Summary
Панкреатический сок является ценным источником биомаркеров рака поджелудочной железы человека. Здесь описан метод интраоперационной процедуры сбора. Чтобы преодолеть проблему принятия этой процедуры в мышиных моделях, мы предлагаем альтернативный образец, опухолевую интерстициальную жидкость, и описываем здесь два протокола для ее выделения.
Abstract
Аденокарцинома поджелудочной железы (PDAC) является четвертой по значимости причиной смерти, связанной с раком, и вскоре станет второй. Существует острая потребность в переменных, связанных со специфическими патологиями поджелудочной железы, чтобы помочь предоперационной дифференциальной диагностике и профилированию пациентов. Панкреатический сок представляет собой относительно неисследованную жидкость организма, которая благодаря своей непосредственной близости к месту опухоли отражает изменения в окружающих тканях. Здесь мы подробно опишем процедуру интраоперационного сбора. К сожалению, перевод сбора панкреатического сока на мышиные модели PDAC для выполнения механистических исследований технически очень сложен. Опухолевая интерстициальная жидкость (TIF) представляет собой внеклеточную жидкость, находящуюся вне крови и плазмы, которая омывает опухолевые и стромальные клетки. Подобно соку поджелудочной железы, из-за его свойства собирать и концентрировать молекулы, которые находятся разбавленными в плазме, TIF может использоваться в качестве индикатора микроокружающих изменений и в качестве ценного источника биомаркеров, связанных с заболеванием. Поскольку TIF не является легкодоступным, были предложены различные методы его изоляции. Здесь мы опишем два простых и технически нетребовательных метода его выделения: тканевое центрифугирование и тканевое элюирование.
Introduction
Аденокарцинома протоков поджелудочной железы (PDAC) является одной из самых агрессивных опухолей, и вскоре станет второй по значимости причиной смерти 1,2,3. Он хорошо известен своей иммуносупрессивной микросредой и своей неспособностью реагировать на протоколы иммунотерапии4. В настоящее время хирургическая резекция по-прежнему является единственным лечебным вариантом для PDAC, но существует высокая частота ранних рецидивов и послеоперационных осложнений. Отсутствие специфических симптомов до запущенной стадии не позволяет провести раннюю диагностику, способствуя срокам заболевания. Кроме того, перекрытие симптомов между PDAC и другими доброкачественными патологиями поджелудочной железы может препятствовать достижению быстрой и надежной диагностики с текущими диагностическими стратегиями. Идентификация переменных, связанных с конкретными патологиями поджелудочной железы, может облегчить процесс принятия хирургических решений и улучшить профилирование пациентов.
Многообещающие результаты в открытии биомаркеров были достигнуты с использованием легкодоступных жидкостей организма, таких как кровь 5,6,7, моча8, слюна9 и панкреатический сок 10,11,12. Во многих исследованиях использовались комплексные «омические» подходы, такие как геномные, протеомные и метаболомные методы, для идентификации молекул-кандидатов или сигнатур, которые могут различать PDAC и другие доброкачественные заболевания поджелудочной железы. Недавно мы продемонстрировали, что панкреатический сок, относительно неисследованная жидкость организма, может быть использован для идентификации метаболических сигнатур пациентов с различными клиническими профилями12. Панкреатический сок представляет собой богатую белком жидкость, которая накапливает секретом клеток протоков поджелудочной железы и поступает в главный проток поджелудочной железы, а затем в основной общий желчный проток. Из-за своей близости к поджелудочной железе на него могут сильно влиять микроокружательные возмущения, индуцированные опухолевой массой (рисунок 1), и, следовательно, более информативные, чем кровь или моча, или профилирование на основе тканей. В нескольких исследованиях изучался потенциал панкреатического сока для выявления новых биомаркеров заболевания с использованием различных подходов, включая цитологический анализ13, протеомный анализ, выполненный масс-спектрометрией 14,15, оценку генетических и эпигенетических маркеров, таких как мутации K-ras и p53 16,17, изменения в метилировании ДНК18 и миРНК 19 . Технически панкреатический сок может быть собран интраоперационно или с помощью минимально инвазивных процедур, таких как эндоскопическое ультразвуковое исследование, ретроградная холангио-панкреатография или эндоскопический сбор секреции дуоденального сока20. Пока не ясно, в какой степени на состав панкреатического сока влияет используемая методика сбора. Мы описываем здесь процедуру интраоперационного сбора и показываем, что панкреатический сок может представлять собой ценный источник биомаркеров PDAC.
Рисунок 1: Схематическое изображение сбора сока поджелудочной железы. (А) Схематическое изображение, изображающее секрецию панкреатического сока в проток поджелудочной железы и его сбор во время операции. Вставка показывает крупный план микроокружения опухоли: панкреатический сок собирает молекулы, высвобождаемые опухолевыми и стромальными клетками в протоках поджелудочной железы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Коллекция панкреатического сока в генетических и ортотопических мышиных моделях PDAC была бы оценена в перспективе использования этой биожидкости в доклинических механистических исследованиях; однако эта процедура может быть технически очень сложной и неосуществимой для более простых моделей, таких как подкожные опухоли. По этой причине мы идентифицировали опухолевую интерстициальную жидкость (TIF) в качестве альтернативного источника панкреатического сока, поскольку она сходная характеристика действует как индикатор окружающих возмущений. Интерстициальная жидкость (ИФ) представляет собой внеклеточную жидкость, обнаруженную вне кровеносных и лимфатических сосудов, которая омывает клеткиткани 21. На состав ПЧ влияет как кровообращение в органе, так и местная секреция; фактически, окружающие клетки активно продуцируют и секретируют белки в IF21. Интерстиций отражает микроокружательные изменения окружающих тканей и, следовательно, может представлять собой ценный источник для обнаружения биомаркеров в нескольких патологических контекстах, таких как опухоли. Высокая концентрация локально секретируемых белков в TIF может быть использована для идентификации молекул-кандидатов для тестирования в качестве прогностических или диагностических биомаркеров в плазме 22,23,24. Несколько исследований доказали, что TIF является подходящим образцом для высокопроизводительных протеомных подходов, таких как методы масс-спектрометрии23,24,25, а также мультиплексные подходы ИФА26 и профилирование микроРНК27.
Было предложено несколько подходов к выделению МФ в опухолях, которые можно в широком смысле классифицировать как in vivo (капиллярная ультрафильтрация 28,29,30,31 и микродиализ 32,33,34,35) и методы ex vivo (тканевая центрифугирование 22,36,37,38 и тканевое элюирование 39,40,41,42). Эти методы были подробно рассмотрены43,44. При выборе соответствующего метода следует учитывать такие вопросы, как последующий анализ и применение, а также восстановленный объем. Недавно мы использовали этот подход в качестве доказательства принципа для демонстрации различной метаболической активности опухолей из двух клеточных линий аденокарциномы мышей поджелудочной железы12. Основываясь на литературе24,38, мы решили использовать метод центрифугирования с низкой скоростью, чтобы избежать разрушения и разбавления клеток от внутриклеточного содержимого. Как количество глюкозы, так и лактата в TIF отражало различные гликолитические характеристики двух разных клеточных линий. Здесь мы подробно опишем протокол для двух наиболее часто используемых методов выделения TIF: тканевого центрифугирования и тканевого элюирования (рисунок 2).
Рисунок 2: Схематическое изображение методов выделения опухолевой интерстициальной жидкости. Схематическая иллюстрация методов, подробно описанных в протоколе, а именно центрифугирования тканей (А) и тканевого элюирования (В). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
У всех зарегистрированных пациентов периферическая кровь и панкреатический сок были собраны во время операции в соответствии с протоколами, утвержденными Этическим комитетом Учреждения. Все пациенты были включены в исследование после подписания информированного согласия, включая сбор биологических образцов и клинических данных. Исследование было одобрено Этическим комитетом Института (протокол No ICH-595, одобрение выдано в мае 2009 года). Процедуры с участием мышей и ухода за ними соответствовали Руководящим принципам ЕС и институциональным рекомендациям (протокол ID 121/2016-PR).
1. Выделение панкреатического сока
ПРИМЕЧАНИЕ: Изъятие панкреатического сока выполняется в контексте открытой процедуры резекции поджелудочной железы (например, панкреатодуоденэктомия, тотальная панкреатэктомия, дистальная панкреатэктомия) экспертами-хирургами поджелудочной железы.
- Подбор пациентов
- Рассмотрите для процедуры любого пациента, запланировавшего открытую резекцию поджелудочной железы.
- Подтвердите включение, если размер основного протока поджелудочной железы считается достаточным для извлечения сока поджелудочной железы. Минимальным пределом в диаметре основного протока поджелудочной железы считается 2 мм при контрастно-усиленной КТ-визуализации.
- Предоперационное исследование протока поджелудочной железы при контрастно-усиленной компьютерной томографии, чтобы помочь в планировании извлечения сока поджелудочной железы
- Трехмерно локализуют главный панкреатический проток внутри железы на уровне шейки поджелудочной железы: измеряют расстояние главного протока поджелудочной железы от переднего, верхнего и нижнего края поджелудочной железы на поперечных скольжениях, а также корональные и сагиттальные рендеры. Оказавшись в операционной, используйте эти измерения, чтобы приблизиться к правильному месту, где проколоть поджелудочную железу, чтобы каннулировать проток Wirsung и извлечь панкреатический сок.
- Подготовка материала
- Стерильный материал: Откройте стерильную оболочку одной иглы 25 г и одного шприца 3 мл и поместите их в стерильное поле в сотрудничестве с медсестрой скраба.
- Нестерильный материал: Держите вакуумную пробирку K2EDTA объемом 3 мл наготове под рукой в операционной для хранения жидкости.
- Подготовка пациента
- Расположите пациента на кровати в операционной. Индуцируют смешанную общую анестезию, используя Ремифентанил, Севоран и Рокурониум, затем интубируют и начинают вентиляцию пациента. Расположите пациента в лежачем пролежне с правой рукой, подвернутой к телу, и левой рукой, отведенной до 90° градусов, закрепленной на подлокотнике.
- Продезинфицируйте кожу живота в месте разреза. Создайте и поддерживайте стерильное поле на животе, драпируя пациента.
- Хирургическая процедура
- Выполните подреберный разрез и получите доступ к брюшной полости. Позиционируйте втягивание брюшной полости Rochard для воздействия на орган.
- Обнажают и мобилизуют поджелудочную железу с помощью маневра Кохера, вскрытия гастроколической связки, разреза забрюшинной ткани вдоль верхней и нижней границы поджелудочной железы, создавая плоскость рассечения между шейкой поджелудочной железы и верхней брыжеечной веной, расположенной сзади.
- Как только поджелудочная железа мобилизуется и подвергается воздействию, приступайте к отмене панкреатического сока перед разрезанием шейки поджелудочной железы.
- Идентификация и локализация протока поджелудочной железы
- Оцените местоположение протока поджелудочной железы с помощью измерения, проведенного при визуализации, а затем пальпируйте переднюю поверхность поджелудочной железы, чтобы определить его точное местоположение.
- Сбор панкреатического сока
- Удерживайте головку поджелудочной железы и двенадцатиперстную кишку снизу и поднимите ее левой рукой, отмечая расположение протока поджелудочной железы первой цифрой.
- Возьмитесь правой рукой за шприц объемом 3 мл с установленной иглой 25 г.
- Используйте правую руку, чтобы вставить иглу в поджелудочную железу только дистально к большому пальцу левой руки. Определить глубину проникновения и степень наклона иглы определяют на основании предоперационных измерений и ощущения проникновения в стенку протока.
- Выведите сок шприцем. Если нет возможности извлечь сок, переместите иглу в четырех направлениях, пытаясь канюлировать проток поджелудочной железы.
- Как только панкреатический сок будет извлечен, переместите его за пределы стерильного поля и перенесите в вакуумную пробирку K2EDTA объемом 3 мл. Держите при температуре 4 °C до тех пор, пока образец не будет передан в лабораторию, и приступайте к дальнейшей обработке как можно раньше.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объем панкреатического сока, который может быть восстановлен с помощью этой процедуры, сильно варьируется, варьируясь примерно от 0,2 мл до 3 мл в нашем опыте. Количество извлекаемого сока сильно зависит от пациента: размер протока Вирсунга и функциональное состояние поджелудочной железы (функционирование по сравнению с атрофической железой). По нашему опыту нет целесообразности, которую можно использовать для увеличения количества извлекаемого панкреатического сока.
2. Переработка панкреатического сока
- Центрифуга панкреатического сока при 400 х г в течение 10 мин при 4 °C для удаления любых клеток или мусора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Панкреатический сок должен быть прозрачным и прозрачным по цвету перед центрифугированием. Иногда может произойти загрязнение крови во время операции, в результате чего образец выглядит более мутным и красным по цвету. Рассмотрите возможность исключения таких образцов из дальнейших анализов. - Восстановите супернатант, аликвоту и храните при -80 °C до дальнейших анализов.
3. Индукция подкожных опухолей
ПРИМЕЧАНИЕ: Мышиные клеточные линии Panc02 и DT6606 были получены от профессора Лоренцо Пьемонти (Институт диабета Сан-Раффаэле, Милан, Италия) и профессора Франческо Новелли (Центр экспериментальных исследований и медицинских исследований, Турин, Италия) соответственно, как описано ранее12.
- Рост опухолевых клеток
- Культивирование клеток Panc02 и DT6606 в среде Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2mM L-глутамина и 1% пенициллин-стрептомицинового антибиотика.
- Оттаивайте замороженные клетки за 1-2 недели до инъекции опухоли, в зависимости от скорости роста клеточной линии.
- Выращивайте клетки при 37 °C при 5% CO2 и влажности 95% в стерильных условиях.
- Отделите клетки 0,025% раствором трипсина/ЭДТА в течение 5 мин при 37 °C, когда они достигнут 80% сливаемости, и устраните трипсин центрифугированием.
ПРИМЕЧАНИЕ: DT6606 являются первичными, не увековеченными клетками, полученными от мыши LSL-KrasG12D-Pdx1-Cre, и их не следует проходить более 3 раз перед инъекцией in vivo с целью сохранения их первоначальных характеристик. Рекомендуется размораживать клетки DT6606 за 7-10 дней до инъекции.
- Инъекция опухолевых клеток in vivo
- Трипсинизируют клетки (см. шаг 3.1.4) и промывайте их один раз фосфатно-буферизованным физиологическим раствором (PBS). Исключите PBS путем центрифугирования и повторного суспендирования клеток в свежих PBS перед подсчетом.
- Подсчитайте клетки и повторно суспендируйте их в PBS в концентрации 0,5-1 x 107 клеток/мл, чтобы иметь конечную концентрацию 0,5-1 x 106 клеток/100 мкл для введения каждой мыши. Подготовьте клетки в избытке. Держите клетки при температуре 4 °C или на льду до конца процедуры.
- Группируйте животных (8-недельные самки мышей C57BL/6J) в разных клетках в соответствии с различными клеточными линиями или методами лечения.
- Удерживайте животных вручную и обезболивайте их, используя смесь кетамина (80 мг / кг) и ксилазина (10 мг / кг) или в соответствии с местными процедурами.
- Сбрить место инъекции, обычно боковую часть над ногой, электробритвой и тщательно очистить место инъекции спиртом.
- Пипетка вверх и вниз по клеточной суспензии с помощью шприца 1 мл, удаляя любые пузырьки воздуха путем перемещения поршня вверх и вниз. Прикрепите иглу 25 Г к шприцу и толкайте поршень вверх, пока клеточная суспензия не достигнет отверстия иглы.
- Защемите кожу бока плоскими щипцами и аккуратно вставьте иглу в основание кожной складки между щипцами, не прокалывая брюшную полость или мускулатуру. Чтобы убедиться в правильном положении иглы, аккуратно постарайтесь переместить кончик иглы вбок под кожу. Игла должна свободно двигаться.
- Медленно вводят 100 мкл клеточной суспензии (содержащей 0,5-1 х 106 клеток), осторожно зажмите место инъекции в течение нескольких секунд и медленно выведите иглу без каких-либо боковых движений.
- Верните мышь обратно в клетку и следите за восстановлением после анестезии.
- Проверяйте рост опухоли с помощью суппорта в течение 3-4 недель. Усыпляют животных, когда опухоли достигают примерно 0,5-1см3 с использованием CO2 или в соответствии с местными процедурами.
4. Выделение опухолевой интерстициальной жидкости (TIF)
- Иссечение подкожных опухолей
- Заблокируйте конечности животных бумажной лентой и очистите кожу спиртом. Разрежьте кожу на животе, чтобы отделить ее от брюшины и перейти к конечностям. Иссейте опухоль, выращенную под кожей бока, с помощью ножниц, зажимов и в конечном итоге скальпеля.
- Взвесьте опухоль и держите ее в чистой трубке на льду до следующего выделения TIF.
- Изоляция TIF методом центрифугирования
- Разрежьте опухоль пополам, быстро промойте две части в PBS и аккуратно промойте их на фильтровальной бумаге, чтобы удалить избыток PBS. Выполняйте эти шаги как можно быстрее, чтобы избежать испарения из опухоли.
- Немедленно перенесите опухоль в 20-мкм нейлоновое клеточное ситечко, прикрепленное к конической трубке объемом 50 мл.
- Центрифугируйте трубку при 400 х г в течение 10 мин при 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это низкоскоростное центрифугирование сохраняет целостность клеток, избегая загрязнения TIF внутриклеточным компартментом. Внутриклеточная утечка содержимого может быть проверена в последующих приложениях, например, путем оценки присутствия внутриклеточных хозяйственных белков, таких как рибосомные белки25. - Извлеките TIF со дна трубки, в конечном итоге аликвотируйте его и немедленно заморозьте на сухом льду и храните при -80 °C до дальнейшего анализа.
Необязательно: На основе последующего протеомного анализа, который должен быть выполнен, разбавьте образец в PBS коктейлем ингибитора протеазы, чтобы избежать деградации конкретных молекул.
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от состава опухоли, в некоторых случаях очень маленькие опухоли не дают никакой жидкости.
- Выделение TIF путем элюирования
- Разрезать опухоль на мелкие кусочки (≈1-3мм3) ножницами или скальпелем и тщательно промыть холодным ПБС.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе очень важно работать быстро и выполнять минимальные манипуляции, чтобы избежать повреждения клеток. - Перенесите кусочки опухоли в пробирку объемом 1,5 мл и добавьте 500 мкл PBS с коктейлем ингибитора протеазы, чтобы избежать деградации аналитов. Инкубировать в течение 1 часа при 37 °C и 5% CO2.
- Восстановите супернатант и перенесите его в новую трубку объемом 1,5 мл. Центрифуга при 1000 х г в течение 5 мин при 4 °C для удаления любых клеток из образца.
- Переложите супернатант в новую трубку и центрифугу снова при 2000 х г в течение 8 мин при 4 °C.
- Переложите супернатант в новую трубку и центрифугу снова при 20 000 х г в течение 30 мин при 4 °C для удаления любого мусора. Восстановите супернатант. Немедленно аликвотировать и замораживать образец TIF на сухом льду и хранить при -80 °C до дальнейшего анализа.
- Разрезать опухоль на мелкие кусочки (≈1-3мм3) ножницами или скальпелем и тщательно промыть холодным ПБС.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы следовали описанной выше процедуре для получения панкреатического сока от пациентов с PDAC (n = 31) и другими доброкачественными заболеваниями поджелудочной железы (non-PDAC, n = 9), включая панкреатит (n = 2), папиллярно-ампульные опухоли (n = 4), нейроэндокринные опухоли (n = 2), внутрипродукционную папиллярную муцинозную неоплазию (IPMN; n = 1) 12. Затем образцы панкреатического сока подвергали метаболомному анализу с использованием ядерного магнитного резонанса (1H-ЯМР)12. Фильтруя широкие ЯМР-сигналы макромолекул (например, липопротеинов, липидов и т. д.), мы смогли детально оценить маломолекулярные метаболиты, как показано в спектрах 1D Карра-Перселла-Мейбума-Гилла (CPMG) (рисунок 3A). Контролируемый анализ OPLS-DA показал, что метаболический профиль, обнаруженный в панкреатическом соке, был способен различать pdac и не-PDAC пациентов с точностью 82,4%, полученной путем перекрестной валидации (рисунок 3B). Интересно, что метаболомический анализ, выполненный на образцах плазмы у тех же пациентов, не дал той же дискриминирующей способности (точность 75,2%, полученная путем перекрестной валидации) (рисунок 3C). Эти результаты показывают, что панкреатический сок является богатым белком образцом и подходит для всестороннего анализа «омики». Кроме того, превосходная дискриминирующая способность панкреатического сока по сравнению с плазмой предполагает, что перемещение «вверх по течению» к образцам, более близким к месту опухоли, может быть успешной стратегией для выявления биомаркеров, которые помогают выделить PDAC от других заболеваний поджелудочной железы.
Рисунок 3: Метаболомное содержание в панкреатическом соке и плазме. (A) 1H-ЯМР CPMG спектры PDAC (n = 31, синий) и не-PDAC образцы (n = 9, зеленый), показывающие подробную информацию о маломолекулярных метаболитах, содержащихся в соках поджелудочной железы. ppm, частей на миллион. (B) Оценки контролируемого многомерного анализа OPLS-DA на спектры CPMG из образцов PDAC панкреатического сока (синие круги) и образцов без PDAC (фиолетовые треугольники). Анализ разделяет две группы (каждая из которых очерчена паучьим графиком) с точностью 82,4%, полученной путем перекрестной проверки. (C) Оценки контролируемого многомерного анализа OPLS-DA на спектрах 1D-NOESY из образцов плазмы PDAC (n = 22, синие круги) и образцов без PDAC (n = 7, фиолетовые треугольники). Точность 75,2% получена путем перекрестной валидации. Этот рисунок был изменен по сравнению с Cortese et al.12 с разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Чтобы продемонстрировать, что содержание TIF надежно отражает изменения в микроокружении опухоли, мы ввели подкожно две линии клеток рака поджелудочной железы с противоположной гликолитической скоростью, Panc02 (высокогликолитик) и DT6606 (низкогликолитик), следуя протоколу, описанному выше. Затем мы выделили TIF из иссеченных опухолей с использованием метода центрифугирования с низкой скоростью, описанного выше (см. пункт 4.2). Из опухолей весом от 0,25-1 г мы восстановили диапазон 5-15 мкл TIF, который затем использовался для количественной оценки концентрации глюкозы и лактата. TIF из высокогликолитарных опухолей содержал меньше глюкозы и больше лактата по сравнению с низкогликолитическими опухолями (рисунок 4). Эти данные показывают, что TIF может быть использован в качестве источника метаболитов и изменений опухоли в соответствии с самой опухолью.
Рисунок 4: Содержание глюкозы и лактата в TIF отражает внутренние особенности опухоли. (А) Концентрация глюкозы и (В) лактата в интерстициальной жидкости, выделенная методом центрифугирования тканей, из Panc02 (высокогликолитической, n=10 в А, n=9 в В) и DT6606 (низкогликолитической, n=5 в А, n=4 в В) подкожно имплантированных опухолей. Квадратурные графики дают медиану, нижний квартиль и верхний квартиль по коробке, а минимум и максимум по усам. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом исследовании мы описали технику интраоперационного сбора сока поджелудочной железы, в значительной степени неисследованную жидкую биопсию. Недавно мы показали, что панкреатический сок может быть использован в качестве источника метаболических маркеров заболевания12. Метаболомический анализ других жидких биопсий, таких как кровь 5,6,7, моча8 и слюна9, показал многообещающие результаты в различении PDAC и здоровых субъектов или панкреатита. Панкреатический сок, однако, непосредственно секретируется клетками протоков поджелудочной железы, и из-за его непосредственной близости к месту опухоли он может быть более надежным показателем изменений в окружающих тканях даже на самых ранних стадиях заболевания. Фактически, в то время как спектральные данные H-ЯМР панкреатического сока достигали дискриминации между пациентами PDAC и другими доброкачественными заболеваниями поджелудочной железы, образцы плазмы этого не делали. Поэтому, хотя сок поджелудочной железы менее доступен, чем другие жидкие биопсии, он представляет собой ценный источник клинических биомаркеров и может помочь в выявлении быстро развивающихся заболеваний. Здесь мы описали интраоперационную методику сбора панкреатического сока; однако он также может быть выполнен во время минимально инвазивных процедур с точки зрения выявления ценных ранних маркеров заболевания. Еще предстоит выяснить, влияют ли различные процедуры сбора на протеомный состав панкреатического сока.
В то время как другие жидкие биопсии легко доступны в мышиных моделях PDAC, сбор сока поджелудочной железы in vivo может быть очень сложным при рассмотрении генетических или ортотопических моделей и вообще невозможен в подкожных моделях. Поэтому в данной работе мы предложили использовать опухолевую интерстициальную жидкость в качестве ценной и широко применимой альтернативы. Фактически, на состав интерстициальной жидкости, подобно панкреатическому соку, непосредственно влияют изменения в местной среде. Протеомное профилирование на TIF из различных опухолей, таких как гепатоцеллюлярные45,46, почечные клетки41, яичники 22,47,48 и карциномы молочной железы 42,49, показали обнадеживающие результаты в исследованиях биомаркеров-кандидатов. Тем не менее, существует небольшое совпадение в идентифицированных белках-кандидатах, что говорит о том, что подход, используемый для выделения TIF, вместе с проведенным последующим анализом и сбором данных, может повлиять на обнаруженные аналиты. Недавнее исследование плоскоклеточного рака, сравнивающее два описанных здесь метода выделения TIF, центрифугирование и элюирование, наблюдало сильную консистенцию в составе TIF независимо от используемого метода, хотя центрифугирование дало более высокое содержание внеклеточных белков25.
Оба метода, описанные здесь для выделения TIF, центрифугирования тканей и элюирования тканей, имеют то преимущество, что они технически нетребовательны, быстры и требуют только базового лабораторного оборудования. По сравнению с другими подходами, такими как микродиализ и капиллярная ультрафильтрация, методы центрифугирования и элюирования имеют внутреннее ограничение, заключающееся только в том, что они осуществимы ex vivo. Важно учитывать несколько вопросов при выборе соответствующего метода, таких как аналитическая цель эксперимента, объем восстановленного и поломка клеток. Также следует учитывать состав опухоли, так как он может влиять на объем восстановленного ТИФ. Центрифугирование тканей было первоначально разработано для бедных клетками и богатых коллагеном тканей, таких как роговица38; опухоли, с другой стороны, обычно представляют собой ткани, характеризующиеся высокой клеточностью и богатой васкуляризацией, оба признака которых увеличивают гидравлическую проводимость и, следовательно, должны способствовать выделению TIF путем центрифугирования. Однако некоторые опухоли, включая PDAC, присутствуют с обильным стромальным или фиброзным компонентом, богатым белками внеклеточного матрикса, такими как коллагены, которые, как правило, удерживают макромолекулы в ткани21.
Тканевое элюирование, с другой стороны, основано на пассивной диффузии белков из ткани в элюат и успешно используется для широкого спектра опухолей43. Элюирование обеспечивает восстановление больших объемов, однако белки будут разбавлены. По этой причине элюирование тканей может не подходить для молекул с очень низким содержанием. Кроме того, элюирование требует большей степени манипуляций с опухолью, что может привести к внутриклеточной утечке содержимого в TIF. Это может не иметь отношения к открытию биомаркеров, но может привести к смещению, если цель состоит в том, чтобы определить местное производство белков. Количество разрушения клеток должно быть проверено в последующих приложениях, чтобы выбрать наиболее подходящий метод в соответствии с типом опухоли. Это может быть выполнено несколькими способами, например, путем тестирования присутствия домашних белков, таких как рибосомные белки, в TIF25. Другой предлагаемый подход заключается в сравнении концентраций выбранных внеклеточных веществ, таких как креатинин или Na+, в TIF и плазме, которые должны бытьаналогичными 22. Внутриклеточную утечку содержимого следует также учитывать при использовании метода центрифугирования; на самом деле, до сих пор нет общего консенсуса относительно того, что следует считать «низкоскоростным», чтобы избежать разрушения клеток, возможно, из-за различий в составе опухоли. Мы решили использовать скорость 400 x g , так как было показано, что не происходит разбавления от внутриклеточного содержимого для g-сил <42438.
Независимо от подхода, TIF представляет собой ценный и широко применимый источник для отбора проб микросреды опухоли. Мы показали, что он повторяет присущие опухоли особенности и может быть полезен для идентификации биомаркеров заболевания или терапевтических мишеней.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим Роберту Мильоре за техническую помощь. Исследование, приведшее к этим результатам, получило финансирование от Associazione Italiana per la ricerca sul cancro (AIRC) в рамках проекта IG2016-ID.18443 – P.I. Marchesi Federica. Спонсоры не играли никакой роли в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Greiner BioOne | GR616201 | |
| 20 µm nylon cell strainer | pluriSelect | 43-50020-03 | |
| 25G needle | BD Biosciences | 305122 | |
| 3 mL K2EDTA vacutainer | BD Biosciences | 366473 | |
| 3 mL syringe | BD Biosciences | 309656 | |
| 50 mL Falcon tube | Corning | 352098 | |
| Clamps | Medicon | 06.20.12 | |
| Disposable scalpel | Medicom | 9000-10 | |
| Fetal bovine serum | Microtech | MG10432 | |
| Flat-tipped forceps | Medicon | 06.00.10 | |
| Penicillin-Streptomycin | Lonza | ECB3001D | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 34044100 | |
| RPMI medium | Euroclone | ECB9006L | |
| Scissors | Medicon | 02.04.09 | |
| Trypsin/EDTA 1x | Lonza | BE17-161F | |
| Ultraglutamine 100x | Lonza | BE17-605E/U1 |
References
- Costello, E., Greenhalf, W., Neoptolemos, J. P. New biomarkers and targets in pancreatic cancer and their application to treatment. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 9 (8), 435-444 (2012).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2020. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 70 (1), 7-30 (2020).
- Neoptolemos, J. P., et al. Therapeutic developments in pancreatic cancer: current and future perspectives. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 15 (6), 333-348 (2018).
- Sahin, I. H., Askan, G., Hu, Z. I., O'Reilly, E. M. Immunotherapy in pancreatic ductal adenocarcinoma: an emerging entity. Annals of Oncology. 28 (12), 2950-2961 (2017).
- Mayerle, J., et al. Metabolic biomarker signature to differentiate pancreatic ductal adenocarcinoma from chronic pancreatitis. Gut. 67 (1), 128-137 (2018).
- Bathe, O. F., et al. Feasibility of identifying pancreatic cancer based on serum metabolomics. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 20 (1), 140-147 (2011).
- Mayers, J. R., et al. Elevation of circulating branched-chain amino acids is an early event in human pancreatic adenocarcinoma development. Nature Medicine. 20 (10), 1193-1198 (2014).
- Napoli, C., et al. Urine metabolic signature of pancreatic ductal adenocarcinoma by (1)h nuclear magnetic resonance: identification, mapping, and evolution. Journal of Proteome Research. 11 (1), 1274-1283 (2012).
- Sugimoto, M., Wong, D. T., Hirayama, A., Soga, T., Tomita, M. Capillary electrophoresis mass spectrometry-based saliva metabolomics identified oral, breast and pancreatic cancer-specific profiles. Metabolomics. 6 (1), 78-95 (2010).
- Chen, R., et al. Comparison of pancreas juice proteins from cancer versus pancreatitis using quantitative proteomic analysis. Pancreas. 34 (1), 70-79 (2007).
- Mori, Y., et al. A minimally invasive and simple screening test for detection of pancreatic ductal adenocarcinoma using biomarkers in duodenal juice. Pancreas. 42 (2), 187-192 (2013).
- Cortese, N., et al. Metabolome of Pancreatic Juice Delineates Distinct Clinical Profiles of Pancreatic Cancer and Reveals a Link between Glucose Metabolism and PD-1+ Cells. Cancer Immunology Research. , (2020).
- Tanaka, M., et al. Cytologic Analysis of Pancreatic Juice Increases Specificity of Detection of Malignant IPMN-A Systematic Review. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 17 (11), 2199-2211 (2019).
- Chen, K. T., et al. Potential prognostic biomarkers of pancreatic cancer. Pancreas. 43 (1), 22-27 (2014).
- Tian, M., et al. Proteomic analysis identifies MMP-9, DJ-1 and A1BG as overexpressed proteins in pancreatic juice from pancreatic ductal adenocarcinoma patients. BMC Cancer. 8, 241 (2008).
- Shi, C., et al. Sensitive and quantitative detection of KRAS2 gene mutations in pancreatic duct juice differentiates patients with pancreatic cancer from chronic pancreatitis, potential for early detection. Cancer Biology & Therapy. 7 (3), 353-360 (2008).
- Rogers, C. D., et al. Differentiating pancreatic lesions by microarray and QPCR analysis of pancreatic juice RNAs. Cancer Biology & Therapy. 5 (10), 1383-1389 (2006).
- Matsubayashi, H., et al. DNA methylation alterations in the pancreatic juice of patients with suspected pancreatic disease. Cancer Research. 66 (2), 1208-1217 (2006).
- Cote, G. A., et al. A pilot study to develop a diagnostic test for pancreatic ductal adenocarcinoma based on differential expression of select miRNA in plasma and bile. The American Journal of Gastroenterology. 109 (12), 1942-1952 (2014).
- Yu, J., et al. Digital next-generation sequencing identifies low-abundance mutations in pancreatic juice samples collected from the duodenum of patients with pancreatic cancer and intraductal papillary mucinous neoplasms. Gut. , (2016).
- Wiig, H., Swartz, M. A. Interstitial fluid and lymph formation and transport: physiological regulation and roles in inflammation and cancer. Physiological Reviews. 92 (3), 1005-1060 (2012).
- Haslene-Hox, H., et al. A new method for isolation of interstitial fluid from human solid tumors applied to proteomic analysis of ovarian carcinoma tissue. PLoS One. 6 (4), 19217 (2011).
- Zhang, J., et al. In-depth proteomic analysis of tissue interstitial fluid for hepatocellular carcinoma serum biomarker discovery. British Journal of Cancer. 117 (11), 1676-1684 (2017).
- Sullivan, M. R., et al. Quantification of microenvironmental metabolites in murine cancers reveals determinants of tumor nutrient availability. Elife. 8, (2019).
- Matas-Nadal, C., et al. Evaluation of Tumor Interstitial Fluid-Extraction Methods for Proteome Analysis: Comparison of Biopsy Elution versus Centrifugation. Journal of Proteome Research. 19 (7), 2598-2605 (2020).
- Espinoza, J. A., et al. Cytokine profiling of tumor interstitial fluid of the breast and its relationship with lymphocyte infiltration and clinicopathological characteristics. Oncoimmunology. 5 (12), 1248015 (2016).
- Halvorsen, A. R., et al. Profiling of microRNAs in tumor interstitial fluid of breast tumors - a novel resource to identify biomarkers for prognostic classification and detection of cancer. Molecular Oncology. 11 (2), 220-234 (2017).
- Yang, S., Huang, C. M. Recent advances in protein profiling of tissues and tissue fluids. Expert Review of Proteomics. 4, 515-529 (2007).
- Huang, C. M., et al. Mass spectrometric proteomics profiles of in vivo tumor secretomes: capillary ultrafiltration sampling of regressive tumor masses. Proteomics. 6 (22), 6107-6116 (2006).
- Leegsma-Vogt, G., Janle, E., Ash, S. R., Venema, K., Korf, J. Utilization of in vivo ultrafiltration in biomedical research and clinical applications. Life Sciences. 73 (16), 2005-2018 (2003).
- Schneiderheinze, J. M., Hogan, B. L. Selective in vivo and in vitro sampling of proteins using miniature ultrafiltration sampling probes. Analytical Chemistry. 68 (21), 3758-3762 (1996).
- Hardt, M., Lam, D. K., Dolan, J. C., Schmidt, B. L. Surveying proteolytic processes in human cancer microenvironments by microdialysis and activity-based mass spectrometry. Proteomics Clinical Applications. 5 (11-12), 636-643 (2011).
- Xu, B. J., et al. Microdialysis combined with proteomics for protein identification in breast tumor microenvironment in vivo. Cancer Microenvironment. 4 (1), 61-71 (2010).
- Bendrik, C., Dabrosin, C. Estradiol increases IL-8 secretion of normal human breast tissue and breast cancer in vivo. The Journal of Immunology. 182 (1), 371-378 (2009).
- Ao, X., Stenken, J. A. Microdialysis sampling of cytokines. Methods. 38 (4), 331-341 (2006).
- Ho, P. C., et al. Phosphoenolpyruvate Is a Metabolic Checkpoint of Anti-tumor T Cell Responses. Cell. 162 (6), 1217-1228 (2015).
- Choi, J., et al. Intraperitoneal immunotherapy for metastatic ovarian carcinoma: Resistance of intratumoral collagen to antibody penetration. Clinical Cancer Research. 12 (6), 1906-1912 (2006).
- Wiig, H., Aukland, K., Tenstad, O. Isolation of interstitial fluid from rat mammary tumors by a centrifugation method. The American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 284 (1), 416-424 (2003).
- Li, S., Wang, R., Zhang, M., Wang, L., Cheng, S. Proteomic analysis of non-small cell lung cancer tissue interstitial fluids. World Journal of Surgical Oncology. 11, 173 (2013).
- Fijneman, R. J., et al. Proximal fluid proteome profiling of mouse colon tumors reveals biomarkers for early diagnosis of human colorectal cancer. Clinical Cancer Research. 18 (9), 2613-2624 (2012).
- Teng, P. N., Hood, B. L., Sun, M., Dhir, R., Conrads, T. P. Differential proteomic analysis of renal cell carcinoma tissue interstitial fluid. Journal of Proteome Research. 10 (3), 1333-1342 (2011).
- Turtoi, A., et al. Novel comprehensive approach for accessible biomarker identification and absolute quantification from precious human tissues. Journal of Proteome Research. 10 (7), 3160-3182 (2011).
- Wagner, M., Wiig, H. Tumor Interstitial Fluid Formation, Characterization, and Clinical Implications. Frontiers in Oncology. 5, 115 (2015).
- Haslene-Hox, H., Tenstad, O., Wiig, H. Interstitial fluid-a reflection of the tumor cell microenvironment and secretome. Biochimica Biophysica Acta. 1834 (11), 2336-2346 (2013).
- Hsieh, S. Y., et al. Secreted ERBB3 isoforms are serum markers for early hepatoma in patients with chronic hepatitis and cirrhosis. Journal of Proteome Research. 10, 4715-4724 (2011).
- Sun, W., et al. Characterization of the liver tissue interstitial fluid (TIF) proteome indicates potential for application in liver disease biomarker discovery. Journal of Proteome Research. 9 (2), 1020-1031 (2010).
- Haslene-Hox, H., et al. Increased WD-repeat containing protein 1 in interstitial fluid from ovarian carcinomas shown by comparative proteomic analysis of malignant and healthy gynecological tissue. Biochimica Biophysica Acta. 1834 (11), 2347-2359 (2013).
- Wang, T. H., et al. Stress-induced phosphoprotein 1 as a secreted biomarker for human ovarian cancer promotes cancer cell proliferation. Molecular & Cellular Proteomics. 9, 1873-1884 (2010).
- Gromov, P., et al. Up-regulated proteins in the fluid bathing the tumour cell microenvironment as potential serological markers for early detection of cancer of the breast. Molecular Oncology. 4 (1), 65-89 (2010).
