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Cancer Research

अग्नाशयी एडेनोकार्सिनोमा के ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट की जांच के लिए समीपस्थ तरल पदार्थ का अलगाव

Published: November 5, 2020 doi: 10.3791/61687
Automatic Translation
*1, *2, 1,3, 1,3, 4,5,6, 1,3, 2,7, 2
1Section of Pancreatic Surgery, Humanitas Clinical and Research Center-IRCCS, 2Department of Immunology and Inflammation, Humanitas Clinical and Research Center-IRCCS, 3Department of Biomedical Sciences, Humanitas University, 4Giotto Biotech S.R.L., 5Section of Bioanalytical Chemistry, Division of Systems Medicine, Department of Metabolism, Digestion and Reproduction, Imperial College London, 6National Phenome Centre, Department of Metabolism, Digestion and Reproduction, Faculty of Medicine, Imperial College London, 7Department of Medical Biotechnology and Translational Medicine, University of Milan
* These authors contributed equally

Summary

अग्नाशय का रस मानव अग्नाशय के कैंसर के लिए बायोमार्कर का एक कीमती स्रोत है। हम यहां इंट्राऑपरेटिव संग्रह प्रक्रिया के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं। मुराइन मॉडल में इस प्रक्रिया को अपनाने की चुनौती को दूर करने के लिए, हम एक वैकल्पिक नमूना, ट्यूमर अंतरालीय तरल पदार्थ का सुझाव देते हैं, और इसके अलगाव के लिए यहां दो प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।

Abstract

अग्नाशयी एडेनोकार्सिनोमा (पीडीएसी) कैंसर से संबंधित मृत्यु का चौथा प्रमुख कारण है, और जल्द ही दूसरा बनने वाला है। प्रीऑपरेटिव डिफरेंशियल डायग्नोसिस और रोगी प्रोफाइलिंग में मदद करने के लिए विशिष्ट अग्नाशयी विकृति से जुड़े चर की तत्काल आवश्यकता है। अग्नाशय का रस एक अपेक्षाकृत अस्पष्टीकृत शरीर का तरल पदार्थ है, जो ट्यूमर साइट के करीब निकटता के कारण, आसपास के ऊतक में परिवर्तन को दर्शाता है। यहां हम इंट्राऑपरेटिव संग्रह प्रक्रिया का विस्तार से वर्णन करते हैं। दुर्भाग्य से, यांत्रिक अध्ययन करने के लिए पीडीएसी के मुराइन मॉडल में अग्नाशय के रस संग्रह का अनुवाद करना तकनीकी रूप से बहुत चुनौतीपूर्ण है। ट्यूमर अंतरालीय द्रव (टीआईएफ) रक्त और प्लाज्मा के बाहर बाह्य तरल पदार्थ है, जो ट्यूमर और स्ट्रोमल कोशिकाओं को स्नान करता है। अग्नाशय के रस के समान, प्लाज्मा में पतला पाए जाने वाले अणुओं को इकट्ठा करने और केंद्रित करने के लिए इसकी संपत्ति के लिए, टीआईएफ का उपयोग माइक्रोएन्वायरमेंटल परिवर्तनों के संकेतक के रूप में और रोग से जुड़े बायोमाकर्स के मूल्यवान स्रोत के रूप में किया जा सकता है। चूंकि टीआईएफ आसानी से सुलभ नहीं है, इसलिए इसके अलगाव के लिए विभिन्न तकनीकों का प्रस्ताव किया गया है। हम यहां इसके अलगाव के लिए दो सरल और तकनीकी रूप से अवांछित तरीकों का वर्णन करते हैं: ऊतक सेंट्रीफ्यूजेशन और ऊतक क्षालन।

Introduction

अग्नाशयी डक्टल एडेनोकार्सिनोमा (पीडीएसी) सबसे आक्रामक ट्यूमर में से एक है, और जल्द ही मृत्यु का दूसरा प्रमुख कारण बन जाएगा 1,2,3. यह अपने इम्यूनोसप्रेसिव माइक्रोएन्वायरमेंट के लिए और इम्यूनोथेरेपी प्रोटोकॉल 4 के प्रति अपनी अनुक्रियाशीलता के लिए अच्छी तरह से जाना जाताहै। वर्तमान में, सर्जिकल रिसेक्शन अभी भी पीडीएसी के लिए एकमात्र उपचारात्मक विकल्प है, फिर भी शुरुआती रिलैप्स और पोस्टसर्जिकल जटिलताओं की उच्च आवृत्ति है। एक उन्नत चरण तक विशिष्ट लक्षणों की कमी प्रारंभिक निदान की अनुमति नहीं देती है, जो रोग की समय सीमा में योगदान देती है। इसके अलावा, पीडीएसी और अन्य सौम्य अग्नाशयी विकृति के बीच लक्षणों का ओवरलैप वर्तमान नैदानिक रणनीतियों के साथ एक त्वरित और विश्वसनीय निदान की उपलब्धि में बाधा डाल सकता है। विशिष्ट अग्नाशयी विकृति से जुड़े चर की पहचान सर्जिकल निर्णय लेने की प्रक्रिया को सुविधाजनक बना सकती है और रोगी प्रोफाइलिंग में सुधार कर सकती है।

बायोमार्कर खोज में आशाजनक परिणाम आसानी से सुलभ शरीर के तरल पदार्थों का उपयोग करके प्राप्त किए गए हैं, जैसे रक्त 5,6,7, मूत्र8, लार9 और अग्नाशय का रस 10,11,12। कई अध्ययनों ने व्यापक "ओमिक्स" दृष्टिकोणों का शोषण किया है, जैसे कि जीनोमिक, प्रोटिओमिक और मेटाबोलिक तकनीक, उम्मीदवार अणुओं या हस्ताक्षरों की पहचान करने के लिए जो पीडीएसी और अन्य सौम्य अग्नाशयी पीड़ाओं के बीच भेदभाव कर सकते हैं। हमने हाल ही में प्रदर्शित किया कि अग्नाशय का रस, एक अपेक्षाकृत अस्पष्टीकृत शरीर का तरल पदार्थ, का उपयोग अलग-अलग नैदानिक प्रोफाइलवाले रोगियों के चयापचय हस्ताक्षर की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। अग्नाशय का रस एक प्रोटीन युक्त तरल पदार्थ है, जो अग्नाशयी डक्टल कोशिकाओं के स्राव को जमा करता है और मुख्य अग्नाशय वाहिनी में बहता है, और फिर मुख्य सामान्य पित्त नली में। अग्न्याशय से इसकी निकटता के कारण, यह ट्यूमर द्रव्यमान (चित्रा 1) द्वारा प्रेरित माइक्रोएन्वायरमेंटल गड़बड़ी से दृढ़ता से प्रभावित हो सकता है, और इसलिए रक्त या मूत्र, या ऊतक-आधारित प्रोफाइलिंग की तुलना में अधिक जानकारीपूर्ण हो सकता है। कई अध्ययनों ने विभिन्न दृष्टिकोणों का उपयोग करके रोग के नए बायोमाकर्स की पहचान करने के लिए अग्नाशय के रस की क्षमता का पता लगाया है, जिसमें साइटोलॉजिकल विश्लेषण13, मास-स्पेक्ट्रोमेट्री14,15 द्वारा किए गए प्रोटिओमिक विश्लेषण, आनुवंशिक और एपिजेनेटिक मार्करों जैसे के-रास और पी 53 उत्परिवर्तन16,17, डीएनए मिथाइलेशन 18 में परिवर्तन, और एमआईआरएनए19 शामिल हैं। . तकनीकी रूप से, अग्नाशय के रस को इंट्राऑपरेटिव रूप से या न्यूनतम इनवेसिव प्रक्रियाओं के साथ एकत्र किया जा सकता है, जैसे कि एंडोस्कोपिक अल्ट्रासाउंड, प्रतिगामी कोलेंजियो-अग्नाशयोग्राफी, या ग्रहणी रस स्राव20 के एंडोस्कोपिक संग्रह द्वारा। यह अभी तक स्पष्ट नहीं है कि उपयोग की जाने वाली संग्रह तकनीक से अग्नाशय के रस की संरचना किस हद तक प्रभावित होती है। हम यहां इंट्राऑपरेटिव संग्रह प्रक्रिया का वर्णन करते हैं और दिखाते हैं कि अग्नाशय का रस पीडीएसी बायोमाकर्स के लिए एक कीमती स्रोत का प्रतिनिधित्व कर सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: अग्नाशय के रस संग्रह का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (ए) अग्नाशयी नलिका में अग्नाशय के रस के स्राव और सर्जरी के दौरान इसके संग्रह को दर्शाने वाला योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। इनसेट ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट का क्लोज-अप दिखाता है: अग्नाशय का रस अग्नाशयी नलिकाओं में ट्यूमर और स्ट्रोमल कोशिकाओं द्वारा जारी अणुओं को इकट्ठा करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पीडीएसी के आनुवंशिक और ऑर्थोटोपिक माउस मॉडल में अग्नाशय के रस के संग्रह को प्रीक्लिनिकल यांत्रिक अध्ययनों में इस बायोफ्लुइड का फायदा उठाने के परिप्रेक्ष्य में सराहना की जाएगी; हालांकि, यह प्रक्रिया तकनीकी रूप से बहुत चुनौतीपूर्ण हो सकती है और चमड़े के नीचे के ट्यूमर जैसे सरल मॉडल के लिए संभव नहीं है। इस कारण से, हमने ट्यूमर इंटरस्टीशियल द्रव (टीआईएफ) को अग्नाशय के रस के वैकल्पिक स्रोत के रूप में पहचाना, इसकी समान विशेषता के लिए आसपास के गड़बड़ी के संकेतक के रूप में कार्य करना। अंतरालीय द्रव (आईएफ) बाह्य तरल है, जो रक्त और लसीका वाहिकाओं के बाहर पाया जाता है, जो ऊतक कोशिकाओं को स्नान करताहै। यदि संरचना अंग और स्थानीय स्राव दोनों में रक्त परिसंचरण से प्रभावित होती है; वास्तव में, आसपास की कोशिकाएं सक्रिय रूप से आईएफ21 में प्रोटीन का उत्पादन और स्राव करती हैं। इंटरस्टिटियम आसपास के ऊतकों के सूक्ष्म पर्यावरणीय परिवर्तनों को दर्शाता है और इसलिए ट्यूमर जैसे कई पैथोलॉजिकल संदर्भों में बायोमार्कर खोज के लिए एक मूल्यवान स्रोत का प्रतिनिधित्व कर सकता है। टीआईएफ में स्थानीय रूप से स्रावित प्रोटीन की उच्च सांद्रता का उपयोग प्लाज्मा 22,23,24 में रोगसूचक या नैदानिक बायोमार्करके रूप में परीक्षण किए जाने वाले उम्मीदवार अणुओं की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। कई अध्ययनों ने टीआईएफ को उच्च-थ्रूपुट प्रोटिओमिक दृष्टिकोणों के लिए एक उपयुक्त नमूना साबित किया है, जैसे कि मास स्पेक्ट्रोमेट्री तकनीक 23,24,25, साथ ही मल्टीप्लेक्स एलिसा दृष्टिकोण26, और माइक्रोआरएनए प्रोफाइलिंग27।

ट्यूमर में आईएफ के अलगाव के लिए कई दृष्टिकोण प्रस्तावित किए गए हैं, जिन्हें मोटे तौर पर विवो (केशिका अल्ट्राफिल्ट्रेशन 28,29,30,31 और माइक्रोडायलिसिस 32,33,34,35) और एक्स विवो विधियों (ऊतक सेंट्रीफ्यूजेशन 22,36,37,38 और ऊतक सेंट्रीफ्यूजेशन22,36,37,38) के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है। ऊतक क्षालन 39,40,41,42)। इन तकनीकों कीव्यापक विस्तार से समीक्षा की गई है। उपयुक्त विधि की पसंद को डाउनस्ट्रीम विश्लेषण और अनुप्रयोगों और पुनर्प्राप्त मात्रा जैसे मुद्दों को ध्यान में रखना चाहिए। हमने हाल ही में इस दृष्टिकोण का उपयोग सिद्धांत के प्रमाण के रूप में किया ताकि दो मुराइन अग्नाशयी एडेनोकार्सिनोमा सेललाइनों 12 से ट्यूमर की विभिन्न चयापचय गतिविधि को प्रदर्शित किया जा सके। साहित्य24,38 के आधार पर, हमने सेल टूटने और इंट्रासेल्युलर सामग्री से कमजोर पड़ने से बचने के लिए कम गति सेंट्रीफ्यूजेशन विधि का उपयोग करना चुना। टीआईएफ में ग्लूकोज और लैक्टेट दोनों की मात्रा दो अलग-अलग सेल लाइनों की विभिन्न ग्लाइकोलाइटिक विशेषताओं को दर्शाती है। यहां हम टीआईएफ के अलगाव के लिए दो सबसे अधिक इस्तेमाल किए जाने वाले तरीकों के प्रोटोकॉल का विस्तार से वर्णन करते हैं: ऊतक सेंट्रीफ्यूजेशन और ऊतक क्षालन (चित्रा 2)।

Figure 2
चित्रा 2: ट्यूमर अंतरालीय द्रव अलगाव विधियों का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। प्रोटोकॉल में विस्तार से वर्णित तकनीकों का योजनाबद्ध चित्रण, अर्थात् ऊतक सेंट्रीफ्यूजेशन (ए) और ऊतक क्षालन (बी)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Protocol

नामांकित सभी रोगियों के लिए, संस्थान की नैतिक समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार सर्जरी के समय परिधीय रक्त और अग्नाशय का रस एकत्र किया गया था। सभी रोगियों को जैविक नमूनों और नैदानिक डेटा के संग्रह सहित सूचित सहमति पर हस्ताक्षर करने के बाद अध्ययन में नामांकित किया गया था। अध्ययन को संस्था की नैतिक समिति (प्रोटोकॉल संख्या आईसीएच -595, मई 2009 को जारी अनुमोदन) द्वारा अनुमोदित किया गया था। चूहों और उनकी देखभाल से जुड़ी प्रक्रियाओं को यूरोपीय संघ और संस्थागत दिशानिर्देशों (प्रोटोकॉल आईडी 121/2016-पीआर) के अनुरूप किया गया था।

1. अग्नाशय के रस का अलगाव

नोट: अग्नाशय के रस की वापसी को विशेषज्ञ अग्नाशय सर्जनों के एक समान रूप से अग्नाशयी शोधन (जैसे, अग्नाशयी डुओडेनेक्टोमी, कुल अग्नाशयेक्टोमी, डिस्टल अग्नाशयेक्टोमी) की एक खुली प्रक्रिया के संदर्भ में निष्पादित किया जाता है।

  1. रोगी का चयन
    1. प्रक्रिया के लिए किसी भी रोगी को खुले अग्नाशय के शोधन के लिए निर्धारित करने पर विचार करें।
    2. समावेश की पुष्टि करें यदि मुख्य अग्नाशय वाहिनी का आकार अग्नाशय के रस की पुनर्प्राप्ति की अनुमति देने के लिए पर्याप्त माना जाता है। मुख्य अग्नाशय वाहिनी के व्यास में न्यूनतम सीमा को कंट्रास्ट-एन्हांस्ड सीटी इमेजिंग में 2 मिमी माना जाता है।
  2. अग्नाशय के रस की पुनर्प्राप्ति की योजना बनाने में मदद करने के लिए विपरीत-वर्धित सीटी इमेजिंग में अग्नाशय वाहिनी का पूर्व-ऑपरेटिव अध्ययन
    1. अग्नाशय की गर्दन के स्तर पर ग्रंथि के भीतर मुख्य अग्नाशय वाहिनी को त्रिआयामी रूप से स्थानीयकृत करें: क्रॉस-अनुभागीय स्लाइड पर पूर्ववर्ती, बेहतर और अवर अग्नाशयी मार्जिन से मुख्य अग्नाशय वाहिनी की दूरी को मापें, और कोरोनल और धनु प्रतिपादन। एक बार ऑपरेटिंग थिएटर में, इन मापों का उपयोग सही जगह का अनुमान लगाने के लिए करें जहां अग्न्याशय को छिद्रित करने के लिए विरसुंग नलिका को पंचर करना है और अग्नाशय के रस को पुनः प्राप्त करना है।
  3. सामग्री की तैयारी
    1. बाँझ सामग्री: एक 25 जी सुई और एक 3 एमएल सिरिंज के बाँझ लिफाफे को खोलें, और उन्हें स्क्रब नर्स के सहयोग से बाँझ क्षेत्र में रखें।
    2. अनस्टेराइल सामग्री: तरल पदार्थ के भंडारण के लिए ऑपरेटिंग रूम में हाथ में एक 3 एमएल के 2 ईडीटीए वैक्यूम टेस्ट ट्यूब तैयार रखें।
  4. रोगी की तैयारी
    1. रोगी को ऑपरेटिंग रूम के बिस्तर पर रखें। रेमिफेन्टैनिल, सेवोरेन और रोकुरोनियम का उपयोग करके मिश्रित सामान्य संज्ञाहरण को प्रेरित करें, फिर रोगी को इंजेक्ट करें और वेंटिलेशन शुरू करें। रोगी को शरीर से जुड़े दाहिने हाथ के साथ लापरवाह डेक्यूबिटस में रखें और बाएं हाथ को आर्मबोर्ड पर 90 डिग्री डिग्री तक अपहरण कर लिया जाए।
    2. चीरा की जगह पर पेट की त्वचा को कीटाणुरहित करें। रोगी को लपेटने वाले पेट पर एक बाँझ क्षेत्र बनाएं और बनाए रखें।
  5. शल्य चिकित्सा प्रक्रिया
    1. एक उप-तटीय चीरा करें और पेट की गुहा तक पहुंच प्राप्त करें। अंग जोखिम के लिए रोचार्ड पेट वापसी की स्थिति।
    2. कोचर पैंतरेबाज़ी के माध्यम से अग्न्याशय को उजागर करें और जुटाएं, गैस्ट्रोकोलिक लिगामेंट को खोलें, अग्न्याशय की बेहतर और अवर सीमा के साथ रेट्रोपरिटोनियल ऊतक का चीरा लगाएं, जिससे अग्नाशय की गर्दन और पीछे की ओर स्थित बेहतर मेसेंटेरिक नस के बीच एक विच्छेदन विमान बन जाता है।
    3. एक बार जब अग्न्याशय जुटाया और उजागर हो जाता है, तो अग्नाशय की गर्दन को विभाजित करने से पहले अग्नाशय के रस की वापसी के लिए आगे बढ़ें।
  6. अग्नाशय वाहिनी की पहचान और स्थानीयकरण
    1. इमेजिंग में लिए गए माप का उपयोग करके अग्नाशय वाहिनी के स्थान का अनुमान लगाएं और फिर इसके सटीक स्थान की पहचान करने के लिए अग्न्याशय की पूर्ववर्ती सतह को थपथपाएं।
  7. अग्नाशय के रस का संग्रह
    1. अग्नाशय के सिर और ग्रहणी को नीचे से पकड़ें और इसे बाएं हाथ से ऊपर उठाएं, पहले अंक के साथ अग्नाशय वाहिनी के स्थान को चिह्नित करें।
    2. 25 ग्राम सुई के साथ 3 एमएल सिरिंज के दाहिने हाथ से पकड़ें।
    3. बाएं अंगूठे के ठीक बाहर अग्न्याशय में सुई डालने के लिए दाहिने हाथ का उपयोग करें। प्रीऑपरेटिव माप के आधार पर और नलिका की दीवार में प्रवेश करने की धारणा के आधार पर प्रवेश की गहराई और सुई के झुकाव की डिग्री तय करें।
    4. सिरिंज के साथ रस निकाल लें। यदि रस को पुनः प्राप्त करना संभव नहीं है, तो अग्नाशय वाहिनी को कैनुला करने की कोशिश करते हुए सुई को चार दिशाओं में स्थानांतरित करें।
    5. एक बार अग्नाशय का रस पुनः प्राप्त हो जाने के बाद, इसे बाँझ क्षेत्र के बाहर ले जाएं और इसे 3 एमएल के 2 ईडीटीए वैक्यूम टेस्ट ट्यूब में स्थानांतरित करें। नमूना प्रयोगशाला में स्थानांतरित होने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें और जितनी जल्दी हो सके आगे की प्रक्रिया के लिए आगे बढ़ें।
      नोट: इस प्रक्रिया के साथ पुनर्प्राप्त किए जा सकने वाले अग्नाशय के रस की मात्रा बहुत भिन्न होती है, हमारे अनुभव में लगभग 0.2 एमएल से 3 एमएल तक होती है। प्राप्त रस की मात्रा रोगी पर अत्यधिक निर्भर है: विरसुंग वाहिनी का आयाम और अग्न्याशय की कार्यात्मक स्थिति (कामकाज बनाम एट्रोफिक ग्रंथि)। हमारे अनुभव में कोई समीचीन नहीं है जिसका उपयोग अग्नाशय के रस की मात्रा को बढ़ाने के लिए किया जा सकता है।

2. अग्नाशय के रस का प्रसंस्करण

  1. किसी भी कोशिका या मलबे को हटाने के लिए 400 x g पर 400 x g पर 4 °C पर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज अग्नाशय का रस।
    नोट: सेंट्रीफ्यूजेशन से पहले अग्नाशय का रस रंग में स्पष्ट और पारदर्शी होना चाहिए। सर्जरी के दौरान रक्त संदूषण कभी-कभी हो सकता है, जिससे नमूना रंग में धुंधला और लाल दिखाई देता है। आगे के विश्लेषण से ऐसे नमूनों को बाहर रखने पर विचार करें।
  2. आगे के विश्लेषण तक सुपरनैटेंट, एलिकोट और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

3. चमड़े के नीचे के ट्यूमर का प्रेरण

नोट: मुराइन पैनक02 और डीटी 6606 सेल लाइनें क्रमशः प्रोफेसर लोरेंजो पिएमोंटी (सैन राफेल डायबिटीज इंस्टीट्यूट, मिलान, इटली) और प्रोफेसर फ्रांसेस्को नोवेली (सेंटर फॉर एक्सपेरिमेंटल रिसर्च एंड मेडिकल स्टडीज, टोरिनो, इटली) से प्राप्त की गई थीं, जैसा कि पहले वर्णित12 था।

  1. ट्यूमर कोशिकाओं का विकास
    1. रोसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट (आरपीएमआई) 1640 माध्यम में कल्चर पैनसी02 और डीटी 6606 कोशिकाएं जिसमें 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन एंटीबायोटिक शामिल हैं।
    2. सेल लाइन की वृद्धि दर के अनुसार, ट्यूमर इंजेक्शन से 1-2 सप्ताह पहले जमे हुए कोशिकाओं को पिघलाएं।
    3. बाँझ परिस्थितियों में 5% सीओ2 और 95% आर्द्रता के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को विकसित करें।
    4. 0.025% ट्रिप्सिन / ईडीटीए समाधान के साथ कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए अलग करें जब वे 80% कंफ्लुएंसी तक पहुंचते हैं और सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा ट्रिप्सिन को खत्म करते हैं।
      नोट: DT6606 प्राथमिक हैं, अमर नहीं, कोशिकाएं हैं, जो LSL-KrasG12D-Pdx1-Cre माउस से प्राप्त होती हैं, और उनकी मूल विशेषताओं को बनाए रखने के लिए विवो में इंजेक्शन से पहले 3 बार से अधिक पारित नहीं किया जाना चाहिए। इंजेक्शन से 7-10 दिन पहले डीटी 6606 कोशिकाओं को पिघलाने की सिफारिश की जाती है।
  2. विवो में ट्यूमर कोशिकाओं का इंजेक्शन
    1. ट्रिप्सिनाइज कोशिकाएं (चरण 3.1.4 देखें) और उन्हें फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के साथ एक बार धो लें। सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा पीबीएस को हटा दें और गिनती से पहले ताजा पीबीएस में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें।
    2. कोशिकाओं की गणना करें और प्रत्येक माउस में इंजेक्ट करने के लिए 0.5-1 x 107 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता पर पीबीएस में उन्हें पुन: निलंबित करें ताकि प्रत्येक माउस में इंजेक्ट करने के लिए 0.5-1 x 106 कोशिकाओं / 100 μL की अंतिम एकाग्रता हो। कोशिकाओं को अधिक मात्रा में तैयार करें। प्रक्रिया के अंत तक कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस या बर्फ पर रखें।
    3. विभिन्न सेल लाइनों या उपचारों के अनुसार विभिन्न पिंजरों में जानवरों (8 सप्ताह की मादा सी 57बीएल / 6 जे चूहों) को समूहित करें।
    4. जानवरों को मैन्युअल रूप से रोकें और केटामाइन (80 मिलीग्राम / किग्रा) और ज़ाइलज़िन (10 मिलीग्राम / किग्रा) या स्थानीय रूप से अनुमोदित प्रक्रियाओं के अनुसार मिश्रण का उपयोग करके उन्हें एनेस्थेटाइज करें।
    5. इंजेक्शन की साइट को शेव करें, आमतौर पर एक पैर के ऊपर एक फ्लैंक, एक इलेक्ट्रिक शेवर के साथ और शराब के साथ इंजेक्शन की साइट को सावधानीपूर्वक साफ करें।
    6. पिपेट 1 एमएल सिरिंज के साथ सेल सस्पेंशन को ऊपर और नीचे करें, पिस्टन को ऊपर और नीचे ले जाकर किसी भी हवा के बुलबुले को हटा दें। सिरिंज से 25 ग्राम सुई संलग्न करें और पिस्टन को ऊपर की ओर धकेलें जब तक कि सेल निलंबन सुई खोलने तक न पहुंच जाए।
    7. फ्लैंक की त्वचा को सपाट-घुमावदार बल के साथ पिंच करें और पेरिटोनियल गुहा या मस्कुलेचर को छिद्रित किए बिना सावधानीपूर्वक सुई को बल के बीच त्वचा की तह के आधार पर डालें। सुई की सही स्थिति को सत्यापित करने के लिए, धीरे से सुई की नोक को त्वचा के नीचे ले जाने का प्रयास करें। सुई को स्वतंत्र रूप से चलना चाहिए।
    8. धीरे-धीरे सेल सस्पेंशन (0.5-1 x 106 कोशिकाओं से युक्त) के 100 μL इंजेक्ट करें, कुछ सेकंड के लिए इंजेक्शन की साइट को धीरे-धीरे दबाएं और धीरे-धीरे सुई को बिना किसी साइडवे आंदोलन के वापस ले लें।
    9. माउस को अपने पिंजरे में वापस लाएं और संज्ञाहरण से वसूली की निगरानी करें।
    10. 3-4 सप्ताह के लिए कैलिपर का उपयोग करके ट्यूमर के विकास की जांच करें। जानवरों को इच्छामृत्यु दें जब ट्यूमर सीओ2 का उपयोग करके या स्थानीय रूप से अनुमोदित प्रक्रियाओं के अनुसार लगभग 0.5-1 सेमी3 तक पहुंच जाते हैं।

4. ट्यूमर अंतरालीय द्रव (टीआईएफ) का अलगाव

  1. चमड़े के नीचे के ट्यूमर का छांटना
    1. पेपर टेप से जानवरों के अंगों को अवरुद्ध करें और शराब से त्वचा को साफ करें। पेरिटोनियम से अलग करने के लिए पेट पर त्वचा को खोलें और अंगों तक जाएं। कैंची, क्लैंप और अंततः एक स्केलपेल की मदद से फ्लैंक की त्वचा के नीचे उगने वाले ट्यूमर का उत्पादन।
    2. ट्यूमर का वजन करें और टीआईएफ के अलगाव के बाद तक इसे बर्फ पर एक साफ ट्यूब में रखें।
  2. सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा टीआईएफ का अलगाव
    1. ट्यूमर को आधे में काट लें, पीबीएस में जल्दी से दो हिस्सों को कुल्ला करें और पीबीएस की अधिकता को हटाने के लिए उन्हें फिल्टर पेपर पर धीरे से धब्बा लगाएं। ट्यूमर से वाष्पीकरण से बचने के लिए इन चरणों को जितनी जल्दी हो सके पूरा करें।
    2. ट्यूमर को तुरंत 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब के ऊपर चिपकाए गए 20 μm नायलॉन सेल छन्नी में स्थानांतरित करें।
    3. ट्यूब को 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 400 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
      नोट: यह कम गति सेंट्रीफ्यूजेशन इंट्रासेल्युलर डिब्बे द्वारा टीआईएफ के संदूषण से बचने के लिए सेल अखंडता को संरक्षित करता है। इंट्रासेल्युलर सामग्री रिसाव को डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों में परीक्षण किया जा सकता है उदाहरण के लिए इंट्रासेल्युलर हाउसकीपिंग प्रोटीन की उपस्थिति का आकलन करके, जैसे राइबोसोमल प्रोटीन25।
    4. ट्यूब के तल से टीआईएफ को पुनर्प्राप्त करें, अंततः इसे एलिकोट करें और तुरंत इसे सूखी बर्फ पर फ्रीज करें और आगे के विश्लेषण तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      वैकल्पिक: किए जाने वाले डाउनस्ट्रीम प्रोटिओमिक विश्लेषण के आधार पर, विशिष्ट अणुओं के क्षरण से बचने के लिए प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल के साथ पीबीएस में नमूने को पतला करें।
      नोट: ट्यूमर की संरचना के आधार पर, कुछ मामलों में बहुत छोटे ट्यूमर किसी भी तरल पदार्थ का उत्पादन नहीं करते हैं।
  3. क्षालन द्वारा टीआईएफ का अलगाव
    1. ट्यूमर को कैंची या स्केलपेल के साथ छोटे टुकड़ों (≈1-3 मिमी 3) में काटें और ठंडे पीबीएस के साथ सावधानी से कुल्ला करें।
      नोट: इस चरण में सेल क्षति से बचने के लिए तेजी से काम करना और न्यूनतम हेरफेर करना बहुत महत्वपूर्ण है।
    2. ट्यूमर के टुकड़ों को 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें और विश्लेषणों के क्षरण से बचने के लिए प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल के साथ पीबीएस के 500 μL जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    3. सतह पर तैरने वाले को पुनर्प्राप्त करें और इसे एक नई 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। नमूने से किसी भी कोशिका को हटाने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 1,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
    4. सुपरनैटेंट को एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें और सेंट्रीफ्यूज को 2,000 x g पर 8 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर फिर से स्थानांतरित करें।
    5. किसी भी मलबे को हटाने के लिए 30 मिनट के लिए 20,000 x g पर फिर से 20,000 x g पर सुपरनैटेंट और सेंट्रीफ्यूज स्थानांतरित करें। सुपरनैटेंट को पुनर्प्राप्त करें। सूखी बर्फ पर तुरंत एलिकोट और फ्रीज टीआईएफ नमूना और आगे के विश्लेषण तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

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Representative Results

हमने पीडीएसी (एन = 31) और अन्य सौम्य अग्नाशयी पीड़ाओं (गैर-पीडीएसी, एन = 9) के रोगियों से अग्नाशय का रस प्राप्त करने के लिए ऊपर वर्णित प्रक्रिया का पालन किया, जिसमें अग्नाशयशोथ (एन = 2), पैपिलरी-एम्पुला ट्यूमर (एन = 4), न्यूरोएंडोक्राइन ट्यूमर (एन = 2), इंट्राडक्टल पैपिलरी म्यूसिनस नियोप्लासिया (आईपीएमएन; एन = 1)12 शामिल हैं। अग्नाशय के रस के नमूनों को परमाणु चुंबकीय अनुनाद (1एच-एनएमआर) 12 का उपयोग करके मेटाबोलिक विश्लेषण के अधीन किया गया था। मैक्रोमोलेक्यूल्स (जैसे, लिपोप्रोटीन, लिपिड, आदि) के व्यापक एनएमआर संकेतों को फ़िल्टर करके हम छोटे आणविक भार मेटाबोलाइट्स की विस्तार से सराहना करने में सक्षम थे, जैसा कि 1 डी कैर-पर्सेल-मेबूम-गिल (सीपीएमजी) स्पेक्ट्रा (चित्रा 3 ए) में दिखाया गया है। पर्यवेक्षित ओपीएलएस-डीए विश्लेषण से पता चला है कि अग्नाशय के रस में पाया गया चयापचय प्रोफ़ाइल क्रॉस-सत्यापन (चित्रा 3 बी) द्वारा प्राप्त 82.4% की सटीकता के साथ पीडीएसी और गैर-पीडीएसी रोगियों के बीच भेदभाव करने में सक्षम था। दिलचस्प बात यह है कि एक ही रोगियों के प्लाज्मा नमूनों पर किए गए मेटाबोलिक विश्लेषण ने समान भेदभावपूर्ण शक्ति (क्रॉस-सत्यापन द्वारा प्राप्त 75.2% की सटीकता) (चित्रा 3 सी) का उत्पादन नहीं किया। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि अग्नाशय का रस एक प्रोटीन युक्त नमूना है और व्यापक "ओमिक्स" विश्लेषण के लिए उपयुक्त है। इसके अलावा, प्लाज्मा की तुलना में अग्नाशय के रस की बेहतर भेदभावपूर्ण शक्ति से पता चलता है कि ट्यूमर साइट के अधिक समीपस्थ नमूनों के लिए "अपस्ट्रीम" स्थानांतरित करना बायोमार्कर की पहचान करने के लिए एक सफल रणनीति हो सकती है जो पीडीएसी को अन्य अग्नाशयी रोगों से बाहर निकालने में मदद करती है।

Figure 3
चित्रा 3: अग्नाशय के रस और प्लाज्मा में मेटाबोलिक सामग्री। (ए) पीडीएसी(एन = 31, नीला) और गैर-पीडीएसी नमूने (एन = 9, हरा) के 1 एच-एनएमआर सीपीएमजी स्पेक्ट्रा अग्नाशय के रस में निहित छोटे आणविक भार मेटाबोलाइट्स पर विवरण दिखाते हैं। पीपीएम, पार्ट्स प्रति मिलियन। (बी) अग्नाशय के रस पीडीएसी नमूनों (नीले सर्कल) और गैर-पीडीएसी नमूनों (बैंगनी त्रिकोण) से सीपीएमजी स्पेक्ट्रा पर पर्यवेक्षित बहुभिन्नरूपी ओपीएलएस-डीए विश्लेषण के स्कोर। विश्लेषण दो समूहों (प्रत्येक को एक मकड़ी के भूखंड द्वारा रेखांकित) को अलग करता है, क्रॉस सत्यापन द्वारा प्राप्त 82.4% की सटीकता के साथ। (ग) प्लाज्मा पीडीएसी नमूनों (एन = 22, ब्लू सर्कल) और गैर-पीडीएसी नमूनों (एन = 7, बैंगनी त्रिकोण) से 1 डी-एनओईएसवाई स्पेक्ट्रा पर पर्यवेक्षित मल्टीवेरिएट ओपीएलएस-डीए विश्लेषण के स्कोर। क्रॉस सत्यापन द्वारा प्राप्त 75.2% की सटीकता। इस आंकड़े को अनुमति के साथ Cortese et al.12 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

यह प्रदर्शित करने के लिए कि टीआईएफ सामग्री ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट में परिवर्तन को मज़बूती से दर्शाती है, हमने ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल का पालन करते हुए विपरीत ग्लाइकोलाइटिक दर, पैनसी 02 (अत्यधिक ग्लाइकोलाइटिक) और डीटी 6606 (लोली ग्लाइकोलाइटिक) के साथ चमड़े के नीचे दो अग्नाशयी कैंसर सेल लाइनों को इंजेक्ट किया। फिर हमने ऊपर वर्णित कम गति सेंट्रीफ्यूजेशन विधि का उपयोग करके उत्पादित ट्यूमर से टीआईएफ को अलग किया (पैराग्राफ 4.2 देखें)। 0.25-1 ग्राम के बीच वजन के ट्यूमर से, हमने टीआईएफ के 5-15 μL की एक सीमा बरामद की, जिसका उपयोग तब ग्लूकोज और लैक्टेट की एकाग्रता को निर्धारित करने के लिए किया गया था। अत्यधिक ग्लाइकोलाइटिक ट्यूमर से टीआईएफ में कम ग्लाइकोलाइटिक ट्यूमर की तुलना में कम ग्लूकोज और अधिक लैक्टेट होता है (चित्रा 4)। इस डेटा से पता चलता है कि टीआईएफ का उपयोग ट्यूमर-व्युत्पन्न मेटाबोलाइट्स के लिए एक स्रोत के रूप में किया जा सकता है और ट्यूमर के अनुसार ही परिवर्तन होता है।

Figure 4
चित्रा 4: टीआईएफ में ग्लूकोज और लैक्टेट सामग्री आंतरिक ट्यूमर विशेषताओं को दर्शाती है। (ए) अंतरालीय द्रव में ग्लूकोज और (बी) लैक्टेट एकाग्रता, ऊतक सेंट्रीफ्यूजेशन विधि का उपयोग करके अलग किया जाता है, पैनसी02 (अत्यधिक ग्लाइकोलाइटिक, ए में एन = 10, बी में एन = 9) और डीटी 6606 (लोली ग्लाइकोलाइटिक, एन = 5 ए में, एन = 4 बी में) चमड़े के नीचे प्रत्यारोपित ट्यूमर। बॉक्स प्लॉट बॉक्स द्वारा माध्य, निचले चतुर्थक और ऊपरी चतुर्थक देते हैं, और मूंछों द्वारा न्यूनतम और अधिकतम देते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस अध्ययन में हमने अग्नाशय के रस को इंट्राऑपरेटिव रूप से इकट्ठा करने की तकनीक का वर्णन किया है, जो काफी हद तक अस्पष्टीकृत द्रव बायोप्सी है। हमने हाल ही में दिखाया है कि अग्नाशय के रस का उपयोग रोग12 के चयापचय मार्करों के स्रोत के रूप में किया जा सकता है। अन्य तरल बायोप्सी पर मेटाबोलिक विश्लेषण, जैसे रक्त 5,6,7, मूत्र8, और लार9, ने पीडीएसी और स्वस्थ विषयों या अग्नाशयशोथ के बीच भेदभाव करने में आशाजनक परिणाम दिखाए हैं। अग्नाशय का रस, हालांकि, सीधे अग्नाशयी डक्टल कोशिकाओं द्वारा स्रावित होता है, और ट्यूमर साइट के करीब निकटता के कारण, यह आसपास के ऊतकों में परिवर्तन का अधिक विश्वसनीय संकेतक हो सकता है, यहां तक कि बीमारी के शुरुआती चरणों में भी। वास्तव में, जबकि अग्नाशय के रस के एच-एनएमआर वर्णक्रमीय डेटा ने पीडीएसी रोगियों और अन्य सौम्य अग्नाशयी रोगों के बीच भेदभाव हासिल किया, प्लाज्मा नमूने नहीं थे। इसलिए, हालांकि अन्य द्रव बायोप्सी की तुलना में कम सुलभ है, अग्नाशय का रस नैदानिक बायोमार्कर के एक कीमती स्रोत का प्रतिनिधित्व करता है, और तेजी से विकसित होने वाली बीमारियों की पहचान में मदद कर सकता है। हमने यहां अग्नाशय के रस संग्रह के लिए इंट्राऑपरेटिव तकनीक का वर्णन किया है; हालांकि, यह रोग के मूल्यवान शुरुआती मार्करों की पहचान करने के परिप्रेक्ष्य में न्यूनतम इनवेसिव प्रक्रियाओं के दौरान भी किया जा सकता है। यह पता लगाया जाना बाकी है कि क्या विभिन्न संग्रह प्रक्रियाएं अग्नाशय के रस की प्रोटिओमिक संरचना को प्रभावित करती हैं।

जबकि पीडीएसी मुराइन मॉडल में अन्य द्रव बायोप्सी आसानी से सुलभ हैं, विवो में अग्नाशय के रस का संग्रह आनुवंशिक या ऑर्थोटोपिक मॉडल पर विचार करते समय बहुत चुनौतीपूर्ण हो सकता है, और चमड़े के नीचे के मॉडल में बिल्कुल संभव नहीं है। इसलिए, इस पेपर में हमने एक मूल्यवान और व्यापक रूप से लागू विकल्प के रूप में ट्यूमर अंतरालीय द्रव के उपयोग का सुझाव दिया है। वास्तव में, अंतरालीय द्रव संरचना, अग्नाशय के रस के समान, स्थानीय परिवेश में परिवर्तन से सीधे प्रभावित होती है। हेपेटोसेलुलर45,46, रीनल सेल 41, डिम्बग्रंथि 22,47,48और स्तन 42,49 कार्सिनोमा जैसे विभिन्न ट्यूमर से टीआईएफ पर प्रोटिओमिक प्रोफाइलिंग ने उम्मीदवार बायोमाकर्स के लिए शोध में उत्साहजनक परिणाम दिखाए हैं। हालांकि, पहचाने गए उम्मीदवार प्रोटीन में थोड़ा ओवरलैप है, यह सुझाव देते हुए कि टीआईएफ को अलग करने के लिए उपयोग किया जाने वाला दृष्टिकोण, प्रदर्शन किए गए डाउनस्ट्रीम विश्लेषण और डेटा संग्रह के साथ, पता लगाए गए विश्लेषणों को प्रभावित कर सकता है। स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा पर एक हालिया अध्ययन ने यहां वर्णित दो टीआईएफ अलगाव विधियों, सेंट्रीफ्यूजेशन और क्षालन की तुलना की, उपयोग की जाने वाली विधि से स्वतंत्र रूप से टीआईएफ संरचना में एक मजबूत स्थिरता देखी, हालांकि सेंट्रीफ्यूजेशन ने बाह्य प्रोटीन25 की उच्च सामग्री प्राप्त की।

टीआईएफ, ऊतक सेंट्रीफ्यूजेशन और ऊतक क्षालन के अलगाव के लिए यहां वर्णित दोनों विधियों में तकनीकी रूप से अवांछित, तेजी से होने का लाभ है, और केवल बुनियादी प्रयोगशाला उपकरणों की आवश्यकता होती है। अन्य दृष्टिकोणों की तुलना में, जैसे कि माइक्रोडायलिसिस और केशिका अल्ट्राफिल्ट्रेशन, सेंट्रीफ्यूजेशन और क्षालन तकनीक केवल संभव होने की आंतरिक सीमा के साथ मौजूद हैं। उपयुक्त विधि चुनते समय कई मुद्दों को ध्यान में रखना महत्वपूर्ण है, जैसे कि प्रयोग का विश्लेषणात्मक उद्देश्य, पुनर्प्राप्त मात्रा और सेल टूटना। ट्यूमर की संरचना पर भी विचार किया जाना चाहिए, क्योंकि यह टीआईएफ की मात्रा को प्रभावित कर सकता है। ऊतक सेंट्रीफ्यूजेशन मूल रूप से सेल-गरीब और कोलेजन युक्त ऊतकों जैसे कॉर्निया38 के लिए विकसित किया गया था; दूसरी ओर, ट्यूमर आमतौर पर उच्च सेलुलरता और समृद्ध वैस्कुलराइजेशन की विशेषता वाले ऊतक होते हैं, दोनों विशेषताएं जो हाइड्रोलिक चालकता को बढ़ाती हैं, और इसलिए सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा टीआईएफ के अलगाव की सुविधा प्रदान करनी चाहिए। हालांकि, पीडीएसी सहित कुछ ट्यूमर, एक प्रचुर मात्रा में स्ट्रोमल या फाइब्रोटिक घटक के साथ मौजूद होते हैं, जो कोलेजन जैसे बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन में समृद्ध होते हैं, जो ऊतक21 में मैक्रोमोलेक्यूल्स को बनाए रखते हैं।

दूसरी ओर, ऊतक क्षालन, ऊतक से एलुएट तक प्रोटीन के निष्क्रिय प्रसार पर आधारित है,और ट्यूमर की एक विस्तृत विविधता के लिए सफलतापूर्वक शोषण किया गया है। क्षालन बड़ी मात्रा की वसूली प्रदान करता है, हालांकि प्रोटीन पतला हो जाएगा। इस कारण से, ऊतक क्षालन बहुत कम प्रचुरता वाले अणुओं के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है। इसके अलावा, क्षालन के लिए ट्यूमर के हेरफेर की अधिक डिग्री की आवश्यकता होती है, संभवतः इसके परिणामस्वरूप टीआईएफ में इंट्रासेल्युलर सामग्री रिसाव होता है। यह बायोमार्कर खोज के लिए अप्रासंगिक हो सकता है लेकिन एक पूर्वाग्रह पेश कर सकता है यदि उद्देश्य प्रोटीन के स्थानीय उत्पादन को निर्धारित करना है। ट्यूमर प्रकार के अनुसार सबसे उपयुक्त विधि चुनने के लिए डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों में सेल टूटने की मात्रा का परीक्षण किया जाना चाहिए। यह कई तरीकों से किया जा सकता है, उदाहरण के लिए टीआईएफ25 में राइबोसोमल प्रोटीन जैसे हाउसकीपिंग प्रोटीन की उपस्थिति का परीक्षण करके। एक अन्य सुझाया गया दृष्टिकोण टीआईएफ और प्लाज्मा में क्रिएटिनिन या एनए + जैसे चयनित बाह्य पदार्थों की सांद्रता की तुलना करना है, जो22 के समान होना चाहिए। सेंट्रीफ्यूजेशन विधि के लिए इंट्रासेल्युलर सामग्री रिसाव पर भी विचार किया जाना चाहिए; वास्तव में, अभी भी कोई आम सहमति नहीं है कि सेल टूटने से बचने के लिए "कम गति" क्या माना जाना चाहिए, संभवतः ट्यूमर संरचना में अंतर के कारण। हमने 400 x g गति का उपयोग करना चुना, क्योंकि यह दिखाया गया है कि जी बलों <42438 के लिए इंट्रासेल्युलर सामग्री से कोई कमजोर पड़ने नहीं होता है।

दृष्टिकोण के बावजूद, टीआईएफ ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट का नमूना लेने के लिए एक कीमती और व्यापक रूप से लागू स्रोत का प्रतिनिधित्व करता है। हमने दिखाया है कि यह ट्यूमर-आंतरिक विशेषताओं को पुन: परिभाषित करता है और रोग या चिकित्सीय लक्ष्यों के बायोमार्कर की पहचान के लिए उपयोगी हो सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम तकनीकी सहायता के लिए रॉबर्टा मिगलियोर को धन्यवाद देते हैं। इन परिणामों के लिए अग्रणी अनुसंधान को IG2016-ID.18443 परियोजना - P.I. Marchesi Federica के तहत Associazione इटालियाना पर la ricerca sul cancro (AIRC) से धन प्राप्त हुआ है। अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि की तैयारी में फंडर्स की कोई भूमिका नहीं थी।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringe BD Biosciences 309659
1.5 mL Eppendorf tube Greiner BioOne GR616201
20 µm nylon cell strainer pluriSelect 43-50020-03
25G needle BD Biosciences 305122
3 mL K2EDTA vacutainer BD Biosciences 366473
3 mL syringe BD Biosciences 309656
50 mL Falcon tube Corning 352098
Clamps Medicon 06.20.12
Disposable scalpel Medicom 9000-10
Fetal bovine serum Microtech MG10432
Flat-tipped forceps Medicon 06.00.10
Penicillin-Streptomycin Lonza ECB3001D
Phosphate-Buffered Saline (PBS) Sigma-Aldrich D8537
Protease inhibitor cocktail Roche 34044100
RPMI medium Euroclone ECB9006L
Scissors Medicon 02.04.09
Trypsin/EDTA 1x Lonza BE17-161F
Ultraglutamine 100x Lonza BE17-605E/U1

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक 165 अग्नाशयी एडेनोकार्सिनोमा अग्नाशय का रस ट्यूमर अंतरालीय द्रव समीपस्थ द्रव तरल बायोप्सी बायोमार्कर प्रोटिओमिक्स
अग्नाशयी एडेनोकार्सिनोमा के ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट की जांच के लिए समीपस्थ तरल पदार्थ का अलगाव
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Donisi, G., Barbagallo, M., Capretti, G., Nappo, G., Takis, P. G., Zerbi, A., Marchesi, F., Cortese, N. Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma. J. Vis. Exp. (165), e61687, doi:10.3791/61687 (2020).

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