Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Fare Derisi ve Ağız Boşluğundaki Gen İşlevlerini Aynı Anda Değerlendirmek için Vivo CRISPR/Cas9 Taraması

Published: November 2, 2020 doi: 10.3791/61693
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2, 3, 1,2
1Centre for Molecular and Systems Biology, Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital, 2Department of Molecular Genetics, University of Toronto, 3Department of Cell and Developmental Biology, Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University

Summary

Burada, immün yetmetik farelerin deri ve ağız boşluğundaki çeşitli genlerin işlevlerini aynı anda değerlendirmek için utero embriyonik lentiviral enjeksiyonlarda ultrason güdümlü ultrason güdümlü kullanarak hızlı ve doğrudan bir in vivo CRISPR / Cas9 tarama metodolojisini açıklıyoruz.

Abstract

Genetiği değiştirilmiş fare modelleri (GEMM), gen fonksiyonlarının değerlendirilmesinde, insan hastalıklarının modelinde ve terapötik yolları değerlendirmek için preklinik model olarak hizmet vermede etkili olmuştur. Bununla birlikte, zaman, emek ve maliyet yoğun doğaları, gen fonksiyonunun sistematik analizi için yararlarını sınırlar. Genom düzenleme teknolojilerindeki son gelişmeler bu sınırlamaların üstesinden gelmekte ve belirli bir gen pertürbasyonunun doğrudan belirli fare organları içinde çok katlı ve hızlı bir şekilde hızlı bir şekilde üretilmesine izin verir. Burada, cildin epitelinde ve farelerin ağız boşluğunda binlerce gen nakavt klonu oluşturmak için CRISPR/Cas9 tabanlı bir yöntemi (Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Tekrarlar) tanımlıyoruz ve tümör baskılayıcı genler için doğrudan in vivo CRISPR ekranı gerçekleştirmek için gereken adımları ayrıntılı olarak açıklayan bir protokol   sunuyoruz. Bu yaklaşım, doku homeostazı sırasında veya çeşitli hastalık ortamlarında genlerin biyolojik işlevini incelemek için diğer organlara veya CRISPR aktivasyonu veya CRISPR-inaktivasyonu gibi diğer CRISPR /Cas9 teknolojilerine uygulanabilir.

Introduction

Post-genomik çağda kanser araştırmaları için zorluklardan biri, nedensel gen mutasyonları için çok miktarda genom verisi çıkarmak ve gen ağında terapötik olarak hedeflenebilen düğümleri tanımlamaktır. Biyoinformatik analizler bu hedeflere son derece yardımcı olsa da, verimli in vitro ve in vivo modeller oluşturmak, biyolojik sistemlerin ve hastalık durumlarının karmaşıklığını çözmek ve ilaç gelişimini sağlamak için bir ön koşuldur. Konvansiyonel transgenik fare modelleri in vivo kanser genetiği çalışmaları için yoğun olarak kullanılmış olsa da, maliyet, zaman ve emek yoğun doğası, modern genomik tarafından çözülen yüzlerce putatif kanser geninin sistematik analizini büyük ölçüde yasaklamıştır. Bu darboğazın üstesinden gelmek için, tek bir farenin derisinde ve ağız boşluğunda yüzlerce genin fonksiyon kaybı mutasyonlarını aynı anda teşvik etmek ve incelemek için daha önce kurulmuş bir ultrason güdümlü rahim enjeksiyon metodolojisi1,2'yi CRISPR / Cas9 (Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Tekrarlar) gen düzenleme teknolojisi3 ile birleştirdik.

Burada açıklanan metodoloji, embriyonik gün E9.5'te canlı fare embriyolarının amniyotik boşluğuna tasarlanmış lentivirüslerin ultrason güdümlü enjeksiyonlarını kullanır. CRISPR/Cas9 bileşenlerini içeren lentiviral yük, daha sonra cildin ve ağız boşluğunun epiteline yol açan tek katmanlı yüzey ektodermini aktarır. Cilt bir dış epidermisin, ardından bodrum membran ve dermisin oluşur. Epidermis, bodrum zarı ile teması sürdüren, proliferatif ve kök hücre kapasitesine sahip, iç, bazal bir tabakadan oluşan tabakalı bir epiteldir. Bazal tabaka, dikenli, granül ve stratum korneum katmanları2,4gibi yukarıdaki farklı katmanlara yol açar. Soy izleme çalışmaları, bu doğrudan in vivo CRISPR/Cas9 yönteminin, yetişkinlik boyunca devam eden bazal tabaka içindeki doku yerleşik kök hücreleri genetik olarak manipüle ettiğini göstermektedir. Lentivirüs, E9.5 yüzey ektodermini klonal yoğunlukta transdüze etmek için titratlanabildiğinden, bu yöntem binlerce ayrık gen nakavt klonunu barındıran mozaik fareler üretmek için kullanılabilir. Yeni nesil dizileme daha sonra crispr/cas9 aracılı gen ablasyonunun bu klonlar içindeki etkisini çok katlı bir şekilde analiz etmek için kullanılabilir5.

Son zamanlarda bu yöntemi, insan Baş ve Boyun Skuamöz Hücreli Karsinom (HNSCC)5'tetekrarlayan mutasyonlar gösteren 484 genin işlevini değerlendirmek için kullandık. HNSCC% 40-50 yüksek ölüm oranına sahip yıkıcı bir kanserdir ve dünya çapında en sık görülen6. HNSCC, üst hava yolunun veya ağız boşluğunun mukozal astarlarında ortaya çıkar ve tütün ve alkol tüketimi veya insan papillomavirüs (HPV) enfeksiyonu ile ilişkilidir. Cutaneous Skuamöz Hücreli Karsinom (SCC) cilt tümörleridir ve insanlarda en sık görülen ikinci kanseri temsil eder7. Cutaneous SCC ve HNSCC histolojik ve moleküler olarak çok benzerdir, TP53, PIK3CA, NOTCH1 ve HRAS8'dedeğişiklik sergileyen vakaların yüksek bir yüzdesi ile. Yüksek frekansta mutasyona uğramış sadece bir avuç gen olsa da, genellikle uzun kuyruk dağılımı olarak adlandırılan bir fenomen olan düşük frekansta mutasyona uğramış yüzlerce gen (< % 5) vardır. Uzun kuyruklu genlerin çoğunluğu biyolojik veya klinik doğrulamadan yoksun olduğu için, bu in vivo CRISPR tarama teknolojisini p53, Pik3ca veya Hras'ta hassaslaştırıcı mutasyonlarla tümöre eğilimli farelerde bu genlerin fonksiyon kaybını modellemek için kullandık ve tümör gelişimini tetiklemek için p53, Pik3ca veya Hras ile işbirliği yapan birkaç yeni tümör baskılayıcı gen tanımladık5.

Burada, çok katlı sgRNA lentiviral CRISPR sgRNA kütüphaneleri oluşturmak ve fare yüzeyi ektoderminde CRISPR / Cas9 gen nakavt ekranları gerçekleştirmek için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz. Not olarak, bu metodoloji CRISPR aktivasyonu (CRISPRa) ve CRISPR inaktivasyonu (CRISPRi) gibi diğer gen manipülasyon teknolojilerini içerecek şekilde uyarlanabilir veya gen işlevlerini incelemek için faredeki diğer organ sistemlerini hedef alacak şekilde değiştirilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu protokol Toronto Üniversitesi IACUC'a uygun olarak onaylandı ve gerçekleştirildi.

1. Havuza sahip CRISPR kütüphanelerinin tasarımı ve klonlatimi

  1. Broad Institute sgRNA tasarımcısı (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design) veya CHOPCHOP sunucusu (https://chopchop.cbu.uib.no) gibi kaynaktan ilgi çekici fare genlerini hedefleyen 4-5 sgRNA'yı seçin. Eşit büyüklükte hedeflemesiz kontroller gRNA kitaplığı oluşturmak için Sanjana ve ark.9 gibi eşit sayıda hedefleme dışı sgRNA seçin.
  2. SgRNA kütüphanelerini oluştururken, hedeflenen organ sistemindeki her sgRNA için yeterli kapsama alanı olduğundan emin olun. Fare derisi için, E9.5'teki epidermis, çoğu kök hücre kapasitesi4olan ~ 150.000 hücre içeren tek bir katmandır. Lenti-viral transdüksiyon %15-20 enfektivite ile sonuçlanırsa, E9.5'te sadece 18.000-24.000 hücre transdüklenecektir. Deneyi buna göre ölçeklendirin.
  3. Bu sgRNA kütüphanelerinin klonlandırılması ve amplifikasyonu için, BsmBI enzim kısıtlama sitelerinin yanı sıra sgRNA'nın 5' ve 3' ucuna astar bağlama DNA dizilerini ekleyin ve elde edilen tam uzunlukta oligoları havuzlu oligonükleotid çipi olarak sipariş edin (Şekil 1A).
    1. Bir yongada farklı kitaplıkları çoklamak için kitaplığa özgü astar dizileri ekleyin.
    2. Uygun astar çiftlerini kullanarak, her kütüphaneyi havuza alınan oligo yongasından ayrı olarak güçlendirin. Bir PCR tüpünde, 25 μL 2x polimeraz ana karışımı, 20 μL DNase / RNase içermeyen su, 5 ng oligo çip DNA'sı, 2,5 μL uygun ileri astar ve 2,5 μL uygun ters astar karıştırın. PCR makinesindeki her döngü için 12-15 döngü kullanın ve 98 °C denatürasyon, 63-67 °C tavlama, 72 °C uzatma parametreleri ile güçlendirin.
    3. PCR ürününü % 2,5 agarose jel üzerinde çalıştırın ve jel DNA temizleme kiti kullanarak ~100 bp PCR ürününü saflaştırın.
  4. Omurga plazmidini hazırlayın.
    1. Üreticinin talimatlarına göre 55 °C'de 1 saat boyunca 50 μL reaksiyon karışımında 2 μL BsmBI ile pLKO-Cre doldurucu v3 plazmid içeren Cre-recombinaz'ın 5 μg'sını ve ardından 37 °C'de 45 dakika boyunca 1 μL alkalin fosfataz inkübasyonunu sindirin.
      NOT: pLKO-Cre doldurucu v3 plazmid içeren Cre-recombinaz, fare hücrelerindeki Lox-Stop-Lox kasetini çıkarmak için Cre-rekombinaz enzimi içeren ve ayrıca sgRNA ve tracrRNA ifadesini yönlendiren bir U6 promotörüne sahip olan lenti-viral bazlı bir plazmiddir. Cas9 ve Cas9 içermeyen bir sürüm Addgene #158030 ve #158031'da kullanılabilir.
    2. Sindirilen DNA'yı %1 agarose jel üzerinde çalıştırın ve jel DNA temizleme kiti kullanarak 7 kb doğrusallaştırılmış vektör bandını arındırın. Not olarak, başarılı bir özet gösteren 2 kb'lık bir doldurma bandı da görünmelidir.
  5. Bir sgRNA plazmid kütüphanesi oluşturmak için ligasyon reaksiyonunu ayarlayın.
    1. 1 μg saflaştırılmış vektör ve 30 ng saflaştırılmış PCR kesici ucu 2 μL BsmBI, 5 μL T4 DNA ligaz, 10 μM ATP ve BsmBI'ye özgü 1x tampon ile karıştırın. Ligasyon karışımını gece boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın. Negatif kontrol olarak PCR kesici uç hariç yukarıdaki tüm malzemeleri içeren ek bir tüp kullanın.
    2. Ertesi gün sabahı, oligo temizleme kitini kullanarak ligasyon karışımını arındırın ve 7 μL RNase / DNase içermeyen suda elute edin.
  6. Kütüphaneyi yetkin hücrelere elektroporatlayın.
    1. Buz üzerinde önceden soğutulmuş cuvettes (1,0 mm) içinde 25 μL çözülmüş elektro-rekabet hücrelerine 2 μL eluted sgRNA kütüphanesi veya negatif kontrol ligasyon karışımı ekleyin. Üreticinin protokolüne uygun elektroporat (10 μF, 600 Ohms, 1800 Volt). Cuvette 10 sn içinde 975 μL geri kazanım ortamı (veya SOC ortamı) ekleyin.
    2. Elektroporlu hücreleri bir kültür tüpüne aktarın ve 300 rpm'de bakteri sallayan bir inkübatörde 37 °C'de bir saat kuluçkaya yatırın.
  7. SgRNA başına dönüşüm verimliliğini ve kütüphane kapsamını tahmin edin.
    1. SgRNA kütüphanesi veya negatif kontrol ligasyonu ile elektroporlanmış hücreleri içeren dönüşüm reaksiyonunun 10 μL'lik kısmını 990 μL Geri Kazanım Ortamına aktararak 100 kat seyreltme hazırlayın ve iyice karıştırın.
    2. Seyreltilmiş dönüşümün plakası 10 μL önceden ısıtılmış 10 cm LB + ampisilin (100 μg/L) agar plakası üzerine. Bu, transformantların 10.000 kat seyreltilmesine neden olur ve dönüşüm verimliliğini hesaplamak için bu plakayı kullanır. Plakaların 14-16 saat boyunca 30 °C'de inkübasyonunu gerçekleştirin.
  8. Toplam 10 önceden ısıtılmış 15 cm LB + ampisilin agar plakasının her plakasına 100 μL geri kazanılan hücre yayarak dönüşüm reaksiyonunun geri kalanını plakalayın. Plakaları 30 °C'de 14-16 saat kuluçkaya yatırın. Not olarak, 30 °C'deki büyüme, viral plazmid içindeki iki uzun terminal tekrarı arasındaki rekombinasyonu en aza indirir.
  9. Klonlama başarısını değerlendirmek için dönüşüm verimliliğini hesaplayın. SgRNA kütüphanesinden veya negatif kontrol ligasyonundan dönüştürücüler içeren seyreltme plakasındaki kolonilerin sayısını sayın (10 cm plakalar, adım 1.8.2). Negatif kontrol karışımı herhangi bir veya sadece çok az koloniye sahip olmamalıdır. Toplam koloni sayısını elde etmek için koloni sayısını 10.000 ile çarpın.
    NOT: Sayılan toplam koloni sayısı, sgRNA başına en az 200x koloni olması gereken bir kütüphane kapsamını temsil eder.
    1. 2000 sgRNA'lı bir kütüphanenin en az 400.000 koloniye sahip olmasını sağlayın. Yeterli koloni olmaması durumunda, tekrarlayın ve daha fazla elektroporasyon kurun.
  10. Kalite kontrolü: Seyreltme plakasından 20 koloni seçin ve her koloniyi 3 mL LB ortam + ampisilin içeren ayrı bir kültür tüpüne ekleyin. 20 tüpün hepsini 30 °C'de bir gecede 250 rpm'de sallayarak kuluçkaya yatırın. Üreticinin talimatlarına göre mini hazırlık kiti kullanarak plazmid DNA'sını saflaştırın ve Sanger, her numunenin U6 astarını (5'-GAG GGC CTA TTT CCC ATG ATT CC-3') kullanarak farklı bir sgRNA dizisine sahip olduğunu doğrulamak için tüm 20 plazmid DNA örneğini sıralayın.
  11. Kolonileri her 15 cm plakadan hasat edin.
    1. 7 mL LB orta ekleyin, ardından kolonileri lb Agar plakasından bir hücre serpici ile kazıyın. Hücreleri 2 L steril konik şişeye aktarmak için 10 mL pipet kullanın. 2 L şişedeki tüm plakalar ve havuz bakterileri için tekrarlayın. Matarayı 30 °C'de 2-3 saat sallanarak kuluçkaya yatırın. Kültürü santrifüjle ve peletin toplayın.
    2. Plazmid DNA'larını maksi-plazmid saflaştırma kiti kullanarak arındır.
  12. Ek kalite kontrolü: 1 ng maxi-prep sgRNA kütüphanesi plazmid DNA kullanın ve üreticinin talimatlarına göre Yeni Nesil dizileme astarları kullanarak bir PCR reaksiyon çalıştırın. Kütüphanedeki tüm sgRNA'ların temsili derin sıralama platformu ile doğrulanabilir.

2. In vivo transdüksiyon için uygun yüksek titer lentivirüs üretimi

NOT: Protokolün bu bölümündeki tüm adımları Sınıf II, Tip A2 biyogüvenlik kabininde bir BSL2+ tesisinde gerçekleştirin. 293FT ve özellikle 293NT ambalaj hücreleri daha yüksek virüs üretimine izin verir. Transfeksiyonlar için düşük pasajlı (

  1. Viral ambalaj hücreleri hazırlayın.
    1. 1. Günde, 6 poli-L-lizin üzerindeki plaka HEK293T hücreleri büyüme ortamlarında % 35 izdiahta 15 cm plaka kapladı (DMEM + % 10 FBS +% 1 Penisilin-Streptomisin antibiyotik çözeltisi (w / v)). Hücreleri gece boyunca 37 °C, %5 CO2'dekuluçkaya yatırın.
    2. Kaplamalı hücreler % 70-80 birleştiğinde ve eşit olarak yayıldıktan sonra, büyüme ortamını 25 mL serum ve antibiyotik içermeyen DMEM ortamı ile değiştirin.
    3. HEK293T ve 293NT hücreleri doku kültürü plastiğinden kolayca ayrılabildiğinden, beslenirken şişelerin kenarlarına yavaşça ortam ekleyin
  2. Transfeksiyon karışımını hazırlayın.
    1. 6 mL'ye psPAX2 lentiviral ambalaj plazmidleri, 43 μg VSV-G ekspresyaklı zarf plazmid pMD2.G, 65 μg sgRNA kütüphanesi plazmid ve 6 mL'ye 240 μL 1 mg/mL polietilenimin (PEI) ekleyin.
      NOT: Bu adımdaki pH kritik olduğundan ve DMEM açıldıktan sonra zaman içinde daha temel hale geldiğinden, transeksiyon için her zaman açılmamış veya çok yakın zamanda açılmış bir DMEM şişesi kullanın.
    2. Oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatır. Bu transfeksiyon karışımı, 870 cm2 yüzey alanına sahip 6 x 15 cm plakalar üzerine kaplanan hücreler için yeterlidir. Transfeksiyon karışımını deneyin gereksinimlerine göre ölçeklendirin.
  3. Viral ambalaj hücrelerinin transfeksiyon.
    1. 15 dakikalık inkübasyondan sonra, 15 cm plakanın her birini, transfeksiyon karışımının 1 mL'lik kısmını plaka boyunca damla yönünde ekleyerek transfectectect. 37 °C'de kuluçkaya yatır, 8 saat boyunca%5 CO 2.
    2. İnkübasyondan sonra, transfection karışımını içeren serumsuz ortamı çıkarın ve 15 cm plakalara ve kültüre 37 °C'de 48 saat, % 5 CO2için 30 mL düzenli kültür ortamı ekleyin.
  4. 48 saat sonra, viral süpernatantı toplayın ve 0,45 μm PVDF filtreden filtreleyin. 1 mL viral süpernatant tutun ve kalite kontrolü ve viral titering için -80 °C'de saklayın.
  5. SW28 rotor başlığı kullanarak yüksek hızlı santrifüjde sakkaroz gradyan santrifüjleme ile viral süpernatantı konsantre edin.
    1. Prime ultracentrifuge tüpleri % 70 etanol ile yıkayarak, ardından PBS ile 3 durulama. Viral süpernatantın yaklaşık 30 mL'lik kısmını 6-ultracentrifuge tüpünün her birine eşit olarak dağıtın.
    2. Her tüpün dibine hafifçe pipet% 20 sakkaroz çözeltisinin 4 mL'si (100 mL PBS'de 20 g sakkaroz). Altı ultrasantrifüj tüpünü altı SW28 salıncak kovasına yerleştirin ve viral süpernatant ekleyerek veya çıkararak her bir karşıt kova çiftini hassas bir şekilde dengeleyin.
    3. Santrifüj viral süpernatant 4 °C'de en az 2 saat ve 4 saate kadar 80.000 x g ve 4 °C. Santrifüjleme yapıldıktan sonra, süpernatantı dikkatlice atın.
    4. Ultracentrifuge tüplerini steril yumuşak kağıt havluya en az 2 dakika baş aşağı yerleştirerek kalan süpernatantı boşaltın ve herhangi bir artık ortamdan kurtulmak için yumuşak bir kağıt havlu kullanarak tüpün içindeki herhangi bir süpernatant damlacığını silin. Tüpün dibinde küçük grimsi beyaz bir pelet görülebilir.
    5. Her tüpe 20-25 μL soğuk, taze PBS ekleyin. Parafin filmi ile tüpleri kapatın ve tüpleri buz üzerinde dik olarak kapatın ve yörüngesel platform çalkalayıcıda ~2 saat boyunca hafifçe sallayın.
    6. 20 μL pipet kullanarak, kabarcıklar oluşturmamaya dikkat ederek ilk tüpün peletini dikkatlice yerinden sökün ve yeniden indirin. Ortamı bir sonraki tüpe aktarın ve tüm virüs topakları yerinden çıkana ve yaklaşık 120-150 μL hacimde tek bir tüpte birleştirilene kadar işlemi tekrarlayın. Bu yüksek titrek viral süspansiyonu hafifçe sallayarak buz üzerinde başka bir ~2 saat kuluçkaya yatırın.
    7. Viral süspansiyonu 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve tüpü 4 °C'de 2 dakika boyunca 12.000 x g'da soğutulmuş ve önceden soğutulmuş bir masa üstü santrifüjde döndürün. Aliquot açık viral süpernatant dikkatlice ayrı 0.2 mL tüplerde 10 μL aliquots olarak ve -80 ° C'de saklayın. Embriyonik enjeksiyonlar sırasında iğneyi tıkayacağından, peleni tüpün altındaki atın.
  6. Havuzlu CRISPR lentivirus kütüphanesinin titrasyonu
    NOT: Elde edilen viral süspansiyon yaklaşık 2.000 kat konsantrasyon ve ortaya çıkan virüs çözeltisi vermeli ve viral titreye sahip olmalıdır10 7-10 9Aşağıda açıklanan 100'den fazla E9.5 ameliyatı için yeterince iyidir.
    1. Tohum R26-Lox-STOP-Lox-tdTomato fare embriyonik fibroblastlar (MEF'ler) veya R26-Lox-STOP-Lox-tdTomato birincil keratinositleri veya başka bir Cre-reporter hücre hattını 2 x 6 kuyu plakasına koyun.
    2. Hücre ~%40 izdiah ederliğe ulaştığında, hücreler transdüksiyona hazırdır. O zaman, viral titerin daha sonra hesaplanmasını sağlamak için bir kuyudaki hücre sayısını belirleyin. Cre-reporter hücrelerinin medyasını 10 μg/mL polibren (=hexadimethrine bromür) ile desteklenmiş büyüme ortamına değiştirin.
    3. 1 μL konsantre virüsü 2 mL büyüme ortamı ile seyreltin. 0, 10, 50, 200 μL seyreltilmiş viral süspansiyon ve 2.4 adımından 50.200 μL konsantre olmayan virüs ekleyin ve plakaları karıştırın ve 37 °C, % 5 CO2'degece boyunca kuluçkaya yatırın.
    4. Ertesi gün virüs içeren büyüme medyasını çıkarın, PBS ile hücreleri yıkayın ve normal büyüme ortamıyla değiştirin. Bu noktadaki üstünlük hala viral atık olarak kabul edilir ve kurumsal BSL2 yönetmeliklerine uygun olarak bertaraf edilmelidir.
    5. Transdüksiyondan yaklaşık 36-48 saat sonra, Lox-STOP-Lox kasetinin Cre aracılı rekombinasyonunu ve tdTomato'nun FACS tarafından ekspresyonunu değerlendirin. Viral titreyi hesapla. Aşağıdaki formülü kullanarak koloni oluşturma birimlerini (cfu)/mL hesaplayın:
      Equation 1
      NOT: Konsantre viral süspansiyon ile unconcentrated viral supernatant arasındaki karşılaştırma, (1) viral üretimin ve (2) viral konsantrasyonun başarısını tahmin etmeyi sağlayacaktır. Alternatif olarak, viral titer qRT-PCR yöntemi kullanılarak tahmin edilebilir10. Büyük ölçekli lentivirüs üretimi ve konsantrasyonu, kartuş konsantrasyonu ile iki adımlı bir konsantrasyon kullanılarak da gerçekleştirilebilir ve ardından daha önce açıklandığı gibi ultrasantrifüjleme2.

3. Ultra sağlam kılavuzlu cerrahi ve enjeksiyon

NOT: Bu teknoloji4,11'denuyarlanmıştır. Yüzey epitelinin transdüksiyonuna yönelik mikroenjeksiyon, yüzey ektoderminin tek bir tabakadan oluştuğu embriyonik gün E9.5'te ve E10'dan başlayarak periderm oluşumundan önce yapılmalıdır, bu da bu bazal tabakanın transdüksiyonuna engel olacaktır. Tercihen Cuma günü fareler kurun, böylece E9.5 embriyoları ile mümkün olan ilk gün ertesi Pazartesi günüdür. Optimum CRISPR/Cas9 verimliliği için Rosa26-Lox-STOP-LOX-Cas9-GFP farelerini (Jackson Laboratory #024857) kullanın12.

  1. İstenilen ameliyat tarihinden 10 gün önce zamanlanmış gebelikler için uygun erkek ve dişi fareleri ayarlayın.
    1. Potansiyel olarak hamile fareleri tanımlamak için sonraki günlerde fareleri takın. Ultrason kullanarak planlanan ameliyattan bir gün önce (yani E8.5) gebeliği onaylayın.
  2. Modifiye Petri kabını hazırlayın.
    1. Çift taraflı yapışkan bandı kullanarak, silikon zarı dairesel açıklığı kaplayan Petri kabının altına yapıştırın. Keskin makas kullanarak silikon zarda 2 x 10 mm oval bir açıklık kesin.
  3. Mikroenjeksiyon sisteminin hazırlanması
    1. Aşağıdaki ayarlarla bir mikropipette çekerek kalın duvarlı bir cam kılcal damardan enjeksiyon iğneleri hazırlayın: Basınç = 200; Isı = 769; Çekme = 0; Hız = 140; Saat = 100.
    2. İğne ucunu çapının ~30 μm olduğu seviyede kesmek için ince makas kullanmak. İğneyi, 20 dakika boyunca düzenli ıslatma ile ince dereceli aşındırıcı bir plaka üzerinde 20 ° 'ye kadar iğne bileyici kullanarak eğimlendirin.
    3. 26 G1/2 iğneli 10 mL şırınga kullanarak %70 etanol iterek mikroenjeksiyon iğnesini sterilize edin. 10 mL şırınga ve mineral yağ yüklü 26 G1/2 iğne kullanarak mikroenjeksiyon iğnesini doldurun. Mikroenjeksiyon iğnesinde kabarcık olmadığından emin olun.
    4. Mikroenjektör iğnesini üretici talimatlarına göre mikromanipülatöre monte edin.
  4. İğneyi viral sgRNA kütüphanesi ile yükleyin.
    1. Düz bir yüzeye sabitlenmiş bir parafilme pipet 10 μL viral süspansiyon.
    2. Mikromanipülatör kullanarak mineral yağı dışarı atın. İğnede az miktarda yağ bulunması, lentivirüslerin pistona temas etmesini önleyecektir. Herhangi bir hava kabarcığı olmadan yavaş aspirasyon ile yaklaşık 4-5 μL viral süspansiyon yükleyin.
  5. İzofluran indüksiyon odasını kullanarak hamile fareyi uyuşturmak. Oksijen regülatörü 1 L/dk ve izofluran buharlaştırıcı %2 olarak ayarlayın. Hayvanın uyuşturulup uyuşturulmamasını belirlemek için, izofluran indüksiyon odasında ~3-5 dakika sonra ayak parmağı kıstırma ile kontrol edin.
  6. Uyuşturulmuş hayvan ventral tarafını ısıtılmış ameliyat aşamasına (40 °C) yerleştirin ve ameliyat tamamlanana kadar sürekli izofluran ve oksijen temini için burun konisi anestezi tüpü ile pençeleri yerinde tutmak için ameliyat bantları uygulayın.
  7. E8.5'te yapılmadıysa E9.5 gebeliği onaylayın.
    1. Karın bölgesine az miktarda (~ 1/2 tsp) epilasyon kremi uygulayın ve pamuk uçlu bir aplikatör kullanarak 3 x 3 cm'lik bir alana yayın.
    2. 2-3 dakika sonra, kremayı gazlı bez veya doku ile hafifçe çıkarın ve PBS ve% 70 etanol kullanarak bölgeyi temizleyin.
    3. Ultrason probu ve jel kullanarak, embriyonik gün E9.5 için hamile fare kontrol edin. Not olarak, bu, gerçek ameliyat gününde zaman kazanmak için önceki gün E8.5'te de yapılabilir.
    4. Ultrason jelini çıkarın ve BPS kullanarak bölgeyi temizleyin ve ardından dezenfekte etmek için% 70 etanol.
  8. Fare barajına 0,02 cc Buprenorfin analjezik deri altından enjekte edin.
  9. Rahmi cerrahi olarak maruz bırakmak
    1. Steril dikgenler ve makas kullanarak, farenin derisine dikey ~2 cm'lik bir kesi yapın.
    2. Künt tokmalar kullanmak kesi etrafındaki cildi peritondan ayırır.
    3. Steril tonlar ve makas kullanarak peritonları kesin.
    4. Künt tokmaklar kullanarak, sol ve sağ rahim boynuzu yavaşça çekin ve embriyoları sayın.
    5. Rahim boynuzlarının çoğunu yeniden yerleştirin, ancak 3 embriyo içeren bir rahim boynuzu distal ucunun açıkta bırakın.
    6. Künt tokparlamalar kullanarak, modifiye Petri kabının silikon zarındaki açıklıktan 3 embriyo ile uterusu hafifçe itin ve çekin.
    7. Petri kabını modelleme kili küpleri kullanarak stabilize edin.
  10. Silikon bir kalıp kullanarak Petri kabının içindeki üç embriyo ile uterusu stabilize edin. Silikon fişi keskin bir bıçak kullanarak embriyoların yan tarafında düzleştirin.
  11. Petri kabını steril PBS ile doldurun. Petri kabının altındaki silikon zarı hamile barajın göbeğiyle yıkayın, böylece herhangi bir sızıntıyı önleyin.
  12. Ultrason başlığını üst embriyonun üzerinde Petri kabına ~ 0,5 cm hareket ettirin ve amniyotik boşluğun ultrason görünümünde açıkça görülebilmesi için aşamayı ayarlayın.
  13. Enjektör iğnesini modifiye Petri kabına dikkatlice hizalayın. Mikromanipülatörü kullanarak, iğnenin ucunu üst embriyonun ~ 5 mm'sine yerleştirin. Sonra iğneyi ileri geri değiştirin ve ucunun ultrason görüntüsünde en parlak göründüğü düzleme doğru hareket edin.
  14. Mikromanipülatör kullanarak iğneyi rahim duvarından amniyotik boşluğa itin.
  15. SgRNA kütüphanesi içeren lentivirüs enjekte edin.
    1. Enjektörü 62 nL'ye ve yavaş enjeksiyon hızına önceden programla. Mikroenjektör, belirli hacimleri yavaş veya hızlı bir hızda enjekte etmek için programlanabilir.
    2. Embriyo başına toplam 496 nL için Enjekte düğmesine 8 kez basın. Ses seviyesini gerekli ihtiyaçlara ve viral titreye göre ayarlayın. 1 x 108 pfu/mL ve 496 nL enjeksiyon hacmi viral titre yaklaşık% 30 enfektiviteye neden olacaktır.
    3. Diğer iki embriyo için aynı prosedürü tekrarlayın.
    4. Ultrason başlığını kaldırın ve silikon fişi çıkarın.
    5. Steril bir pamuk takası kullanarak 3 embriyoyu yavaşça fare karnına itin.
    6. Sonraki 3 embriyoyu yavaşça çekin ve istenen sayıda embriyo enjekte edilene kadar enjeksiyon prosedürünü tekrarlayın.
      NOT: Hamile barajların embriyolarını bu süreden sonra iptal etme olasılığı çok daha fazla olduğundan 30 dakika anesteziyi aşmayın. Deneyimli bir cerrah 30 dakikalık ameliyat içinde 12 embriyoya kadar enjekte edebilir.
  16. Ultrason başlığını kaldırın, mikromanipülatörü iğneyle çıkarın, PBS'yi aspire edin ve petri kabını çıkarın. Steril mendiller kullanarak, karın boşluğunda biriken PBS'leri emin.
  17. Emilebilir dikişler kullanarak periton kesisini kapatın. Karın derisindeki kesiği kapatmak için iki zımba kullanın.
    NOT: Rahim ameliyatlarında ultra sağlam güdümlü yapılırken, temiz bir çevrenin korunmasına, sterilitenin mümkün olduğunca korunmasına ve olası kirleticilerden uzak durulması için azami özen gösterilmelidir. Aynı gün içinde birden fazla ameliyat yapılması gerekiyorsa, diseksiyon aletlerinin boncuk sterilizatörü kullanılarak sterilize edilmesi ve etanol ile temizlenen fare dokusu ile karşılaşan diğer aparatların temizlenmesi önemlidir. Bu, ameliyat sonrası embriyoların daha yüksek hayatta kalmasını büyük ölçüde arttırır. Burada açıklanan ameliyat yönteminin sağkalım oranı sürekli olarak %80-100 arasındadır.
  18. Ameliyat sonrası bakım.
    1. Hamile dişinin ısıtılmış bir kafeste iyileşmesine izin verin ve 15-30 dakika gözlemleyin.
    2. Vajinal kanalı kan için kontrol edin, bu erken kürtaj ve komplikasyon belirtisidir. Ameliyat sonrası ağrı kesici için, ameliyattan sonraki iki gün boyunca günde iki kez analjezik uygulamayı yapın.
  19. Transdüklenmiş embriyoları/yenidoğan Rosa26-Lox-STOP-Lox-Cas9-GFP farelerini floresan diseksiyon mikroskobu, floresan protein el feneri ve filtre gözlükleri kullanarak veya kulak veya kuyruk klipslerindeki entegre viral parçacıklar için genotipleme yaparak tanımlayın.
    NOT: Fareler en iyi, saçlar uzamaya başlamadan önce doğum sonrası 3 güne kadar floresan mikroskop kullanılarak tanımlanır.
  20. CRISPR kitaplığı için yeterli kapsama alanı sağlamak için, aşağıdaki parametrelere göre kapsama alanını hesaplayın: E9.5 fare yüzeyi ektoderm ~150.000 hücreden oluşur; ~%20'lik transdüksiyon minimum çift enfeksiyon oranı (~1/10 çift enfekte hücre)4,5,11; %20 enfektivitede, her embriyoda 30.000 enfekte hücre vardır. Belirli bir sgRNA ile en az 100 ayrı hücrenin transdükte olduğundan emin olun. Örneğin, 2000 sgRNA'lık bir havuz 2 x 105 hücre veya 6-7 hayvan gerektirir.

4. Derin sıralama prosedürü

  1. Tümör oluşumu veya başka bir fenotip gibi deneysel uç nokta üzerine, fareyi kurban edin ve ilgi dokusunu toplar. Üreticinin protokolüne uyarak genomik DNA'yı arındırmak için kan ve doku DNA ekstraksiyon kiti kullanın. Tümörlerden DNA ekstraksiyonu başlamadan önce, çalışma tezgahını DNA Erase ile temizleyin ve plazmidlerin işlendiği laboratuvar alanından uzakta çalışın.
    NOT: Zaman içinde sgRNA katlama değişikliklerinin hesaplanmasına izin vermek için bir referans örneği oluşturmak önemlidir. Transdüklenmiş embriyolar enfeksiyondan 3 gün sonra veya transdüklenmiş hücreler (bkz. adım 2. 6) orijinal kütüphanede sgRNA gösterimini belirlemek için referans örnek olarak hizmet edebilir.
  2. Tablo 1'de listelenen dış astarları ve Tablo 2'de özetlenen PCR programını kullanarak 50 μL ön amplifikasyon PCR 1 reaksiyonunda şablon olarak 100 ng – 1,5 μggenomik DNA kullanın. İstenilen kapsamayı sağlamak için yeterli reaksiyon ayarlayın.
    NOT: Barkodlama PCR reaksiyonunu laboratuvarın ayrı bir özel alanında veya herhangi bir kirlenmeyi önlemek için DNA silme ile iyice temizlenen bir doku kültürü kaputunda ayarlayın. Kirlenme olmadığından emin olmak için şablon olarak su içeren her PCR plakası için negatif kontrol çalıştırın.
  3. Tüm PCR 1 reaksiyonlarını bir araya çekin ve 600 bp bandın başarılı amplifikasyonu doğrulamak için% 1,5 kontrol agarose jel üzerinde 20 μL çalıştırın.
  4. Tablo 3'te listelenen benzersiz barkodlu astar kombinasyonu ve Tablo 4'te özetlenen PCR programı kullanılarak 50 μL PCR 2 reaksiyonunda şablon olarak havuza alan PCR1 reaksiyonunun 5 μL'sinikullanın. %2 agarose jel üzerinde 50 μL PCR 2 reaksiyonu çalıştırın ve üretici talimatlarına göre jel çıkarma kiti kullanarak 200bp bandını arındırın.
    NOT: Ön amplifikasyon adımı sadece karmaşık bir transdüklenmiş dokunun amplifikasyonu için gereklidir. Muhtemelen gelişen tek bir tümörün amplifikasyonu klonal bir hücre oluşturursa ve böylece sadece tek bir sgRNA içeriyorsa, ön amplifikasyon PCR1'i atlayabilir ve pcr2 ile hemen devam edebilirsiniz.
  5. Florometrik nicelik kullanarak DNA konsantrasyonunu ölçün ve sıralama tesisine derin sıralama için gönderilir (örneğin, tümör başına 1 milyon okuma).
  6. Yalnızca kullanılmamış hizalamalara izin veren Bowtie v1.2.3 kullanın, sıralı okumaları sgRNA kitaplığı13'e hizalayın. Fasta formatında sgRNA dizilerini girerek bowtie-build komutunu kullanarak bir bowtie dizini oluşturun. Okuma hizalaması sırasında en fazla iki uyuşmazlığa izin veren ve birden fazla kitaplık sgRNA sırasını hizalayan okumaları atan -m 2 -v 1seçenekleriyle bowtie komutunu kullanarak okumaları eşleyin. Genellikle, okumaların% 80'inden fazlası bu parametrelerin altında hizalanır.
  7. Hizalanmış dosyayı giriş14olarak kullanarak okuma sayısı tablosunu elde etmek için MAGeCK count komutunu kullanın. sgRNA sayım tablosu, diferansiyel sgRNA'ların (MAGeCK) belirlenmesi ve temel genlerin (BAGEL) bulunması gibi aşağı akış analizi için kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Şekil 1A, birkaç özel CRISPR kütüphanesini tek bir 12k veya 92k oligo yongasında uygun maliyetli bir şekilde çoklandırmak için oligonükleotidlerin tasarımını göstermektedir. SgRNA'lar (mavi renk kodlu) seçildikten sonra, oligonükleotidler kısıtlama siteleri (turuncu renkli BsmBI) ve kütüphaneye özgü PCR astar çiftleri (yeşil renk kodlu) ile tasarlanmıştır. Tek bir oligo yongasında çoklama için astar çiftlerinin benzersiz kombinasyonu kullanılarak çeşitli kütüphaneler tasarlanabilir. PCR, belirli bir PCR astar çifti kullanarak kütüphaneleri yükseltirken, her zaman sadece su negatif kontrolü ekleyin ve tüm reaksiyonları bir agarose jel üzerinde çalıştırın. Negatif kontrol şeridinde 100 bp'de herhangi bir bant bulunmamalı, kitaplık yükseltilmiş şeritte ise tek bir 100 bp bandı bulunmalıdır. Bant yoksa, PCR astar çiftinin uygun şekilde seçildiğinden emin olun. Şekil 1B, klonlanmış kütüphanenin kalite kontrol adımını ve viral üretim ve konsantrasyon prosedürünü göstermektedir. SgRNA'ların klonlamadan transdüksiyona kadar eşit temsilini korumaya özen edilmelidir. Plazmid ve lenti-viral kütüphane transdüklenmiş hücrelerden PCR güçlendirilmiş DNA'nın yeni nesil dizileme okumaları yüksek korelasyon göstermelidir. Lenti-virüs hazırlığından önce mi yoksa sonra mı temsilin kaybedilmediğini incelemek için herhangi bir sapma dikkatlice analiz edilmelidir. SgRNA plazmid DNA'dan okursa, sgRNA'ların eşit temsilini göstermiyorsa, viral hazırlık ve konsantrasyon prosedürü dikkatle tekrarlanmalıdır. Plazmid DNA'da eşit sgRNA gösterimi kaybı meydana geldiyse, oligo çipinden kütüphanelerin daha az amplifikasyon döngüsüne sahip PCR amplifikasyonu da dahil olmak üzere tüm klonlama prosedürü tekrarlanmalıdır. CRISPR kitaplık taramasının başarısı, kitaplıkta bulunan sgRNA'ların eşit temsiline bağlıdır.

Şekil 2, hamile faredeki E9.5 embriyolarını manipüle etmek için kurulan ultrason güdümlü mikro enjeksiyonu göstermektedir. Tüm kurulum, tüm prosedürün steril durumunu korumak ve cerrahi prosedürler nedeniyle hamile farenin herhangi bir enfeksiyonunu önlemek için biyogüvenlik seviyesi sınıf II kabininin altına yerleştirilir. Enjekte ederken rahim boynuzlarına baskı yapılmamasına özen verilmelidir. İğne çok keskin olmalıdır, böylece rahim duvarındaki ve amniyotik zardaki yara minimumdur.

Şekil 3, doğum sonrası gün (P)0'da E9.5 Lox-stop-Lox (LSL) Konfeti fare yavrularında Cre-recombinase taşıyan lenti-virüsünün ultra sağlam güdümlü enjeksiyonunun sonuçlarını göstermektedir. Viral titer epidermisin uygun bir transdüksiyon kapsamını elde etmek için ayarlanabilir. Yüksek virüs titresi fare derisinin daha geniş kapsama alanına neden olsa da, aynı hücreye birden fazla sgRNA'nın potansiyel olarak sonuçları karıştırmasına neden olur. Tek bir hücrenin birden çok transdüksiyonunu azaltmak için enfeksiyon oranı <%lt;20 tutulmalıdır.

Şekil 4, plazmid ve lenti-viral kütüphane transdüklenmiş hücrelerden PCR güçlendirilmiş DNA'nın yeni nesil dizileme okumalarını ve ayrıca 4 temsili tümörden okuduğunu göstermektedir. Adam10 ve Ripk4'ü hedefleyen sgRNA kılavuzları, plazmid havuzunda veya enfekte hücrelerde sgRNA sunumuna kıyasla tümör örneklerinde (üçgenler ve elmaslar) zenginleştirilir. Adam10 ve Ripk4 tümör baskılayıcı olarak işlev görür5. Her numuneye benzersiz barkodlar atanarak ve protokolde belirtildiği gibi derin sıralanarak birkaç yüz tümör çoklayıcı olabilir.

Figure 1
Şekil 1: Hedeflenen CRISPR kitaplığının klonlama. (A) 12 k veya 92 k özel oligo çipi için oligonükleotidlerin tasarımını temsil eden şematik. SgRNA'nın her iki tarafına BsmBI (veya diğer uyumlu) kısıtlama siteleri (turuncu renk kodlu ve altı çizili) eklendi. Ok kafaları BsmBI kesim bölgesini gösterir. Her kütüphane için, havuza alınan yongadan PCR kullanılarak özel olarak yükseltilebilmesi için benzersiz bir PCR astar çifti (yeşil, kahverengi ve mor renk kodlu) eklendi. Birkaç özel kitaplık 12k veya 92k oligos'a kadar çoklanabilir. (B) Plazmid DNA'daki CRISPR kütüphanesinden sgRNA temsilini gösteren grafik, aynı lentiviral kütüphane ile transdüklenmiş hücrelerden alınan DNA'ya karşı. Her nokta bir kılavuzu temsil eder. Transdüksiyondan sonra bol miktarda korelasyon ile tam temsil sürdürüldü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Ultrason güdümlü mikroenjeksiyon kurulumunun resmi. (A) E9.5 embriyolarını taşıyan fare uyuşturuldu ve uterus PBS dolu modifiye Petri kabı odasında (dört modelleme kili ile stabilize edildi) maruz kalınarak ısıtılmış bir platforma yerleştirildi. Mavi yarı yuvarlak kauçuk embriyo içeren uterusu destekledi ve mikroenjektörden enjeksiyon iğnesi sağ tarafa yerleştirilmiştir. Ultrason tarama kafası, iğne kafası görünür şekilde arkadaki monitöre canlı görüntü aktaran üst üzerine monte edildi. (B) Bir E9.5 embriyosunun yakın çekim ultra ses görüntüsü. Lentiviral kütüphane amniyotik boşluğa iğne ile (sağ tarafta görülür) enjekte edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Farede yüzey epitelinin başarılı transdüksiyon. Cre lentivirüs ile transdüklenmiş yenidoğan Cre-reporter LSL-Konfeti farelerinin tüm vücut, ağız boşluğu, dil ve damak floresan görüntüleri (Giriş: ilgili beyaz ışık görüntüleri). Ölçek çubukları = 500 μm Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Tümör örneklerinin derin dizilimi. Plazmid DNA'daki CRISPR kütüphanesinden sgRNA temsilini gösteren grafik, aynı lentiviral kütüphane ile transdüklenmiş hücrelerden alınan DNA'ya ve 4 temsili tümörden alınan okumalara ek olarak. Kırmızı ve yeşil daireler, kütüphanede ve transdüklenmiş hücrelerde okunan Adam10 ve Ripk4 sgRNA sayısını gösterirken, kırmızı üçgen Adam10 sgRNA'ların okumalarını temsil eder ve yeşil elmas, 1000x kat zenginleştirme gösteren ayrı HNSCC farelerinden tümörlerde tanımlanan Ripk4 sgRNA'larının okumalarını temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

PCR1 İleri Astar GAGGGCCTATTTCCCATGATTC
PCR1 Ters Astar CAAACCCAGGGCTGCCTTGGAA

Tablo 1: PCR1 reaksiyon için primerler. Lenti virüsü ile transdüklenmiş hücrelerin genomik DNA'sından sgRNA kasetini çevreleyen bölgenin amplifikasyonu için kullanılan ileri ve ters astarlar.

adım sıcaklık Saat  
1 98 °C 30 sn
2 98 °C 10 sn
3 66 °C 30 sn
4 72 °C 15 sn 15 döngü (adım 2-4)
5 72 °C 2 dk
6 4 °C tutmak

Tablo 2: PCR1 döngü parametreleri. Lenti virüsü ile transdüklenmiş hücrelerin genomik DNA'sından sgRNA kasetini çevreleyen bölgenin amplifikasyonu için kullanılan PCR koşulları.

501 FW AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTATAGCCTACACTCTTTCCCTACACG
ACGCTCTTCCGATCTtgtggaaaggacgaaaCACCG
701 Karavan CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGAGTAATGTGACTGGAGTTCAGACGTGGCT
CTTCCGATCTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTAAAAC
* Altı çizili tabanlar, çoklama için kullanılan Illumina (ileri için D501-510 ve ters için D701-712) barkod konumunu gösterir.
* Kırmızı renkli bazlar, lentiviral CRISPR plazmidinde hedef bölgeye bağlanan sırayı gösterir. Bu bölge kullanılan lentiviral vektöre göre değiştirilebilir.

Tablo 3: PCR2 reaksiyon için Barkod Astarları. Astarlar her tümör örneğini barkodlamak için kullanılır (doğrudan genomik DNA'dan veya PCR1'den gelen ürünleri şablon olarak kullanarak). Altı çizili bölge, derin bir sıralama reaksiyonunda çoklama için her örnek için atanabilecek benzersiz barkod bölgesini gösterir. Kırmızı renkli taban çiftleri, bu astarların bağladığı lentiviral yapıdaki hedef bölgeyi gösterir. Bu hedef bölge kullanılan lentiviral yapının türüne göre değiştirilebilir.

adım sıcaklık Saat  
1 98 °C 30 sn
2 98 °C 10 sn
3 68 °C 30 sn
4 72 °C 15 sn 10 döngü (adım 2-4)
5 72 °C 2 dk
6 4 °C tutmak

Tablo 4: PCR2 döngü parametreleri. Her tümör örneğini barkodlamak için kullanılan PCR koşulları (doğrudan genomik DNA'dan veya PCR1'den gelen ürünleri şablon olarak kullanmak).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

CRISPR/Cas9 genom düzenleme, gen fonksiyonlarını ve hücresel süreçleri araştırmak için in vitro ve in vivo çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. In vivo çalışmaların çoğunda crispr/cas9 gen düzenlenmiş hücreler bir hayvan modeline (allograft veya ksinograft) aşılanmış kullanır. Bu, kanser genetiği ve hücresel fonksiyonları incelemek için güçlü bir araç olsa da, hala doğal doku mikroçevrasyonundan yoksundur ve yara ve / veya bağışıklık tepkileri ortaya çıkabilir.

Bu zorlukların üstesinden gelmek için, birkaç grup, son birkaç yılda birkaç, çoklayıcı otokton fare modeli üreten doğrudan in vivo CRISPR yaklaşımlarına öncülük etti15,16,17,18. Bu projeler genellikle hedef organlara sgRNA'lar sunmak için adeno ilişkili virüse (AAV) dayanır. AAV, çok daha yüksek titre üretimine izin verir, böylece in vivo manipülasyonlar için gerekli olan yüksek titer virüsünün üretimini kolaylaştırır. Bununla birlikte, AAV'lerin kullanımı, lentivirüs'ün aksine, AAV'lerin genomik DNA'ya bıçaklanmaması ve sgRNA kütüphanelerinin okunmasını pratik hale getirmemesi nedeniyle, analiz edilebilen gen sayısını yaklaşık 40-50 genle ciddi şekilde sınırlar. AAV tabanlı tarama, hedef bölgelerde hedef yakalama sıralaması gibi mutasyonların doğrudan okunmasını gerektirir. Ancak, çok katlı PCR tabanlı yakalama sıralaması, 'taranabilir' bir kitaplıktaki yakalanabilir hedeflerin sayısını genellikle düzinelerce15 , 16,17,18sırasıyla kısıtlar.

Vivo CRISPR ekranlarda AAV ile karşılaştırıldığında, burada açıklanan metodoloji lentiviral sgRNA'ları kullanır. Lentiviral yapıların hedef hücrenin DNA'sına entegre olduğu göz önüne alındığında, sgRNA gösterimi herhangi bir geleneksel CRISPR ekranına benzer genomik DNA'da analiz edilebilir19,20. Böylece, bu metodoloji yüzlerce genin eşzamanlı analizine izin verir ve genom çapında in vivo ekranlara bile sorunsuz bir şekilde ölçeklendirilebilir. Örneğin, 78.000 sgRNA'ya ve 30x kapsama alanına sahip genom çapında bir ekran, benzer bir shRNA ekranı4için daha önce açıklandığı gibi ~ 90 embriyo gerektirir. En yaygın inbred fare suşlarının çöp boyutları yaklaşık 8-12 yavru / çöp olduğundan ve deneyimli bir cerrah tüm fareleri bir küçük içine kolayca enjekte edebileceğinden, böyle bir genom çapında ekran için sadece yaklaşık ~ 10-12 baraj ve ameliyat gerekir.

Bir in vivo ekranın başarısı yüksek titer virüs üretimine bağlıdır. İlgi sgRNA'yı ifade eden lentiviral yapılar, Cas9 ve Cre (örneğin, pSECC) kullanışlı ve uygulanabilir bir hepsi bir arada çözüm olsa da, lentiviral kapsid için ambalaj sınırına sahiptir (toplam boyutta ~ 10 kb), genel olarak daha düşük viral titreye yol açar. Bu zorluğun üstesinden gelmek için R26-LSL-Cas9-GFP fareleri ve bir sgRNA ile birlikte sadece Cre-recombinase içeren bir lenti-viral yapı kullanıyoruz. Elde edilen lentiviral yapı sadece 7 kb uzunluğundadır ve 108 PFU / mL'den fazla viral bir titre verir.

Hedeflenen ve belirli kütüphaneler birkaç gün gibi kısa bir sürede hızlı bir şekilde oluşturulabilir ve karmaşık genetik etkileşim ağı birkaç hafta içinde in vivo olarak incelenebilir. CAS9 aracılı mutajensis, organ gelişimi, homeostaz veya hastalık fenotiplerini (kanser, enflamatuar cilt hastalıkları vb.) incelemek için vahşi tip farelerde yapılabilir veya insan hastalarda bulunan genetik durumu modellemek için herhangi bir onkojenik mutasyonu barındıran farelerle veya mutasyonların kombinasyonuyla kolayca birleştirilebilir. Buna ek olarak, klonlama metodolojisi, uyumlu kısıtlama siteleri ve sgRNA dizileri hepsi bir arada plazmid'e eklenerek CRISPRa veya CRISPRi kitaplıklarını klonlamak için rafine edilebilir. Not olarak, gen fonksiyonlarını manipüle eden tüm kütüphaneler sadece fare modellerinde değil, diğer hayvan modellerinde ve organoid kültürlerinde de kullanılabilir. Birlikte, bu metodoloji yardımcı programı vurgular ve in vivo gen fonksiyonunu hızla değerlendirmek için somatik gen düzenleme ve fare modellemesini entegre etmek için doğrudan in vivo CRISPR kullanmak için bir ortak nokta sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Bu çalışma Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüsü (CIHR 365252), Krembil Vakfı ve Ontario Araştırma Fonu Araştırma Mükemmellik Turu 8'den (RE08-065) bir proje hibesi ile desteklenmiştir. Sampath Kumar Loganathan, Kanada Kanser Derneği bursunun (BC-F-16#31919) sahibidir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 micron filter Sigma S2HVU02RE
12k or 92k oligo chip Customarray Inc. (Genscript)
15 cm cell culture plates Corning
293FT Invitrogen R70007
293NT Systems Biosciences LV900A-1
Alkaline phosphatase NEB M0290L
Amplicillin Fisher Scientific BP1760-25
ATP NEB 9804S
BsmBI NEB R0580L
Chromic gut suture Covidien
Deep sequencing (Next-Seq or Hi-Seq) Illumina
DNA-cleanup kit Zymo Research D4008
DNAesy Blood and Tissue DNA extraction kit Qiagen 69506
Endura electrocompetent cells Lucigen 60242-1
Glass Capillaries Drummond 3-000-203-G/X
HEK293T cells ATCC CRL-3216
High-Speed Centrifuge Beckman Coulter MLS-50
LB Agar Wisent Technologies 800-011-LG
Micropipette puller Sutter Instrument P97
Mineral oil Sigma M5904
Mini-prep plasmid Kit Frogga Bio PDH300
Mouse oxygen anaesthesia system Visual Sonics
Nanoject II micromanipulator Drummond
NEBuffer 3.1 (Buffer for BsmBI) NEB R0580L
Needle sharpener Sutter Instrument BV-10
Oligo cleanup kit Zymo research D4060
PAGE purified illumina sequencing primer IDT DNA
PEI (polyethyleneimine) Sigma 408727-100ML
Permoplast modeling clay
Petridish with central opening Visual Sonics
pMD2.G Addgene 12259
psPAX2 Addgene 12260
Q5 Polymerase 2x Master mix NEB M0494L
Qubit Fluorometric Quantification Invitrogen Q33327
Semicircular Silicone plug Corning
Silicone membrane Visual Sonics
T4 DNA ligase NEB M0202L
Ultra-centrifuge tubes Beckman Coulter 344058
Vevo2000 ultrasound system Visual Sonics

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Beronja, S., Fuchs, E. RNAi-mediated gene function analysis in skin. Methods in Molecular Biology. 961, 351-361 (2013).
  2. Beronja, S., Livshits, G., Williams, S., Fuchs, E. Rapid functional dissection of genetic networks via tissue-specific transduction and RNAi in mouse embryos. Nature Medicine. 16, 821-827 (2010).
  3. Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343, 84-87 (2014).
  4. Beronja, S., et al. RNAi screens in mice identify physiological regulators of oncogenic growth. Nature. 501, 185-190 (2013).
  5. Loganathan, S. K., et al. Rare driver mutations in head and neck squamous cell carcinomas converge on NOTCH signaling. Science. 367, 1264-1269 (2020).
  6. Leemans, C. R., Snijders, P. J. F., Brakenhoff, R. H. The molecular landscape of head and neck cancer. Nature Reviews Cancer. 18, 269-282 (2018).
  7. Green, A. C., Olsen, C. M. Cutaneous squamous cell carcinoma: an epidemiological review. British Journal of Dermatology. 177, 373-381 (2017).
  8. Campbell, J. D., et al. pathway network, and immunologic features distinguishing squamous carcinomas. Cell Reports. 23, 194-212 (2018).
  9. Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nature Methods. 11, 783-784 (2014).
  10. Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. Comparison of lentiviral vector titration methods. BMC Biotechnology. 6, 34 (2006).
  11. Schramek, D., et al. Direct in vivo RNAi screen unveils myosin IIa as a tumor suppressor of squamous cell carcinomas. Science. 343, 309-313 (2014).
  12. Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159, 440-455 (2014).
  13. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10, 25 (2009).
  14. Li, W., et al. MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knockout screens. Genome Biology. 15, 554 (2014).
  15. Winters, I. P., Murray, C. W., Winslow, M. M. Towards quantitative and multiplexed in vivo functional cancer genomics. Nature Reviews Genetics. 19, 741-755 (2018).
  16. Rogers, Z. N., et al. Mapping the in vivo fitness landscape of lung adenocarcinoma tumor suppression in mice. Nature Genetics. 50, 483-486 (2018).
  17. Chow, R. D., et al. AAV-mediated direct in vivo CRISPR screen identifies functional suppressors in glioblastoma. Nature Neuroscience. 20, 1329-1341 (2017).
  18. Wang, G., et al. Mapping a functional cancer genome atlas of tumor suppressors in mouse liver using AAV-CRISPR–mediated direct in vivo screening. Science Advances. 4, 5508 (2018).
  19. Chan, K., Tong, A. H. Y., Brown, K. R., Mero, P., Moffat, J. Pooled CRISPR-based genetic screens in mammalian cells. Journal of Visualized Experiments. (151), e59780 (2019).
  20. Hart, T., et al. High-resolution CRISPR screens reveal fitness genes and genotype-specific cancer liabilities. Cell. 163, 1515-1526 (2015).

Tags

JoVE'de Bu Ay Sayı 165 in vivo CRISPR ultrason destekli mikro enjeksiyon uzun kuyruk CRISPR kütüphanesi kanserin fare modelleri hızlı in vivo ekran
Fare Derisi ve Ağız Boşluğundaki Gen İşlevlerini Aynı Anda Değerlendirmek için Vivo CRISPR/Cas9 Taraması
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Loganathan, S. K., Malik, A.,… More

Loganathan, S. K., Malik, A., Langille, E., Luxenburg, C., Schramek, D. In Vivo CRISPR/Cas9 Screening to Simultaneously Evaluate Gene Function in Mouse Skin and Oral Cavity. J. Vis. Exp. (165), e61693, doi:10.3791/61693 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter