm entre Au NPs via ligação de portal de carbonismo, enquanto o CB7 ligado à superfície pode prender moléculas de UA dentro de sua cavidade (Figura 1 ), resultando em pontos de acesso plasmônico forte e localizado e, portanto, os altamente sensíveis (até ~0,2 μM) e reprodutíveis (dentro de 2% de erro) sinais sers de UA com correlações muito fortes (R2 > 0,98) entre a intensidade do SERS e a concentração de troncos (Figura 5).
Na tentativa de otimizar a concentração de CB7, notamos que 20 μM CB7 foi utilizado para garantir a formação de substratos sers reprodutíveis. Em particular, a concentração absoluta de CB7 utilizado depende do sistema global (ou seja, NPs Au, analitos e moléculas de fundo, se houver)18,22. Uma maior concentração de CB7 deve ser usada se a agregação de Au NPs for muito lenta. Por outro lado, uma menor concentração de CB7 deve ser usada se a solução amostral precipitar rapidamente e levar a janelas de medição mais curtas. Espera-se que a agregação de Au NPs mediada pelo CB7 em nosso ambiente experimental siga a cinética de agregação coloidal limitada de difusão (DLCA)19, na qual estruturas abertas e alongadas em forma de cadeia foram rapidamente formadas inicialmente antes de se unirem como rede quase fractal. A cinética DLCA normalmente ocorre em uma alta relação CB: Au NP (por número), o que equivale a 106:1 no nosso caso. Deve-se notar que o ácido úrico está presente em fluidos corporais (por exemplo, soro sanguíneo, urina) em maior concentração. Por exemplo, a concentração normal de ácido úrico é de 3,5 – 7,0 mg/dL no sorosanguíneo 38 e 16 – 100 mg/dL na urina2, respectivamente (concentração acima ou abaixo da concentração normal é conhecida como hiperuricemia e hipouricemia)39. Portanto, apenas uma pequena quantidade de amostra é necessária para a detecção de biomarcadores neste esquema altamente sensível onde um alto fator de diluição é usado para diminuir a concentração da amostra para uma faixa adequada. Isso é particularmente importante para o monitoramento de pontos de atendimento de pacientes em estado terminal cuja excreção de urina é muito baixa. Amostras altamente diluídas resultam em volumes amostrais maiores e, portanto, reduzem erros na quantificação de biomarcadores devido à evaporação da água e perda de amostras devido à transferência de líquido, ao mesmo tempo em que dão outras vantagens, incluindo minimizar os efeitos matriciais25. Devido à natureza seletiva deste método de sondagem, limita-se-se a moléculas analitos que podem formar complexos hospedeiros-convidados com CB. Deve-se notar que é possível observar interferências de outras moléculas porque o CB pode se ligar a diferentes moléculas convidadas. No entanto, a purificação amostral, como eletroforese gel e HPLC, pode ser realizada antes da medição do SERS.
O esquema de detecção demonstrado neste protocolo tem o potencial de detecção multiplexada de biomarcadores em uma matriz complexa para aplicações clínicas quando está acoplado a técnicas avançadas de análise de dados.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
A TCL agradece o apoio do Royal Society Research Grant 2016 R1 (RG150551) e do Prêmio líder futuro da UCL BEAMS financiado através do prêmio de Patrocínio Institucional da EPSRC (EP/P511262/1). WiKC, TCL e IPP agradecem ao Studentship financiado pelo Programa de Anexo de Pesquisa A*STAR-UCL através do CDT EPSRC M3S (EP/L015862/1). A GD e a TJ agradecem ao CDT EPSRC M3S (EP/L015862/1) pelo patrocínio de sua discuagem. TJ e TCL reconhecem a Camtech Innovations por contribuição ao ensino do TJ. Todos os autores são gratos ao Fundo de Acesso Aberto da UCL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40 nm gold nanoparticles | NanoComposix | AUCN40-100M | NanoXact, 0.05 mg/ mL, bare (citrate) |
| Centrifuge tube | Corning Falcon | 14-432-22 | 50 mL volume |
| Cucurbit[7]uril | Lab-made | see ref. 19 | |
| Gold(III) chloride trihydrate | Sigma aldrich | 520918 | ≥99.9% trace metals basis |
| Luer lock disposable syringe | Cole-Parmer | WZ-07945-15 | 3 mL volume |
| Luer-to-MicroTight adapter | LuerTight | P-662 | 360 μm outer diameter Tubing to Luer Syringe |
| PEEK tubing | IDEX | 1572 | 360 μm outer diameter, 150 μm inner diameter |
| PEEK tubing cutter | IDEX | WZ-02013-30 | Capillary Polymer Chromatography Tubing Cutter For 360 µm to 1/32" OD tubing |
| Raman spectrometer | Ocean Optics | QE pro | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma aldrich | S4641 | ACS reagent, ≥99.0% |
| Sonicator | |||
| Standard Probe | Digi-Sense | WZ-08516-55 | Type-K |
| Syringe pump | Aladdin | ALADDIN2-220 | 2 syringes, maximum syringe volume 60 mL |
| Thermocouple thermometer | Digi-Sense | WZ-20250-91 | Single-Input Thermocouple Thermometer with NIST-Traceable Calibration |
| ThermoMixer | Eppendorf | 5382000031 | With an Eppendorf SmartBlock for 50 mL tubes |
| Uric acid | Sigma aldrich | U2625 | ≥99%, crystalline |
References
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![Detecção quantitativa de sers de ácido úrico através da formação de nanojunções plasmônicas precisas dentro de Agregados de Nanopartículas de Ouro e Cucurbit[<em>n</em>]uril](https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/61682.jpg)
