Summary
Her beskriver vi en hurtig og direkte in vivo CRISPR/Cas9 screeningsmetode ved hjælp af ultralydstyret i livmoderembryo-lentivirale injektioner for samtidig at vurdere funktioner af flere gener i huden og mundhulen hos immunkontromerende mus.
Abstract
Genetisk modificerede musemodeller (GEMM) har været medvirkende til at vurdere genfunktion, modellere menneskelige sygdomme og fungere som præklinisk model til vurdering af terapeutiske veje. Men deres tids-, arbejds- og omkostningsintensive natur begrænser deres nytteværdi for systematisk analyse af genfunktion. De seneste fremskridt inden for genomredigeringsteknologier overvinder disse begrænsninger og giver mulighed for hurtig generering af specifikke genforbræte direkte inden for specifikke museorganer på en multiplekseret og hurtig måde. Her beskriver vi en CRISPR/Cas9-baseret metode (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) til at generere tusindvis af gen knock-out kloner i epitel af huden og mundhulen af mus, og give en protokol beskriver de nødvendige skridt til at udføre en direkte in vivo CRISPR skærm for tumor suppressor gener. Denne tilgang kan anvendes på andre organer eller andre CRISPR/Cas9-teknologier såsom CRISPR-aktivering eller CRISPR-inaktivering for at studere genernes biologiske funktion under vævshomøostase eller i forskellige sygdomsindstillinger.
Introduction
En af udfordringerne for kræftforskningen i den postgenomiske æra er at udvinde den enorme mængde genomdata for kausale genmutationer og identificere knuder i gennetværket, der kan målrettes terapeutisk. Selv om bioinformatiske analyser har bidraget enormt til at nå disse mål, er det en forudsætning at etablere effektive in vitro- og in vivo-modeller for at dechifrere kompleksiteten af biologiske systemer og sygdomstilstande og for at muliggøre udvikling af lægemidler. Mens konventionelle transgene musemodeller er blevet brugt i vid udstrækning til in vivo kræft genetik undersøgelser, deres omkostninger-, tid-og arbejdskrævende karakter har stort set forbudt systematisk analyse af de hundredvis af formodede kræft gener optrevlet af moderne genomik. For at overvinde denne flaskehals kombinerede vi en tidligere etableret ultralydsstyret i livmoderinjektionsmetode1,2 med en CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) genredigeringsteknologi3 for samtidig at fremkalde og studere funktionstabsmutationer af hundredvis af gener i hud og mundhule hos en enkelt mus.
Den metode, der er beskrevet her, bruger ultralydsstyrede injektioner af manipulerede lentivirus i fosterhulen af levende museembryoner på embryonal dag E9.5. Den lentivirale last, der indeholder CRISPR/Cas9-komponenterne, transduce den enkeltlags overflade ectoderm, som senere giver anledning til epitel af huden og mundhulen. Huden er sammensat af en ydre epidermis, efterfulgt af kældermembran og dermis. Epidermis er et stratificeret epitel bestående af et indre, basalt lag, som opretholder kontakt med kældermembranen og har proliferativ og stamcellekapacitet. Det basale lag giver anledning til de differentierede lag ovenfor, såsom spinøse, granulære og stratum corneum lag2,4. Undersøgelser af afstamningssporing viser, at denne direkte in vivo CRISPR/Cas9-metode genmanipulerer vævsbeboende stamceller i det basale lag, der fortsætter i hele voksenalderen. Da lentivirus kan titreres for at transduce E9.5 overflade ectoderm ved klonisk tæthed, kan denne metode bruges til at generere mosaikmus, der huser tusinder af diskrete gen knock-out kloner. Næste generations sekventering kan derefter bruges til at analysere effekten af CRISPR/Cas9-medieret genabsering inden for disse kloner på en multiplekseret måde5.
Vi har for nylig brugt denne metode til at vurdere funktionen af 484 gener, der viser tilbagevendende mutationer i humane hoved og hals Squamous Cell Carcinoma (HNSCC)5. HNSCC er en ødelæggende kræft med en høj dødelighed på 40-50%, og det er den 6th mest almindelige kræft på verdensplan6. HNSCC opstår i slimhindeforinger af de øvre luftveje eller mundhulen og er forbundet med tobaks- og alkoholforbrug eller human papillomavirus (HPV) infektion. Kutan squamous Cell Carcinoma (SCC) er hudtumorer og repræsenterer den næsthyppigste kræftform hos mennesker7. Kutan SCC og HNSCC er histologisk og molekylært meget ens, med en høj procentdel af tilfælde udviser ændring i TP53, PIK3CA, NOTCH1, og HRAS8. Mens der kun er en håndfuld gener muteret ved høj frekvens, er der hundredvis af gener, der findes muteret ved lav frekvens (< 5%), et fænomen, der almindeligvis omtales som langtidshalefordelingen. Da størstedelen af langhalegenerene mangler biologisk eller klinisk validering, brugte vi denne in vivo CRISPR-screeningsteknologi til at modellere tab af funktion af disse gener i tumor-tilbøjelige mus med sensibiliserende mutationer i p53, Pik3ca eller Hras og identificerede flere nye tumorundertrykkergener, der samarbejder med p53, Pik3ca eller Hras for at udløse tumorudvikling5.
Her beskriver vi en detaljeret protokol til generering af multiplexed sgRNA lentivirale CRISPR sgRNA-biblioteker og udfører CRISPR/Cas9-gensmittende skærme i museoverfladens ectoderm. Bemærk, at denne metode kan tilpasses til at inkorporere andre genmanipulationsteknologier såsom CRISPR-aktivering (CRISPRa) og CRISPR-inaktivering (CRISPRi) eller ændres til at målrette andre organsystemer med musen for at studere genfunktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol blev godkendt og udført i overensstemmelse med IACUC fra University of Toronto.
1. Design og kloning af sammenlagte CRISPR-biblioteker
- Vælg 4-5 sgRNA'er, der er målrettet mod musegener af interesse fra ressourcer, f.https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design (Broad Institute sgRNA designer) eller CHOPCHOP-server (https://chopchop.cbu.uib.no). Vælg et lige antal ikke-målretnings-sgRNA'er fra f.eks.
- Mens du konstruerer sgRNA-bibliotekerne, skal du sørge for, at der er tilstrækkelig dækning for hvert sgRNA i det målrettede organsystem. For musehuden er epidermis på E9.5 et enkelt lag, der indeholder ~ 150.000 celler, hvoraf de fleste har stamcellekapacitet4. Hvis lenti-viral transduktion resulterer i 15-20% smitteevne, vil kun 18.000-24.000 celler blive transduceret ved E9.5. Skaler eksperimentet i overensstemmelse hermed.
- Til kloning og forstærkning af disse sgRNA-biblioteker tilsættes BsmBI-enzymbegrænsningssteder samt primerbindings-DNA-sekvenser til 5' og 3' slutningen af sgRNA'et og bestiller den resulterende oligoer i fuld længde som samlet oligonukleotidchip (Figur 1A).
- Hvis du vil multix forskellige biblioteker på én chip, skal du tilføje biblioteksspecifikke primersekvenser.
- Ved hjælp af de relevante primerpar kan du forstærke hvert bibliotek adskilt fra den samlede oligochip. I et PCR-rør blandes 25 μL 2x polymerase master mix, 20 μL DNase/RNase frit vand, 5 ng oligo chip DNA, 2,5 μL passende fremad primer og 2,5 μL passende omvendt primer. Brug 12-15 cyklusser og forstærk med 98 °C denaturering, 63-67 °C udglødning, 72 °C forlængelsesparametre for hver cyklus i PCR-maskinen.
- Kør PCR produkt på en 2,5% agarose gel og rense ~ 100 bp PCR produkt ved hjælp af en gel DNA oprydning kit.
- Gør rygraden klar.
- 5 μg af cre-rekombininase indeholdende pLKO-Cre stuffer v3 plasmid med 2 μL BsmBI i 50 μL reaktionsblanding i 1 time ved 55 °C efterfulgt af 1 μL alkalisk fosfataseinkubation i 45 min ved 37 °C i henhold til fabrikantens anvisninger.
BEMÆRK: Cre-recombinase indeholder pLKO-Cre stuffer v3 plasmid er en lenti-viral baseret plasmid, der indeholder Cre-recombinase enzym til at fjerne Lox-Stop-Lox kassette i museceller og har også en U6 promotor til at drive udtrykket af sgRNA og tracrRNA. En version med Cas9 og uden Cas9 kan bruges og fås på Addgene #158030 og #158031. - Kør det fordøjede DNA på en 1% agarose gel og rense 7 kb linearized vektor band ved hjælp af en gel DNA oprydning kit. Bemærk, at et 2 kb stuffer-bånd også skal være synligt, hvilket indikerer en vellykket fordøjelse.
- 5 μg af cre-rekombininase indeholdende pLKO-Cre stuffer v3 plasmid med 2 μL BsmBI i 50 μL reaktionsblanding i 1 time ved 55 °C efterfulgt af 1 μL alkalisk fosfataseinkubation i 45 min ved 37 °C i henhold til fabrikantens anvisninger.
- Opsæt ligationen reaktion til at generere en sgRNA plasmid bibliotek.
- 1 μg renset vektor og 30 ng renset PCR-skær blandes med 2 μL BsmBI, 5 μL T4 DNA-ligase, 10 μM ATP og 1x buffer, der er specifik for BsmBI. Ligationblandingen inkuberes natten over ved 37 °C. Brug et ekstra rør, der indeholder alle ovenstående materialer undtagen PCR-indsatsen som en negativ kontrol.
- Næste dag morgen renses ligationblandingen ved hjælp af oligo-oprydningssættet og elute i 7 μL RNase/ DNase frit vand.
- Elektroporate biblioteket i kompetente celler.
- Der tilsættes 2 μL elueret sgRNA-bibliotek eller negativ kontrol ligationblanding til 25 μL optøede elektrokompetente celler i forkølede cuvetter (1,0 mm) på is. Elektroporat efter producentens protokol (10 μF, 600 Ohms, 1800 Volt). Til cuvette tilsættes 975 μL genvindingsmedium (eller SOC-medium) inden for 10 s af pulsen.
- Elektroporatedceller overføres til et dyrkningsrør, og der inkuberes i en time ved 37 °C i en bakteriel rysteinkubator ved 300 omdrejninger i minuttet.
- Anslå transformationseffektiviteten og bibliotekets dækning pr. sgRNA.
- Der fremstilles en 100 gange så stor fortynding ved at overføre 10 μL af transformationsreaktionen, der indeholder celler, der er elektroporated med sgRNA-bibliotek eller negativ kontrol ligation til 990 μL recovery medium og blandes godt.
- Plade 10 μL af den fortyndede omdannelse blandes på en forvarmet 10 cm LB + ampicillin (100 μg/L) agarplade. Dette resulterer i en 10.000 gange fortynding af transformanterne og bruger denne plade til at beregne transformationseffektiviteten. Pladerne inkuberes ved 30 °C i 14-16 timer.
- Resten af transformationsreaktionen plades ved at sprede 100 μL genvundne celler på hver plade på i alt 10 forvarmede 15 cm LB + ampicillin agarplader. Pladerne inkuberes i 14-16 timer ved 30 °C. Bemærk, at vækst ved 30 °C minimerer rekombination mellem de to lange terminal gentagelser i viral plasmid.
- For at vurdere kloningssuccesen skal transformationseffektiviteten beregnes. Antallet af kolonier på fortyndingspladen, der indeholder transformanter fra sgRNA-biblioteket eller negativ kontrol ligation (10 cm plader, trin 1.8.2). Negativ kontrol mix bør ikke have nogen eller kun meget få kolonier. Hvis du vil opnå det samlede antal kolonier, skal du gange antallet af kolonier med 10.000.
BEMÆRK: Det optalte samlede antal kolonier repræsenterer en biblioteksdækning, som skal være mindst 200x kolonier pr. sgRNA.- Sørg for, at et bibliotek med 2000 sgRNA'er har mindst 400.000 kolonier. I tilfælde af at der ikke er nok kolonier, gentag og opret mere elektroporation.
- Kvalitetskontrol: Vælg 20 kolonier fra fortyndingspladen, og tilsæt hver koloni til et individuelt dyrkningsrør, der indeholder 3 mL LB-medier + ampicillin. Alle 20 rør inkuberes natten over ved 30 °C, der ryster ved 250 omdrejninger i minuttet. Rensning af plasmid-DNA'et ved hjælp af miniforberedelsessæt i henhold til producentens anvisninger og Sanger-sekvensen af alle de 20 plasmid-DNA-prøver for at verificere, at hver prøve har en anden sgRNA-sekvens ved hjælp af U6 primeren (5'-GAG GGC CTA TTT CCC ATG ATT CC-3').
- Høst kolonierne fra hver 15 cm plade.
- Tilsæt 7 mL LB medium, og skrab derefter kolonierne af LB Agar-pladen med en cellespreder. Brug en 10 mL pipette til at overføre cellerne til en 2 L steril konisk kolbe. Gentag for alle plader og poolbakterier i 2 L kolben. Kolben inkuberes i 2-3 timer, der ryster ved 30 °C. Centrifuge kulturen og indsamle pellet.
- Rense plasmid DNA ved hjælp af en maxi-plasmid rensning kit.
- Yderligere kvalitetskontrol: Brug 1 ng maxi-prep sgRNA bibliotek plasmid DNA og køre en PCR reaktion ved hjælp af Next-Generation sekventering primere i henhold til producentens anvisninger. Repræsentationen af alle sgRNA'er i biblioteket kan verificeres af dyb sekventeringsplatform.
2. Produktion af høj titer lentivirus egnet til in vivo transduktion
BEMÆRK: Udfør alle trin i dette afsnit af protokollen i en BSL2+ facilitet i et klasse II-, type A2-biosikkerhedsskab. 293FT og især 293NT emballageceller giver mulighed for højere virusproduktion. Brug celler med lav passage ( 3. Ultra-lyd guidet kirurgi og injektion BEMÆRK: Denne teknologi blev tilpasset fra4,11. Mikroinjektion rettet mod transduktion af overfladeepitelet skal udføres på fosterdagen E9.5, når overflade ectoderm består af et enkelt lag og før dannelsen af peridermet fra og med E10, hvilket ville forhindre transduktion af dette basale lag. Helst oprette mus på fredag, således at den første mulige dag med E9.5 embryoner er den følgende mandag. Brug Rosa26-Lox-STOP-LOX-Cas9-GFP-mus (Jackson Laboratory #024857) for optimal CRISPR/Cas9 effektivitet12. 4. Procedure for dyb rækkefølge
BEMÆRK: Brug altid en uåbnet eller for nylig åbnet flaske DMEM til transfekten, da pH-timen på dette trin er kritisk, og DMEM bliver mere grundlæggende over tid, når den først er åbnet.
BEMÆRK: Den resulterende viral suspension bør give en omtrentlig 2.000 gange koncentration og den resulterende virusopløsning og bør have viral titer på 107-109, hvilket er godt nok til mere end 100 E9.5 operationer beskrevet nedenfor.
BEMÆRK: Sammenligning mellem den koncentrerede virale suspension med dens ukoncentrerede virale supernatant vil gøre det muligt at estimere succesen af (1) viral produktion samt (2) viral koncentration. Alternativt kan den virale titer estimeres ved hjælp af qRT-PCR-metode10. Storstilet produktion og koncentration af lentivirus kan også udføres ved hjælp af en totrinskoncentration med en patronkoncentration efterfulgt af ultracentrifugering som tidligere beskrevet2.
BEMÆRK: Må ikke overstige 30 min anæstesi som gravide dæmninger er langt mere tilbøjelige til at afbryde deres embryoner ud over dette tidspunkt. En erfaren kirurg kan injicere op til 12 embryoner inden for 30 minutters operation.
BEMÆRK: Når du udfører ultralydstyret i livmoderoperationer, skal man være yderst omhyggelig med at opretholde et rent miljø, opretholde sterilitet så meget som muligt og undgå eventuelle forurenende stoffer. Hvis der skal udføres mere end én operation samme dag, er det vigtigt at sterilisere dissektionsinstrumenterne ved hjælp af en perlesterilisator og rengøre andet apparatur, der støder på musevæv renset med ethanol. Dette øger i høj grad embryonernes højere overlevelse efter operationen. Overlevelsesraten for kirurgi metode, der er beskrevet her, er konsekvent mellem 80-100%.
BEMÆRK: Mus identificeres bedst ved hjælp af fluorescerende mikroskop op til postnatal dag 3, før håret begynder at vokse.
BEMÆRK: Det er vigtigt at generere en referenceprøve for at gøre det muligt at beregne ændringer i sgRNA-foldning over tid. Transducerede embryoner 3 dage efter infektion eller transducerede celler (se trin 2. 6) kan tjene som referenceprøve til bestemmelse af sgRNA-repræsentation i det oprindelige bibliotek.
BEMÆRK: Opsæt barcoding PCR reaktion i et separat dedikeret område af laboratoriet eller i en vævskultur hætte, der rengøres grundigt ved DNA slette for at undgå forurening. Kør negativ kontrol for hver PCR-plade med vand som skabelon for at sikre, at der ikke er nogen forurening.
BEMÆRK: Forforstærkningstrinnet er kun nødvendigt for forstærkning af et komplekst transduceret væv. Hvis forstærke en enkelt tumor, der formentlig udviklet danne en kloncelle og dermed indeholder kun en enkelt sgRNA, kan man springe præ-forstærkning PCR1 og gå straks med PCR2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1A viser designet af oligonukleotider til multiplexing af flere brugerdefinerede CRISPR-biblioteker på en omkostningseffektiv måde på en enkelt 12k eller 92k oligochip. Når sgRNA'erne (blå farvekodet) er valgt, er oligonukleotider designet med begrænsningssteder (orangefarvet BsmBI) og biblioteksspecifikke PCR primer-par (grøn farvekodet). Flere biblioteker kan designes ved hjælp af unik kombination af primer par til multiplexing i en enkelt oligo chip. Når PCR forstærke bibliotekerne ved hjælp af en bestemt PCR primer par, altid omfatte en vand kun negativ kontrol og køre alle reaktioner på en agarose gel. Den negative kontrol vognbane bør ikke have nogen bands på 100 bp, mens biblioteket forstærket vognbane bør have en enkelt 100 bp band. Hvis der ikke er noget bånd, skal du sørge for, at PCR-primerparret er valgt korrekt. Figur 1B viser kvalitetskontroltrinnet i det klonede bibliotek og den virale produktions- og koncentrationsprocedure. Der bør drages omsorg for at bevare den lige repræsentation af sgRNA'er fra kloning til transduktion. Næste generations sekventering af PCR forstærket DNA fra plasmid og lenti-viral bibliotek transducerede celler bør vise en høj korrelation. Enhver afvigelse skal analyseres omhyggeligt for at undersøge, om repræsentationen går tabt før eller efter lenti-viruspræparatet. Hvis sgRNA-aflæsningerne fra plasmid-DNA'et ikke viser samme repræsentation af sgRNA'er, skal viruspræparatet og koncentrationsproceduren gentages med forsigtighed. Hvis tabet af lige sgRNA-repræsentation fandt sted i plasmid-DNA, skal hele kloningsproceduren gentages, herunder PCR-forstærkning af biblioteker fra oligochip med reducerede forstærkningscyklusser. Crispr-biblioteksscreeningens succes afhænger i høj grad af, om de sgRNA'er, der er til stede i biblioteket, er ligeligt repræsenteret.
Figur 2 viser ultralydsstyret mikroinjektion, der er oprettet til at manipulere E9.5-embryonerne hos gravid mus. Hele set-up er placeret under en biosikkerhed niveau klasse II kabinet for at opretholde den sterile tilstand af hele proceduren og for at undgå enhver infektion af den gravide mus på grund af de kirurgiske procedurer. Der skal udvises forsigtighed for at undgå at presse livmoderhornene under injektionen. Nålen skal være meget skarp, så såret på livmodervæggen og fosterhinden er minimalt.
Figur 3 viser resultaterne af den ultralysstyrede injektion af lenti-virus, der transporterer Cre-recombinase i E9.5 Lox-stop-Lox (LSL) Konfetti museunger på postnatal dag (P)0. Viral titer kan justeres for at få en passende transduktionsdækning af epidermis. Mens høj titer af virus ville resultere i større dækning af musehuden, ville det også resultere i transduktion af flere sgRNA'er i samme celle, hvilket potentielt forvirrer resultaterne. For at reducere flere transduktioner af en enkelt celle skal infektionshastigheden holdes <20%.
Figur 4 viser næste generation sekventering læser af PCR forstærket DNA fra plasmid og lenti-viral bibliotek transduced celler og læser også fra 4 repræsentative tumorer. sgRNA-guider rettet mod Adam10 og Ripk4 er beriget i tumorprøverne (trekanter og diamanter) sammenlignet med sgRNA-præsentation i plasmidpool eller inficerede celler. Adam10 og Ripk4 fungerer som tumor undertrykkere5. Flere hundrede tumorer kan multiplekseres ved at tildele unikke stregkoder til hver prøve og dyb sekventeret som skitseret i protokollen.
Figur 1: Kloning af målrettet CRISPR-bibliotek. (A)Skematisk fremstilling af oligonukleotider for den brugerdefinerede oligochip på 12 k eller 92 k. BsmBI (eller andre kompatible) begrænsningssteder (orange farvekodet og understreget) blev tilføjet på hver side af sgRNA. Pilespidserne angiver BsmBI-klippestedet. For hvert bibliotek blev der tilføjet et unikt par PCR-primere (grøn, brun og lilla farvekodet), så den specifikt kan forstærkes ved hjælp af PCR fra den samlede chip. Flere brugerdefinerede biblioteker kan multiplekseres op til 12k eller 92k oligos. (B) Graf, der viser sgRNA-repræsentation fra et CRISPR-bibliotek i plasmid-DNA versus DNA fra celler, der er transduceret med samme lentivirale bibliotek. Hver prik repræsenterer en guide. Fuld repræsentation blev opretholdt efter transduktion med en vis sammenhæng i overflod. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Billede af det ultralydsstyrede mikroinjection set-up. (A) Mus transporterer E9.5 embryoner blev bedøvet og placeret på en opvarmet platform med livmoderen eksponeret i en PBS fyldt modificeret Petri parabol kammer (stabiliseret af fire modellering ler). Den blå halvrunde gummi understøttede livmoderen indeholdende embryoner og injektion nål fra mikroinjektoren er placeret på højre side. Ultralydsscanning hovedet blev monteret på toppen videresendelse levende billede til skærmen bag med nål hovedet synlige. (B) Nærbillede af et E9.5-foster. Lentiviral bibliotek blev injiceret med nålen (set på højre side) i fosterhulen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Vellykket transduktion af overfladeepitelet i mus. Fluorescerende billeder af hele kroppen, mundhulen, tungen, og ganen af nyfødte Cre-reporter LSL-Konfetti mus transduceret med Cre lentivirus (Indløb: tilsvarende hvidt lys billeder). Skalalinjer = 500 μm Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Dyb sekventering af tumorprøver. Graf, der viser sgRNA-repræsentation fra et CRISPR-bibliotek i plasmid-DNA versus DNA fra celler, der er transduceret med det samme lentivirale bibliotek og ud over læsninger fra 4 repræsentative tumorer. De røde og grønne cirkler angiver antallet af Adam10 og Ripk4 sgRNA læser i biblioteket og transducerede celler, mens den røde trekant repræsenterer læser af Adam10 sgRNA'er og den grønne diamant repræsenterer læser af Ripk4 sgRNA identificeret i tumorer fra separate HNSCC mus viser en 1000x fold berigelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
PCR1 Fremad Primer | GAGGGCCTATTTCCCATGATTC |
PCR1 Omvendt primer | CAAACCCAGGGCTGCCTTGGAA |
Tabel 1: Primere til PCR1-reaktion. De forreste og omvendte primere, der anvendes til forstærkning af regionen omkring sgRNA-kassette fra genomisk DNA fra celler, der transduceres med lentivirus.
skridt | temperatur | Tidspunkt | |
1 | 98 °C | 30 sek. | |
2 | 98 °C | 10 sek. | |
3 | 66 °C | 30 sek. | |
4 | 72 °C | 15 sek. | 15 cyklusser (trin 2-4) |
5 | 72 °C | 2 min. | |
6 | 4 °C | holde |
Tabel 2: PCR1-cyklusparametre. PCR-betingelser, der anvendes til forstærkning af regionen omkring sgRNA-kassette fra genomisk DNA fra celler, der transduceres med lentivirus.
501 FW | 1984, S. 1773, PRÆMIS 23, OG AF 17.12.1989, S. 1333, PRÆMIS 23, OG AF 12.12.1989, ACGCTCTTCCGATCTtgtggaaaggacgaaaCACCG |
||
701 RV | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGAGTAATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCT 1984, s. 1973, s. 1773, OG AF 17.12.1989, S. 1333, OG AF 13.12.1989, S. 1333, OG AF 13.12.19 |
||
* De understregede baser angiver Den Illumina (D501-510 for fremad og D701-712 for omvendt) stregkode placering, der blev brugt til multiplexing. | |||
* Røde farvede baser angiver den sekvens, der binder sig til målstedet på den lentivirale CRISPR plasmid. Denne region kan ændres i henhold til den anvendte lentivirale vektor. |
Tabel 3: Stregkode primere til PCR2 reaktion. Primere bruges til at stregkode forstærke hver tumor prøve (enten direkte fra genomisk DNA eller ved hjælp af produkter fra PCR1 som skabelon). Det understregede område angiver det entydige stregkodeområde, der kan tildeles for hver prøve til multipleksering i en dyb sekventeringsreaktion. De røde farvede basepar angiver målområdet i den lentivirale konstruktion, som disse primere binder. Denne målregion kan ændres i henhold til den anvendte type lentivirale konstruktion.
skridt | temperatur | Tidspunkt | |
1 | 98 °C | 30 sek. | |
2 | 98 °C | 10 sek. | |
3 | 68 °C | 30 sek. | |
4 | 72 °C | 15 sek. | 10 cyklusser (trin 2-4) |
5 | 72 °C | 2 min. | |
6 | 4 °C | holde |
Tabel 4: PCR2-cyklusparametre. PCR-betingelser, der bruges til at stregkode, forstærker hver tumorprøve (enten direkte fra genomisk DNA eller ved hjælp af produkterne fra PCR1 som skabelon).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CRISPR/Cas9 genomredigering har været meget udbredt i in vitro- og in vivo-undersøgelser til at undersøge genfunktioner og cellulære processer. De fleste in vivo-undersøgelser anvender CRISPR/Cas9-genredigerede celler, der er podet ind i en dyremodel (allograft eller xenograft). Selv om dette er et kraftfuldt værktøj til at studere kræft genetik og cellulære funktioner, det stadig mangler den indfødte væv mikromiljø og kan fremkalde sårende og / eller immunrespons.
For at overvinde disse udfordringer har flere grupper været banebrydende for direkte in vivo CRISPR-tilgange, der genererer flere, multiplekserede autoktone musemodeller i løbet af de sidste par år15,16,17,18. Disse projekter er normalt afhængige af adeno-associeret virus (AAV) til at levere sgRNA'er til at målrette organer. AAV giver mulighed for produktion af meget højere titer og derved lette produktionen høj titer virus, der kræves for in vivo manipulationer. Brugen af AAV'er begrænser imidlertid alvorligt antallet af gener, der kan analyseres til omkring 40-50 gener, da AAV'er i modsætning til lentivirus ikke stabilt integreres i genomisk DNA, hvilket gør udlæsning af sgRNA-biblioteker upraktisk. AAV-baseret screening kræver direkte udlæsning af mutationer på målsteder ved hjælp af f.eks. målrettet fangstsekvensering. Multikseret PCR-baseret hentningssekvensering begrænser dog antallet af mål, der kan hentes, i et 'screenbart' bibliotek normalt i størrelsesordenen15,16,17,18.
Sammenlignet med AAV in vivo CRISPR-skærme bruger den metode, der er beskrevet her, lentivirale sgRNA'er. Da lentivirale konstruktioner integreres i målcellens DNA , kan sgRNA-repræsentation analyseres i genomisk DNA svarende til alle konventionelle CRISPR-skærme19,20. Således giver denne metode mulighed for samtidig analyse af hundredvis af gener og kan problemfrit skaleres op selv til genom-dækkende in vivo-skærme. For eksempel ville en genom-dækkende skærm med 78.000 sgRNA'er og en dækning på 30x kræve ~ 90 embryoner som tidligere beskrevet for en lignende shRNA-skærm4. Da kuldstørrelserne for de fleste almindelige indavlede musestammer er omkring 8-12 hvalpe / kuld, og en erfaren kirurg let kan injicere alle mus inden for en littler, kræves kun omkring ~ 10-12 dæmninger og operationer til en sådan genom-bred skærm.
Succesen med en in vivo skærm afhænger af høj titer virus produktion. Mens lentivirale konstruktioner, der udtrykker et sgRNA af interesse, Cas9 og Cre (f.eks pSECC) er en bekvem og gennemførlig alt-i-en løsning, de har emballagen grænse for lentiviral capsid (~ 10 kb i samlet størrelse), hvilket fører til den samlede lavere virale titer. For at overvinde denne udfordring bruger vi R26-LSL-Cas9-GFP mus og en lenti-viral konstruktion, der kun indeholder Cre-recombinase sammen med et sgRNA. Den resulterende lentivirale konstruktion er kun 7 kb i længden og giver en viral titer på mere end 108 PFU / mL.
Målrettede og specifikke biblioteker kan hurtigt genereres på så lidt som et par dage, og det komplekse netværk af genetiske interaktioner kan studeres in vivo inden for få uger. Cas9-medieret myliose kan udføres enten i vilde mus for at studere organudvikling, homøostase eller sygdomsphoenotyper (kræft, inflammatoriske hudsygdomme osv.) eller kan let kombineres med mus, der huser nogen onkogene mutationer eller kombination af mutationer for at modellere den genetiske status, der findes hos menneskelige patienter. Derudover kan kloningsmetoden raffineres til at klone CRISPRa- eller CRISPRi-biblioteker ved at tilføje kompatible begrænsningssteder og sgRNA-sekvenser i alt-i-en plasmid. Bemærk, at alle biblioteker, der manipulerer genfunktioner, kan bruges ikke kun i musemodeller, men også i andre dyremodeller og i organoidkulturer. Sammen fremhæver denne metode værktøjet og giver en standardtekst til at bruge direkte in vivo CRISPR til at integrere somatisk genredigering og musemodellering for hurtigt at vurdere genfunktion in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af et projekt tilskud fra canadian Institute of Health Research (CIHR 365252), Krembil Foundation og Ontario Research Fund Research Excellence Round 8 (RE08-065). Sampath Kumar Loganathan er modtager af en canadisk Cancer Society stipendium (BC-F-16 # 31919).
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.45 micron filter | Sigma | S2HVU02RE | |
12k or 92k oligo chip | Customarray Inc. (Genscript) | ||
15 cm cell culture plates | Corning | ||
293FT | Invitrogen | R70007 | |
293NT | Systems Biosciences | LV900A-1 | |
Alkaline phosphatase | NEB | M0290L | |
Amplicillin | Fisher Scientific | BP1760-25 | |
ATP | NEB | 9804S | |
BsmBI | NEB | R0580L | |
Chromic gut suture | Covidien | ||
Deep sequencing (Next-Seq or Hi-Seq) | Illumina | ||
DNA-cleanup kit | Zymo Research | D4008 | |
DNAesy Blood and Tissue DNA extraction kit | Qiagen | 69506 | |
Endura electrocompetent cells | Lucigen | 60242-1 | |
Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
High-Speed Centrifuge | Beckman Coulter | MLS-50 | |
LB Agar | Wisent Technologies | 800-011-LG | |
Micropipette puller | Sutter Instrument | P97 | |
Mineral oil | Sigma | M5904 | |
Mini-prep plasmid Kit | Frogga Bio | PDH300 | |
Mouse oxygen anaesthesia system | Visual Sonics | ||
Nanoject II micromanipulator | Drummond | ||
NEBuffer 3.1 (Buffer for BsmBI) | NEB | R0580L | |
Needle sharpener | Sutter Instrument | BV-10 | |
Oligo cleanup kit | Zymo research | D4060 | |
PAGE purified illumina sequencing primer | IDT DNA | ||
PEI (polyethyleneimine) | Sigma | 408727-100ML | |
Permoplast modeling clay | |||
Petridish with central opening | Visual Sonics | ||
pMD2.G | Addgene | 12259 | |
psPAX2 | Addgene | 12260 | |
Q5 Polymerase 2x Master mix | NEB | M0494L | |
Qubit Fluorometric Quantification | Invitrogen | Q33327 | |
Semicircular Silicone plug | Corning | ||
Silicone membrane | Visual Sonics | ||
T4 DNA ligase | NEB | M0202L | |
Ultra-centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344058 | |
Vevo2000 ultrasound system | Visual Sonics |
References
- Beronja, S., Fuchs, E. RNAi-mediated gene function analysis in skin. Methods in Molecular Biology. 961, 351-361 (2013).
- Beronja, S., Livshits, G., Williams, S., Fuchs, E. Rapid functional dissection of genetic networks via tissue-specific transduction and RNAi in mouse embryos. Nature Medicine. 16, 821-827 (2010).
- Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343, 84-87 (2014).
- Beronja, S., et al. RNAi screens in mice identify physiological regulators of oncogenic growth. Nature. 501, 185-190 (2013).
- Loganathan, S. K., et al. Rare driver mutations in head and neck squamous cell carcinomas converge on NOTCH signaling. Science. 367, 1264-1269 (2020).
- Leemans, C. R., Snijders, P. J. F., Brakenhoff, R. H. The molecular landscape of head and neck cancer. Nature Reviews Cancer. 18, 269-282 (2018).
- Green, A. C., Olsen, C. M. Cutaneous squamous cell carcinoma: an epidemiological review. British Journal of Dermatology. 177, 373-381 (2017).
- Campbell, J. D., et al. pathway network, and immunologic features distinguishing squamous carcinomas. Cell Reports. 23, 194-212 (2018).
- Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nature Methods. 11, 783-784 (2014).
- Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. Comparison of lentiviral vector titration methods. BMC Biotechnology. 6, 34 (2006).
- Schramek, D., et al. Direct in vivo RNAi screen unveils myosin IIa as a tumor suppressor of squamous cell carcinomas. Science. 343, 309-313 (2014).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159, 440-455 (2014).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10, 25 (2009).
- Li, W., et al. MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knockout screens. Genome Biology. 15, 554 (2014).
- Winters, I. P., Murray, C. W., Winslow, M. M. Towards quantitative and multiplexed in vivo functional cancer genomics. Nature Reviews Genetics. 19, 741-755 (2018).
- Rogers, Z. N., et al. Mapping the in vivo fitness landscape of lung adenocarcinoma tumor suppression in mice. Nature Genetics. 50, 483-486 (2018).
- Chow, R. D., et al. AAV-mediated direct in vivo CRISPR screen identifies functional suppressors in glioblastoma. Nature Neuroscience. 20, 1329-1341 (2017).
- Wang, G., et al. Mapping a functional cancer genome atlas of tumor suppressors in mouse liver using AAV-CRISPR–mediated direct in vivo screening. Science Advances. 4, 5508 (2018).
- Chan, K., Tong, A. H. Y., Brown, K. R., Mero, P., Moffat, J. Pooled CRISPR-based genetic screens in mammalian cells. Journal of Visualized Experiments. (151), e59780 (2019).
- Hart, T., et al. High-resolution CRISPR screens reveal fitness genes and genotype-specific cancer liabilities. Cell. 163, 1515-1526 (2015).