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Biology

Optimización del crecimiento del cristal para la cristalografía macromolecular de neutrones

Published: March 13, 2021 doi: 10.3791/61685
Automatic Translation
1, 1,2, 1
1CEA, CNRS, IBS, Université Grenoble Alpes, 2ELVESYS SAS

Summary

Los estudios estructurales de biomacromolecules por cristalografía requieren cristales de alta calidad. Aquí demostramos un protocolo que puede ser utilizado por OptiCrys (un instrumento totalmente automatizado desarrollado en nuestro laboratorio) y / o botones de microdiálisis para el crecimiento de grandes cristales de alta calidad basados en el conocimiento del diagrama de fase de cristalización.

Abstract

El uso de cristalografía macromolecular de neutrones (NMX) se está expandiendo rápidamente con la mayoría de las estructuras determinadas en la última década gracias a la construcción de nuevas líneas de haz NMX y a una mayor disponibilidad de software de refinamiento de estructuras. Sin embargo, las fuentes de neutrones disponibles actualmente para NMX son significativamente más débiles que las fuentes equivalentes para la cristalografía de rayos X. A pesar de los avances en este campo, siempre serán necesarios cristales significativamente más grandes para los estudios de difracción de neutrones, particularmente con la tendencia a estudiar macromoléculas y complejos cada vez más grandes. Por lo tanto, son necesarias nuevas mejoras en los métodos y la instrumentación adecuados para el crecimiento de cristales más grandes para que el uso de NMX se expanda.

En este trabajo, introducimos estrategias racionales y un banco de crecimiento de cristal (OptiCrys) desarrollado en nuestro laboratorio que combina la observación en tiempo real a través de una cámara de vídeo montada en microscopio con un control automatizado preciso de las soluciones de cristalización (por ejemplo, concentración precipitante, pH, aditivo, temperatura). A continuación, demostramos cómo este control de la temperatura y la composición química facilita la búsqueda de condiciones óptimas de cristalización utilizando proteínas solubles modelo. El conocimiento exhaustivo del diagrama de fase de cristalización es crucial para seleccionar la posición inicial y la ruta cinética para cualquier experimento de cristalización. Mostramos cómo un enfoque racional puede controlar el tamaño y el número de cristales generados en función del conocimiento de diagramas de fase multidimensionales.

Introduction

Comprender la relación estructura-función de las proteínas y el mecanismo de las vías fisiológicas a menudo se basa en conocer las posiciones de los átomos de hidrógeno (H) y cómo se transfiere la carga dentro de una proteína1,2. Dado que los átomos de hidrógeno dispersan los rayos X débilmente, sus posiciones sólo se pueden determinar con datos de difracción de rayos X de muy alta resolución (>1 Å)3,4. Por el contrario, la cristalografía de neutrones se puede utilizar para obtener una posición precisa de átomos de hidrógeno en macromoléculas biológicas como hidrógeno y átomos de deuterio (H2,isótopo de hidrógeno) tienen longitudes de dispersión de aproximadamente la misma magnitud que el oxígeno, nitrógeno y carbono5. Sin embargo, el flujo de neutrones de las fuentes de neutrones disponibles es más débil que el de los haces de rayos X, por lo que a menudo debe compensarse con2,3. Esto se puede lograr intercambiando H con H2 y/o aumentando el volumen de cristales para reducir la dispersión incoherente de los hidrógenos y aumentar la relación señal-ruido de las imágenes de difracción.

Hay varios enfoques de cristalización (el diagrama de fase esquemática correspondiente se muestra en la Figura 1)para obtener cristales grandes y de alta calidad para la cristalografía bio-macromolecular de rayos X y neutrones6. En la difusión de vapor, una gota preparada a partir de una mezcla de una proteína y una solución de cristalización se equilibra con el tiempo, a través de la evaporación del agua u otras especies volátiles, contra un reservorio que contiene una mayor concentración de precipitante de la misma solución de cristalización. El aumento de la concentración de proteínas y precipitantes en la gota conduce a la sobresaturación necesaria para la nucleación espontánea seguida del crecimiento cristalino en estos núcleos6,7. Aunque la difusión de vapor es la técnica más utilizada para el cultivo de cristales4,el proceso de cristalización no se puede controlar con precisión8. En el método de difusión de interfaz libre, la solución de cristalización se difunde en una solución de proteína concentrada, dirigiendo muy lentamente el sistema hacia la sobresaturación. Este método se puede considerar como un método de lote con una velocidad de mezcla lenta6,9,10,11,12. En el método por lotes, la proteína se mezcla rápidamente con una solución de cristalización que conduce a una supersaturación rápida y a su vez nucleación uniforme con muchos cristales3,7. Este método representa aproximadamente un tercio de todas las estructuras actualmente depositadas en el Banco de Datos de Proteínas. El método de diálisis también se utiliza para el cultivo de cristales proteicos de alta calidad y bien diffracting. En el método de diálisis, las moléculas de difusa precipitante de un reservorio a través de una membrana semi-permeable en una cámara separada con la solución proteica. La cinética del equilibrio depende de varios factores, como la temperatura, el tamaño del poro de membrana y el volumen y concentración de muestras de proteínas y agentes de cristalización6.

Los diagramas de fase de cristalización se pueden utilizar para describir diferentes estados de una proteína en función de diferentes variables físicas o químicas3. Como se ilustra en la Figura 1,cada técnica de cristalización se puede visualizar como el uso de una trayectoria cinética diferente para llegar a las zonas de nucleación y metástasis de tal diagrama6,10,13. Esto proporciona información sobre la solubilidad proteica y la concentración de proteínas a la que se observa un equilibrio termodinámico entre el cristal y la solución, encontrando así las condiciones óptimas para la nucleación y el crecimiento3,14. En un diagrama de fase bidimensional, la concentración de proteínas se traza como una función de una variable y las otras variables se mantienen constantes15. En dicho diagrama de fase, cuando la concentración de proteínas está por debajo de la curva de solubilidad, la solución se encuentra en la región subsaturada y no se produce nucleación ni crecimiento de cristales. Por encima de esta curva se encuentra la zona de sobresaturación donde la concentración de proteínas es superior al límite de solubilidad3,14. Esto se divide además en tres regiones: la zona metástasis, la zona de nucleación espontánea y la zona de precipitación. En la zona metastásica, la sobresaturación no es suficiente para que la nucleación ocurra en un tiempo razonable, pero el crecimiento de los cristales de semillas puede tener lugar. La agregación y precipitación se favorecen en la zona de precipitación, donde la sobresaturación es demasiado alta14,15.

Cuando se logra una supersaturación suficiente para la nucleación espontánea, aparecerán los primeros núcleos10. El crecimiento de los cristales conduce a una reducción en la concentración de proteínas hasta que se alcanza el límite de solubilidad. Mientras la supersaturación permanezca en las proximidades de la curva de solubilidad, no habrá ningún cambio significativo en el tamaño de los cristales. Sin embargo, se ha demostrado que las variaciones en la temperatura y composición química de la solución de cristalización (por ejemplo, la concentración de precipitante) afectarán a la solubilidad proteica y pueden conducir al inicio de un mayor crecimiento de cristal8,13,16.

Como la diálisis es ventajosa para el crecimiento de cristales de buena calidad, el banco de cristalización OptiCrys ilustrado en la Figura 2, fue diseñado y desarrollado en nuestro laboratorio para controlar la cristalización de una manera totalmente automatizada8. Para ello, se escribió un software con LabVIEW que permite el control y seguimiento de la temperatura de una configuración de diálisis del depósito que fluye en contacto con los elementos Peltier, a través de un controlador electrónico y un enfriador. El mismo software también regula automáticamente la composición química de la solución de cristalización (por ejemplo, el intercambio de agentes de cristalización) utilizando un sistema fluido multicanal. Además, una cámara digital y un microscopio invertido se utilizan para visualizar y grabar el proceso de cristalización. Dos cámaras de cristalización con volúmenes de 15 μL y 250 μL están disponibles para el cultivo de cristales para diferentes propósitos. Como el proceso de cristalización es reversible, la detección de diferentes condiciones es posible con sólo unos pocos microlitros de la solución proteica siempre y cuando la muestra no se dañe8. Como resultado, el uso de este método minimiza la cantidad de material proteico utilizado.

Del trabajo anterior8,es evidente que durante el proceso de crecimiento del cristal, las observaciones in situ deben llevarse a cabo a intervalos de tiempo regulares. Estos pueden variar de unos segundos a varios días, dependiendo del evento en observación (precipitación, nucleación o crecimiento de cristal).

La optimización del crecimiento de cristales con OptiCrys se basa en diagramas de fase de concentración precipitantes a temperatura. En el caso de proteínas con solubilidad como función directa de la temperatura, es posible hacer uso del régimen de salazón18. Aquí es donde el aumento de la fuerza iónica de la solución, que se puede visualizar utilizando diagramas de fase precipitantes a proteínas, disminuye la solubilidad de la proteína. Asimismo, las proteínas con solubilidad inversa pueden hacer uso del régimen de salazón18. La nucleación se produce en la zona de nucleación, en las proximidades de la zona metástasis, y el crecimiento del cristal tiene lugar en la zona metástasis del diagrama de fase hasta que la concentración de proteínas alcanza el límite de solubilidad. Como se muestra en la Figura 3A, con temperatura de composición química constante se puede disminuir para mantener la solución de cristalización en la zona metástasis para evitar nuevas nucleación. Los cristales crecen hasta que se logra el segundo equilibrio cristal/solución y después de eso, no se observa ningún aumento adicional en el tamaño de los cristales. La temperatura se reduce varias veces hasta que los cristales alcanzan el tamaño deseado. En la Figura 3B,a temperatura constante, el aumento de la concentración precipitante mantiene la solución en la zona metástasis. Este proceso se puede repetir varias veces para obtener cristales grandes. Cambiar la temperatura y manipular las condiciones de la solución de cristalización, mediante el control de los niveles de sobresaturación, son dos potentes herramientas para separar la nucleación y el crecimiento de cristales que son controlados precisa y automáticamente por OptiCrys5,8,14.

En la literatura y el PDB están disponibles ejemplos de cristalización controlada por temperatura, temperatura y concentración precipitada, así como datos relativos de difracción obtenidos. Entre ellos se encuentran la γ-cristalina humana E, la lectina PA-IIL, la pirofosfatasa inorgánica de levadura, la urate oxidasa, la anhidrasis carbónica humana II, la quinasa YchB y lactato deshidrogenasa5,14,17,18.

Aunque OptiCrys fue comercializado por NatX-ray, hay muchos laboratorios que no tienen acceso a este instrumento o al enfoque en serie que ofrece. La alternativa a esta técnica es utilizar botones de microdiálisis plástica disponibles comercialmente con varios volúmenes. Con estos, la temperatura y la composición química se pueden ajustar y variar manualmente. La inspección de los botones de microdiálisis no se puede realizar in situ y, en su lugar, debe realizarse manualmente con un microscopio óptico. El control de temperatura se puede lograr manteniendo la muestra en una incubadora de temperatura controlada sin vibraciones. Es esencial mantener la temperatura constante para garantizar que los experimentos de cristalización sean reproducibles. Variación significativa de la temperatura también puede conducir a daños o destrucción de cristales5.

Aquí proporcionamos un protocolo detallado que describe la preparación de muestras y el uso de software de control para el crecimiento de cristales grandes y de alta calidad adecuados para la cristalografía de proteínas de neutrones. Este procedimiento paso a paso fue diseñado para aprovechar el diagrama de fase de cristalización con el fin de seleccionar una posición inicial y una ruta cinética para controlar el tamaño y la calidad de los cristales generados. Además, se presenta un protocolo detallado para el cultivo de cristales con botones de microdiálisis que utiliza la misma razón para obtener cristales grandes y de alta calidad.

Protocol

1. Método de diálisis con botones de microdiálisis

  1. Preparación de muestras
    1. Preparar la solución proteica disolviendo 30 mg de lisozyme de clara de huevo de pollo como polvo liofilizado en 1 ml de Tampón CH3COONa (acetato de sodio de 100 mM, pH 4) con el fin de obtener una solución con una concentración final de 30 mg·mL-1.
    2. Centrífuga la muestra a los 13.000 × g durante 10 minutos a 277 K. Este proceso ayuda a eliminar los agregados antes de iniciar el proceso de cristalización.
    3. Compruebe la absorbancia de la muestra a 280 nm y calcule la concentración de proteínas utilizando la ecuación Beer-Lambert (A= εcl).
      NOTA: Según la ecuación Beer-Lambert, la absorbancia electrónica (A) es directamente proporcional a la concentración (c, mg·mL-1)de una especie absorbente dada una longitud óptica constante (l, cm). El gradiente de esta relación lineal es el coeficiente de extinción molar (ε, para lysozyme a 280 nm es 2.64 mL·mg−1·cm−1)19. Las sidechains de aminoácidos aromáticos (tirosina, triptófano y fenilalanina) y los enlaces de disulfuro entre residuos de cisteína tienen una fuerte absorbancia a ~280 nm derivada de π permitidos espectroscópicamente – π* transiciones. Como la mayoría de las proteínas contienen estos residuos, la concentración de proteínas normalmente se puede calcular fácilmente midiendo la absorbancia a 280 nm, dado el conocimiento del coeficiente de extinción.
    4. Preparar soluciones de cristalización como se muestra en la Figura 4. Filtre todas las soluciones de stock con filtros Millipore de 0,22 μm antes de preparar la solución de cristalización.
  2. Crecimiento de cristales
    1. Corta una membrana de diálisis de celulosa con un corte de peso molecular adecuado (6-8 kDa) y remojala en agua destilada.
      NOTA: Los discos de membrana de diálisis están disponibles comercialmente para los botones de microdiálisis, pero si se utiliza el tubo de diálisis, no olvide cortar los bordes para separar las dos capas de membrana del tubo para tener sólo membranas de una sola capa.
    2. Llene los pozos de una bandeja de 24 pozos con 2 ml de solución de cristalización en el mismo orden que se muestra en la Figura 4.
      NOTA: Si se utilizan botones con volúmenes más grandes (por ejemplo, 200 μL), llene tubos de 50 ml con una solución de cristalización mínima de 5 ml para garantizar un intercambio eficiente.
    3. Añadir/Pipetear 35 μL de solución de lysozyme a la cámara del botón de microdiálisis como se ilustra en la Figura 5A.
      NOTA: Para evitar la formación de burbujas de aire en un botón de diálisis de 30 μL cuando se cierra, se debe añadir un volumen adicional (volumen muerto) de 5 μL de proteína adicional, lo que significa un total de 35 μL de muestra proteica. Esta muestra de proteína adicional crea una forma ligeramente abovedada en la parte superior de la cámara, como se muestra en la Figura 5B, que impide la formación de burbujas de aire.
    4. Tome un aplicador del tamaño adecuado y coloque la junta tórica elástica en su extremidad(Figura 5C). A continuación, coloque la membrana, previamente ligeramente limpiada/drenada con un trozo de papel sin fibra, en la parte superior de la cámara del botón de diálisis. Tenga cuidado de no poner polvo en la cámara al aplicar el papel. Ajuste la membrana de diálisis en su lugar transfiriendo el anillo en serie elástico del aplicador a la ranura del botón de diálisis (Figura 5C).
      NOTA: El momento crítico de la manipulación es fijar la membrana de diálisis en la parte superior de la cámara mediante la transferencia del anillo O elástico del aplicador a la ranura del botón de diálisis. Todos los movimientos deben estar perfectamente sincronizados para evitar encerrar burbujas de aire con la muestra en la cámara proteica. Es útil practicar el estiramiento del anillo O elástico antes de su aplicación para conocer su rigidez, utilizar pinzas para sostener parte de la membrana durante su aplicación y llevar a cabo los primeros experimentos de prueba con una proteína modelo.
    5. Transfiera el botón al pozo o al tubo de 50 ml utilizando pinzas(Figura 5D).
    6. Cubra el pozo con un coverlip, presionándolo suavemente sobre la grasa para sellar el pozo(Figura 5E).
      NOTA: Si no hay grasa en la parte superior de los pozos, asegúrese de agregar esto antes de iniciar el experimento o utilizar un pedazo de cinta en lugar de tapa de vidrio. El principio de cristalización de proteínas mediante botones de microdiálisis se ilustra en la Figura 5.
    7. Mantenga la muestra en 293 K en una incubadora termoregulada. Diferentes temperaturas pueden ser necesarias de acuerdo con las condiciones de proteína y cristalización utilizadas.
      NOTA: La misma cuadrícula de condiciones de cristalización que se muestra en la Figura 4 (permitiendo que la concentración de precipitante sea variada) se puede examinar en función de la temperatura. En tal caso, debe reproducirse la misma placa de cristalización y cada copia deberá colocarse en una incubadora regulada a una temperatura diferente. Esto requiere tener varias incubadoras termoreguladas sin vibraciones disponibles.
    8. Compruebe la bandeja o tubos en busca de cristales(Figura 4)y tome notas de forma regular, normalmente diariamente, para distinguir lo que hay en cada bandeja. Las buenas notas son esenciales para evitar resultados falsos positivos y discriminar el polvo de los cristales.

2. Proceso de crecimiento de cristal usando OptiCrys

  1. Preparación de muestras
    1. Preparar una solución proteica y una membrana de diálisis como se describe en la sección 1.1.
    2. Prepare soluciones de stock de NaCl (4 M) y de CH3COONa pH 4 (1 M) y filtrelas en tubos de 50 ml.
    3. Añadir la solución proteica (15 μL de lysozyme con 30 mg·mL-1)a la cámara de diálisis de la configuración de diálisis del depósito de flujo controlado por temperatura. Consulte la Figura 6 para obtener más información sobre la configuración de diálisis del depósito de flujo controlada por temperatura. OptiCrys tiene dos cámaras de diálisis, el volumen mínimo es de 15 μL y el volumen máximo es de 250 μL.
    4. Cubra la sobrecámara con una membrana de diálisis y fije la membrana con la junta tórica elástica(Figura 6B).
      NOTA: Esta configuración es diferente de los botones de microdiálisis donde cada cámara está sellada directamente por una membrana de diálisis. En la célula de flujo, la membrana de diálisis se fija en su lugar a la sobrecámara permitiendo el montaje de cristales sin su eliminación. Para ello, la sobrecámara simplemente se puede desenroscar del embalse.
    5. Voltea la sobrecámara y colóquela encima de la cámara de diálisis. Presione lenta y suavemente para eliminar todo el aire atrapado entre las dos piezas y evitar burbujas en la cámara(Figura 6C). Practicar con una proteína modelo puede ser ventajoso al entrenar para evitar burbujas de aire y pérdida de muestras.
    6. Fijar el depósito en su posición atornillando suavemente en la parte superior de la sobrecámara, siendo de nuevo consciente para evitar atrapar burbujas de aire. El sobreapriete del depósito también puede formar burbujas en la cámara de cristalización(Figura 6D).
    7. Agregue la solución de cristalización y cubra la cámara del depósito con la tapa hermética. (Figura 6G). El volumen máximo del depósito es de 1 ml.
    8. Transfiera este conjunto e insértelo en el soporte de latón. Este soporte está en contacto con elementos Peltier que se utilizan para controlar la temperatura.
    9. Como se ilustra en la Figura 6,la tapa hermética está equipada con una ventana óptica para permitir la iluminación superior de la cámara de diálisis. Coloque la fuente de luz (Figura 2) en la ventana permitiendo que la luz pase a través de la cámara.
    10. La cámara del depósito se puede conectar a una bomba para permitir que funcione como una célula de flujo continuo. Conecte el tubo encima de los tubos de 50 ml que contienen las soluciones de stock y el agua destilada a la válvula giratoria como se ilustra en la Figura 7.
      NOTA: Si durante el experimento no se desea la preparación automática y el cambio de soluciones de cristalización, omita el paso 2.1.10. En tal caso, debe prepararse la solución de cristalización y rellenar manualmente el depósito.
  2. Software
    1. Encienda el ordenador e inicie el software Croissance cristalline [Crystal growth]. Este software de control está escrito con LabVIEW(http://www.ni.com/labview/)y ofrece una interfaz gráfica fácil de usar. Incluye 4 interfaces gráficas diferentes(Accueil [Welcome], Paramétrage [Setting], Essai [Test] y Maintenance [Maintenance]) (Figura 8).
      NOTA: Las traducciones del francés están entre corchetes.
    2. Seleccione la vista Mantenimiento haciendo clic en el botón como se muestra en la Figura 8. Esta vista es actualmente la más utilizada y permite a los usuarios controlar la mayoría de los parámetros durante el experimento.
      NOTA: Después de hacer clic en la vista Mantenimiento, aparecerá una nueva ventana con diferentes secciones para controlar parámetros como la temperatura o la luz. En la Figura 8 se muestran diferentes partes de esta vista con flechas y marcos. En los pasos siguientes, demostramos cómo se controla cada parámetro mediante el software.
    3. La sección Régulateur de température [Controlador de temperatura] permite el control y monitoreo de la temperatura. Haga clic en el botón, número uno (1) en la Figura 8,para encenderlo.
      NOTA: El rango de temperatura en OptiCrys es de 233.0 – 353.0 ± 0.1 K.
    4. Ajuste la temperatura en la sección consigna [consigna] y pulse intro (Figura 8(2)). Debajo de este botón, hay un gráfico con 2 trazas (rojo y amarillo). La traza roja muestra la temperatura final (ordenada) y la traza amarilla muestra la temperatura actual. Como se muestra en la Figura 8(2),la temperatura se establece en 20 °C.
      NOTA: Para cultivar un cristal, como se explica en la sección de crecimiento de cristales, habrá que elegir muchas temperaturas. Para cambiar la temperatura, agregue cada nueva temperatura en la sección consigne [setpoint] y pulse el botón Intro en el teclado.
    5. Encienda la luz aumentando la luminosidad de la sección Lumières [Luces] de la Figura 8. Luminosidad oscila entre 0 y 100, "0" indica que la luz está apagada y a "100" la luz se establece en la máxima intensidad y brillo. Al aumentar la luz, en la sección Microscopio, se puede ver dentro de la cámara de diálisis. Durante el experimento, el brillo de la célula puede variar; ajustar los parámetros para visualizar claramente dentro de la cámara de diálisis. La ampliación también se puede aumentar o disminuir mediante el uso de los botones + y – delante de "zoom" para una mejor visualización.
    6. En el lado derecho de la sección Microscopio, hay varias secciones para almacenar información relevante para cada experimento de cristalización. Cada usuario puede crear una carpeta para almacenar información sobre las condiciones de cristalización, los nombres de proteínas y el corte de peso molecular de la membrana de diálisis utilizada (Figura 8(3)).
    7. El usuario puede definir un nombre para el experimento simplemente escribiéndolo en el Expediente Nom [Nombre de carpeta]. Al hacer clic en el botón Dossier [Carpeta] (que se muestra con un marco verde en la Figura 8)se abre una nueva ventana. En esta ventana, habrá un archivo de texto que contiene toda la información definida para el experimento. Además, las imágenes con sello de tiempo se guardan en esta carpeta para su procesamiento futuro.
    8. En la sección Imágenes NB , seleccione el número de imágenes que se deben tomar durante el transcurso del experimento. Especifique el número de imágenes en el panel derecho junto con el intervalo de tiempo deseado entre estas (por ejemplo, min, hora, día). La Figura 8 muestra la configuración del software para grabar cero imágenes en un minuto.
      NOTA: Utilice la sección Pompe [Bomba] para mezclar soluciones de stock e inyectar solución de cristalización en la cámara del depósito. Consulte la sección 2.1.10 y la Figura 7 para obtener una explicación del principio del sistema de mezcla de fluidos.
    9. Concentraciones de entrada de las soluciones de stock en Etape 1 [Paso 1]: soluciones stocks. Para el experimento de cristalización en la siguiente sección, se utilizará NaCl 4 M y CH3COONa 1 M pH 4.
      NOTA: Las concentraciones de soluciones de stock se encuentran en unidades molares.
    10. Defina la concentración final de cada solución. Por ejemplo 0,75 M para NaCl y 0,1 M para CH3COONa pH 4. Introdérlos en la sección de concentración final (Figura 8) en el Etape 2 [Paso 2]: solución à préparer [solución para preparar]. Pulse el botón Calcular [Calcular], que se muestra con un marco rojo en la Figura 8. El volumen final de cada solución de stock que se utilizará en la mezcla se mostrará en el panel de volumen delante de cada panel de concentración.
    11. Pulse el botón Lancer préparation [Launch preparation] (Figura 8). Como se ilustra en la Figura 7,la válvula giratoria toma cada solución de stock y las inyecta al tubo de mezcla a través de un interruptor.
    12. Una vez preparada la solución de cristalización, haga clic en el botón Solución de entrada [Entrada de solución] en Etape 3 [Paso 3]: Flujo de la sección de la bomba (marco amarillo en la Figura 8). El interruptor cambia para inyectar la nueva solución de cristalización de tubo de mezcla en la cámara del depósito. Para detener el proceso de intercambio, pulse el botón Distribución de Arrêt [Distribution Stop].
      NOTA: Observe el proceso de cristalización durante el experimento y modifique parámetros como la temperatura, la solución de cristalización y el zoom, en la interfaz gráfica correspondiente del software de supervisión. Mediante el uso del software no hay necesidad de eliminar la tapa hermética o la celda de flujo durante el experimento por lo que la única variable será la que el usuario cambia a través del software.
  3. Gran crecimiento de cristales
    1. Añadir 15 μL de lysozyme con una concentración de 30 mg·mL-1 a la cámara de diálisis (Figura 6A).
      NOTA: Prepare la muestra de proteínas como se describe en la sección 1.1.
    2. Montar la configuración de diálisis del depósito de flujo controlada por temperatura como se describe en la sección 2.1 y la Figura 6.
    3. Prepare la solución de cristalización. No olvide filtrar todas las soluciones de stock antes de la preparación de la muestra con filtros de 0,22 μm. Para este experimento, la solución de cristalización contiene NaCl de 0,75 M y 0,1 M CH3COONa pH 4. Esto se puede añadir manualmente o utilizando la cámara del depósito y el sistema de bombeo como se describe en las secciones 2.2.10 a 2.2.12.
    4. Ajuste la temperatura a 295 K como se explica en las secciones 2.2.3 y 2.2.4 y se muestra en la imagen 8. En condiciones iniciales, el equilibrio entre la cámara de diálisis y el embalse se alcanzará después de aproximadamente 90 minutos y los primeros núcleos visibles aparecerán después de 22 horas.
    5. Permitir que los cristales crezcan hasta que no se observen cambios más visibles en el tamaño de los cristales(Figura 9,panel 1).
      NOTA: Con el fin de determinar el tiempo de nucleación y medir la variación en el tamaño de los cristales, grabe imágenes cada 15 o 20 minutos, que es respectivamente 4 o 3 imágenes por hora en la sección imágenes NB. Para la observación in situ de la desnaturalización de proteínas, la agregación y precipitación o la disolución o nucleación de cristales, normalmente se requieren entre unos segundos y unas pocas decenas de minutos. Sin embargo, para el crecimiento de cristales, este rango es entre unos pocos minutos a unas pocas horas.
    6. Después de tres días, baje la temperatura a 291 K para reiniciar el crecimiento del cristal. Mantenga la temperatura constante y deje que el cristal se desarrolle(Figura 9,panel 2). Para esta etapa del experimento, será suficiente grabar imágenes cada 2 horas y comprobar cada 10 a 12 horas cualquier cambio en el tamaño de los cristales. El experimento puede continuar si no se observa ningún cambio en el tamaño de los cristales.
      NOTA: Dependiendo de las concentraciones de proteínas y precipitantes en la solución de cristalización y los volúmenes de proteína utilizados, el tiempo necesario para alcanzar el equilibrio para cada paso puede variar.
    7. Disminuya la temperatura a 288 K para reiniciar el crecimiento del cristal. En el estado experimental del caso presentado aquí, un día es suficiente para alcanzar el equilibrio(Figura 9,panel 3).
    8. Compruebe el tamaño de los cristales y mantenga una temperatura constante siempre y cuando el cristal siga creciendo.
    9. Después de 4 días, disminuya la temperatura a 275 K para reiniciar el crecimiento del cristal(Figura 9,panel 4).
      – En las condiciones experimentales del caso presentado, después de unos 10 días se obtendrá un cristal de 500 μm en una dimensión (Figura 9).
  4. Control del tamaño del cristal
    1. Preparar una solución proteica y la diálisis del depósito de flujo controlada por temperatura configurada como se describe en las secciones 2.3.1 y 2.3.2.
    2. Preparar soluciones de cristalización con 0,9 M NaCl y 0,1 M CH3COONa pH 4.
    3. Ajuste la temperatura a 291 K y permita que los cristales crezcan. En condiciones iniciales, el primer evento de nucleación comenzará después de alrededor de una hora y numerosos cristales crecerán en la cámara de diálisis durante tres horas(Figura 10,pasos: 1 y 2). Grabe imágenes cada 20 minutos para comprobar el tamaño de los cristales durante el proceso de crecimiento.
      NOTA: La optimización de las condiciones de cristalización es crucial para controlar la mayoría de las propiedades finales de los cristales generados. La temperatura y la composición química de las soluciones de cristalización se pueden cambiar para disolver y volver a cultivar cristales de tamaño uniforme. También debe tenerse en cuenta que una muestra de proteína no se consume en un experimento de este tipo, ya que las condiciones se pueden invertir para re-disolver la muestra siempre y cuando no se desnaturaliza. Al disolver cristales cambiando la temperatura y manteniendo una composición química constante, continúe el experimento de la siguiente manera:
    4. Una vez que los cristales han crecido a 291 K, estos se pueden disolver para volver a crecer menos, cristales más grandes. Aumentar la temperatura gradualmente más de 20 minutos para llegar a 313 K. Se tarda alrededor de una hora en disolver todos los cristales dentro de la cámara de diálisis(Figura 10,pasos: 3-5). Grabe imágenes cada 5 a 15 minutos para supervisar el proceso de disolución.
      NOTA: Muchas proteínas son sensibles a las altas temperaturas. Asegúrese de trabajar dentro del rango de temperatura donde la proteína es estable para evitar cualquier daño / desnaturalización. Además de la solubilidad proteica, la temperatura también afecta a la solución tampón. Por ejemplo, el pH del búfer puede cambiar con la temperatura, especialmente en el búfer Tris. En tal caso, es crucial establecer el pH de acuerdo con la temperatura a la que se realiza el experimento18. También cabe señalar que la disolución de proteínas toma significativamente menos tiempo (de unos pocos minutos a unas pocas horas) en comparación con el crecimiento del cristal de proteínas (de unas pocas horas a unos pocos días). En general, durante la disolución de los cristales, la temperatura aumenta gradual y lentamente (respetando el corto tiempo de disolución total), principalmente en el caso de disolución parcial de los cristales para evitar el aumento de la mosaicidad cristalina. Cuando los cristales están creciendo, la temperatura puede disminuir rápidamente (en menos de un minuto) a la temperatura establecida (respetando el largo tiempo de crecimiento total). El monitoreo regular de la cámara de cristalización mediante la grabación de imágenes es aconsejable para prevenir daños a la proteína y ayudar a definir el momento óptimo para la disolución o crecimiento de cristales para cada proteína estudiada.
    5. Después de que todos los cristales se hayan disuelto, establezca la temperatura en 295 K para iniciar un segundo evento de nucleación(Figura 10,pasos: 6,7). Grabe imágenes cada 5 minutos para supervisar el segundo proceso de nucleación. En este paso, los primeros núcleos aparecen después de unos 18 minutos.
      NOTA: A esta temperatura, la solución estará en la zona de nucleación, en las proximidades de la zona metástasis. Como resultado, sólo unos pocos núcleos aparecerán en la cámara de cristalización.
    6. Continúe el experimento repitiendo el flujo de trabajo de optimización descrito en la sección 2.3 para el crecimiento de cristales más grandes. La duración total del experimento representado en la Figura 10 es de solo unos pocos días.
      NOTA: Si durante la fase de nucleación los cristales aparecen en diferentes momentos, se obtienen cristales de diferentes tamaños en la cámara de cristalización. En tal caso, el aumento de la temperatura (en el caso de las proteínas con solubilidad directa) dará lugar a una disolución más rápida de los cristales más pequeños. Dependiendo del efecto de maduración cinética, la proteína adicional (obtenida de la disolución) se puede utilizar para el crecimiento de los cristales más grandes.
      Al disolver cristales a temperatura constante cambiando la composición química de la solución de cristalización, continúe el experimento de la siguiente manera:
      También es posible disolver los cristales cultivados anteriormente cambiando la composición química de la solución de cristalización durante el experimento para volver a cultivar una población de cristales de tamaño uniforme en nuevas condiciones.
    7. Preparar la solución proteica (2.3.1), la configuración de diálisis del depósito de flujo controlada por temperatura (2.1) y la solución de cristalización (2.4.2) como se describió anteriormente. En condiciones iniciales en la zona de nucleación lejos de la zona metástasis, numerosos cristales pequeños aparecerán en la cámara de cristalización y comenzarán a crecer(Figura 11,pasos: 1,2).
    8. Después de tres horas, cuando muchos cristales medianos son visibles en la cámara de cristalización(Figura 11,paso: 3), disminuya la concentración de NaCl (0,9 M) gradualmente para llegar a cero. Para ello, prepare una nueva solución de cristalización que contenga solo solución de búfer con 0,1 M CH3COONa pH 4. Utilice el sistema de bombeo para cambiarlo con la solución de cristalización en la cámara del depósito. Siga los pasos 2.2.10 a 2.2.12 para la preparación e inyección de una nueva solución en la cámara del depósito. Con esta nueva solución, cuando se intercambian soluciones, la concentración nacl disminuye en la cámara hasta que la solución final en la cámara del embalse no contiene más de 0,1 M de CH3COONa pH 4 y no NaCl. Capture imágenes cada 10 minutos para grabar el proceso de disolución.
    9. Permita que los cristales se disuelvan por completo(Figura 11,pasos: 4,5). El tiempo de disolución es de unas dos horas para este experimento. Como se mencionó anteriormente, el tiempo de disolución depende del sistema proteico, las condiciones de cristalización y el volumen de la cámara de diálisis utilizado. La observación regular de la cámara de cristalización (ver sección Microscopio) y la grabación de imágenes y notas durante el experimento son esenciales.
    10. Cuando todos los cristales dentro de la cámara se disuelvan(Figura 11,paso: 5), utilice el sistema de bombeo de nuevo para preparar una nueva solución de cristalización inyectando NaCl a una concentración menor que la anterior (0,75 M NaCl en 0,1 M CH3COONa pH 4).
    11. Inyecte la nueva solución en la cámara del depósito(Figura 11, pasos: 6,7) y repita el flujo de trabajo de optimización del crecimiento de cristalización como se describe en la sección 2.3. Se generará una población uniforme de cristales más grandes. Los resultados mostrados en la Figura 11 se obtuvieron después de unos días.

Representative Results

En las Secciones 2.3 y 2.4, se presentan tres ejemplos de crecimiento optimizado del cristal, mostrando el uso del instrumento y un diseño experimental para el cultivo de grandes cristales. Para esta demostración, hemos utilizado la lisozyme como una proteína modelo, aunque los experimentos de crecimiento de cristal se han realizado con éxito con muchos otros sistemas proteicos utilizando este método (ver arriba). Mediante el uso y el dominio del protocolo presentado aquí se puede adaptar para otros candidatos a proteínas.

En la sección 2.3 demostramos que las estrategias de cristalización racional establecidas podrían ser beneficiosas para el cultivo de cristales con volúmenes de dispersión suficientes para la cristalografía de proteínas de neutrones. Aquí, demostramos que las estrategias racionales de optimización propuestas también permiten la generación de una población uniforme de cristales de cualquier tamaño específico necesario para los enfoques de determinación de la estructura aguas abajo.

Estos dos experimentos están diseñados para enfatizar la importancia de los diagramas de fase en el control de la nucleación de cristal y el crecimiento. Aquí, el control de la temperatura y la composición química de las soluciones de cristalización en combinación con el monitoreo del proceso de cristalización en tiempo real se utilizan para estudiar el diagrama de fase cualitativa. Utilizando este método, la nucleación y el crecimiento de cristales se pueden optimizar racionalmente de una manera reversible. El uso de este enfoque en serie también reduce la cantidad de proteínas y el tiempo necesario para controlar el tamaño y la calidad de los cristales.

En el método de diálisis, una solución proteica se separa de una solución de cristalización por una membrana semi-permeable6 (Figura 5). Esta membrana de diálisis permite que moléculas pequeñas como aditivos, tampón e iones pasen a través de la membrana pero no macromoléculas como las proteínas6,20. Esta característica permite modificar la solución de cristalización durante el transcurso del experimento6. El intercambio de la solución se puede realizar manualmente, por ejemplo en botones de microdiálisis, o de forma automatizada utilizando un instrumento desarrollado para este fin, OptiCrys8.

En el primer conjunto de experimentos, se utilizaron botones de microdiálisis para la cristalización de la lisozyme de clara de huevo de pollo. Los botones de microdiálisis estaban inmersos en soluciones de cristalización con diferentes concentraciones de sal. En este sencillo experimento de cuadrícula de cristalización, la única variable es la concentración precipitante, mientras que la temperatura se mantiene constante (293 K). Como se muestra en la Figura 4,ligeras variaciones en la concentración de sal inducen un cambio en el tamaño y el número de cristales observados, permitiendo la investigación del diagrama de fase de cristalización. En la Figura 4,panel 1, la solución de cristalización contiene NaCl de 0,7 M y un número limitado de cristales más grandes han aparecido en los botones. Al aumentar la concentración de sal de 0,7 a 1,2 M, la sobresaturación aumenta y la solución en la zona de nucleación se aleja de la zona metástasis(Figura 4,paneles 1 a 6). Como resultado, el número de cristales aumenta y su tamaño disminuye.

En el primer experimento con un instrumento totalmente automatizado que permite la cristalización de diálisis controlada por temperatura, OptiCrys(Figura 9),el experimento de crecimiento de cristal se adaptó para generar un gran crecimiento de cristal. El experimento se lanzó a una temperatura inicial de 295 K con una solución de cristalización que contiene 0,75 M NaCl y 0,1 M Na acetato buffer pH 4. En estas condiciones experimentales, la solución de cristalización llegó a la zona de nucleación en las proximidades de la zona metástasis del diagrama de fase(Figura 9,flecha 1). Como resultado, sólo unos pocos núcleos fueron generados durante la primera etapa del experimento. Con el fin de cultivar cristales seleccionados aún más (que se muestra en la Figura 9),el flujo de trabajo de optimización del crecimiento de cristal se dirigió hacia la zona metástasis por temperatura variable tan pronto como se alcanzó el equilibrio cristalino-solución.

Cada vez que se alcanzaba el equilibrio entre el cristal y la solución, la temperatura se bajaba, primero a 291 K, luego a 288 K y finalmente a 275 K, para mantener la solución de cristalización en la zona metástasis. El resultado de este experimento es un único cristal grande adecuado tanto para rayos X macromoleculares como para cristalografía de neutrones.

Para la mayoría de las proteínas, el diagrama de fase cuantitativa preciso (o simplemente un diagrama cualitativo) aún no se ha obtenido debido a la falta de dispositivos experimentales capaces de medir con precisión la concentración de proteínas (o simplemente de observar /detectar el proceso de cristalización en tiempo real) durante los experimentos de cristalización18. Como resultado, a menudo no es posible diseñar el experimento de tal manera que la cristalización comienza en el área óptima del diagrama de fase, en las proximidades de la zona metástasis.

Por lo tanto, un estudio de optimización de cristalización debe tener lugar antes de que se lleve a cabo el experimento dedicado al crecimiento de un cristal de gran volumen. En este estudio, utilizando variaciones de temperatura (en composición química constante) por un lado y variaciones en la composición química (a temperatura constante) por otro lado, son necesarias para identificar la zona metástasis y delinear las condiciones óptimas para iniciar un gran experimento de crecimiento de cristal.

Con este fin, se presentan otros dos experimentos que fueron diseñados para demostrar la reversibilidad de los experimentos de cristalización de diálisis controlados por temperatura con OptiCrys para la nucleación, el crecimiento de cristales, la disolución y el re-crecimiento. El flujo de trabajo de optimización del crecimiento de cristales se controló de modo que se culta una población uniforme de menos cristales de lysozyme más grandes, utilizando la variación de la temperatura o la concentración precipitada.

En el segundo experimento con OptiCrys, la composición química de la solución de cristalización se mantuvo constante durante todo el experimento (0,9 M NaCl en 0,1 M CH3COONa pH 4) con temperatura variable. La temperatura inicial se fijó en 291 K. Los resultados de este experimento se resumen en la Figura 10. Debido a la alta supersaturación, un gran número de pequeños cristales aparecieron en la cámara de cristalización(Figura 10,paneles 1 y 2). De acuerdo con el concepto de solubilidad proteica directa, al aumentar gradualmente la temperatura a 313 K, todos los cristales fueron disueltos(Figura 10,paneles 3, 4 y 5). Finalmente, al bajar la temperatura a 295 K, se inició la segunda nucleación en las proximidades de la zona metástasis y permitió la formación controlada de un menor número de núcleos. Un mayor crecimiento del cristal dio lugar a la generación uniforme de una población de cristales más grandes(Figura 10,panel 7).

Como se muestra en la Figura 11,la variación de la composición química de la solución de cristalización, a una temperatura constante de 291 K, también se puede utilizar para obtener una población uniforme de cristales más grandes. Al igual que el experimento anterior, la condición inicial era 0,9 M NaCl en 0,1 M CH3COONa pH 4. La concentración nacl se redujo gradualmente de 0,9 M a cero para disolver los cristales(Figura 11,paneles 4 y 5). En este punto, NaCl fue reemplazado por completo por una solución de búfer de 0,1 M CH3COONa pH 4. La reducción de la concentración de sal mantiene la solución en la zona subsaturada del diagrama de fase, lo que conduce a la disolución de los cristales. A continuación, se inyectó en la cámara del depósito una nueva solución de cristalización con menor resistencia iónica, a 0,75 M NaCl en 0,1 M CH3COONa pH 4. En esta concentración precipitada, aparecieron los primeros núcleos(Figura 11,panel 6) después de 90 minutos. El número de cristales generados fue menor y los cristales alcanzan un volumen mayor(Figura 11,panel 7) que antes.

Figure 1
Figura 1: Diagrama de fase esquemática. Las trayectorias cinéticas para tres técnicas de cristalización están representadas en un régimen de salazón. Cada método logra la nucleación y cristalización de manera diferente, visualizada por una vía cinética diferente a través del diagrama de fase para llegar a las zonas de nucleación y metástasis. La curva de solubilidad separa las regiones de subsaturación y sobresaturación. La supersaturación se divide en tres zonas: metástasis, nucleación y precipitación. En la zona de nucleación, la nucleación espontánea ocurre mientras que en la zona metástasis se produce el crecimiento del cristal. Esta figura está adaptada desde Junius et al. 8Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Representación esquemática del banco de cristalización (OptiCrys). La fuente de luz LED se encuentra en la parte superior de la célula de flujo de diálisis controlada por temperatura. Un microscopio invertido y la cámara digital se muestran en la parte superior derecha de la imagen con la flecha roja. El círculo rojo representa la ubicación del tubo del enfriador. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Diagrama esquemático de fase de cristalización de proteínas bidimensionales en función de la temperatura (A) y la concentración precipitada (B). (A) En el caso de una proteína con solubilidad directa, la disminución de la temperatura mantiene la solución de cristalización en la zona metástasis. La variación de temperatura se puede repetir varias veces para controlar el proceso de crecimiento del cristal hasta que se obtienen cristales con el volumen deseado. (B) Cambiar la concentración de la solución precipitante también se puede utilizar para mantener la solución de cristalización en la zona metástasis para el cultivo de cristales. Esta figura está adaptada desde Junius et al. 8Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Cristales de lysozyme obtenidos utilizando el método de diálisis. Este experimento se realizó a una temperatura constante de 293 K en 0,1 M tampón de acetato sódico pH 4. El aumento de la concentración de NaCl de 0,7 M a 1,2 M aumenta la tasa de nucleación y da como resultado un mayor número de cristales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Visión general del proceso de cristalización de proteínas por el método de diálisis. (A) Al añadir la proteína a la cámara del botón de diálisis, (B) se crea una forma de domo en la parte superior de la cámara. (C) Se utiliza un aplicador para transferir el anillo O a la ranura del botón de diálisis con el fin de fijar la membrana de diálisis en su lugar. (D) El botón de diálisis está listo para la inmersión en la solución de depósito. (E) La solución de cristalización pasa a través de la membrana semipermeable y los cristales comienzan a formarse dentro de la cámara. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Vista esquemática de la configuración de diálisis de flujo controlada por temperatura. (A) La muestra de proteínas se añade a la cámara de diálisis. (B) La membrana de diálisis se fija en la sobrecámara con un anillo en T mediante el uso de un aplicador. (C) La sobrecámara se gira y fija en la parte superior de la cámara de diálisis. Las flechas blancas indican dónde se colocan los tornillos en la sobrecámara. (D) La cámara del depósito se gira en el sentido de las agujas del reloj (E) y se fija en la parte superior de la sobrecámara. (F) La cámara del depósito está cubierta por una tapa hermética con conectores a un sistema de bombeo y (G) la celda de flujo se coloca en el soporte de latón. Esta figura está adaptada desde Junius et al. 8Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Preparación e inyección de la solución de cristalización en el depósito por el sistema fluido (A). Los tubos que contienen sal y agua están conectados al controlador de presión/vacío (B) y a la válvula giratoria (C). Mediante el uso de la presión, el controlador de presión/vacío crea un flujo constante de los líquidos desde los tubos hasta la válvula giratoria. Cada líquido que pasa a través del medidor de flujo (D) y el interruptor se inyecta en el tubo de mezcla (F). Una vez que todos los líquidos se han añadido al tubo de mezcla, el interruptor mediante algunas modificaciones inyecta la solución final del tubo de mezcla en el depósito (G). El líquido fluye a través del sistema en la dirección de las flechas en el diagrama marcado en orden ascendente (de 1 a 6). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: Vista de mantenimiento del software de supervisión. Esta vista se utiliza para controlar diferentes parámetros como la temperatura, la luz, la solución de cristalización y el zoom. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 9
Figura 9: El diagrama de fase en función de la temperatura (las imágenes seleccionadas deben seguirse en orden ascendente). Se obtiene un solo cristal de lizima grande cambiando sistemáticamente la temperatura de 295 K a 275 K. En cada paso, el crecimiento del cristal se detiene al alcanzar la curva de solubilidad. Reducir la temperatura manteniendo la solución en la zona metástasis reinicia el crecimiento del cristal. Las imágenes tienen diferentes niveles de aumento. Esta figura está adaptada desde Junius et al. 8,18Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 10
Figura 10: Optimización del crecimiento de cristales en composición química constante mediante control de temperatura (las imágenes seleccionadas deben ser rastreadas en orden ascendente). Iniciar el proceso de nucleación en la zona de nucleación a 291 K, lejos de la zona metástasis, resulta en la formación de numerosos cristales. Aumentar la temperatura a 313 K luego disuelve los cristales hasta que no se vean núcleos visibles en la cámara de diálisis. Por último, la disminución de la temperatura a 295 K reinicia el proceso de nucleación por segunda vez, lo que conduce a un número limitado de cristales más grandes. Esta figura está adaptada desde Junius et al. 8,18Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 11
Figura 11: Optimización del crecimiento del cristal a temperatura constante utilizando variaciones en la concentración precipitada (las imágenes seleccionadas deben ser rastreadas en orden ascendente). La disminución de la concentración precipitante de 0,9 M a 0 M disuelve los cristales obtenidos durante el primer evento de nucleación. El proceso de cristalización se reinicia mediante la inyección del mismo precipitante pero con menor resistencia iónica, 0,75 M, lo que conduce a la formación de unos cristales más grandes. Esta figura está adaptada desde Junius et al. 8,18Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Diferentes variables físicas, químicas y biológicas influyen en la cristalización de proteínas al afectar la solubilidad proteica21. Entre estas variables, la temperatura y la composición química de la solución de cristalización se utilizan aquí en combinación con la técnica de diálisis para mejorar y cultivar grandes cristales de alta calidad de biomacromolecules para estudios de difracción de neutrones. Mediante el conocimiento de diagramas de fase, la cristalización se hace más predecible. Aunque el cribado de diferentes condiciones de cristalización en un enfoque en serie también es posible, el objetivo principal de utilizar los enfoques racionales presentados es separar y controlar la cinética de la nucleación de cristal y el crecimiento.

Al igual que todos los estudios de cristalización, las muestras de proteínas puras y homogéneas de alta calidad y las soluciones de cristalización sin polvo aumentan la tasa de éxito del experimento. La filtración y la centrifugación de las soluciones son pasos esenciales en los protocolos descritos. Conocer las propiedades fisicoquímicas de las proteínas estudiadas como el peso molecular (para elegir la membrana de diálisis adecuada), el punto isoeléctrico y la solubilidad proteica son cruciales para el diseño de un experimento óptimo de crecimiento de cristal. Además, se debe tener en cuenta la estabilidad de las proteínas a diferentes temperaturas o con diferentes productos químicos para prevenir la pérdida de la muestra y aumentar la probabilidad de éxito. Teniendo en cuenta el rango de temperatura de OptiCrys (233.0–353.0 ± 0.1 K), una amplia gama de proteínas se puede cristalizar con él. Pero vale la pena destacar que las proteínas que son principalmente termoestables, como las proteínas de fuentes termofílicas, serían las que más se benefician en los experimentos de crecimiento de cristal de gran volumen controlados por temperatura ofrecidos por este instrumento.

Utilizando una cámara de diálisis de bajo volumen (cuando se utilizan OptiCrys) o botones de microdiálisis y examinando varias temperaturas y condiciones de cristalización (por ejemplo, rejillas de concentración precipitada o pH), es posible obtener información sobre la ubicación del límite de la zona metástasis (equilibrio cinético entre nucleación y zonas metastásicas). Esto es invaluable al diseñar un experimento exitoso de crecimiento de cristales, especialmente para los nuevos candidatos a proteínas en cristalización. Sin esta información los experimentos pueden comenzar desde un área del diagrama de fase con alta supersaturación, demasiado lejos del límite de la zona metástasis para controlar fácilmente la nucleación cristalina. Aunque se puede intentar la disolución del precipitado proteico, por ejemplo aumentando la temperatura en caso de solubilidad directa, para proteínas con menor termosabilidad, mantener la muestra a alta temperatura durante un período de tiempo más largo puede hacer irreversible la precipitación proteica. Por lo tanto, la mejor estrategia consiste en utilizar una condición inicial con una sobresaturación más baja situada cerca del límite de metastabilidad, donde se puede controlar la nucleación y evitar la precipitación proteica. En línea con esto, la preselección de cristalización disminuye la probabilidad de tener un precipitado proteico en la cámara de diálisis y aumenta la tasa de éxito del experimento.

Después de diseñar un experimento, preparar cámaras de diálisis (OptiCrys) o botones de microdiálisis es otro paso importante. La prevención de la formación de burbujas de aire en la cámara/botón de diálisis aumenta la posibilidad de cristalización exitosa, especialmente cuando se utilizan pequeños volúmenes. La presencia de burbujas de aire en la cámara de diálisis también puede cambiar la cinética del proceso de cristalización y reducir la reproducibilidad del experimento (porque se ha modificado la superficie de contacto proteína/solución). No sólo la proteína, sino también la solución de cristalización pueden afectar el éxito del experimento. El uso de nuevos tubos de 50 ml para el sistema de bombeo cada vez que uno quiere iniciar un nuevo experimento y tubo de lavado después de cada experimento disminuye la posibilidad de contaminación y evita la creación de cristales de sal en el aparato.

El uso de botones de microdiálisis es una alternativa cuando OptiCrys no está disponible. Las estrategias para optimizar la cristalización y el seguimiento del crecimiento de cristal mencionados anteriormente, deben llevarse a cabo manualmente. Por lo general, esto requiere estar fuera de una incubadora termoregulada, lo que puede ser problemático cuando la regulación de la temperatura es un paso crítico en la metodología descrita. Esto no facilita el cambio de la composición química de las soluciones de cristalización, o el monitoreo del crecimiento del cristal por imágenes, por lo que el proceso de crecimiento del cristal no se puede controlar en tiempo real.

El conocimiento del diagrama de fase es la base del uso del banco de cristalización, OptiCrys, para cultivar sistemáticamente cristales grandes y de alta calidad de forma automatizada. El control de parámetros fisicoquímicos como la temperatura, la concentración precipitante y el pH durante la cristalización mueve el equilibrio proteína-solución en una trayectoria cinética bien definida a través del diagrama de fase. Esto se complementa con el uso de una membrana de diálisis para ajustar el transporte masivo y crear un gradiente controlado en la cámara de cristalización que afecta al tamaño y la calidad de los cristales. Por lo tanto, el uso de datos termodinámicos y trayectorias cinéticas es esencial para controlar el proceso de cristalización con el fin de cultivar cristales de alta calidad. Gracias a OptiCrys, los diagramas de fase sistemáticos en un espacio multidimensional se pueden estudiar con un enfoque en serie utilizando significativamente menos material que antes. Para demostrar esta metodología, proporcionamos aquí un caso de estudio con una proteína modelo, lisozyme de clara de huevo de pollo. Mediante el uso y masterización del protocolo presentado aquí se puede adaptar para sistemas proteicos reales5,14,17,18.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

MBS reconoce el apoyo de LABEX VALO GRAL en virtud del contrato de 2015. NJ reconoce el Programa Internacional de Investigación doctoral (Irtelis) de la CEA para la Beca de Doctorado. Los autores reconocen la financiación del Programa de Investigación e Innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea en virtud del acuerdo de subvención Marie Skłodowska-Curie número 722687. Los autores también están agradecidos al Dr. Esko Oksanen (ESS, Lund) y al Dr. Jean-Luc Ferrer (IBS, Grenoble) por sus conversaciones e ideas útiles. IBS reconoce su integración en el Instituto Interdisciplinario de Investigación de Grenoble (IRIG, CEA).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
200 µl Dialysis Button Hampton Research HR3-330 Dialysis button
24 well plates Jena Bioscience CPL-132 Crystallization plate
2-Switch FLUIGENT 2SW001 Switch
30 μl Dialysis Button Hampton Research HR3-324 Dialysis button
50 mL Corning Centrifuge tubes Sigma-Aldrich CLS430828-500EA Centrifuge tubes
Acetic acid Sigma-Aldrich S2889 Chemical
Chicken Egg White Lysozyme Sigma-Aldrich L6876 Lyophilized protein powder
Dialysis Membrane Discs 6-8 kDa MWCO Spectrum 132478 Dialysis membrane
Dialysis Membrane Tubing 6-8 kDa MWCO Spectrum 132650T Dialysis membrane
Microcentrifuge Eppendorf Minispin Bench-top centrifuge
Flow Unit FLUIGENT FLU-XL Flow meter
Flowboard FLUIGENT FLB Flowboard
Microfluidic Flow Control System EZ FLUIGENT EZ-01000002 Pressure/vacuum controller
MilliporeSigma 0.22 µm syringe Filters Millipore GSWP04700 0.22 μm pore size filter
M-Switch FLUIGENT MSW002 Rotary valve
Opticrys NatX-ray PRT008 Crystallization bench
Siliconized circle cover slides Hampton Research HR3-231 Glass slides
Sodium Chloride ≥ 99% Sigma-Aldrich 746398 Chemical
Switchboard FLUIGENT SWB002 Switchboard
Thermoregulated incubator Memmert IPP30 Thermoregulated incubator

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References

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Vahdatahar, E., Junius, N., Budayova - Spano, M. Optimization of Crystal Growth for Neutron Macromolecular Crystallography. J. Vis. Exp. (169), e61685, doi:10.3791/61685 (2021).

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