Summary
Pankreassaft ist eine wertvolle Quelle von Biomarkern für menschlichen Bauchspeicheldrüsenkrebs. Wir beschreiben hier eine Methode für das intraoperative Sammelverfahren. Um die Herausforderung zu meistern, dieses Verfahren in Mausmodellen anzuwenden, schlagen wir eine alternative Probe, die interstitielle Tumorflüssigkeit, vor und beschreiben hier zwei Protokolle für ihre Isolierung.
Abstract
Das Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse (PDAC) ist die vierthäufigste krebsbedingte Todesursache und wird bald die zweithäufigste werden. Es besteht ein dringender Bedarf an Variablen, die mit spezifischen Pankreaspathologien verbunden sind, um die präoperative Differentialdiagnose und die Patientenprofilierung zu unterstützen. Pankreassaft ist eine relativ unerforschte Körperflüssigkeit, die aufgrund ihrer Nähe zur Tumorstelle Veränderungen im umgebenden Gewebe widerspiegelt. Hier beschreiben wir ausführlich das intraoperative Sammelverfahren. Leider ist die Übersetzung der Pankreassaftsammlung in murine PDAC-Modelle, um mechanistische Studien durchzuführen, technisch sehr anspruchsvoll. Tumorinterstitielle Flüssigkeit (TIF) ist die extrazelluläre Flüssigkeit außerhalb von Blut und Plasma, die Tumor- und Stromazellen badet. Ähnlich wie Pankreassaft kann TIF aufgrund seiner Eigenschaft, Moleküle, die im Plasma verdünnt gefunden werden, zu sammeln und zu konzentrieren, als Indikator für mikroökologische Veränderungen und als wertvolle Quelle für krankheitsassoziierte Biomarker genutzt werden. Da TIF nicht leicht zugänglich ist, wurden verschiedene Techniken für seine Isolierung vorgeschlagen. Wir beschreiben hier zwei einfache und technisch anspruchslose Methoden zur Isolierung: Gewebezentrifugation und Gewebeelution.
Introduction
Das duktale Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse (PDAC) ist einer der aggressivsten Tumoren und wird bald die zweithäufigste Todesursachesein 1,2,3. Es ist bekannt für seine immunsuppressive Mikroumgebung und für seine Nichtreaktion auf Immuntherapieprotokolle4. Derzeit ist die chirurgische Resektion immer noch die einzige kurative Option für PDAC, aber es gibt eine hohe Häufigkeit von frühen Rückfällen und postoperativen Komplikationen. Das Fehlen spezifischer Symptome bis zu einem fortgeschrittenen Stadium ermöglicht keine frühzeitige Diagnose, was zur Pünktlichkeit der Krankheit beiträgt. Darüber hinaus kann die Überlappung der Symptome zwischen PDAC und anderen gutartigen Pankreaspathologien das Erreichen einer schnellen und zuverlässigen Diagnose mit den aktuellen Diagnosestrategien behindern. Die Identifizierung von Variablen, die mit spezifischen Pankreaspathologien assoziiert sind, könnte den chirurgischen Entscheidungsprozess erleichtern und die Erstellung von Patientenprofilen verbessern.
Vielversprechende Ergebnisse bei der Entdeckung von Biomarkern wurden mit leicht zugänglichen Körperflüssigkeiten wie Blut 5,6,7, Urin8, Speichel 9 und Pankreassaft10,11,12 erzielt. Viele Studien haben umfassende "Omics"-Ansätze wie genomische, proteomische und metabolomische Techniken genutzt, um Kandidatenmoleküle oder Signaturen zu identifizieren, die zwischen PDAC und anderen gutartigen Pankreaserkrankungen unterscheiden könnten. Wir haben kürzlich gezeigt, dass Pankreassaft, eine relativ unerforschte Körperflüssigkeit, verwendet werden kann, um metabolische Signaturen von Patienten mit unterschiedlichen klinischen Profilen zu identifizieren12. Pankreassaft ist eine proteinreiche Flüssigkeit, die das Sekretom der Pankreasduktalzellen ansammelt und zum Hauptgang der Bauchspeicheldrüse und dann zum Hauptgallengang fließt. Aufgrund seiner Nähe zur Bauchspeicheldrüse könnte es stark von mikroumweltbedingten Störungen beeinflusst werden, die durch die Tumormasse induziert werden (Abbildung 1) und daher aussagekräftiger sind als Blut oder Urin oder gewebebasiertes Profiling. Mehrere Studien haben das Potenzial von Pankreassaft zur Identifizierung neuer Biomarker von Krankheiten mit verschiedenen Ansätzen untersucht, einschließlich zytologischer Analyse 13, proteomischer Analyse durch Massenspektrometrie 14,15, Bewertung genetischer und epigenetischer Marker wie K-ras- und p53-Mutationen 16,17, Veränderungen der DNA-Methylierung 18 und miRNAs 19 . Technisch gesehen kann Pankreassaft intraoperativ oder mit minimalinvasiven Verfahren wie endoskopischem Ultraschall, retrograder Cholangio-Pankreatographie oder durch endoskopische Entnahme von Zwölffingerdarmsaftsekretion20 gewonnen werden. Es ist noch nicht klar, inwieweit die Pankreassaftzusammensetzung durch die verwendete Sammeltechnik beeinflusst wird. Wir beschreiben hier das intraoperative Sammelverfahren und zeigen, dass Pankreassaft eine wertvolle Quelle für PDAC-Biomarker darstellen kann.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Pankreassaftsammlung. (A) Schematische Darstellung der Sekretion von Pankreassaft in den Pankreasgang und seiner Sammlung während der Operation. Der Einschub zeigt eine Nahaufnahme der Tumormikroumgebung: Pankreassaft sammelt Moleküle, die von Tumor- und Stromazellen in den Pankreasgängen freigesetzt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Die Sammlung von Pankreassaft in genetischen und orthotopen Mausmodellen von PDAC wäre in der Perspektive zu begrüßen, dieses Biofluid in präklinischen mechanistischen Studien zu nutzen; Dieses Verfahren kann jedoch technisch sehr anspruchsvoll sein und ist für einfachere Modelle wie subkutane Tumoren nicht realisierbar. Aus diesem Grund identifizierten wir Tumor-Interstitialflüssigkeit (TIF) als alternative Quelle zu Pankreassaft, da sie als Indikator für umgebende Störungen fungiert. Interstitielle Flüssigkeit (IF) ist die extrazelluläre Flüssigkeit, die sich außerhalb von Blut- und Lymphgefäßen befindet und Gewebezellen badet21. Die IF-Zusammensetzung wird sowohl durch die Durchblutung des Organs als auch durch die lokale Sekretion beeinflusst; Tatsächlich produzieren und sezernieren umgebende Zellen aktiv Proteine im IF21. Das Interstitium spiegelt mikroökologische Veränderungen des umgebenden Gewebes wider und könnte daher eine wertvolle Quelle für die Entdeckung von Biomarkern in verschiedenen pathologischen Kontexten wie Tumoren darstellen. Die hohe Konzentration lokal sezernierter Proteine in TIF kann verwendet werden, um Kandidatenmoleküle zu identifizieren, die als prognostische oder diagnostische Biomarker im Plasma22,23,24 getestet werden sollen. Mehrere Studien haben gezeigt, dass TIF eine geeignete Probe für proteomische Hochdurchsatzansätze ist, wie z. B. Massenspektrometrietechniken 23,24,25, sowie Multiplex-ELISA-Ansätze 26 und microRNA-Profiling 27.
Es wurden mehrere Ansätze für die Isolierung von IF in Tumoren vorgeschlagen, die grob kategorisiert werden können als in vivo (Kapillarultrafiltration 28,29,30,31 und Mikrodialyse 32,33,34,35) und ex vivo Methoden (Gewebezentrifugation 22,36,37,38 und Gewebeelution 39,40,41,42). Diese Techniken wurden ausführlich überprüft43,44. Bei der Wahl der geeigneten Methode sollten Aspekte wie die nachgelagerten Analysen und Anwendungen sowie das zurückgewonnene Volumen berücksichtigt werden. Wir haben diesen Ansatz kürzlich als Proof of Principle verwendet, um die unterschiedliche metabolische Aktivität von Tumoren aus zwei murinen Pankreas-Adenokarzinom-Zelllinienzu demonstrieren 12. Basierend auf Literatur 24,38 haben wir uns für die Verwendung der Low-Speed-Zentrifugationsmethode entschieden, um Zellbruch und Verdünnung durch intrazelluläre Inhalte zu vermeiden. Sowohl die Menge an Glukose als auch Laktat in TIF spiegelten die unterschiedlichen glykolytischen Eigenschaften der beiden verschiedenen Zelllinien wider. Hier beschreiben wir detailliert das Protokoll für die beiden am häufigsten verwendeten Methoden zur Isolierung von TIF: Gewebezentrifugation und Gewebeelution (Abbildung 2).
Abbildung 2: Schematische Darstellung der Methoden zur Isolierung der interstitiellen Tumorflüssigkeit. Schematische Darstellung der im Protokoll ausführlich beschriebenen Techniken, nämlich Gewebezentrifugation (A) und Gewebeelution (B). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Für alle eingeschlossenen Patienten wurden peripheres Blut und Pankreassaft zum Zeitpunkt der Operation gemäß den vom Ethikausschuss der Institution genehmigten Protokollen entnommen. Alle Patienten wurden nach unterzeichneter Einverständniserklärung in die Studie aufgenommen, einschließlich der Sammlung biologischer Proben und klinischer Daten. Die Studie wurde von der Ethikkommission der Institution genehmigt (Protokollnummer ICH-595, Genehmigung erteilt im Mai 2009). Die Verfahren mit Mäusen und ihre Pflege entsprachen den EU- und institutionellen Richtlinien (Protokoll-ID 121/2016-PR).
1. Isolierung von Pankreassaft
HINWEIS: Der Entzug von Pankreassaft wird im Rahmen eines offenen Verfahrens der Pankreasresektion (z. B. Pankreatikoduodenektomie, totale Pankreatektomie, distale Pankreatektomie) von einer Equipe von erfahrenen Pankreaschirurgen durchgeführt.
- Patientenauswahl
- Betrachten Sie für das Verfahren jeden Patienten, der für eine offene Pankreasresektion geplant ist.
- Bestätigen Sie den Einschluss, wenn die Größe des Hauptpankreasgangs als ausreichend erachtet wird, um die Entnahme von Pankreassaft zu ermöglichen. Die minimale Grenze im Durchmesser des Hauptpankreasgangs beträgt 2 mm bei kontrastmittelverstärkter CT-Bildgebung.
- Präoperative Untersuchung des Pankreasgangs bei kontrastverstärkter CT-Bildgebung zur Unterstützung der Planung der Pankreassaftgewinnung
- Dreidimensionale Lokalisierung des Hauptpankreasgangs innerhalb der Drüse auf Höhe des Pankreashalses: Messen Sie den Abstand des Hauptpankreasgangs vom vorderen, oberen und unteren Pankreasrand auf Querschnittsobjektträgern und koronalen und sagittalen Renderings. Sobald Sie im Operationssaal sind, verwenden Sie diese Messungen, um den richtigen Ort anzunähern, an dem die Bauchspeicheldrüse punktiert werden muss, um den Wirsung-Gang zu kanülieren und Pankreassaft zu entnehmen.
- Vorbereitung des Materials
- Steriles Material: Öffnen Sie den sterilen Umschlag einer 25-G-Nadel und einer 3-ml-Spritze und positionieren Sie sie in Zusammenarbeit mit der Peeling-Schwester im sterilen Feld.
- Unsteriles Material: Halten Sie im Operationssaal ein 3 mL K2EDTA-Vakuumreagenzglas zur Aufbewahrung der Flüssigkeit bereit.
- Vorbereitung des Patienten
- Positionieren Sie den Patienten auf dem Operationssaalbett. Induzieren Sie eine gemischte Vollnarkose mit Remifentanil, Sevorane und Rocuronium, intubieren Sie dann und beginnen Sie mit der Beatmung des Patienten. Positionieren Sie den Patienten in Rückenlage, wobei der rechte Arm am Körper befestigt ist und der linke Arm auf einem Armbrett um 90° Grad abgeführt wird.
- Desinfizieren Sie die Haut des Bauches an der Stelle des Einschnitts. Erstellen und pflegen Sie ein steriles Feld auf dem Bauch, das den Patienten drapiert.
- Chirurgischer Eingriff
- Führen Sie einen Subkostalschnitt durch und erhalten Sie Zugang zur Bauchhöhle. Positionieren Sie eine Rochard Bauchretraktion für Organexposition.
- Freilegen und mobilisieren Sie die Bauchspeicheldrüse durch Kocher-Manöver, Öffnung des gastrokolischen Bandes, Inzision des retroperitonealen Gewebes entlang der oberen und unteren Grenze der Bauchspeicheldrüse, wodurch eine Dissektionsebene zwischen Pankreashals und Vena mesenterica superior nach hinten entsteht.
- Sobald die Bauchspeicheldrüse mobilisiert und freigelegt ist, fahren Sie mit dem Pankreassaftentzug fort, bevor Sie den Pankreashals schneiden.
- Identifizierung und Lokalisation des Pankreasgangs
- Schätzen Sie die Position des Pankreasgangs anhand der Messung, die bei der Bildgebung durchgeführt wurde, und tasten Sie dann die vordere Oberfläche der Bauchspeicheldrüse ab, um ihre genaue Position zu identifizieren.
- Sammlung von Pankreassaft
- Halten Sie den Pankreaskopf und den Zwölffingerdarm von unten und heben Sie ihn mit der linken Hand an, wobei Sie die Position des Pankreasgangs mit der ersten Ziffer markieren.
- Greifen Sie mit der rechten Hand der 3-ml-Spritze mit aufgesetzter 25-G-Nadel.
- Verwenden Sie die rechte Hand, um die Nadel in die Bauchspeicheldrüse einzuführen, die nur distal zum linken Daumen führt. Bestimmen Sie die Eindringtiefe und den Grad der Neigung der Nadel basierend auf präoperativen Messungen und der Wahrnehmung, in die Kanalwand eingedrungen zu sein.
- Ziehen Sie den Saft mit der Spritze heraus. Wenn es nicht möglich ist, den Saft zu erhalten, verschieben Sie die Nadel in die vier Richtungen, um den Pankreasgang zu kanülieren.
- Sobald der Pankreassaft entnommen ist, bewegen Sie ihn außerhalb des sterilen Feldes und übertragen Sie ihn in das 3 ml K2EDTA-Vakuumreagenzglas. Bei 4 °C aufbewahren, bis die Probe ins Labor überführt wird, und so früh wie möglich mit der weiteren Verarbeitung fortfahren.
HINWEIS: Das Volumen des Pankreassaftes, der mit diesem Verfahren gewonnen werden kann, variiert stark und reicht unserer Erfahrung nach etwa von 0,2 ml bis 3 ml. Die gewonnene Saftmenge hängt stark vom Patienten ab: der Dimension des Wirsung-Kanals und dem Funktionsstatus der Bauchspeicheldrüse (Funktion versus atrophische Drüse). Nach unserer Erfahrung gibt es kein Hilfsmittel, das verwendet werden kann, um die Menge an Pankreassaft zu erhöhen.
2. Verarbeitung von Pankreassaft
- Pankreassaft bei 400 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren, um Zellen oder Ablagerungen zu entfernen.
HINWEIS: Pankreassaft sollte vor der Zentrifugation klar und transparent sein. Blutkontamination während der Operation kann manchmal auftreten, wodurch die Probe trüber und röter erscheint. Erwägen Sie, solche Proben von weiteren Analysen auszuschließen. - Überstand zurückgewinnen, aliquot und bis zur weiteren Analyse bei -80 °C lagern.
3. Induktion subkutaner Tumoren
HINWEIS: Die murinen Zelllinien Panc02 und DT6606 wurden von Prof. Lorenzo Piemonti (San Raffaele Diabetes Institute, Mailand, Italien) bzw. Prof. Francesco Novelli (Center for Experimental Research and Medical Studies, Turin, Italien) erhalten, wie zuvor beschrieben12.
- Wachstum von Tumorzellen
- Kultur Panc02 und DT6606 Zellen in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium mit 10% fetalem Rinderserum (FBS), 2mM L-Glutamin und 1% Penicillin-Streptomycin-Antibiotikum.
- Tauen Sie gefrorene Zellen 1-2 Wochen vor der Tumorinjektion entsprechend der Wachstumsrate der Zelllinie auf.
- Zellen bei 37 °C mit 5% CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit unter sterilen Bedingungen züchten.
- Zellen mit 0,025% Trypsin/EDTA-Lösung für 5 min bei 37 °C ablösen, wenn sie 80% Konfluenz erreichen und Trypsin durch Zentrifugation eliminieren.
HINWEIS: DT6606 sind primäre, nicht immortalisierte Zellen, die von der LSL-KrasG12D-Pdx1-Cre-Maus abgeleitet sind und nicht mehr als 3 Mal vor der Injektion in vivo durchlaufen werden sollten, um ihre ursprünglichen Eigenschaften zu erhalten. Es wird empfohlen, DT6606-Zellen 7-10 Tage vor der Injektion aufzutauen.
- Injektion von Tumorzellen in vivo
- Trypsinisieren Sie die Zellen (siehe Schritt 3.1.4) und waschen Sie sie einmal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Eliminieren Sie PBS durch Zentrifugation und resuspendieren Sie Zellen in frischem PBS vor dem Zählen.
- Zählen Sie die Zellen und resuspendieren Sie sie in PBS in einer Konzentration von 0,5-1 x 107 Zellen/ml, um eine Endkonzentration von 0,5-1 x 106 Zellen/100 μL zu injizieren. Bereiten Sie die Zellen im Überschuss vor. Halten Sie die Zellen bis zum Ende des Eingriffs bei 4 °C oder auf Eis.
- Gruppieren Sie die Tiere (8 Wochen alte weibliche C57BL / 6J-Mäuse) in verschiedenen Käfigen nach verschiedenen Zelllinien oder Behandlungen.
- Halten Sie die Tiere manuell zurück und betäuben Sie sie mit einer Mischung aus Ketamin (80 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) oder nach lokal zugelassenen Verfahren.
- Rasieren Sie die Injektionsstelle, normalerweise eine Flanke über einem Bein, mit einem Elektrorasierer und reinigen Sie die Injektionsstelle sorgfältig mit Alkohol.
- Pipettieren Sie die Zellsuspension mit einer 1-ml-Spritze auf und ab und entfernen Sie Luftblasen, indem Sie den Kolben auf und ab bewegen. Befestigen Sie eine 25 G Nadel an der Spritze und drücken Sie den Kolben nach oben, bis die Zellsuspension die Nadelöffnung erreicht.
- Drücken Sie die Haut der Flanke mit einer flachen Pinzette zusammen und führen Sie die Nadel vorsichtig an der Basis der Hautfalte zwischen die Pinzette ein, ohne die Peritonealhöhle oder die Muskulatur zu punktieren. Um die korrekte Position der Nadel zu überprüfen, versuchen Sie vorsichtig, die Nadelspitze seitlich unter die Haut zu bewegen. Die Nadel sollte sich frei bewegen.
- Injizieren Sie langsam 100 μL Zellsuspension (mit 0,5-1 x 106 Zellen), klemmen Sie die Injektionsstelle vorsichtig für einige Sekunden und ziehen Sie die Nadel langsam ohne seitliche Bewegung zurück.
- Bringen Sie die Maus zurück in ihren Käfig und überwachen Sie die Erholung von der Narkose.
- Überprüfen Sie das Tumorwachstum mit einem Messschieber für 3-4 Wochen. Euthanasieren Sie die Tiere, wenn Tumore etwa 0,5-1 cm3 erreichen, mit CO2 oder nach lokal zugelassenen Verfahren.
4. Isolierung von Tumor-Interstitialflüssigkeit (TIF)
- Exzision von subkutanen Tumoren
- Blockieren Sie die Gliedmaßen der Tiere mit Klebeband und reinigen Sie die Haut mit Alkohol. Schneiden Sie die Haut am Bauch auf, um sie vom Peritoneum zu trennen und bis zu den Gliedmaßen zu gehen. Entfernen Sie den Tumor, der unter der Haut der Flanke gewachsen ist, mit Hilfe von Scheren, Klemmen und schließlich einem Skalpell.
- Wiegen Sie den Tumor und bewahren Sie ihn bis zur Isolierung von TIF in einem sauberen Röhrchen auf Eis auf.
- Isolierung von TIF durch Zentrifugation
- Schneiden Sie den Tumor in zwei Hälften, spülen Sie die beiden Teile schnell in PBS und tupfen Sie sie vorsichtig auf Filterpapier, um überschüssiges PBS zu entfernen. Führen Sie diese Schritte so schnell wie möglich durch, um eine Verdunstung aus dem Tumor zu vermeiden.
- Übertragen Sie den Tumor sofort in ein 20 μm Nylonzellsieb, das auf einem 50 ml konischen Röhrchen befestigt ist.
- Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 400 x g für 10 min bei 4 °C.
HINWEIS: Diese Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit bewahrt die Zellintegrität und vermeidet eine Kontamination von TIF durch intrazelluläre Kompartimente. Intrazelluläre Inhaltsverluste können in nachgeschalteten Anwendungen getestet werden, indem beispielsweise das Vorhandensein von intrazellulären Housekeeping-Proteinen wie ribosomalen Proteinen bewertetwird 25. - Gewinnen Sie das TIF vom Boden des Röhrchens, aliquotieren Sie es schließlich und frieren Sie es sofort auf Trockeneis ein und lagern Sie es bis zur weiteren Analyse bei -80 °C.
Optional: Basierend auf der durchzuführenden nachgeschalteten proteomischen Analyse die Probe in PBS mit einem Proteaseinhibitor-Cocktail verdünnen, um den Abbau bestimmter Moleküle zu vermeiden.
HINWEIS: Je nach Zusammensetzung des Tumors geben sehr kleine Tumoren in einigen Fällen keine Flüssigkeit ab.
- Isolierung von TIF durch Elution
- Schneiden Sie den Tumor mit einer Schere oder einem Skalpell in kleine Stücke (≈1-3 mm3) und spülen Sie ihn vorsichtig mit kaltem PBS ab.
HINWEIS: In diesem Schritt ist es sehr wichtig, schnell zu arbeiten und minimale Manipulationen durchzuführen, um Zellschäden zu vermeiden. - Die Tumorstücke werden in ein 1,5-ml-Röhrchen überführt und 500 μL PBS mit einem Proteaseinhibitor-Cocktail hinzugefügt, um den Abbau von Analyten zu vermeiden. 1 Stunde bei 37 °C und 5%CO2 inkubieren.
- Gewinnen Sie den Überstand zurück und übertragen Sie ihn in ein neues 1,5-ml-Röhrchen. Zentrifugieren Sie bei 1.000 x g für 5 min bei 4 °C, um Zellen aus der Probe zu entfernen.
- Der Überstand wird in ein neues Röhrchen überführt und erneut bei 2.000 x g für 8 min bei 4 °C zentrifugiert.
- Der Überstand wird in ein neues Röhrchen überführt und erneut bei 20.000 x g für 30 min bei 4 °C zentrifugiert, um eventuelle Ablagerungen zu entfernen. Stellen Sie den Überstand wieder her. Die TIF-Probe wird sofort aliquot und auf Trockeneis eingefroren und bis zur weiteren Analyse bei -80 °C gelagert.
- Schneiden Sie den Tumor mit einer Schere oder einem Skalpell in kleine Stücke (≈1-3 mm3) und spülen Sie ihn vorsichtig mit kaltem PBS ab.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wir folgten dem oben beschriebenen Verfahren, um Pankreassaft von Patienten mit PDAC (n = 31) und anderen gutartigen Pankreaserkrankungen (nicht-PDAC, n = 9) zu erhalten, einschließlich Pankreatitis (n = 2), papillären Ampullentumoren (n = 4), neuroendokrinen Tumoren (n = 2), intraduktalen papillären muzinösen Neoplasien (IPMN; n = 1) 12. Die Pankreassaftproben wurden dann einer metabolomischen Analyse mittels Kernspinresonanz (1H-NMR)12 unterzogen. Durch die Filterung der breiten NMR-Signale von Makromolekülen (z.B. Lipoproteine, Lipide, etc.) konnten wir kleinmolekulare Metaboliten im Detail abschätzen, wie in den 1D Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) Spektren gezeigt (Abbildung 3A). Die überwachte OPLS-DA-Analyse zeigte, dass das in Pankreassaft nachgewiesene metabolische Profil in der Lage war, zwischen PDAC- und Nicht-PDAC-Patienten mit einer Genauigkeit von 82,4% zu unterscheiden, die durch Kreuzvalidierung erhalten wurde (Abbildung 3B). Interessanterweise ergab die metabolomische Analyse, die an Plasmaproben derselben Patienten durchgeführt wurde, nicht die gleiche Unterscheidungskraft (Genauigkeit von 75,2% durch Kreuzvalidierung) (Abbildung 3C). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Pankreassaft eine proteinreiche Probe ist und sich für umfassende "Omics"-Analysen eignet. Darüber hinaus deutet die überlegene Unterscheidungskraft von Pankreassaft im Vergleich zu Plasma darauf hin, dass der Übergang "stromaufwärts" zu Proben, die näher an der Tumorstelle liegen, eine erfolgreiche Strategie zur Identifizierung von Biomarkern sein könnte, die helfen, PDAC von anderen Pankreaserkrankungen zu unterscheiden.
Abbildung 3: Metabolomischer Gehalt in Pankreassaft und Plasma. (A) 1H-NMR CPMG-Spektren von PDAC (n=31, blau) und Nicht-PDAC-Proben (n=9, grün), die Details zu den in den Pankreassäften enthaltenen niedermolekularen Metaboliten zeigen. ppm, parts per million. (B) Scores von überwachten multivariaten OPLS-DA-Analysen auf CPMG-Spektren aus Pankreassaft-PDAC-Proben (blaue Kreise) und Nicht-PDAC-Proben (violette Dreiecke). Die Analyse trennt die beiden Gruppen (jede durch ein Spinnendiagramm umrandet), mit einer Genauigkeit von 82,4%, die durch Kreuzvalidierung erhalten wird. (C) Ergebnisse der überwachten multivariaten OPLS-DA-Analyse an 1D-NOESY-Spektren aus Plasma-PDAC-Proben (n = 22, blaue Kreise) und Nicht-PDAC-Proben (n = 7, violette Dreiecke). Genauigkeit von 75,2% durch Kreuzvalidierung. Diese Abbildung wurde von Cortese et al.12 mit Genehmigung modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Um zu zeigen, dass der TIF-Gehalt Veränderungen in der Tumormikroumgebung zuverlässig widerspiegelt, injizierten wir subkutan zwei Bauchspeicheldrüsenkrebs-Zelllinien mit entgegengesetzter glykolytischer Rate, Panc02 (stark glykolytisch) und DT6606 (niedrig glykolytisch), gemäß dem oben beschriebenen Protokoll. Anschließend isolierten wir TIF aus den exzidierten Tumoren mit der oben beschriebenen Niedergeschwindigkeitszentrifugationsmethode (siehe Abschnitt 4.2). Von Tumoren mit einem Gewicht zwischen 0,25-1 g konnten wir einen Bereich von 5-15 μL TIF gewinnen, der dann zur Quantifizierung der Konzentration von Glukose und Laktat verwendet wurde. TIF aus stark glykolytischen Tumoren enthielt weniger Glukose und mehr Laktat im Vergleich zu niedrig glykolytischen Tumoren (Abbildung 4). Diese Daten zeigen, dass TIF als Quelle für tumorabgeleitete Metaboliten und Veränderungen je nach Tumor selbst verwendet werden kann.
Abbildung 4: Der Glukose- und Laktatgehalt in TIF spiegelt intrinsische Tumormerkmale wider. (A) Glukose- und (B) Laktatkonzentration in interstitieller Flüssigkeit, isoliert mit der Gewebezentrifugationsmethode, aus Panc02 (stark glykolytisch, n=10 in A, n=9 in B) und DT6606 (niedrig glykolytisch, n=5 in A, n=4 in B) subkutan implantierten Tumoren. Boxplots geben Median, unteres Quartil und oberes Quartil durch die Box und Minimum und Maximum durch die Schnurrhaare. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dieser Studie haben wir die Technik zur intraoperativen Entnahme von Pankreassaft beschrieben, eine weitgehend unerforschte Flüssigkeitsbiopsie. Wir haben kürzlich gezeigt, dass Pankreassaft als Quelle für metabolische Marker der Krankheit genutzt werden kann12. Die metabolomische Analyse anderer Flüssigbiopsien wie Blut 5,6,7, Urin8 und Speichel9 hat vielversprechende Ergebnisse bei der Unterscheidung zwischen PDAC und gesunden Probanden oder Pankreatitis gezeigt. Pankreassaft wird jedoch direkt von Pankreasduktalzellen sezerniert und könnte aufgrund seiner Nähe zur Tumorstelle ein zuverlässigerer Indikator für die Veränderungen im umgebenden Gewebe sein, selbst in den sehr frühen Stadien der Erkrankung. Während H-NMR-Spektraldaten von Pankreassaft eine Unterscheidung zwischen PDAC-Patienten und anderen gutartigen Pankreaserkrankungen erreichten, war dies bei Plasmaproben nicht der Fall. Obwohl Pankreassaft weniger zugänglich als andere Flüssigkeitsbiopsien, stellt er daher eine wertvolle Quelle für klinische Biomarker dar und könnte bei der Identifizierung sich schnell entwickelnder Krankheiten helfen. Wir haben hier die intraoperative Technik zur Pankreassaftsammlung beschrieben; Es könnte aber auch bei minimalinvasiven Eingriffen durchgeführt werden, um wertvolle frühe Krankheitsmarker zu identifizieren. Es bleibt zu klären, ob die verschiedenen Sammelverfahren die proteomische Zusammensetzung von Pankreassaft beeinflussen.
Während andere Flüssigkeitsbiopsien in PDAC-Mausmodellen leicht zugänglich sind, kann die Sammlung von Pankreassaft in vivo sehr schwierig sein, wenn genetische oder orthotope Modelle berücksichtigt werden, und ist in subkutanen Modellen überhaupt nicht durchführbar. Daher haben wir in diesem Artikel die Verwendung von Tumor-Interstitialflüssigkeit als wertvolle und breit anwendbare Alternative vorgeschlagen. Tatsächlich wird die interstitielle Flüssigkeitszusammensetzung, ähnlich wie bei Pankreassaft, direkt von Veränderungen im lokalen Milieu beeinflusst. Proteomische Profilierung auf TIF von verschiedenen Tumoren, wie hepatozelluläre 45,46, Nierenzelle 41, Eierstock 22,47,48 und Brust 42,49 Karzinome, haben ermutigende Ergebnisse in der Forschung nach Kandidaten-Biomarkern gezeigt. Es gibt jedoch wenig Überschneidungen bei den identifizierten Kandidatenproteinen, was darauf hindeutet, dass der Ansatz zur Isolierung von TIF zusammen mit der durchgeführten nachgeschalteten Analyse und der Datenerhebung die nachgewiesenen Analyten beeinflussen könnte. Eine kürzlich durchgeführte Studie über Plattenepithelkarzinome, in der die beiden hier beschriebenen TIF-Isolierungsmethoden, Zentrifugation und Elution, verglichen wurden, beobachtete unabhängig von der verwendeten Methode eine starke Konsistenz in der TIF-Zusammensetzung, obwohl die Zentrifugation einen höheren Gehalt an extrazellulären Proteinen ergab25.
Beide hier beschriebenen Methoden zur Isolierung von TIF, Gewebezentrifugation und Gewebeelution, haben den Vorteil, dass sie technisch anspruchslos und schnell sind und nur eine grundlegende Laborausstattung erfordern. Im Vergleich zu anderen Ansätzen, wie Mikrodialyse und Kapillarultrafiltration, weisen die Zentrifugations- und Elutionstechniken die intrinsische Einschränkung auf, nur ex vivo durchführbar zu sein. Es ist wichtig, bei der Auswahl der geeigneten Methode mehrere Aspekte zu berücksichtigen, z. B. den analytischen Zweck des Experiments, das gewonnene Volumen und den Zellbruch. Die Zusammensetzung des Tumors sollte ebenfalls berücksichtigt werden, da sie das Volumen des wiedergewonnenen TIF beeinflussen kann. Die Gewebezentrifugation wurde ursprünglich für zellarme und kollagenreiche Gewebe wie Hornhautentwickelt 38; Tumoren hingegen sind in der Regel Gewebe, die sich durch hohe Zellularität und reiche Vaskularisation auszeichnen, beides Merkmale, die die hydraulische Leitfähigkeit erhöhen und daher die Isolierung von TIF durch Zentrifugation erleichtern sollten. Einige Tumoren, einschließlich PDAC, weisen jedoch eine reichlich vorhandene stromale oder fibrotische Komponente auf, die reich an extrazellulären Matrixproteinen wie Kollagenen ist, die dazu neigen, Makromoleküle im Gewebe zurückzuhalten21.
Die Gewebeelution hingegen basiert auf der passiven Diffusion von Proteinen vom Gewebe zum Eluat und wurde erfolgreich für eine Vielzahl von Tumoren genutzt43. Elution ermöglicht die Rückgewinnung größerer Volumina, jedoch werden Proteine verdünnt. Aus diesem Grund ist die Gewebeelution möglicherweise nicht für Moleküle mit sehr geringer Häufigkeit geeignet. Darüber hinaus erfordert die Elution ein höheres Maß an Manipulation des Tumors, was möglicherweise zu intrazellulären Inhaltsverlusten bei TIF führt. Dies könnte für die Entdeckung von Biomarkern irrelevant sein, könnte aber zu einer Verzerrung führen, wenn das Ziel darin besteht, die lokale Produktion von Proteinen zu bestimmen. Die Menge des Zellbruchs sollte in nachgeschalteten Anwendungen getestet werden, um die für den Tumortyp am besten geeignete Methode auszuwählen. Dies kann auf verschiedene Arten erfolgen, z. B. durch Testen des Vorhandenseins von Haushaltsproteinen wie ribosomalen Proteinen in TIF25. Ein weiterer vorgeschlagener Ansatz ist der Vergleich der Konzentrationen ausgewählter extrazellulärer Substanzen wie Kreatinin oder Na+ in TIF und Plasma, die ähnlich sein sollten22. Intrazelluläre Inhaltsverluste sollten auch für die Zentrifugationsmethode in Betracht gezogen werden; Tatsächlich gibt es immer noch keinen allgemeinen Konsens darüber, was als "Low-Speed" betrachtet werden sollte, um Zellbruch zu vermeiden, möglicherweise aufgrund der Unterschiede in der Tumorzusammensetzung. Wir haben uns für eine Geschwindigkeit von 400 x g entschieden, da gezeigt wurde, dass für g-Kräfte <42438 keine Verdünnung des intrazellulären Inhalts auftritt.
Unabhängig vom Ansatz stellt TIF eine wertvolle und breit anwendbare Quelle dar, um die Tumormikroumgebung zu beproben. Wir haben gezeigt, dass es tumorintrinsische Merkmale rekapituliert und für die Identifizierung von Biomarkern für Krankheiten oder therapeutische Ziele nützlich sein könnte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Wir danken Roberta Migliore für die technische Unterstützung. Die Forschung, die zu diesen Ergebnissen geführt hat, wurde von der Associazione Italiana per la ricerca sul cancro (AIRC) im Rahmen des Projekts IG2016-ID.18443 – P.I. Marchesi Federica – finanziert. Die Geldgeber hatten keine Rolle beim Studiendesign, der Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Greiner BioOne | GR616201 | |
| 20 µm nylon cell strainer | pluriSelect | 43-50020-03 | |
| 25G needle | BD Biosciences | 305122 | |
| 3 mL K2EDTA vacutainer | BD Biosciences | 366473 | |
| 3 mL syringe | BD Biosciences | 309656 | |
| 50 mL Falcon tube | Corning | 352098 | |
| Clamps | Medicon | 06.20.12 | |
| Disposable scalpel | Medicom | 9000-10 | |
| Fetal bovine serum | Microtech | MG10432 | |
| Flat-tipped forceps | Medicon | 06.00.10 | |
| Penicillin-Streptomycin | Lonza | ECB3001D | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 34044100 | |
| RPMI medium | Euroclone | ECB9006L | |
| Scissors | Medicon | 02.04.09 | |
| Trypsin/EDTA 1x | Lonza | BE17-161F | |
| Ultraglutamine 100x | Lonza | BE17-605E/U1 |
References
- Costello, E., Greenhalf, W., Neoptolemos, J. P. New biomarkers and targets in pancreatic cancer and their application to treatment. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 9 (8), 435-444 (2012).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2020. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 70 (1), 7-30 (2020).
- Neoptolemos, J. P., et al. Therapeutic developments in pancreatic cancer: current and future perspectives. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 15 (6), 333-348 (2018).
- Sahin, I. H., Askan, G., Hu, Z. I., O'Reilly, E. M. Immunotherapy in pancreatic ductal adenocarcinoma: an emerging entity. Annals of Oncology. 28 (12), 2950-2961 (2017).
- Mayerle, J., et al. Metabolic biomarker signature to differentiate pancreatic ductal adenocarcinoma from chronic pancreatitis. Gut. 67 (1), 128-137 (2018).
- Bathe, O. F., et al. Feasibility of identifying pancreatic cancer based on serum metabolomics. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 20 (1), 140-147 (2011).
- Mayers, J. R., et al. Elevation of circulating branched-chain amino acids is an early event in human pancreatic adenocarcinoma development. Nature Medicine. 20 (10), 1193-1198 (2014).
- Napoli, C., et al. Urine metabolic signature of pancreatic ductal adenocarcinoma by (1)h nuclear magnetic resonance: identification, mapping, and evolution. Journal of Proteome Research. 11 (1), 1274-1283 (2012).
- Sugimoto, M., Wong, D. T., Hirayama, A., Soga, T., Tomita, M. Capillary electrophoresis mass spectrometry-based saliva metabolomics identified oral, breast and pancreatic cancer-specific profiles. Metabolomics. 6 (1), 78-95 (2010).
- Chen, R., et al. Comparison of pancreas juice proteins from cancer versus pancreatitis using quantitative proteomic analysis. Pancreas. 34 (1), 70-79 (2007).
- Mori, Y., et al. A minimally invasive and simple screening test for detection of pancreatic ductal adenocarcinoma using biomarkers in duodenal juice. Pancreas. 42 (2), 187-192 (2013).
- Cortese, N., et al. Metabolome of Pancreatic Juice Delineates Distinct Clinical Profiles of Pancreatic Cancer and Reveals a Link between Glucose Metabolism and PD-1+ Cells. Cancer Immunology Research. , (2020).
- Tanaka, M., et al. Cytologic Analysis of Pancreatic Juice Increases Specificity of Detection of Malignant IPMN-A Systematic Review. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 17 (11), 2199-2211 (2019).
- Chen, K. T., et al. Potential prognostic biomarkers of pancreatic cancer. Pancreas. 43 (1), 22-27 (2014).
- Tian, M., et al. Proteomic analysis identifies MMP-9, DJ-1 and A1BG as overexpressed proteins in pancreatic juice from pancreatic ductal adenocarcinoma patients. BMC Cancer. 8, 241 (2008).
- Shi, C., et al. Sensitive and quantitative detection of KRAS2 gene mutations in pancreatic duct juice differentiates patients with pancreatic cancer from chronic pancreatitis, potential for early detection. Cancer Biology & Therapy. 7 (3), 353-360 (2008).
- Rogers, C. D., et al. Differentiating pancreatic lesions by microarray and QPCR analysis of pancreatic juice RNAs. Cancer Biology & Therapy. 5 (10), 1383-1389 (2006).
- Matsubayashi, H., et al. DNA methylation alterations in the pancreatic juice of patients with suspected pancreatic disease. Cancer Research. 66 (2), 1208-1217 (2006).
- Cote, G. A., et al. A pilot study to develop a diagnostic test for pancreatic ductal adenocarcinoma based on differential expression of select miRNA in plasma and bile. The American Journal of Gastroenterology. 109 (12), 1942-1952 (2014).
- Yu, J., et al. Digital next-generation sequencing identifies low-abundance mutations in pancreatic juice samples collected from the duodenum of patients with pancreatic cancer and intraductal papillary mucinous neoplasms. Gut. , (2016).
- Wiig, H., Swartz, M. A. Interstitial fluid and lymph formation and transport: physiological regulation and roles in inflammation and cancer. Physiological Reviews. 92 (3), 1005-1060 (2012).
- Haslene-Hox, H., et al. A new method for isolation of interstitial fluid from human solid tumors applied to proteomic analysis of ovarian carcinoma tissue. PLoS One. 6 (4), 19217 (2011).
- Zhang, J., et al. In-depth proteomic analysis of tissue interstitial fluid for hepatocellular carcinoma serum biomarker discovery. British Journal of Cancer. 117 (11), 1676-1684 (2017).
- Sullivan, M. R., et al. Quantification of microenvironmental metabolites in murine cancers reveals determinants of tumor nutrient availability. Elife. 8, (2019).
- Matas-Nadal, C., et al. Evaluation of Tumor Interstitial Fluid-Extraction Methods for Proteome Analysis: Comparison of Biopsy Elution versus Centrifugation. Journal of Proteome Research. 19 (7), 2598-2605 (2020).
- Espinoza, J. A., et al. Cytokine profiling of tumor interstitial fluid of the breast and its relationship with lymphocyte infiltration and clinicopathological characteristics. Oncoimmunology. 5 (12), 1248015 (2016).
- Halvorsen, A. R., et al. Profiling of microRNAs in tumor interstitial fluid of breast tumors - a novel resource to identify biomarkers for prognostic classification and detection of cancer. Molecular Oncology. 11 (2), 220-234 (2017).
- Yang, S., Huang, C. M. Recent advances in protein profiling of tissues and tissue fluids. Expert Review of Proteomics. 4, 515-529 (2007).
- Huang, C. M., et al. Mass spectrometric proteomics profiles of in vivo tumor secretomes: capillary ultrafiltration sampling of regressive tumor masses. Proteomics. 6 (22), 6107-6116 (2006).
- Leegsma-Vogt, G., Janle, E., Ash, S. R., Venema, K., Korf, J. Utilization of in vivo ultrafiltration in biomedical research and clinical applications. Life Sciences. 73 (16), 2005-2018 (2003).
- Schneiderheinze, J. M., Hogan, B. L. Selective in vivo and in vitro sampling of proteins using miniature ultrafiltration sampling probes. Analytical Chemistry. 68 (21), 3758-3762 (1996).
- Hardt, M., Lam, D. K., Dolan, J. C., Schmidt, B. L. Surveying proteolytic processes in human cancer microenvironments by microdialysis and activity-based mass spectrometry. Proteomics Clinical Applications. 5 (11-12), 636-643 (2011).
- Xu, B. J., et al. Microdialysis combined with proteomics for protein identification in breast tumor microenvironment in vivo. Cancer Microenvironment. 4 (1), 61-71 (2010).
- Bendrik, C., Dabrosin, C. Estradiol increases IL-8 secretion of normal human breast tissue and breast cancer in vivo. The Journal of Immunology. 182 (1), 371-378 (2009).
- Ao, X., Stenken, J. A. Microdialysis sampling of cytokines. Methods. 38 (4), 331-341 (2006).
- Ho, P. C., et al. Phosphoenolpyruvate Is a Metabolic Checkpoint of Anti-tumor T Cell Responses. Cell. 162 (6), 1217-1228 (2015).
- Choi, J., et al. Intraperitoneal immunotherapy for metastatic ovarian carcinoma: Resistance of intratumoral collagen to antibody penetration. Clinical Cancer Research. 12 (6), 1906-1912 (2006).
- Wiig, H., Aukland, K., Tenstad, O. Isolation of interstitial fluid from rat mammary tumors by a centrifugation method. The American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 284 (1), 416-424 (2003).
- Li, S., Wang, R., Zhang, M., Wang, L., Cheng, S. Proteomic analysis of non-small cell lung cancer tissue interstitial fluids. World Journal of Surgical Oncology. 11, 173 (2013).
- Fijneman, R. J., et al. Proximal fluid proteome profiling of mouse colon tumors reveals biomarkers for early diagnosis of human colorectal cancer. Clinical Cancer Research. 18 (9), 2613-2624 (2012).
- Teng, P. N., Hood, B. L., Sun, M., Dhir, R., Conrads, T. P. Differential proteomic analysis of renal cell carcinoma tissue interstitial fluid. Journal of Proteome Research. 10 (3), 1333-1342 (2011).
- Turtoi, A., et al. Novel comprehensive approach for accessible biomarker identification and absolute quantification from precious human tissues. Journal of Proteome Research. 10 (7), 3160-3182 (2011).
- Wagner, M., Wiig, H. Tumor Interstitial Fluid Formation, Characterization, and Clinical Implications. Frontiers in Oncology. 5, 115 (2015).
- Haslene-Hox, H., Tenstad, O., Wiig, H. Interstitial fluid-a reflection of the tumor cell microenvironment and secretome. Biochimica Biophysica Acta. 1834 (11), 2336-2346 (2013).
- Hsieh, S. Y., et al. Secreted ERBB3 isoforms are serum markers for early hepatoma in patients with chronic hepatitis and cirrhosis. Journal of Proteome Research. 10, 4715-4724 (2011).
- Sun, W., et al. Characterization of the liver tissue interstitial fluid (TIF) proteome indicates potential for application in liver disease biomarker discovery. Journal of Proteome Research. 9 (2), 1020-1031 (2010).
- Haslene-Hox, H., et al. Increased WD-repeat containing protein 1 in interstitial fluid from ovarian carcinomas shown by comparative proteomic analysis of malignant and healthy gynecological tissue. Biochimica Biophysica Acta. 1834 (11), 2347-2359 (2013).
- Wang, T. H., et al. Stress-induced phosphoprotein 1 as a secreted biomarker for human ovarian cancer promotes cancer cell proliferation. Molecular & Cellular Proteomics. 9, 1873-1884 (2010).
- Gromov, P., et al. Up-regulated proteins in the fluid bathing the tumour cell microenvironment as potential serological markers for early detection of cancer of the breast. Molecular Oncology. 4 (1), 65-89 (2010).
