Summary
Bugspytkirtelsaft er en dyrebar kilde til biomarkører for kræft i bugspytkirtlen. Vi beskriver her en metode til intraoperativ indsamlingsprocedure. For at overvinde udfordringen med at vedtage denne procedure i murinemodeller foreslår vi en alternativ prøve, tumor interstitiel væske, og beskriver her to protokoller for dens isolering.
Abstract
Pancreas adenocarcinom (PDAC) er den fjerde førende årsag til kræftrelateret død og snart at blive den anden. Der er et presserende behov for variabler forbundet med specifikke bugspytkirtelpatologier for at hjælpe præoperativ differentialdiagnose og patientprofilering. Pancreasjuice er en relativt uudforsket kropsvæske, som på grund af sin nærhed til tumorstedet afspejler ændringer i det omgivende væv. Her beskriver vi detaljeret den intraoperative indsamlingsprocedure. Desværre er oversættelse af bugspytkirtelsaftsamling til murinemodeller af PDAC til udførelse af mekanistiske undersøgelser teknisk meget udfordrende. Tumor interstitiel væske (TIF) er den ekstracellulære væske uden for blod og plasma, som bader tumor- og stromalceller. På samme måde som bugspytkirtelsaft, for dets egenskab til at indsamle og koncentrere molekyler, der findes fortyndet i plasma, kan TIF udnyttes som en indikator for mikromiljømæssige ændringer og som en værdifuld kilde til sygdomsassocierede biomarkører. Da TIF ikke er let tilgængelig, er der foreslået forskellige teknikker til isolering. Vi beskriver her to enkle og teknisk krævende metoder til isolering: vævscentrifugering og vævseluering.
Introduction
Pankreatisk duktalt adenocarcinom (PDAC) er en af de mest aggressive tumorer og snart at blive den næststørste dødsårsag 1,2,3. Det er kendt for sit immunsuppressive mikromiljø og for dets manglende reaktion på immunterapiprotokoller4. I øjeblikket er kirurgisk resektion stadig den eneste helbredende mulighed for PDAC, men alligevel er der en høj frekvens af tidlige tilbagefald og postkirurgiske komplikationer. Manglen på specifikke symptomer indtil et avanceret stadium tillader ikke en tidlig diagnose, hvilket bidrager til sygdommens deadlines. Desuden kan overlapningen af symptomer mellem PDAC og andre godartede bugspytkirtelpatologier hæmme opnåelsen af en hurtig og pålidelig diagnose med de nuværende diagnostiske strategier. Identifikation af variabler forbundet med specifikke bugspytkirtelpatologier kan lette den kirurgiske beslutningsproces og forbedre patientprofilering.
Lovende resultater i biomarkøropdagelse er opnået ved hjælp af let tilgængelige kropsvæsker, såsom blod 5,6,7, urin8, spyt 9 og bugspytkirtelsaft10,11,12. Mange undersøgelser har udnyttet omfattende "omics" tilgange, såsom genomiske, proteomiske og metabolomiske teknikker, til at identificere kandidatmolekyler eller signaturer, der kan diskriminere mellem PDAC og andre godartede pancreas lidelser. Vi har for nylig demonstreret, at bugspytkirtelsaft, en relativt uudforsket kropsvæske, kan bruges til at identificere metaboliske signaturer hos patienter med forskellige kliniske profiler12. Bugspytkirtelsaft er en proteinrig væske, som akkumulerer sekretomet af bugspytkirtelkanalerne og strømmer til hovedbugspytkirtelkanalen og derefter til den vigtigste fælles galdekanal. På grund af dets nærhed til bugspytkirtlen kan det blive stærkt påvirket af mikromiljøforstyrrelser induceret af tumormassen (figur 1) og derfor mere informativ end blod eller urin eller vævsbaseret profilering. Flere undersøgelser har undersøgt potentialet i bugspytkirtelsaft til at identificere nye biomarkører for sygdom ved hjælp af forskellige tilgange, herunder cytologisk analyse13, proteomisk analyse udført ved massespektrometri 14,15, vurdering af genetiske og epigenetiske markører såsom K-ras og p53 mutationer 16,17, ændringer i DNA-methylering 18 og miRNA'er 19 . Teknisk set kan bugspytkirtelsaft indsamles intraoperativt eller med minimalt invasive procedurer, såsom endoskopisk ultralyd, retrograd cholangio-pancreatografi eller ved endoskopisk samling af duodenal juice sekretion20. Det er endnu ikke klart, i hvilket omfang pancreasjuicesammensætningen påvirkes af den anvendte indsamlingsteknik. Vi beskriver her den intraoperative indsamlingsprocedure og viser, at bugspytkirtelsaft kan repræsentere en dyrebar kilde til PDAC-biomarkører.
Figur 1: Skematisk repræsentation af pancreas juice samling. (A) Skematisk repræsentation, der viser udskillelsen af bugspytkirtelsaft i bugspytkirtelkanalen og dens samling under operationen. Indsatsen viser et nærbillede af tumormikromiljøet: bugspytkirtelsaft samler molekyler frigivet af tumor- og stromale celler i bugspytkirtelkanalerne. Klik her for at se en større version af denne figur.
Indsamlingen af bugspytkirtelsaft i genetiske og ortopiske musemodeller af PDAC ville blive værdsat i perspektivet for at udnytte denne biofluid i prækliniske mekanistiske undersøgelser; Denne procedure kan dog være teknisk meget udfordrende og er ikke mulig for enklere modeller såsom subkutane tumorer. Af denne grund identificerede vi tumor interstitiel væske (TIF) som en alternativ kilde til bugspytkirtelsaft for dets lignende egenskab ved at fungere som en indikator for omgivende forstyrrelser. Interstitiel væske (IF) er den ekstracellulære væske, der findes uden for blod og lymfekar, som bader vævsceller21. IF-sammensætningen påvirkes af både blodcirkulationen til organet og lokal sekretion; faktisk producerer og udskiller omgivende celler aktivt proteiner i IF21. Interstitium afspejler mikromiljømæssige ændringer i omgivende væv og kan derfor udgøre en værdifuld kilde til biomarkøropdagelse i flere patologiske sammenhænge, såsom tumorer. Den høje koncentration af lokalt udskilte proteiner i TIF kan bruges til at identificere kandidatmolekyler, der skal testes som prognostiske eller diagnostiske biomarkører i plasma22,23,24. Flere undersøgelser har vist, at TIF er en passende prøve til proteomiske tilgange med høj kapacitet, såsom massespektrometriteknikker 23,24,25 samt multiplex ELISA-tilgange 26 og mikroRNA-profilering 27.
Der er foreslået flere metoder til isolering af IF i tumorer, som bredt kan kategoriseres som in vivo (kapillær ultrafiltrering 28,29,30,31 og mikrodialyse 32,33,34,35) og ex vivo-metoder (vævscentrifugering 22,36,37,38 og vævseluation 39,40,41,42). Disse teknikker er blevet gennemgået i omfattende detaljer43,44. Ved valget af den passende metode bør der tages hensyn til spørgsmål som f.eks. downstreamanalyser og applikationer og den genvundne mængde. Vi brugte for nylig denne tilgang som et bevis på princippet for at demonstrere den forskellige metaboliske aktivitet af tumorer fra to murine pancreas adenocarcinom cellelinjer12. Baseret på litteratur 24,38 valgte vi at bruge lavhastighedscentrifugeringsmetoden for at undgå cellebrud og fortynding fra intracellulært indhold. Både mængden af glukose og laktat i TIF afspejlede de forskellige glykolytiske egenskaber ved de to forskellige cellelinjer. Her beskriver vi detaljeret protokollen for de to mest almindeligt anvendte metoder til isolering af TIF: vævscentrifugering og vævseluering (figur 2).
Figur 2: Skematisk repræsentation af tumor interstitielle væskeisoleringsmetoder. Skematisk illustration af de teknikker, der er beskrevet detaljeret i protokollen, nemlig vævscentrifugering (A) og vævseluering (B). Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
For alle indskrevne patienter blev perifert blod og bugspytkirtelsaft indsamlet på tidspunktet for operationen i henhold til protokoller godkendt af institutionens etiske udvalg. Alle patienterne blev inkluderet i studiet efter underskrevet informeret samtykke, herunder indsamling af biologiske prøver og kliniske data. Undersøgelsen blev godkendt af institutionens etiske udvalg (protokolnummer ICH-595, godkendelse udstedt i maj 2009). Procedurer, der involverede mus og deres pleje, var i overensstemmelse med EU's og institutionernes retningslinjer (protokol ID 121/2016-PR).
1. Isolering af bugspytkirtelsaft
BEMÆRK: Tilbagetrækning af bugspytkirtelsaft udføres i forbindelse med en åben procedure for bugspytkirtelresektion (f.eks. Pancreaticoduodenectomy, total pancreatectomy, distal pancreatectomy) af en ekvipage af ekspert bugspytkirtelkirurger.
- Valg af patienter
- Overvej proceduren enhver patient, der er planlagt til en åben bugspytkirtelresektion.
- Bekræft inklusion, hvis hovedpancreaskanalstørrelsen anses for tilstrækkelig til at tillade udtagning af bugspytkirtelsaft. Minimumsgrænsen i diameter af hovedkanalen i bugspytkirtlen betragtes som 2 mm ved kontrastforstærket CT-billeddannelse.
- Præoperativ undersøgelse af bugspytkirtelkanalen ved kontrastforstærket CT-billeddannelse for at hjælpe planlægningen af udtagning af bugspytkirtelsaft
- Tridimensionelt lokalisere hovedbugspytkirtelkanalen i kirtlen på niveauet af bugspytkirtelhalsen: mål afstanden til hovedbugspytkirtelkanalen fra den forreste, overlegne og ringere bugspytkirtelmargen på tværsnitsglas og koronale og sagittale gengivelser. Når du er på operationsstuen, skal du bruge disse målinger til at tilnærme det rigtige sted, hvor du skal punktere bugspytkirtlen for at kannulere Wirsung-kanalen og hente bugspytkirtelsaft.
- Forberedelse af materiale
- Sterilt materiale: Åbn den sterile konvolut på en 25 G nål og en 3 ml sprøjte, og placer dem i det sterile felt i samarbejde med skrubbesygeplejersken.
- Usterilt materiale: Hold et 3 ml K2EDTA vakuumreagensglas klar ved hånden i operationsstuen til opbevaring af væsken.
- Forberedelse af patienten
- Placer patienten på operationsstuen. Inducer blandet generel anæstesi ved hjælp af Remifentanil, Sevorane og Rocuronium, intuberer derefter og begynd at ventilere patienten. Placer patienten i liggende decubitus med højre arm gemt til kroppen og venstre arm bortført til 90 ° grader fastgjort på et armbræt.
- Desinficere mavens hud på snitstedet. Opret og vedligehold et sterilt felt på maven, der draperer patienten.
- Kirurgisk procedure
- Udfør et subkostalt snit og få adgang til bukhulen. Placer en Rochard abdominal tilbagetrækning til organeksponering.
- Udsæt og mobiliser bugspytkirtlen gennem Kocher-manøvre, åbning af det gastrokoliske ledbånd, snit af retroperitonealvævet langs overlegen og ringere grænse af bugspytkirtlen, hvilket skaber et dissektionsplan mellem bugspytkirtelhals og overlegen mesenterisk vene placeret bagud.
- Når bugspytkirtlen er mobiliseret og udsat, fortsæt til bugspytkirtelsaft tilbagetrækning før sektionering af bugspytkirtlen hals.
- Identifikation og lokalisering af bugspytkirtelkanalen
- Anslå placeringen af bugspytkirtelkanalen ved hjælp af målingen taget ved billeddannelse, og palperer derefter den forreste overflade af bugspytkirtlen for at identificere dens nøjagtige placering.
- Indsamling af bugspytkirtelsaft
- Hold bugspytkirtelhovedet og tolvfingertarmen nedenunder og løft det med venstre hånd, hvilket markerer placeringen af bugspytkirtelkanalen med det første ciffer.
- Tag fat med højre hånd på 3 ml sprøjten med 25 G nålen monteret på.
- Brug højre hånd til at indsætte nålen i bugspytkirtlen lige distal til venstre tommelfinger. Bestem dybden af penetration og graden af hældning af nålen baseret på præoperative målinger og på opfattelsen af at have trængt ind i kanalvæggen.
- Træk saften ud med sprøjten. Hvis det ikke er muligt at hente saften, skal du flytte nålen i de fire retninger og forsøge at kannulere bugspytkirtelkanalen.
- Når bugspytkirtelsaften er hentet, skal du flytte den uden for det sterile felt og overføre den til 3 ml K2EDTA vakuumreagensglas. Opbevares ved 4 °C, indtil prøven overføres til laboratoriet, og der foretages yderligere behandling så tidligt som muligt.
BEMÆRK: Mængden af bugspytkirtelsaft, der kan genvindes med denne procedure, varierer meget og spænder fra 0,2 ml til 3 ml efter vores erfaring. Mængden af udtaget juice er meget afhængig af patienten: dimensionen af Wirseng-kanalen og bugspytkirtlens funktionelle status (funktion versus atrofisk kirtel). Efter vores erfaring er der ingen hensigtsmæssighed, der kan bruges til at øge mængden af bugspytkirtelsaft hentet.
2. Behandling af bugspytkirtelsaft
- Centrifuge bugspytkirtelsaft ved 400 x g i 10 minutter ved 4 °C for at fjerne celler eller snavs.
BEMÆRK: Pancreasjuice skal være klar og gennemsigtig i farven før centrifugering. Blodforurening under operationen kan undertiden forekomme, hvilket får prøven til at virke grumset og rødere i farven. Overvej at udelukke sådanne prøver fra yderligere analyser. - Supernatanten, aliquoten genvindes, og opbevares ved -80 °C indtil yderligere analyser.
3. Induktion af subkutane tumorer
BEMÆRK: Murine Panc02 og DT6606 cellelinjer blev opnået fra henholdsvis prof. Lorenzo Piemonti (San Raffaele Diabetes Institute, Milano, Italien) og prof. Francesco Novelli (Center for eksperimentel forskning og medicinske studier, Torino, Italien) som tidligere beskrevet12.
- Vækst af tumorceller
- Kultur Panc02 og DT6606 celler i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium indeholdende 10% føtalt bovin serum (FBS), 2mM L-glutamin og 1% penicillin-streptomycin antibiotikum.
- Optøning frosne celler 1-2 uger før tumorinjektion, i henhold til cellelinjens væksthastighed.
- Celler vokser ved 37 °C med 5 % CO2 og 95 % fugtighed under sterile forhold.
- Afmonter celler med 0,025% Trypsin/EDTA-opløsning i 5 minutter ved 37 °C, når de når 80% sammenløb, og prøv fjernes ved centrifugering.
BEMÆRK: DT6606 er primære, ikke udødeliggjorte, celler, afledt af LSL-KrasG12D-Pdx1-Cre musen, og bør ikke passeres mere end 3 gange før injektion in vivo for at bevare deres oprindelige egenskaber. Det anbefales at optø DT6606-celler 7-10 dage før injektion.
- Injektion af tumorceller in vivo
- Trypsinize celler (se trin 3.1.4) og vask dem en gang med fosfatbufferet saltvand (PBS). PBS elimineres ved centrifugering, og celler resuspenderes i frisk PBS inden tælling.
- Cellerne tælles, og de resuspenderes i PBS i en koncentration på 0,5-1 x 107 celler/ml for at have en endelig koncentration på 0,5-1 x 106 celler/100 μL til injektion i hver mus. Forbered cellerne i overskud. Cellerne opbevares ved 4 °C eller på is indtil procedurens afslutning.
- Gruppér dyrene (8 uger gamle C57BL/6J-hunmus) i forskellige bure efter forskellige cellelinjer eller behandlinger.
- Hold dyrene tilbage manuelt, og bedøm dem ved hjælp af en blanding af ketamin (80 mg/kg) og xylazin (10 mg/kg) eller i henhold til lokalt godkendte procedurer.
- Barber injektionsstedet, normalt en flanke over et ben, med en elektrisk barbermaskine og rengør forsigtigt injektionsstedet med alkohol.
- Pipetter op og ned i cellesuspensionen med en 1 ml sprøjte, og fjern eventuelle luftbobler ved at flytte stemplet op og ned. Fastgør en 25 G nål til sprøjten, og skub stemplet opad, indtil cellesuspensionen når kanyleåbningen.
- Klem flankens hud med fladspidset tang og indsæt forsigtigt nålen i bunden af hudfolden mellem tangen uden at punktere bughulen eller muskulaturen. For at kontrollere nålens korrekte position skal du forsigtigt prøve at flytte nålens spids sidelæns under huden. Nålen skal bevæge sig frit.
- Injicer langsomt 100 μL cellesuspension (indeholdende 0,5-1 x 106 celler), klem forsigtigt injektionsstedet i et par sekunder, og træk langsomt nålen ud uden sidelæns bevægelse.
- Returner musen tilbage til buret og overvåg genopretningen fra anæstesi.
- Kontroller tumorvækst ved hjælp af en tykkelse i 3-4 uger. Afliv dyrene, når tumorerne når ca. 0,5-1 cm3 ved hjælp af CO2 eller i henhold til lokalt godkendte procedurer.
4. Isolering af tumor interstitiel væske (TIF)
- Udskæring af subkutane tumorer
- Bloker dyrenes lemmer med papirbånd og rengør huden med alkohol. Skær huden åben på maven for at adskille den fra peritoneum og fortsæt op til lemmerne. Skær tumoren vokset under flankens hud ved hjælp af saks, klemmer og til sidst en skalpel.
- Væg tumoren og hold den i et rent rør på is, indtil den er isoleret af TIF.
- Isolering af TIF ved centrifugering
- Skær tumoren i halve, skyl de to dele hurtigt i PBS og blød dem forsigtigt på filterpapir for at fjerne overskydende PBS. Udfør disse trin så hurtigt som muligt for at undgå fordampning fra tumoren.
- Overfør straks tumoren til en 20 μm nyloncelle sil fastgjort oven på et 50 ml konisk rør.
- Centrifuger røret ved 400 x g i 10 minutter ved 4 °C.
BEMÆRK: Denne centrifugering med lav hastighed bevarer celleintegriteten og undgår forurening af TIF med intracellulært rum. Lækage af intracellulært indhold kan testes i downstream-applikationer, for eksempel ved at vurdere tilstedeværelsen af intracellulære husholdningsproteiner, såsom ribosomale proteiner25. - TIF genvindes fra bunden af røret, til sidst aliquot det og fryses straks på tøris og opbevares ved -80 °C indtil yderligere analyse.
Valgfrit: Baseret på den nedstrøms proteomiske analyse, der skal udføres, fortyndes prøven i PBS med en proteasehæmmercocktail for at undgå nedbrydning af specifikke molekyler.
BEMÆRK: Afhængigt af tumorens sammensætning giver i nogle tilfælde meget små tumorer ingen væske.
- Isolering af TIF ved eluering
- Skær tumoren i små stykker (≈1-3 mm3) med en saks eller en skalpel og skyl forsigtigt med kold PBS.
BEMÆRK: I dette trin er det meget vigtigt at arbejde hurtigt og udføre minimal manipulation for at undgå celleskader. - Overfør tumorstykkerne til et 1,5 ml rør og tilsæt 500 μL PBS med en proteasehæmmercocktail for at undgå nedbrydning af analytter. Der inkuberes i 1 time ved 37 °C og 5 % CO2.
- Gendan supernatanten og overfør den til et nyt 1,5 ml rør. Der centrifugeres ved 1.000 x g i 5 minutter ved 4 °C for at fjerne eventuelle celler fra prøven.
- Supernatanten overføres til et nyt rør, og centrifugeres igen ved 2.000 x g i 8 minutter ved 4 °C.
- Supernatanten overføres til et nyt rør, og centrifugeres igen ved 20.000 x g i 30 minutter ved 4 °C for at fjerne eventuelt snavs. Gendan supernatanten. TIF-prøven nedfryses straks på tøris og opbevares ved -80 °C indtil yderligere analyse.
- Skær tumoren i små stykker (≈1-3 mm3) med en saks eller en skalpel og skyl forsigtigt med kold PBS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi fulgte den ovenfor beskrevne procedure for at opnå bugspytkirtelsaft fra patienter med PDAC (n = 31) og andre godartede bugspytkirtelpåvirkninger (ikke-PDAC, n = 9), herunder pancreatitis (n = 2), papillær-ampulla tumorer (n = 4), neuroendokrine tumorer (n = 2), intraduktal papillær mucinøs neoplasi (IPMN; n = 1)12. Prøverne af bugspytkirtelsaft blev derefter underkastet metabolomisk analyse ved anvendelse af kernemagnetisk resonans (1H-NMR)12. Ved at filtrere de brede NMR-signaler fra makromolekyler (f.eks. Lipoproteiner, lipider osv.) var vi i stand til i detaljer at forstå små molekylvægtmetabolitter, som vist i 1D Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) spektre (figur 3A). Overvåget OPLS-DA-analyse viste, at den metaboliske profil, der blev påvist i bugspytkirtelsaft, var i stand til at skelne mellem PDAC- og ikke-PDAC-patienter med en nøjagtighed på 82,4 % opnået ved krydsvalidering (figur 3B). Interessant nok gav metabolomisk analyse udført på plasmaprøver fra de samme patienter ikke den samme diskriminerende effekt (nøjagtighed på 75,2% opnået ved krydsvalidering) (figur 3C). Disse resultater indikerer, at bugspytkirtelsaft er en proteinrig prøve og egnet til omfattende "omics" analyser. Desuden antyder den overlegne diskriminerende kraft af bugspytkirtelsaft sammenlignet med plasma, at flytning af "opstrøms" til prøver mere proksimale til tumorstedet kan være en vellykket strategi til at identificere biomarkører, der hjælper med at udpege PDAC fra andre bugspytkirtelsygdomme.
Figur 3: Metabolomisk indhold i bugspytkirtelsaft og plasma. (A) 1H-NMR CPMG-spektre af PDAC (n=31, blå) og ikke-PDAC-prøver (n=9, grøn), der viser oplysninger om de små molekylvægtsmetabolitter i bugspytkirtelsafterne. ppm, dele pr. million. (B) Scores af overvåget multivariat OPLS-DA-analyse på CPMG-spektre fra pancreasjuice PDAC-prøver (blå cirkler) og ikke-PDAC-prøver (lilla trekanter). Analysen adskiller de to grupper (hver skitseret af et edderkoppeplot) med en nøjagtighed på 82,4% opnået ved krydsvalidering. (C) Scores af overvåget multivariat OPLS-DA-analyse på 1D-NOESY-spektre fra plasma PDAC-prøver (n = 22, blå cirkler) og ikke-PDAC-prøver (n = 7, lilla trekanter). Nøjagtighed på 75,2% opnået ved krydsvalidering. Dette tal er blevet ændret fra Cortese et al.12 med tilladelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
For at demonstrere, at TIF-indholdet pålideligt afspejler ændringer i tumormikromiljøet, injicerede vi subkutant to kræftcellelinjer i bugspytkirtlen med modsat glykolytisk hastighed, Panc02 (stærkt glykolytisk) og DT6606 (lavt glykolytisk), efter protokollen beskrevet ovenfor. Derefter isolerede vi TIF fra de udskårne tumorer ved hjælp af den ovenfor beskrevne lavhastighedscentrifugeringsmetode (se punkt 4.2). Fra tumorer med vægt mellem 0,25-1 g genvandt vi et interval på 5-15 μL TIF, som derefter blev brugt til at kvantificere koncentrationen af glucose og lactat. TIF fra stærkt glykolytiske tumorer indeholdt mindre glukose og mere lactat sammenlignet med lavt glykolytiske tumorer (figur 4). Disse data viser, at TIF kan bruges som kilde til tumorafledte metabolitter og ændringer i henhold til selve tumoren.
Figur 4: Glukose- og laktatindhold i TIF afspejler iboende tumoregenskaber. (A) Glucose- og (B) laktatkoncentration i interstitiel væske, isoleret ved hjælp af vævscentrifugeringsmetoden, fra Panc02 (stærkt glykolytisk, n = 10 i A, n = 9 i B) og DT6606 (lavt glykolytisk, n = 5 i A, n = 4 i B) subkutant implanterede tumorer. Boksplotter giver median, nedre kvartili og øvre kvartil ved kassen og minimum og maksimum ved whiskers. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne undersøgelse har vi beskrevet teknikken til intraoperativt at indsamle bugspytkirtelsaft, en stort set uudforsket væskebiopsi. Vi har for nylig vist, at bugspytkirtelsaft kan udnyttes som en kilde til metaboliske markører for sygdom12. Metabolomisk analyse af andre flydende biopsier, såsom blod 5,6,7, urin8 og spyt9, har vist lovende resultater i at diskriminere mellem PDAC og raske forsøgspersoner eller pancreatitis. Bugspytkirtelsaft udskilles imidlertid direkte af kanalceller i bugspytkirtlen, og på grund af dets nærhed til tumorstedet kan det være en mere pålidelig indikator for ændringerne i det omgivende væv, selv i de meget tidlige stadier af sygdommen. Faktisk, mens H-NMR-spektraldata for bugspytkirtelsaft opnåede en forskelsbehandling mellem PDAC-patienter og andre godartede bugspytkirtelsygdomme, gjorde plasmaprøver det ikke. Derfor, selvom det er mindre tilgængeligt end andre flydende biopsier, udgør bugspytkirtelsaft en dyrebar kilde til kliniske biomarkører og kan hjælpe med at identificere hurtigt udviklende sygdomme. Vi har her beskrevet den intraoperative teknik til indsamling af bugspytkirtelsaft; Det kan dog også udføres under minimalt invasive procedurer med henblik på at identificere værdifulde tidlige markører for sygdom. Det skal endnu ikke undersøges, om de forskellige indsamlingsprocedurer påvirker den proteomiske sammensætning af bugspytkirtelsaft.
Mens andre væskebiopsier er let tilgængelige i PDAC murine-modeller, kan samlingen af bugspytkirtelsaft in vivo være meget udfordrende, hvis man overvejer genetiske eller ortopiske modeller, og er slet ikke mulig i subkutane modeller. Derfor har vi i dette papir foreslået brugen af tumor interstitiel væske som et værdifuldt og bredt anvendeligt alternativ. Faktisk er interstitiel væskesammensætning, ligesom bugspytkirtelsaft, direkte påvirket af ændringer i det lokale miljø. Proteomisk profilering på TIF fra forskellige tumorer, såsom hepatocellulær 45,46, nyrecelle41, ovarie 22,47,48 og bryst 42,49 karcinomer, har vist opmuntrende resultater i forskningen for kandidatbiomarkører. Der er imidlertid kun ringe overlapning i de identificerede kandidatproteiner, hvilket tyder på, at den fremgangsmåde, der anvendes til at isolere TIF, sammen med den udførte downstream-analyse og dataindsamlingen kan påvirke de påviste analytter. En nylig undersøgelse af pladecellecarcinom, der sammenlignede de to TIF-isolationsmetoder, der er beskrevet her, centrifugering og eluering, observerede en stærk konsistens i TIF-sammensætningen uafhængigt af den anvendte metode, selvom centrifugering gav et højere indhold af ekstracellulære proteiner25.
Begge metoder, der er beskrevet her til isolering af TIF, vævscentrifugering og vævseluering, har den fordel, at de er teknisk krævende, hurtige og kun kræver grundlæggende laboratorieudstyr. Sammenlignet med andre fremgangsmåder, såsom mikrodialyse og kapillær ultrafiltrering, er centrifugerings- og elueringsteknikkerne til stede med den iboende begrænsning, at de kun er mulige ex vivo. Det er vigtigt at tage højde for flere problemer, når man vælger den passende metode, såsom det analytiske formål med eksperimentet, det genvundne volumen og cellebrud. Tumorens sammensætning bør også overvejes, da det kan påvirke mængden af TIF genvundet. Vævscentrifugering blev oprindeligt udviklet til cellefattige og kollagenrige væv såsom hornhinde38; tumorer på den anden side er normalt væv præget af høj cellularitet og rig vaskularisering, begge funktioner, der øger hydraulisk ledningsevne, og bør derfor lette isoleringen af TIF ved centrifugering. Imidlertid er nogle tumorer, herunder PDAC, til stede med en rigelig stromal eller fibrotisk komponent, rig på ekstracellulære matrixproteiner, såsom kollagener, som har tendens til at bevare makromolekyler i vævet21.
Vævseluation er derimod baseret på passiv diffusion af proteiner fra vævet til eluatet og er med succes blevet udnyttet til en lang række tumorer43. Elution giver genopretning af større mængder, men proteiner vil blive fortyndet. Af denne grund er vævseluering muligvis ikke egnet til molekyler med meget lav forekomst. Desuden kræver eluering en større grad af manipulation af tumoren, hvilket muligvis resulterer i intracellulær indholdslækage i TIF. Dette kan være irrelevant for biomarkøropdagelse, men kan introducere en bias, hvis målet er at bestemme lokal produktion af proteiner. Mængden af cellebrud bør testes i downstream-applikationer for at vælge den mest hensigtsmæssige metode i henhold til tumortypen. Dette kan udføres på flere måder, for eksempel ved at teste tilstedeværelsen af husholdningsproteiner, såsom ribosomale proteiner, i TIF25. En anden foreslået fremgangsmåde er at sammenligne koncentrationerne af udvalgte ekstracellulære stoffer, såsom kreatinin eller Na+, i TIF og plasma, som bør være ens22. Intracellulær indholdslækage bør også overvejes i forbindelse med centrifugeringsmetoden; Faktisk er der stadig ingen generel konsensus om, hvad der skal betragtes som "lav hastighed" for at undgå cellebrud, muligvis på grund af forskellene i tumorsammensætning. Vi valgte at bruge en hastighed på 400 x g, da det har vist sig, at der ikke sker nogen fortynding fra intracellulært indhold for g-kræfter <42438.
Uanset tilgangen repræsenterer TIF en dyrebar og bredt anvendelig kilde til at prøve tumormikromiljøet. Vi har vist, at det rekapitulerer tumor-iboende træk og kan være nyttigt til identifikation af biomarkører for sygdom eller terapeutiske mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Roberta Migliore for teknisk bistand. Forskningen, der fører til disse resultater, har modtaget finansiering fra Associazione Italiana per la ricerca sul cancro (AIRC) under IG2016-ID.18443-projektet - P.I. Marchesi Federica. Finansieringskilderne havde ingen rolle i undersøgelsesdesign, dataindsamling og analyse, beslutning om at offentliggøre eller forberedelse af manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Greiner BioOne | GR616201 | |
| 20 µm nylon cell strainer | pluriSelect | 43-50020-03 | |
| 25G needle | BD Biosciences | 305122 | |
| 3 mL K2EDTA vacutainer | BD Biosciences | 366473 | |
| 3 mL syringe | BD Biosciences | 309656 | |
| 50 mL Falcon tube | Corning | 352098 | |
| Clamps | Medicon | 06.20.12 | |
| Disposable scalpel | Medicom | 9000-10 | |
| Fetal bovine serum | Microtech | MG10432 | |
| Flat-tipped forceps | Medicon | 06.00.10 | |
| Penicillin-Streptomycin | Lonza | ECB3001D | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 34044100 | |
| RPMI medium | Euroclone | ECB9006L | |
| Scissors | Medicon | 02.04.09 | |
| Trypsin/EDTA 1x | Lonza | BE17-161F | |
| Ultraglutamine 100x | Lonza | BE17-605E/U1 |
References
- Costello, E., Greenhalf, W., Neoptolemos, J. P. New biomarkers and targets in pancreatic cancer and their application to treatment. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 9 (8), 435-444 (2012).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2020. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 70 (1), 7-30 (2020).
- Neoptolemos, J. P., et al. Therapeutic developments in pancreatic cancer: current and future perspectives. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 15 (6), 333-348 (2018).
- Sahin, I. H., Askan, G., Hu, Z. I., O'Reilly, E. M. Immunotherapy in pancreatic ductal adenocarcinoma: an emerging entity. Annals of Oncology. 28 (12), 2950-2961 (2017).
- Mayerle, J., et al. Metabolic biomarker signature to differentiate pancreatic ductal adenocarcinoma from chronic pancreatitis. Gut. 67 (1), 128-137 (2018).
- Bathe, O. F., et al. Feasibility of identifying pancreatic cancer based on serum metabolomics. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 20 (1), 140-147 (2011).
- Mayers, J. R., et al. Elevation of circulating branched-chain amino acids is an early event in human pancreatic adenocarcinoma development. Nature Medicine. 20 (10), 1193-1198 (2014).
- Napoli, C., et al. Urine metabolic signature of pancreatic ductal adenocarcinoma by (1)h nuclear magnetic resonance: identification, mapping, and evolution. Journal of Proteome Research. 11 (1), 1274-1283 (2012).
- Sugimoto, M., Wong, D. T., Hirayama, A., Soga, T., Tomita, M. Capillary electrophoresis mass spectrometry-based saliva metabolomics identified oral, breast and pancreatic cancer-specific profiles. Metabolomics. 6 (1), 78-95 (2010).
- Chen, R., et al. Comparison of pancreas juice proteins from cancer versus pancreatitis using quantitative proteomic analysis. Pancreas. 34 (1), 70-79 (2007).
- Mori, Y., et al. A minimally invasive and simple screening test for detection of pancreatic ductal adenocarcinoma using biomarkers in duodenal juice. Pancreas. 42 (2), 187-192 (2013).
- Cortese, N., et al. Metabolome of Pancreatic Juice Delineates Distinct Clinical Profiles of Pancreatic Cancer and Reveals a Link between Glucose Metabolism and PD-1+ Cells. Cancer Immunology Research. , (2020).
- Tanaka, M., et al. Cytologic Analysis of Pancreatic Juice Increases Specificity of Detection of Malignant IPMN-A Systematic Review. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 17 (11), 2199-2211 (2019).
- Chen, K. T., et al. Potential prognostic biomarkers of pancreatic cancer. Pancreas. 43 (1), 22-27 (2014).
- Tian, M., et al. Proteomic analysis identifies MMP-9, DJ-1 and A1BG as overexpressed proteins in pancreatic juice from pancreatic ductal adenocarcinoma patients. BMC Cancer. 8, 241 (2008).
- Shi, C., et al. Sensitive and quantitative detection of KRAS2 gene mutations in pancreatic duct juice differentiates patients with pancreatic cancer from chronic pancreatitis, potential for early detection. Cancer Biology & Therapy. 7 (3), 353-360 (2008).
- Rogers, C. D., et al. Differentiating pancreatic lesions by microarray and QPCR analysis of pancreatic juice RNAs. Cancer Biology & Therapy. 5 (10), 1383-1389 (2006).
- Matsubayashi, H., et al. DNA methylation alterations in the pancreatic juice of patients with suspected pancreatic disease. Cancer Research. 66 (2), 1208-1217 (2006).
- Cote, G. A., et al. A pilot study to develop a diagnostic test for pancreatic ductal adenocarcinoma based on differential expression of select miRNA in plasma and bile. The American Journal of Gastroenterology. 109 (12), 1942-1952 (2014).
- Yu, J., et al. Digital next-generation sequencing identifies low-abundance mutations in pancreatic juice samples collected from the duodenum of patients with pancreatic cancer and intraductal papillary mucinous neoplasms. Gut. , (2016).
- Wiig, H., Swartz, M. A. Interstitial fluid and lymph formation and transport: physiological regulation and roles in inflammation and cancer. Physiological Reviews. 92 (3), 1005-1060 (2012).
- Haslene-Hox, H., et al. A new method for isolation of interstitial fluid from human solid tumors applied to proteomic analysis of ovarian carcinoma tissue. PLoS One. 6 (4), 19217 (2011).
- Zhang, J., et al. In-depth proteomic analysis of tissue interstitial fluid for hepatocellular carcinoma serum biomarker discovery. British Journal of Cancer. 117 (11), 1676-1684 (2017).
- Sullivan, M. R., et al. Quantification of microenvironmental metabolites in murine cancers reveals determinants of tumor nutrient availability. Elife. 8, (2019).
- Matas-Nadal, C., et al. Evaluation of Tumor Interstitial Fluid-Extraction Methods for Proteome Analysis: Comparison of Biopsy Elution versus Centrifugation. Journal of Proteome Research. 19 (7), 2598-2605 (2020).
- Espinoza, J. A., et al. Cytokine profiling of tumor interstitial fluid of the breast and its relationship with lymphocyte infiltration and clinicopathological characteristics. Oncoimmunology. 5 (12), 1248015 (2016).
- Halvorsen, A. R., et al. Profiling of microRNAs in tumor interstitial fluid of breast tumors - a novel resource to identify biomarkers for prognostic classification and detection of cancer. Molecular Oncology. 11 (2), 220-234 (2017).
- Yang, S., Huang, C. M. Recent advances in protein profiling of tissues and tissue fluids. Expert Review of Proteomics. 4, 515-529 (2007).
- Huang, C. M., et al. Mass spectrometric proteomics profiles of in vivo tumor secretomes: capillary ultrafiltration sampling of regressive tumor masses. Proteomics. 6 (22), 6107-6116 (2006).
- Leegsma-Vogt, G., Janle, E., Ash, S. R., Venema, K., Korf, J. Utilization of in vivo ultrafiltration in biomedical research and clinical applications. Life Sciences. 73 (16), 2005-2018 (2003).
- Schneiderheinze, J. M., Hogan, B. L. Selective in vivo and in vitro sampling of proteins using miniature ultrafiltration sampling probes. Analytical Chemistry. 68 (21), 3758-3762 (1996).
- Hardt, M., Lam, D. K., Dolan, J. C., Schmidt, B. L. Surveying proteolytic processes in human cancer microenvironments by microdialysis and activity-based mass spectrometry. Proteomics Clinical Applications. 5 (11-12), 636-643 (2011).
- Xu, B. J., et al. Microdialysis combined with proteomics for protein identification in breast tumor microenvironment in vivo. Cancer Microenvironment. 4 (1), 61-71 (2010).
- Bendrik, C., Dabrosin, C. Estradiol increases IL-8 secretion of normal human breast tissue and breast cancer in vivo. The Journal of Immunology. 182 (1), 371-378 (2009).
- Ao, X., Stenken, J. A. Microdialysis sampling of cytokines. Methods. 38 (4), 331-341 (2006).
- Ho, P. C., et al. Phosphoenolpyruvate Is a Metabolic Checkpoint of Anti-tumor T Cell Responses. Cell. 162 (6), 1217-1228 (2015).
- Choi, J., et al. Intraperitoneal immunotherapy for metastatic ovarian carcinoma: Resistance of intratumoral collagen to antibody penetration. Clinical Cancer Research. 12 (6), 1906-1912 (2006).
- Wiig, H., Aukland, K., Tenstad, O. Isolation of interstitial fluid from rat mammary tumors by a centrifugation method. The American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 284 (1), 416-424 (2003).
- Li, S., Wang, R., Zhang, M., Wang, L., Cheng, S. Proteomic analysis of non-small cell lung cancer tissue interstitial fluids. World Journal of Surgical Oncology. 11, 173 (2013).
- Fijneman, R. J., et al. Proximal fluid proteome profiling of mouse colon tumors reveals biomarkers for early diagnosis of human colorectal cancer. Clinical Cancer Research. 18 (9), 2613-2624 (2012).
- Teng, P. N., Hood, B. L., Sun, M., Dhir, R., Conrads, T. P. Differential proteomic analysis of renal cell carcinoma tissue interstitial fluid. Journal of Proteome Research. 10 (3), 1333-1342 (2011).
- Turtoi, A., et al. Novel comprehensive approach for accessible biomarker identification and absolute quantification from precious human tissues. Journal of Proteome Research. 10 (7), 3160-3182 (2011).
- Wagner, M., Wiig, H. Tumor Interstitial Fluid Formation, Characterization, and Clinical Implications. Frontiers in Oncology. 5, 115 (2015).
- Haslene-Hox, H., Tenstad, O., Wiig, H. Interstitial fluid-a reflection of the tumor cell microenvironment and secretome. Biochimica Biophysica Acta. 1834 (11), 2336-2346 (2013).
- Hsieh, S. Y., et al. Secreted ERBB3 isoforms are serum markers for early hepatoma in patients with chronic hepatitis and cirrhosis. Journal of Proteome Research. 10, 4715-4724 (2011).
- Sun, W., et al. Characterization of the liver tissue interstitial fluid (TIF) proteome indicates potential for application in liver disease biomarker discovery. Journal of Proteome Research. 9 (2), 1020-1031 (2010).
- Haslene-Hox, H., et al. Increased WD-repeat containing protein 1 in interstitial fluid from ovarian carcinomas shown by comparative proteomic analysis of malignant and healthy gynecological tissue. Biochimica Biophysica Acta. 1834 (11), 2347-2359 (2013).
- Wang, T. H., et al. Stress-induced phosphoprotein 1 as a secreted biomarker for human ovarian cancer promotes cancer cell proliferation. Molecular & Cellular Proteomics. 9, 1873-1884 (2010).
- Gromov, P., et al. Up-regulated proteins in the fluid bathing the tumour cell microenvironment as potential serological markers for early detection of cancer of the breast. Molecular Oncology. 4 (1), 65-89 (2010).
