Während Replikationsgabelkollisionen mit DNA-Addukten Doppelstrangbrüche induzieren können, ist über die Interaktion zwischen Replisomen und blockierenden Läsionen weniger bekannt. Wir haben den Proximity-Ligations-Assay verwendet, um diese Begegnungen zu visualisieren und die Konsequenzen für die Replisomenzusammensetzung zu charakterisieren.
Es gibt einen beträchtlichen Einblick in die zelluläre Reaktion auf Doppelstrangbrüche (DSBs), die durch Nukleasen, Strahlung und andere DNA-Brecher induziert werden. Dies spiegelt zum Teil die Verfügbarkeit von Methoden zur Identifizierung von Bruchstellen und zur Charakterisierung von Faktoren wider, die an diesen Sequenzen an DSBs rekrutiert werden. DSBs treten jedoch auch als Zwischenprodukte bei der Verarbeitung von DNA-Addukten auf, die von Verbindungen gebildet werden, die keine direkten Brüche verursachen und nicht an bestimmten Sequenzstellen reagieren. Folglich sind für die meisten dieser Wirkstoffe Technologien, die die Analyse von Bindungsinteraktionen mit Reaktionsfaktoren und Reparaturproteinen ermöglichen, unbekannt. Zum Beispiel können DNA-Interstrangvernetzungen (ICLs) Brüche nach Begegnungen mit Replikationsgabeln hervorrufen. Obwohl sie aus Medikamenten bestehen, die häufig als Chemotherapeutika für Krebs verwendet werden, gibt es bisher keine Methodik zur Überwachung ihrer Wechselwirkungen mit Replikationsproteinen.
In dieser Arbeit beschreiben wir unsere Strategie, um die zelluläre Reaktion auf Gabelkollisionen mit diesen herausfordernden Addukten zu verfolgen. Wir haben ein Steroidantigen mit Psoralen verknüpft, das Photoaktivierungs-abhängige ICLs in Zellkernen lebender Zellen bildet. Die ICLs wurden mittels Immunfluoreszenz gegen den Antigen-Tag sichtbar gemacht. Der Tag kann auch ein Partner im Proximity-Ligation-Assay (PLA) sein, der die enge Assoziation zweier Antigene meldet. Die PLA wurde ausgenutzt, um Proteine, die eng mit den markierten ICLs assoziiert waren, von solchen zu unterscheiden, die dies nicht waren. Es war möglich, Replisome-Proteine zu definieren, die nach Begegnungen mit ICLs zurückblieben, und andere, die verloren gingen, zu identifizieren. Dieser Ansatz ist auf jede Struktur oder jedes DNA-Addukt anwendbar, das immunologisch nachgewiesen werden kann.
Die zelluläre Reaktion auf Doppelstrangbrüche ist dank einer Reihe von immer leistungsfähigeren Methoden zur Lenkung von Brüchen an bestimmte genomische Stellen gut dokumentiert 1,2,3. Die Lokalisationssicherheit ermöglicht eine eindeutige Charakterisierung von Proteinen und anderen Faktoren, die sich an der Stelle ansammeln und an der DNA-Schadensantwort (DDR) beteiligt sind, wodurch die nicht-homologe Endverknüpfung (NHEJ) und die homologe Rekombination (HR) angesteuert werden, die Brüche reparieren. Natürlich werden viele Brüche durch Agenzien wie Strahlung und chemische Spezies verursacht, die bestimmte Sequenzen nicht angreifen4. Für diese stehen jedoch Verfahren zur Verfügung, mit denen die Enden in Strukturen umgewandelt werden können, die für das Tagging und die Lokalisierung geeignetsind 5,6. Brüche werden auch durch biologische Prozesse, wie z. B. die Umlagerung von Immunglobulinen, eingeführt, und neuere Technologien ermöglichen ihre Lokalisierung sowie7. Die Beziehung zwischen den reagierenden Faktoren und diesen Stellen kann dann bestimmt werden.
Brüche treten auch als indirekte Folge von Addukten auf, die von Verbindungen gebildet werden, die keine inhärenten Brecher sind, aber DNA-Transaktionen wie Transkription und Replikation stören. Sie können als Merkmal der zellulären Reaktion auf diese Obstruktionen gebildet werden, vielleicht während der Reparatur oder weil sie eine Struktur provozieren, die anfällig für Nukleaseangriffe ist. Typischerweise ist die physikalische Beziehung zwischen dem Addukt, dem Bruch und der Assoziation mit antwortenden Faktoren inferenzlich. Zum Beispiel werden ICLs durch Chemotherapeutika wie Cisplatin und MitomycinC8 und als Reaktionsprodukt von abasischen Stellen9 gebildet. ICLs sind als potente Blöcke für Replikationsgabeln10 bekannt, wodurch Gabeln, die durch Nukleasen11 gespalten werden können, blockiert werden. Die kovalente Bindung zwischen den Strängen wird oft durch Signalwege erleichtert, die obligate Brüche als Zwischenprodukteaufweisen 12,13, was eine homologe Rekombination erfordert, um die Replikationsgabel 14 wieder aufzubauen. In den meisten Experimenten verfolgt der Forscher die Reaktion von interessierenden Faktoren auf die Brüche, die stromabwärts der Kollision einer Replikationsgabel mit einer ICL gebildet werden. Da es jedoch keine Technologie zur Lokalisierung einer provokativen Läsion gibt, kann die Nähe des Replisoms und seiner Bestandteile zum ICL nur vermutet werden.
Wir haben eine Strategie entwickelt, die die Analyse von Proteinassoziationen mit nicht-sequenzspezifischen kovalenten Addukten ermöglicht, die hier anhand von ICLs dargestellt werden. In unser System werden diese durch Psoralen eingeführt, ein photoaktives Naturprodukt, das seit Tausenden von Jahren als Therapeutikum bei Hauterkrankungen verwendetwird 15. Unser Ansatz basiert auf zwei wichtigen Merkmalen von Psoralens. Die erste ist ihre hohe Frequenz der Vernetzungsbildung, die 90 % der Addukte überschreiten kann, im Gegensatz zu den weniger als 10 %, die von beliebten Verbindungen wie Cisplatin oder Mitomycin C 8,16 gebildet werden. Die zweite ist die Zugänglichkeit der Verbindung zur Konjugation ohne Verlust der Vernetzungskapazität. Wir haben Trimethylpsoralen kovalent mit Digoxigenin (Dig), einem seit langem etablierten Immuntag, verknüpft. Dies ermöglicht den Nachweis der Psoralen-Addukte in genomischer DNA durch Immunfärbung des Dig-Tags und die Visualisierung durch konventionelle Immunfluoreszenz17.
Dieses Reagenz wurde in unserer früheren Arbeit zur Analyse von Replikationsgabelbegegnungen mit ICLs unter Verwendung eines DNA-Faser-basierten Assays eingesetzt16. In dieser Arbeit fanden wir heraus, dass die Replikation über eine intakte ICL hinaus fortgesetzt werden kann. Dies war abhängig von der ATR-Kinase, die durch Replikationsstress aktiviert wird. Der Neustart der Replikation war angesichts der Struktur der replikativen CMG-Helikase unerwartet. Dieser besteht aus dem MCM-Hetero-Hexamer (M), das einen versetzten Gap-Ring um den Templat-Strang für die Leitstrangsynthese bildet, der von den Proteinen des GINS-Komplexes (G, bestehend aus PSF1, 2, 3 und SLD5) und CDC45 (C)18 eingeschlossen wird. Der Vorschlag, dass die Replikation auf der Seite der ICL distal zur Seite der Replisomkollision neu gestartet werden könnte, sprach für eine Änderung der Struktur des Replisoms. Um der Frage nachzugehen, welche Komponenten zum Zeitpunkt der Begegnung mit einer ICL im Replikom waren, haben wir den hier beschriebenen Ansatz entwickelt. Wir nutzten den Dig-Tag als Partner in Proximity-Ligation-Assays (PLA)19 , um die enge Assoziation der ICL mit Proteinen des Replisoms20 zu untersuchen.
Obwohl die PLA eine sehr leistungsfähige Technik ist, gibt es technische Bedenken, die gelöst werden müssen, um klare und reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Die Antikörper müssen eine hohe Affinität und Spezifität aufweisen. Darüber hinaus ist es wichtig, die unspezifischen Hintergrundsignale so weit wie möglich zu reduzieren. Wir haben festgestellt, dass Membranen und Zelltrümmer zum Hintergrund beitragen, und wir haben sie so weit wie möglich entfernt. Das Waschen mit Waschmittel, das Puffer enthält, v…
The authors have nothing to disclose.
Diese Forschung wurde zum Teil durch das Intramural Research Program des NIH, National Institute on Aging, USA, unterstützt (Z01-AG000746–08). J.H. wird von den National Natural Science Foundations of China (21708007 und 31871365 unterstützt.
Alexa Fluor 568, Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody | Invitrogen | A-10011 | 1 in 1000 |
35 mm plates with glass 1.5 coverslip | MatTek | P35-1.5-14-C | Glass Bottom Microwell Dishes 35mm Petri Dish Microwell |
Alexa Fluor 488,Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody | Invitrogen | A-10001 | 1 in 1000 |
Bovine serum albumin (BSA) | SeraCare | 1900-0012 | Blocking solution, reagents need to be stored at 4 °C |
CDC45 antibody (rabbit) | Abcam | ab126762 | 1 in 200 |
Cell adhesive | Life Science | 354240 | for cell-TAK solution |
Confocal microscope | Nikkon | Nikon TE2000 spinning disk microscope | equiped with Volocity software |
Digoxigenin (Dig) antibody (mouse) | Abcam | ab420 | 1 in 200 |
Dig-TMP | synthesized in the Seidman Lab | ||
Duolink Amplification reagents (5×) | Sigma-Aldrich | DUO82010 | reagents need to be stored at -20 °C |
Duolink in situ detection reagents | Sigma-Aldrich | DUO92007 | reagents need to be stored at -20 °C |
Duolink in situ oligonucleotide PLA probe MINUS | Sigma-Aldrich | DUO92004 | anti-mouse MINUS, reagents need to be stored at 4 °C |
Duolink in situ oligonucleotide PLA probe PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | anti-rabbit PLUS, reagents need to be stored at 4 °C |
Duolink in situ wash buffer A | Sigma-Aldrich | DUO82046 | Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 °C |
Duolink in situ wash buffer B | Sigma-Aldrich | DUO82048 | Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 °C |
epifluorescent microscope | Zeiss | Axiovert 200M microscope | Equipped with the Axio Vision software packages (Zeiss, Germany) |
Formaldehyde 16% | Fisher Scientific | PI28906 | for fix solution |
Goat serum | Thermo | 31873 | Blocking solution, reagents need to be stored at 4 °C |
Image analysis software | open source | Cell profiler | works for analysis of single plane images |
Image analysis software-license required | Bitplane | Imaris | Cell Biology module needed. Can quantify PLA dots/nuclei in image stacks (3D) and do 3D reconstructions |
Ligase (1 unit/μl) | Sigma-Aldrich | DUO82029 | reagents need to be stored at -20 °C |
Ligation reagent (5×) | Sigma-Aldrich | DUO82009 | reagents need to be stored at -20 °C |
MCM2 antibody (rabbit) | Abcam | ab4461 | 1 in 200 |
MCM5 antibody (rabbit monoclonal) | Abcam | Ab75975 | 1 in 1000 |
Methanol | Lab ALLEY | A2076 | pre-cold at -20°C before use |
phosphoMCM2S108 antibody (rabbit) | Abcam | ab109271 | 1 in 200 |
Polymerase (10 unit/μl) | Sigma-Aldrich | DUO82030 | reagents need to be stored at -20 °C |
Prolong gold mounting media with DAPI | ThermoFisher Scientific | P36935 | |
PSF1 antibody (rabbit) | Abcam | ab181112 | 1 in 200 |
RNAse A 100 mg/ml | Qiagen | 19101 | reagents need to be stored at 4 °C |
Statistical analysis and data visualization software | open source | R studio | ggplot2 package for generation of dot plot and box plots |
Statistical analysis and data visualization software-license required | Systat Software | Sigmaplot V13 | |
TMP (trioxalen) | Sigma-Aldrich | T6137_1G | |
TritonX-100 | Sigma-Aldrich | T8787_250ML | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416_100ML | |
UV box | Southern New England Ultraviolet | Discontinued. See Opsytec UV test chamber as a possible replacement | |
UV test Chamber | Opsytec | UV TEST CHAMBER BS-04 | |
VE-821 | Selleckchem | S8007 | final concentrtion is 1µM |