Summary
כאן אנו מתארים מתודולוגיית הקרנה מהירה וישירה vivo CRISPR /Cas9 באמצעות אולטרסאונד מונחה זריקות lentiviral עוברי הרחם כדי להעריך בו זמנית פונקציות של מספר גנים בעור וחלל הפה של עכברים immunocompetent.
Abstract
מודלים של עכברים מהונדסים גנטית (GEMM) סייעו בהערכת תפקוד הגנים, מידול מחלות אנושיות, ושימשו מודל פרה-קולינרי להערכת אפיקים טיפוליים. עם זאת, האופי עתיר הזמן, העבודה והעלות שלהם מגביל את התועלת שלהם לניתוח שיטתי של תפקוד הגנים. ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיות לעריכת גנום מתגברת על מגבלות אלה ומאפשרת יצירה מהירה של הפרעות גנים ספציפיות ישירות בתוך איברי עכבר ספציפיים באופן מרובה פיקסלים ומהיר. כאן, אנו מתארים שיטה מבוססת CRISPR /Cas9 (מקובצים באופן קבוע Interspaced קצר Palindromic חוזר) כדי ליצור אלפי שיבוטים נוקאאוט גנים בתוך האפיתל של העור חלל הפה של עכברים, ולספק פרוטוקול המפרט את השלבים הדרושים כדי לבצע מסך ישיר vivo CRISPR עבור גנים מדכאי גידול. גישה זו יכולה להיות מיושמת על איברים אחרים או טכנולוגיות CRISPR/Cas9 אחרות כגון CRISPR-הפעלה או CRISPR-inactivation ללמוד את הפונקציה הביולוגית של גנים במהלך הומאוסטזיס רקמה או בהגדרות מחלה שונות.
Introduction
אחד האתגרים בחקר הסרטן בעידן הפוסט-גנומי הוא לכרות את הכמות העצומה של נתוני הגנום עבור מוטציות גנטיות סיבתיות ולזהות צמתים ברשת הגנים שניתן לסמן אותם כמטרה טיפולית. בעוד ניתוחים ביואינפורמטיים סייעו מאוד לקראת מטרות אלה, הקמת מודלים יעילים במבחנה וב-vivo היא תנאי מוקדם לפענוח המורכבות של מערכות ביולוגיות ומדינות מחלה ולאפשר פיתוח תרופות. בעוד מודלים קונבנציונליים של עכבר מהונדס שימשו בהרחבה למחקרים גנטיים של סרטן vivo, האופי שלהם עלות, זמן- ועבודה אינטנסיבית אסרה במידה רבה על ניתוח שיטתי של מאות גנים סרטניים putative נפרם על ידי גנומיקה מודרנית. כדי להתגבר על צוואר בקבוק זה, שילבנו אולטרסאונד הוקמה בעבר מונחה במתודולוגיית הזרקת הרחם1,2 עם CRISPR / Cas9 (מקובצים באופן קבוע Interspaced קצר Palindromic חוזר) טכנולוגיית עריכתגנים 3 בו זמנית לגרום וללמוד מוטציות אובדן תפקוד של מאות גנים בעור חלל הפה של עכבר אחד.
המתודולוגיה המתוארת כאן משתמשת בזריקות מונחות אולטרסאונד של lentiviruses מהונדסים לתוך חלל מי השפיר של עוברי עכבר חיים ביום העוברי E9.5. המטען העדני המכיל רכיבי CRISPR/Cas9 מתמר את האקטודרם בעל השכבות היחידות, אשר מאוחר יותר מעורר את האפיתל של העור וחלל הפה. העור מורכב מאפידרמיס חיצוני, ואחריו קרום מרתף ודרמיס. אפידרמיס הוא אפיתל מרובד המורכב משכבה פנימית בסיסית, השומרת על קשר עם קרום המרתף ויש לה יכולת רבייה ותא גזע. שכבת הבסיס מעוררת את השכבות המובחנות לעיל כגון שכבות קרנית ספיניות, פרטניות ושכבות2,4. מחקרי מעקב שושלת מראים כי שיטה ישירה זו ב- vivo CRISPR/Cas9 מבצעת מניפולציה גנטית בתאי גזע שוכני רקמות בתוך שכבת הבסיס הנמשכת לאורך כל הבגרות. כמו lentivirus ניתן titrated כדי לתמר את E9.5 פני השטח ectoderm בצפיפות שיבוט, שיטה זו יכולה לשמש כדי ליצור עכברי פסיפס מחסה אלפי שיבוטים נוק אאוט גן דיסקרטי. לאחר מכן ניתן להשתמש ברצף הדור הבא כדי לנתח את ההשפעה של אבלציה של גנים בתיווך CRISPR/Cas9 בתוך שיבוטים אלה באופן מרובה ערכים5.
לאחרונה השתמשנו בשיטה זו כדי להעריך את הפונקציה של 484 גנים המראים מוטציות חוזרות ונשנות בקרצינומה של תאי קשקש הראש והצוואר האנושיים (HNSCC)5. HNSCC הוא סרטן הרסני עם שיעור תמותה גבוה של 40-50% וזה הסרטןהשישי בשכיחותו בעולם6. HNSCC להתעורר רירית רירית של דרכי הנשימה העליונות או חלל הפה קשורים עם צריכת טבק ואלכוהול או זיהום וירוס הפפילומה האנושי (HPV). קרצינומה של תאי קשקש עוריים (SCC) הם גידולים בעור ומייצגים את הסרטן השני בשכיחותו בבני אדם7. SCC עורית ו HNSCC דומים מאוד מבחינה היסטולוגית מולקולרית, עם אחוז גבוה של מקרים המציגים שינוי TP53, PIK3CA, NOTCH1, ו HRAS8. אמנם יש רק קומץ גנים שעברו מוטציה בתדירות גבוהה, אך ישנם מאות גנים שנמצאו שעברו מוטציה בתדירות נמוכה (< 5%), תופעה הידועה בכינויה התפלגות הזנב הארוך. מכיוון שרוב הגנים ארוכי הזנב חסרים אימות ביולוגי או קליני, השתמשנו בטכנולוגיית ההקרנה in vivo CRISPR זו כדי מודל של אובדן תפקוד של גנים אלה בעכברים נוטים לגידולים עם מוטציות רגישות ב- p53, Pik3ca או Hras וזיהינו מספר גנים מדכאי גידולים חדשניים המשתפים פעולה עם p53, Pik3ca או Hras כדי לעורר התפתחות הגידול5.
כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט כדי ליצור ספריות sgRNA lentiviral CRISPR sgRNA מרובות ולבצע CRISPR / Cas9 גנים לדפוק את המסכים באקטודרם משטח העכבר. שים לב, מתודולוגיה זו יכולה להיות מותאמת לשלב טכנולוגיות אחרות מניפולציה גנים כגון הפעלת CRISPR (CRISPRa) ו CRISPR איון (CRISPRi) או שונה כדי למקד מערכות איברים אחרות בעכבר ללמוד פונקציות גנים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול זה אושר ובוצע בהתאם ל- IACUC של אוניברסיטת טורונטו.
1. עיצוב ושיבוט של ספריות CRISPR במאגר
- בחר 4-5 sgRNAs המכוונים לגנים של עכברים בעלי עניין ממשאבים כגון מעצב sgRNA של המכון הרחב (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design) או שרת CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no). בחר מספר שווה של sgRNAs שאינם מיקוד מן למשל, Sanjana et al.9 כדי ליצור בגודל שווה שאינו מיקוד פקדים gRNA הספריה.
- בעת בניית ספריות sgRNA, ודא שיש כיסוי מספיק עבור כל sgRNA במערכת האיברים הממוקדת. עבור עור העכבר, האפידרמיס ב E9.5 היא שכבה אחת המכילה ~ 150,000 תאים, שרובם יש קיבולת תאי גזע4. אם התמרה עדנטי ויראלי תוצאות 15-20% זיהומיות, רק 18,000-24,000 תאים יועברו ב E9.5. התאם את קנה המידה של הניסוי בהתאם.
- לשיבוט והגברה של ספריות sgRNA אלה, הוסיפו אתרי הגבלת אנזימים של BsmBI וכן רצפי דנ"א מחייבים פריימר לסוף sgRNA בגובה 5 ו-3 אינץ' והזמינו את האוליגוס באורך מלא כשבב אוליגונוקלאוטיד(איור 1A).
- לספריות מרובות-ערכים שונות בשבב אחד, הוסף רצפי פריימר ספציפיים לספריה.
- באמצעות זוגות פריימר המתאימים, להגביר כל ספרייה בנפרד משבב אוליגו בריכה. בצינור PCR, לערבב 25 μL של 2x פולימראז מאסטר לערבב, 20 μL של DNase / RNase מים חינם, 5 ng של DNA שבב אוליגו, 2.5 μL של פריימר קדימה המתאים ו 2.5 μL של פריימר הפוך מתאים. השתמש 12-15 מחזורים להגביר עם 98 מעלות צלזיוס denaturation, חישול 63-67 מעלות צלזיוס, 72 °C (72 °F) הרחבת פרמטרים עבור כל מחזור במכונת PCR.
- הפעל מוצר PCR על ג'ל agarose 2.5% ולטהר ~ 100 bp PCR המוצר באמצעות ערכת ניקוי DNA ג'ל.
- הכינו את פלסמיד עמוד השדרה.
- תקציר 5 מיקרוגרם של Cre-recombinase המכיל pLKO-Cre ממולא v3 פלסמיד עם 2 μL של BsmBI ב 50 μL תגובה לערבב במשך 1 שעות ב 55 מעלות צלזיוס, ואחריו 1 μL של תפירה phosphatase אלקליין במשך 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס על פי הוראות היצרן.
הערה: Cre-recombinase המכיל pLKO-Cre ממולא v3 פלסמיד הוא פלסמיד מבוסס lenti-ויראלי המכיל אנזים Cre-recombinase כדי להסיר קלטת Lox-Stop-Lox בתאי עכבר ויש לו גם מקדם U6 כדי לנהוג הביטוי של sgRNA ו tracrRNA. גרסה עם Cas9 וללא Cas9 ניתן להשתמש וזמין על #158030 Addgene #158031. - הפעל את ה-DNA מתעכל על 1% ג'ל agarose ולטהר את הלהקה וקטור 7 kb ליניארי באמצעות ערכת ניקוי DNA ג'ל. שימו לב, רצועת ממולאים של 2 kb צריכה להיות גלויה גם היא ומצביעה על תקציר מוצלח.
- תקציר 5 מיקרוגרם של Cre-recombinase המכיל pLKO-Cre ממולא v3 פלסמיד עם 2 μL של BsmBI ב 50 μL תגובה לערבב במשך 1 שעות ב 55 מעלות צלזיוס, ואחריו 1 μL של תפירה phosphatase אלקליין במשך 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס על פי הוראות היצרן.
- הגדר את תגובת הקשירה כדי ליצור ספריית פלסמיד sgRNA.
- מערבבים 1 מיקרוגרם של וקטור מטוהר ו 30 ng של PCR מטוהרים להוסיף עם 2 μL של BsmBI, 5 μL של ליגאז DNA T4, 10 μM ATP ו 1x מאגר ספציפי BsmBI. דגירה תערובת קשירה לילה ב 37 °C (69 °F). השתמש בצינור נוסף המכיל את כל החומרים לעיל למעט תוספת PCR כפקד שלילי.
- למחרת בבוקר, לטהר את תערובת קשירה באמצעות ערכת ניקוי אוליגו ו elute ב 7 μL של מים חינם RNase / DNase.
- אלקטרופורט הספרייה לתאים מוסמכים.
- הוסף 2 μL של ספריית sgRNA eluted או תערובת קשירת בקרה שלילית ל 25 μL של תאים אלקטרו-תחרותיים מופשרים בקובטות מצוננות מראש (1.0 מ"מ) על קרח. אלקטרופורט בעקבות פרוטוקול היצרן (10 μF, 600 אוהם, 1800 וולט). כדי cuvette להוסיף 975 μL של מדיום התאוששות (או בינוני SOC) בתוך 10 s של הדופק.
- להעביר תאים electroporated לצינור תרבות דגירה במשך שעה ב 37 °C (69 °F) באינקובטור טלטול חיידקי ב 300 סל"ד.
- הערך את יעילות הטרנספורמציה ואת כיסוי הספרייה לכל sgRNA.
- הכן דילול פי 100 על ידי העברת 10 μL של תגובת הטרנספורמציה המכילה תאים electroporated עם ספריית sgRNA או קשירת שליטה שלילית ל 990 μL של התאוששות בינוני ומערבבים היטב.
- צלחת 10 μL של תערובת טרנספורמציה מדוללת על צלחת אגר 10 ס"מ מחממת מראש + אמפילין (100 מיקרוגרם / L). התוצאה היא דילול של פי 10,000 של המשתנים ולהשתמש בצלחת זו כדי לחשב את יעילות הטרנספורמציה. בצע דגירה של הצלחות ב 30 מעלות צלזיוס עבור 14-16 שעות.
- צלחת שאר תגובת השינוי על ידי הפצת 100 μL של תאים התאושש על כל צלחת של סך של 10 מראש מחומם LB + צלחות אגר ampicillin. דגירה הצלחות עבור 14-16 שעות ב 30 מעלות צלזיוס. שימו לב, צמיחה ב-30°C ממזערת את ההסתגרות בין שתי החזרות ארוכות הטווח בתוך הפלסמיד הנגיפי.
- כדי להעריך את הצלחת השיבוט, חשב את יעילות הטרנספורמציה. לספור את מספר המושבות על לוח הדילול המכיל transformants מספריית sgRNA או קשירת בקרה שלילית (10 ס"מ לוחות, שלב 1.8.2). תערובת שליטה שלילית לא צריכה להיות כל או רק מעט מאוד מושבות. כדי להשיג את המספר הכולל של המושבות, הכפל את מספר המושבות ב-10,000.
הערה: המספר הכולל של המושבות שנספר מייצג כיסוי ספריה שאמור להיות מינימום של מושבות 200x לכל sgRNA.- ודא שלספריה עם 2000 sgRNAs יהיו לפחות 400,000 מושבות. במקרה שאין מספיק מושבות, לחזור ולהגדיר יותר electroporation.
- בקרת איכות: מלוח הדילול, בחרו 20 מושבות והוסיפו כל מושבה לצינור תרבות בודד המכיל 3 מ"ל של מדיה LB + אפיקילין. דגירה כל 20 צינורות לילה ב 30 מעלות צלזיוס רועד ב 250 סל"ד. לטהר את ה-DNA פלסמיד באמצעות ערכת הכנה מיני על פי הוראות היצרן ורצף סנגר כל 20 דגימות DNA פלסמיד כדי לאמת כל דגימה יש רצף sgRNA שונה באמצעות פריימר U6 (5 '-GAG GGC CTA TTT CTT ATG ATG ATT CC-3').
- לקצור את המושבות מכל צלחת 15 ס"מ.
- הוסף 7 מ"ל של מדיום LB, ולאחר מכן לגרד את המושבות את צלחת LB אגר עם מפזר תאים. השתמש פיפטה 10 מ"ל להעביר את התאים לתוך בקבוק חרוט סטרילי 2 L. יש לחזור על הפעולה עבור כל הצלחות וחיידקי הבריכה בבקבוקון 2 L. דגירה הבקבוק במשך 2-3 שעות רועד ב 30 מעלות צלזיוס. צנטריפוגה התרבות ולאסוף את גלולה.
- לטהר דנ"א פלסמיד באמצעות ערכת טיהור מקסי-פלסמיד.
- בקרת איכות נוספת: השתמש ב- 1 ננוגרם של ספריית sgRNA בהכנה למקסי והפעל תגובת PCR באמצעות פריימרים לריצוף הדור הבא בהתאם להוראות היצרן. ניתן לאמת את הייצוג של כל sgRNAs בספריה על ידי פלטפורמת רצף עמוק.
2. ייצור של לנטיוירוס טיטר גבוה מתאים התמרכוציה vivo
הערה: בצע את כל השלבים בסעיף זה של הפרוטוקול במתקן BSL2+ בארון בטיחות ביולוגי מסוג A2 מסוג Class II. 293FT ובמיוחד תאי האריזה של 293NT מאפשרים ייצור וירוסים גבוה יותר. השתמש בתאי מעבר נמוך ( 3. ניתוח מונחה אולטרה קול והזרקה הערה: טכנולוגיה זו הותאמה מ4,11. Microinjection המיועד להעתקה של אפיתל פני השטח חייב להתבצע ביום העוברי E9.5, כאשר אקטודרם פני השטח מורכב משכבה אחת ולפני היווצרות של periderm החל מ- E10, אשר ימנע התמרה של שכבה בסיסית זו. רצוי להגדיר עכברים ביום שישי, כך היום הראשון האפשרי עם E9.5 עוברים הוא יום שני הבא. השתמשו בעכברי Rosa26-Lox-STOP-LOX-Cas9-GFP (מעבדת ג'קסון #024857) ליעילות אופטימלית של CRISPR/Cas912. 4. הליך רצף עמוק
הערה: השתמש תמיד בבקבוק DMEM שלא נפתח או נפתח לאחרונה עבור ה- transfection, מכיוון שה- pH בשלב זה הוא קריטי, ו- DMEM הופך לבסיסי יותר עם הזמן לאחר הפתיחה.
הערה: ההשעיה נגיפית וכתוצאה מכך צריך להניב ריכוז כ 2,000 פי ואת פתרון הנגיף וכתוצאה מכך צריך titer ויראלי של 107-109, וזה מספיק טוב עבור יותר מ 100 E9.5 ניתוחים המתוארים להלן.
הערה: השוואה בין ההשעיה הנגיפית המרוכזת עם ההשעיה הנגיפית הבלתי מעורערת שלה תאפשר להעריך את ההצלחה של (1) ייצור ויראלי כמו גם (2) ריכוז ויראלי. לחלופין, ניתן להעריך את הטיטר הוויראלי באמצעות שיטת qRT-PCR10. ייצור בקנה מידה גדול וריכוז של lentivirus יכול להתבצע גם באמצעות ריכוז דו שלבי עם ריכוז מחסנית ואחריו ultracentrifugation כפי שתואר קודםלכן 2.
הערה: לא יעלה על 30 דקות של הרדמה כמו סכרים בהריון נוטים הרבה יותר להפיל את העוברים שלהם מעבר לזמן זה. מנתח מנוסה יכול להזריק עד 12 עוברים בתוך 30 דקות ניתוח.
הערה: בעת ביצוע אולטרה-קול מונחה בניתוחי הרחם, יש לנקוט בזהירות מירבית כדי לשמור על סביבה נקייה, לשמור על עקרות ככל האפשר ולהימנע מכל מזהמים אפשריים. אם יותר מניתוח אחד חייב להיעשות באותו יום, חשוב לעקר את מכשירי הניתוח באמצעות מעקר חרוזים ולנקות מכשירים אחרים שנתקלים ברקמת עכבר מנוקה עם אתנול. זה מגדיל מאוד את ההישרדות הגבוהה יותר של העוברים לאחר הניתוח. שיעור ההישרדות של שיטת הניתוח המתוארת כאן הוא באופן עקבי בין 80-100%.
הערה: עכברים מזוהים בצורה הטובה ביותר באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עד יום לאחר הלידה 3 לפני השיער מתחיל לגדול.
הערה: חשוב ליצור דוגמת ייחוס כדי לאפשר חישוב שינויים בקיפול sgRNA לאורך זמן. עוברים שעברו עירוי 3 ימים לאחר ההדבקה או תאים שעברו חילוף (ראה שלב 2. 6) יכולים לשמש כמדגם הפניה לקביעת ייצוג sgRNA בספריה המקורית.
הערה: הגדר את תגובת PCR barcoding באזור ייעודי נפרד של המעבדה או מכסה המנוע של תרבית הרקמות כי הוא ניקה ביסודיות על ידי DNA למחוק כדי למנוע זיהום. הפעל שליטה שלילית עבור כל לוח PCR עם מים כתבנית כדי לוודא שאין זיהום.
הערה: שלב טרום ההגברה נדרש רק להגברה של רקמה טרנסיבית מורכבת. אם הגברה של גידול יחיד שככל הנראה התפתחה בצורת תא שיבוט ובכך מכילה רק sgRNA אחד, ניתן לדלג על PCR1 טרום הגברה ולהמשיך מיד עם PCR2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1A מציג את העיצוב של האוליגונוקלאוטידים עבור multiplexing מספר ספריות CRISPR מותאמות אישית באופן חסכוני בשבב אוליגו יחיד של 12k או 92k. לאחר בחירת sgRNAs (צבע כחול מקודד), האוליגונוקלאוטידים מעוצבים עם אתרי הגבלה (BsmBI בצבע כתום) וזוגות פריימר PCR ספציפיים לספריה (מקודדים בצבע ירוק). ניתן לעצב מספר ספריות באמצעות שילוב ייחודי של זוגות פריימר עבור multiplexing בשבב אוליגו יחיד. כאשר PCR מגביר את הספריות באמצעות זוג פריימר PCR ספציפי, תמיד לכלול שליטה שלילית מים בלבד ולהפעיל את כל התגובות על ג'ל agarose. לנתיב הבקרה השלילי לא אמורות להיות רצועות במהירות של 100 bp, בעוד שלנתיב המוגבר של הספרייה צריכה להיות רצועה אחת של 100 bp. אם אין רצועה, ודא שצמד פריימר PCR נבחר כראוי. איור 1B מציג את שלב בקרת האיכות של הספרייה המשובטת ואת הליך הייצור והריכוז הוויראלי. יש לנקוט זהירות כדי לשמר את הייצוג השווה של sgRNAs מ שיבוט עד התמרה. הדור הבא של קריאות רצף של PCR מוגברת DNA מן פלסמיד ותאים transduced הספרייה lenti-ויראלי צריך להראות מתאם גבוה. כל סטייה יש לנתח בזהירות כדי לבחון אם הייצוג הולך לאיבוד לפני או אחרי הכנת lenti-וירוס. אם sgRNA קורא DNA פלסמיד אינם מראים ייצוג שווה של sgRNAs, אז הכנה ויראלית הליך ריכוז חייב לחזור בזהירות. אם אובדן ייצוג sgRNA שווה התרחש ב- DNA פלסמיד, אז הליך השיבוט כולו חייב לחזור על עצמו כולל הגברה PCR של ספריות משבב אוליגו עם מחזורי הגברה מופחתת. ההצלחה של הקרנת ספריית CRISPR תלויה באופן קריטי בייצוג שווה של sgRNAs הקיימים בספריה.
איור 2 מציג את הזרקת המיקרו מונחית האולטרסאונד שהוגדרה למניפולציה בעוברים E9.5 בעכבר בהריון. ההגדרה כולה ממוקמת תחת ארון ברמה biosafety מחלקה II כדי לשמור על המצב הסטרילי של ההליך כולו, כדי למנוע כל זיהום של העכבר ההרה עקב הליכים כירורגיים. יש להקפיד להימנע מלחיצה על קרני הרחם בזמן ההזרקה. המחט חייבת להיות חדה מאוד, כך הפצע על קיר הרחם ואת קרום מי השפיר הוא מינימלי.
איור 3 מציג את התוצאות של הזרקה מודרכת אולטרה-קולית של לנטי-וירוס הנושאת Cre-recombinase ב- E9.5 Lox-stop-Lox (LSL) גורי עכבר קונפטי ביום שלאחר הלידה (P)0. טיטר ויראלי יכול להיות מותאם כדי לקבל כיסוי התמרה מתאים של האפידרמיס. בעוד titer גבוה של וירוס יגרום כיסוי גדול יותר של עור העכבר, זה גם יגרום טרנסדוקציה של sgRNAs מרובים לאותו תא פוטנציאל לבלבל את התוצאות. כדי להפחית התמרנויות מרובות של תא בודד, יש לשמור את שיעור ההדבקה <20%.
איור 4 מציג קריאות רצף מהדור הבא של PCR דנ"א מוגבר מספרייה פלסמיד ולנטי ויראלית שעברו חילוף תאים וקורא גם מ-4 גידולים מייצגים. מדריכי sgRNA המכוונים Adam10 ו Ripk4 מועשרים בדגימות הגידול (משולשים ויהלומים) לעומת מצגת sgRNA בבריכת פלסמיד או תאים נגועים. Adam10 ו Ripk4 מתפקדים כמדכאיגידולים 5. כמה מאות גידולים יכולים להיות מולטיפלקסים על ידי הקצאת ברקודים ייחודיים לכל מדגם ורצף עמוק כמתואר בפרוטוקול.
איור 1: שיבוט ספריית CRISPR ייעודית. (A) סכמטי המייצג את העיצוב של אוליגונוקלאוטידים עבור שבב אוליגו מותאם אישית 12 k או 92 k. אתרי הגבלה של BsmBI (או אתרי הגבלה תואמים אחרים) (צבע כתום מקודד ומודגש בקו תחתון) נוספו בכל צד של הסגנ"א. ראשי החצים מציינים את אתר החתך של BsmBI. עבור כל ספריה, נוספו זוג פריימרים ייחודיים של PCR (בצבע ירוק, חום וסגול מקודדים), כך שניתן יהיה להגביר אותו במיוחד באמצעות PCR מהשבב במאגר. מספר ספריות מותאמות אישית ניתן להכפיל עד 12k או 92k אוליגוס. (B) גרף המציג ייצוג sgRNA מספריית CRISPR ב- DNA פלסמיד לעומת DNA מתאים שעברו עיון עם אותה ספרייה lentiviral. כל נקודה מייצגת קו עזר. ייצוג מלא נשמר לאחר התמרה עם מתאם כלשהו בשפע. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תמונה של מערך המיקרו-שינג מונחה האולטרסאונד. (A)עכבר נושא E9.5 עוברים היה מורדם והונח על פלטפורמה מחוממת עם הרחם חשוף בתא צלחת פטרי שונה PBS (התייצב על ידי ארבעה חימר דוגמנות). הגומי הכחול בחצי הסיבוב תמך ברחם המכיל עוברים ומחט ההזרקה מהמיקרו-יין ממוקמת בצד ימין. ראש סריקת אולטרסאונד היה מותקן על החלק העליון העברת תמונה חיה למוניטור מאחורי עם ראש מחט גלוי. (B)תקריב של עובר E9.5. ספרייה Lentiviral הוזרק עם המחט (לראות בצד ימין) לתוך חלל מי השפיר. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: התמרה מוצלחת של אפיתל פני השטח בעכבר. תמונות פלואורסצנטיות של כל הגוף, חלל הפה, הלשון והחך של עכברי LSL-קונפטי שזה עתה נולדו שעברו עיקול עם קר לנסטיוירוס (מפרצון: תמונות אור לבן תואמות). סרגלי קנה מידה = 500 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: רצף עמוק של דגימות גידול. גרף המציג ייצוג sgRNA מספריית CRISPR ב- DNA פלסמיד לעומת DNA מתאים transduced עם אותה ספרייה lentiviral ובנוסף קריאות מ 4 גידולים מייצגים. העיגולים האדומים והירוקים מציינים את מספר הקריאות של Adam10 ו- Ripk4 sgRNA בספרייה ובתאים שעברו חילוף ואילו המשולש האדום מייצג את הקריאות של Adam10 sgRNAs והיהלום הירוק מייצג קריאות של Ripk4 sgRNAs המזוהים בגידולים מעכברי HNSCC נפרדים המראים העשרה בקיפול 1000x. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
פריימר קדימה PCR1 | גאגג'קאטאטקטקטאקאטק |
PCR1 הפוך פריימר | קאאקאקאגגקטגקטגקטגאגא |
טבלה 1: פריימרים לתגובת PCR1. פריימרים קדימה והפוך המשמשים להגברת האזור המקיף קלטת sgRNA מדנ"א גנומי של תאים המועברים עם נגיף הלנטי.
צעד | טמפרטורה | זמן | |
1 | 98 °C (69 °F) | 30 שניות | |
2 | 98 °C (69 °F) | 10 שניות | |
3 | 66 °C (66 °F) | 30 שניות | |
4 | 72 °C (69 °F) | 15 שניות | 15 מחזורים (שלב 2-4) |
5 | 72 °C (69 °F) | 2 דקות | |
6 | 4 °C (69 °F) | אחז |
טבלה 2: פרמטרי מחזור PCR1. תנאי PCR המשמשים להגברת האזור המקיף את קלטת sgRNA מדנ"א גנומי של תאים שעברו טרנספר עם נגיף הלנטי.
501 FW | אטגאטאקגגגאגגאגאטקטאקטטקטטקטקטקטקג'קה-ג'י ACGCTCTTCCTCTtgtggaאגאגאאקהCCG |
||
701 קרוואנים | קאגאגאגאגאגאטגאטגטגטגאגאטקטגאטקגגאטקג'יגה-גטגקט CTTCג'קאטקטגקטאטגטקטטאק |
||
* הבסיסים בקו תחתון מציינים את Illumina (D501-510 עבור קדימה D701-712 עבור הפוך) מיקום ברקוד ששימשו עבור multiplexing. | |||
* בסיסים בצבע אדום מציינים את הרצף שנקשר לאתר היעד בפלסמיד CRISPR lentiviral. אזור זה ניתן לשנות על פי וקטור lentiviral בשימוש. |
טבלה 3: פריימרים מקודדים לתגובת PCR2. פריימרים המשמשים לברקוד להגביר כל דגימת גידול (או ישירות מן ה-DNA הגנומי או באמצעות המוצרים מ PCR1 כתבנית). האזור עם הקו התחתון מציין את אזור הברקוד הייחודי שניתן להקצות עבור כל דגימה עבור multiplexing בתגובת רצף עמוקה. זוגות הבסיס בצבע אדום מציינים את אזור היעד במבנה הלנטי-ויראלי שפריימריז אלה קושרים. אזור יעד זה ניתן לשנות בהתאם לסוג של מבנה lentiviral בשימוש.
צעד | טמפרטורה | זמן | |
1 | 98 °C (69 °F) | 30 שניות | |
2 | 98 °C (69 °F) | 10 שניות | |
3 | 68 °C (68 °F) | 30 שניות | |
4 | 72 °C (69 °F) | 15 שניות | 10 מחזורים (שלב 2-4) |
5 | 72 °C (69 °F) | 2 דקות | |
6 | 4 °C (69 °F) | אחז |
טבלה 4: פרמטרי מחזור PCR2. תנאי PCR המשמשים ברקוד להגביר כל דגימת גידול (או ישירות מן ה-DNA הגנומי או באמצעות המוצרים מ PCR1 כתבנית).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
עריכת הגנום CRISPR/Cas9 הייתה בשימוש נרחב במחקרי הפריה חוץ גופית וב-vivo כדי לחקור תפקודי גנים ותהליכים תאיים. רוב מחקרי vivo משתמשים בתאים ערוכים בגן CRISPR/Cas9 המושתלים במודל של בעלי חיים (allograft או xenograft). אמנם זהו כלי רב עוצמה לחקר גנטיקה סרטן ותפקודים הסלולר, זה עדיין חסר microenvironment רקמה מקורית ועלול לעורר פצעים ו / או תגובות חיסוניות.
כדי להתגבר על אתגרים אלה, מספר קבוצות חלוץ ישיר בגישות VIVO CRISPR יצירת מספר, מולטיפלקסים אוטוכטוניים עכבר מודלים בשנים האחרונות15,16,17,18. פרויקטים אלה מסתמכים בדרך כלל על וירוס הקשור לאדנו (AAV) כדי לספק sgRNAs לאיברים היעד. AAV מאפשר יצירת טיטר גבוה מאוד ובכך להקל על ייצור וירוס טיטר גבוה הנדרש עבור מניפולציות in vivo. עם זאת, השימוש ב- AAVs מגביל מאוד את מספר הגנים שניתן לנתח לכ-40-50 גנים, שכן AAVs, שלא כמו lentivirus, אינם משתלבים ביציבות בדנ"א הגנומי, מה שהופך את הקריאה של ספריות sgRNA לבלתי מעשית. סינון מבוסס AAV מחייב קריאה ישירה של מוטציות באתרי יעד באמצעות למשל, רצף לכידה ממוקד. עם זאת, רצף לכידה מרובה-ערכים מבוססי PCR מגביל את מספר המטרות הניתנות ללכידה בספריה 'ניתנת לסינון' בדרך כלל בסדר גודל של עשרות15,16,17,18.
בהשוואה למסכי AAV במסכי VIVO CRISPR, המתודולוגיה המתוארת כאן משתמשת ב- sgRNAs lentiviral. בהתחשב בכך מבנים lentiviral להשתלב ב- DNA של תא היעד, ייצוג sgRNA ניתן לנתח DNA גנומי דומה לכל מסכי CRISPRקונבנציונליים 19,20. לפיכך, מתודולוגיה זו מאפשרת ניתוח בו זמנית של מאות גנים וניתן לשנות את גודלם בצורה חלקה אפילו למסכי vivo רחבים בגנום. לדוגמה, מסך גנום רחב עם 78,000 sgRNAs וכיסוי של 30x ידרוש ~ 90 עוברים כפי שתואר קודם לכן עבור מסך shRNA דומה4. כמו גודל המלטה של זנים הנפוצים ביותר של עכבר מולד הוא סביב 8-12 גורים / המלטה מנתח מנוסה יכול בקלות להזריק את כל העכברים בתוך קצת יותר, רק על ~ 10-12 סכרים וניתוחים יידרשו עבור מסך כזה גנום רחב.
ההצלחה של מסך in vivo תלויה בייצור וירוס טיטר גבוה. בעוד מבנים lentiviral המבטאים sgRNA של עניין, Cas9 ו Cre (למשל, pSECC) הם פתרון All-in-One נוח וישים, יש להם את מגבלת האריזה עבור קפסיד lentiviral (~ 10 kb בגודל הכולל), המוביל טיטר ויראלי נמוך הכוללת. כדי להתגבר על אתגר זה, אנו משתמשים בעכברי R26-LSL-Cas9-GFP ובמבנה לנטי-ויראלי המכיל רק Cre-recombinase יחד עם sgRNA. המבנה lentiviral וכתוצאה מכך הוא רק 7 kb אורך ומניב titer ויראלי של יותר מ 108 PFU / mL.
ספריות ממוקדות וספציפיות יכולות להיווצר במהירות תוך מספר ימים בלבד וניתן ללמוד את הרשת המורכבת של אינטראקציות גנטיות ב- vivo תוך מספר שבועות. Mutagenesis בתיווך Cas9 יכול להתבצע גם בעכברים מסוג פראי ללמוד התפתחות איברים, הומאוסטזיס או מחלות פנוטיפים (סרטן, מחלות עור דלקתיות, וכו ') או ניתן לשלב בקלות עם עכברים מחסה כל מוטציות אונקוגני או שילוב של מוטציות כדי מודל המצב הגנטי נמצא בחולים אנושיים. בנוסף, ניתן לזקק את מתודולוגיית השיבוט כדי לשכפל ספריות CRISPRa או CRISPRi על-ידי הוספת אתרי הגבלה תואמים ורצפי sgRNA בפלסמיד All-in-One. שימו לב, כל הספריות שמתפעלות תפקודי גנים יכולות לשמש לא רק במודלים של עכברים אלא גם במודלים אחרים של בעלי חיים ובתרבויות אורגנואידיות. יחד, מתודולוגיה זו מדגישה את כלי השירות ומספקת מוכן מראש להשתמש ישיר vivo CRISPR לשלב עריכת גנים סומטית ומידול העכבר כדי להעריך במהירות את תפקוד הגנים vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענק פרויקט מהמכון הקנדי לחקר הבריאות (CIHR 365252), קרן קרמביל וקרן המחקר של אונטריו סבב מצוינות מחקר 8 (RE08-065). סמפת קומאר לוגנאתן הוא מקבל מלגת האגודה הקנדית למלחמה בסרטן (BC-F-16#31919).
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.45 micron filter | Sigma | S2HVU02RE | |
12k or 92k oligo chip | Customarray Inc. (Genscript) | ||
15 cm cell culture plates | Corning | ||
293FT | Invitrogen | R70007 | |
293NT | Systems Biosciences | LV900A-1 | |
Alkaline phosphatase | NEB | M0290L | |
Amplicillin | Fisher Scientific | BP1760-25 | |
ATP | NEB | 9804S | |
BsmBI | NEB | R0580L | |
Chromic gut suture | Covidien | ||
Deep sequencing (Next-Seq or Hi-Seq) | Illumina | ||
DNA-cleanup kit | Zymo Research | D4008 | |
DNAesy Blood and Tissue DNA extraction kit | Qiagen | 69506 | |
Endura electrocompetent cells | Lucigen | 60242-1 | |
Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
High-Speed Centrifuge | Beckman Coulter | MLS-50 | |
LB Agar | Wisent Technologies | 800-011-LG | |
Micropipette puller | Sutter Instrument | P97 | |
Mineral oil | Sigma | M5904 | |
Mini-prep plasmid Kit | Frogga Bio | PDH300 | |
Mouse oxygen anaesthesia system | Visual Sonics | ||
Nanoject II micromanipulator | Drummond | ||
NEBuffer 3.1 (Buffer for BsmBI) | NEB | R0580L | |
Needle sharpener | Sutter Instrument | BV-10 | |
Oligo cleanup kit | Zymo research | D4060 | |
PAGE purified illumina sequencing primer | IDT DNA | ||
PEI (polyethyleneimine) | Sigma | 408727-100ML | |
Permoplast modeling clay | |||
Petridish with central opening | Visual Sonics | ||
pMD2.G | Addgene | 12259 | |
psPAX2 | Addgene | 12260 | |
Q5 Polymerase 2x Master mix | NEB | M0494L | |
Qubit Fluorometric Quantification | Invitrogen | Q33327 | |
Semicircular Silicone plug | Corning | ||
Silicone membrane | Visual Sonics | ||
T4 DNA ligase | NEB | M0202L | |
Ultra-centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344058 | |
Vevo2000 ultrasound system | Visual Sonics |
References
- Beronja, S., Fuchs, E. RNAi-mediated gene function analysis in skin. Methods in Molecular Biology. 961, 351-361 (2013).
- Beronja, S., Livshits, G., Williams, S., Fuchs, E. Rapid functional dissection of genetic networks via tissue-specific transduction and RNAi in mouse embryos. Nature Medicine. 16, 821-827 (2010).
- Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343, 84-87 (2014).
- Beronja, S., et al. RNAi screens in mice identify physiological regulators of oncogenic growth. Nature. 501, 185-190 (2013).
- Loganathan, S. K., et al. Rare driver mutations in head and neck squamous cell carcinomas converge on NOTCH signaling. Science. 367, 1264-1269 (2020).
- Leemans, C. R., Snijders, P. J. F., Brakenhoff, R. H. The molecular landscape of head and neck cancer. Nature Reviews Cancer. 18, 269-282 (2018).
- Green, A. C., Olsen, C. M. Cutaneous squamous cell carcinoma: an epidemiological review. British Journal of Dermatology. 177, 373-381 (2017).
- Campbell, J. D., et al. pathway network, and immunologic features distinguishing squamous carcinomas. Cell Reports. 23, 194-212 (2018).
- Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nature Methods. 11, 783-784 (2014).
- Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. Comparison of lentiviral vector titration methods. BMC Biotechnology. 6, 34 (2006).
- Schramek, D., et al. Direct in vivo RNAi screen unveils myosin IIa as a tumor suppressor of squamous cell carcinomas. Science. 343, 309-313 (2014).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159, 440-455 (2014).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10, 25 (2009).
- Li, W., et al. MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knockout screens. Genome Biology. 15, 554 (2014).
- Winters, I. P., Murray, C. W., Winslow, M. M. Towards quantitative and multiplexed in vivo functional cancer genomics. Nature Reviews Genetics. 19, 741-755 (2018).
- Rogers, Z. N., et al. Mapping the in vivo fitness landscape of lung adenocarcinoma tumor suppression in mice. Nature Genetics. 50, 483-486 (2018).
- Chow, R. D., et al. AAV-mediated direct in vivo CRISPR screen identifies functional suppressors in glioblastoma. Nature Neuroscience. 20, 1329-1341 (2017).
- Wang, G., et al. Mapping a functional cancer genome atlas of tumor suppressors in mouse liver using AAV-CRISPR–mediated direct in vivo screening. Science Advances. 4, 5508 (2018).
- Chan, K., Tong, A. H. Y., Brown, K. R., Mero, P., Moffat, J. Pooled CRISPR-based genetic screens in mammalian cells. Journal of Visualized Experiments. (151), e59780 (2019).
- Hart, T., et al. High-resolution CRISPR screens reveal fitness genes and genotype-specific cancer liabilities. Cell. 163, 1515-1526 (2015).