Summary
हम फ्लोरेसेंस सक्रिय सेल छंटाई का उपयोग करके माउस एपिडिडिमल फैट पैड से अत्यधिक व्यवहार्य आदिपोज प्रोजेनिटर कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक सरल तरीका पेश करते हैं।
Abstract
मोटापा और मेटाबोलिक विकार जैसे मधुमेह, हृदय रोग और कैंसर, सभी नाटकीय एडीपोज ऊतक रिमॉडलिंग से जुड़े हुए हैं। ऊतक-निवासी एडिपोज प्रोजेनिटर कोशिकाएं (एपीसीएस) ऊतक होमोस्टेसिस में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं और ऊतक विकृति में योगदान दे सकती हैं। एकल सेल विश्लेषण प्रौद्योगिकियों का बढ़ता उपयोग-एकल सेल आरएनए-अनुक्रमण और एकल-कोशिका प्रोटेओमिक्स सहित-जनसंख्या या ऊतक-व्यापी परिवर्तनों के संदर्भ में व्यक्तिगत सेल अभिव्यक्ति परिवर्तनों के अभूतपूर्व संकल्प की अनुमति देकर स्टेम/जनकक्षक क्षेत्र को बदल रहा है । इस लेख में, हम माउस एपिडिडिमल एडीपोज ऊतक को विच्छेदन करने, एकल एडीपोज ऊतक-व्युत्पन्न कोशिकाओं को अलग करने, और व्यवहार्य Sca1+ /CD31-/CD45-/Ter119-APCsके लिए समृद्ध करने के लिए फ्लोरेसेंस सक्रिय सेल छंटाई (FACS) प्रदर्शन करने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । ये प्रोटोकॉल जांचकर्ताओं को एकल सेल आरएनए अनुक्रमण जैसे डाउनस्ट्रीम विश्लेषणों के लिए उपयुक्त उच्च गुणवत्ता वाले एपीसीएस तैयार करने की अनुमति देंगे ।
Introduction
आदिपोस ऊतक ऊर्जा चयापचय में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। अतिरिक्त ऊर्जा लिपिड के रूप में संग्रहीत की जाती है, और एडीपोज ऊतक पोषण की स्थिति और ऊर्जावान मांग के आधार पर महत्वपूर्ण विस्तार या पीछे हटने में सक्षम है। एडिपोसिट ऊतक के विस्तार के परिणामस्वरूप एडिपोसाइट आकार (हाइपरट्रॉफी) और/या आदिपोसाइट संख्या (हाइपरप्लासिया) में वृद्धि से हो सकता है; बाद की प्रक्रिया कसकर प्रसार और एडिपोज प्रोग्निटर कोशिकाओं के भेदभाव से विनियमित1,2. मोटापे के दौरान, ऊतक अत्यधिक फैलता है, और ऊतक रोग - हाइपोक्सिया, सूजन और इंसुलिन प्रतिरोध सहित - अक्सर3,4विकसित होता है। ये जटिलताएं उच्च रक्तचाप, मधुमेह, हृदय रोग, स्ट्रोक और कैंसरसहितकई पुरानी बीमारियों के लिए जोखिम कारक हैं। इसलिए, अनियंत्रित एडीपोज ऊतक विस्तार को सीमित करना और एडीपोज ऊतक विकृतियों को कम करना शीर्ष जैव चिकित्सा अनुसंधान प्राथमिकताएं हैं। आदिपोज ऊतक विस्तार के दौरान, निवासी एडीपोज ऊतक-व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाएं (एएससी) क्रमिक रूप से प्रीडिपोसाइट्स (प्रतिबद्ध जनक कोशिकाओं) में और फिर परिपक्व एडिपोसाइट्स6में अंतर करते हैं। हाल ही में एकल कोशिका आरएनए-अनुक्रमण (स्क्रर्ना-एसईक्यू) अध्ययनों से पता चलता है कि ये आदिपोज जनक प्रकोष्ठ (एपीसी) आबादी (एएससी और प्रीडिपोसाइट्स) पर्याप्त आणविकऔर कार्यात्मक विषमता7,8,9,10, 11,12प्रदर्शित करते हैं। उदाहरण के लिए, एएससी एक कम एडिपोजेनिक भेदभाव क्षमता प्रदर्शित करता है, जबकि प्रीडिपोसाइट्स7की तुलना में उच्च प्रसार और विस्तार क्षमताओं का प्रदर्शन भी करता है। एएससी और प्रीडिपोसाइट आबादी के भीतर और अधिक आणविक मतभेदों की सूचना दी जाती है, हालांकि इन मतभेदों की कार्यात्मक प्रासंगिकता अस्पष्ट7बनी हुई है। साथ में, ये डेटा आदिपोज जनक सेल पूल की जटिलता को उजागर करते हैं और इन महत्वपूर्ण सेल आबादी को बेहतर ढंग से समझने और हेरफेर करने के लिए उपकरणों को विकसित और मानकीकृत करने की आवश्यकता को रेखांकित करते हैं।
यह प्रोटोकॉल माउस एपिडिडिमल फैट पैड से उच्च व्यवहार्यता Sca1+ एडिपोज प्रोजेनिटर सेल आबादी के अलगाव का विवरण देता है जो संवेदनशील डाउनस्ट्रीम विश्लेषणों के लिए उपयुक्त हैं, जिसमें एकल-सेल अध्ययन (स्क्रएनए-अनुक्रमण) और सेल संस्कृति शामिल हैं। अलग-थलग और एपीसी की व्यवहार्यता में सुधार करने वाले मामूली संशोधनों के साथ7,13 वर्णित के रूप में एपीडिडिमल फैट पैड का अलगाव और वियोजन किया गया था। संक्षेप में, एपिडिडिमल फैट पैड से अलग कोशिकाओं को Sca1 के खिलाफ एंटीबॉडी से सना हुआ है, जो एएससी और प्रीडिपोसाइट्स6,7और अन्य वंश (लिन) मार्कर दोनों के लिए एक मार्कर है: Ter119 (एरिथ्रॉइड कोशिकाएं), सीडी 31 (एंडोथेलियल सेल), और सीडी 45 (ल्यूकोसाइट्स)। व्यवहार्य Sca1+/Ter119-/CD31-/CD45-/DAPI-कोशिकाओं तो फ्लोरेसेंस सक्रिय सेल छंटाई (FACS) द्वारा हल कर रहे हैं । महत्वपूर्ण बात यह है कि इस प्रोटोकॉल को सफल अलगाव और व्यवहार्य Sca1+/Lin-adipose जनक कोशिकाओं के विश्लेषण द्वारा मान्य किया गया था हाल ही में एक एकल सेल आरएनए अनुक्रमण अध्ययन में रिपोर्ट किया गया था जो एएससी और प्रीडिपोसाइट्स7के भीतर कार्यात्मक रूप से विषम उपजनसंख्या की पहचान करता है ।
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Protocol
मेयो क्लिनिक संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदन के तहत सभी पशु प्रायोगिक प्रक्रियाओं का प्रदर्शन किया गया ।
1. समाधान की तैयारी
- 100 एमएल हैंक्स के संतुलित नमक समाधान (एचबीबीएस) में कोलेजनेस II 2 ग्राम को भंग करके कोलेजनेस 2% (w/v) समाधान तैयार करें। प्रत्येक उपयोग के लिए 200 μL अलीकोट।
- 84 एमएल एफ-12 मीडियम, 15 एमएल हॉर्स सीरम और 1 एमएल पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन को मिलाकर बेअसर मीडियम तैयार करें।
- दुलबेको के फॉस्फेट-बफर खारा (डीपीबीएस) के 100 मिलीएल में 500 मिलीग्राम गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) और 0.5 एम ईडीटीए के 400 माइक्रोन को भंग करके फ्लो साइटोमेट्री बफर तैयार करें।
2. एपीडिडिमल फैट पैड और ऊतक वियोजन का विच्छेदन
- मानवीय इच्छामृत्यु (आइसोफ्लुएंज/सर्वाइकल अपभ्रंश) एक पुरुष माउस । इस प्रोटोकॉल में चार महीने पुराने एफवीबी माउस का इस्तेमाल किया गया था।
- पेट पर 70% इथेनॉल लगाएं/स्प्रे करें और साफ कैंची और संदंश का उपयोग करके पेट के निचले गुहा का पर्दाफाश करें।
- एपिडिडिमल फैट पैड (समीपस्थ/टेस्ट से जुड़ा) का पता लगाएं । वृषण और एपीडिडिमल फैट पैड के बीच जंक्शन को कुंद संदंश के साथ पकड़ें और एपिडिडिमल फैट पैड को मुक्त करने के लिए धीरे से खींचें।
- एचबीएसएस के 5 एमएल में कैंची और इनक्यूबेट एपीडिडायमल फैट पैड का उपयोग करके टेस्ट निकालें, जो 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 50 एमएल शंकु नली में 3% बीएसए के साथ पूरक है।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 7 मिनट के लिए 150 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
- 50 एमएल शंकुदाता ट्यूब से फ्लोटिंग एपिडिडिमल फैट पैड लें और साफ कैंची का उपयोग करके ऊतक को बारीक करें।
- 13 एमएल कल्चर ट्यूब में एचबीएसएस के 3.8 एमएल में 200 माइक्रोन कोलेजनेस 2% समाधान जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 5 आरपीएम पर एक घूर्णन इनक्यूबेटर में कीमा बनाया हुआ ऊतक और इनक्यूबेट जोड़ें। घूर्णन इनक्यूबेटर के बजाय, 37 डिग्री सेल्सियस पर सेल कल्चर इनक्यूबेटर का वैकल्पिक रूप से कभी-कभी आंदोलनों के साथ उपयोग किया जा सकता है।
- पूरी सामग्री को 50 एमएल शंकु नली में स्थानांतरित करें और बेअसर माध्यम के 10 एमएल जोड़ें। ट्यूब को 2-3 बार उलटा करके धीरे-धीरे मिलाएं।
- एक 70 माइक्रोन सेल छन्नी के साथ लगे एक और 50 एमएल शंकु नली तैयार करें। कोशिका छलनी का उपयोग कर नई ट्यूब में पचा ऊतक फ़िल्टर।
- प्रवाह के माध्यम से 15 एमएल शंकु नली और अपकेंद्रित्र को 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 350 x ग्राम पर स्थानांतरित करें।
- डीपीबीएस के 5 एमएल के साथ सुपरनैंट और रिसिपेंड सेल छर्रों को ध्यान से हटा दें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 350 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
- सुपरनेट को सावधानी से हटा दें और 50 माइक्रोल फ्लो साइटोमेट्री बफर जोड़ें। धीरे-धीरे पाइपिंग करके अच्छी तरह मिलाएं और कोशिकाओं को बर्फ पर रखें। सेल छर्रों की मात्रा और अवशिष्ट सुपरनेट की छोटी मात्रा के कारण, प्रवाह साइटोमेट्री बफर में कोशिकाओं की कुल मात्रा 50 माइक्रोन (लगभग 100 माइक्रोन) से अधिक होगी।
3. एंटीबॉडी लेबलिंग और फ्लोरेसेंस सक्रिय सेल छंटाई (FACS)
- कोशिकाओं को कोमल पिप्टिंग के साथ अच्छी तरह से मिलाने के बाद, सेल सस्पेंशन के 54 माइक्रोल को 1.7 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। एफसीआर ब्लॉकिंग रिएजेंट के 6 माइक्रोन जोड़ें और धीरे-धीरे पाइपिंग करके अच्छी तरह से मिलाएं। 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट। 54 माइक्रोन लेने के बाद किसी भी बचे हुए कोशिकाओं को बचाएं और उन्हें बर्फ में रखें ताकि वे चरण 3.5 और चरण 3.6 में एक अन दाग नियंत्रण के रूप में उपयोग कर सके।
- चरण 3.1 में इनक्यूबेशन के दौरान, एंटी-स्कैड-एपीसी, एंटी-टेर119-फिटसी, एंटी-सीडी31-फिटसी, और एंटी-सीडी 45-फिटसी एंटीबॉडी को माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में 11 माइक्रोल प्रत्येक के संयोजन से एक एंटीबॉडी कॉकटेल तैयार करें। कोमल पिपटिंग द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं और प्रकाश से संरक्षित बर्फ पर रखें।
- एफसीआर के साथ इनक्यूबेशन के बाद 10 मिनट के लिए रिएजेंट अवरुद्ध, एंटीबॉडी कॉकटेल के ४० μL जोड़ें और कोमल pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण । 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
- दाग कोशिकाओं में DAPI के 1 μg/mL के साथ पूरक प्रवाह साइटोमेट्री बफर के ५०० μL जोड़ें । सेल छलनी स्नैप कैप के साथ 5 एमएल टेस्ट ट्यूब का उपयोग करके कोमल पिपटिंग और फिल्टर सेल द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं। कोशिकाओं को बर्फ पर रखें।
- चरण 3.1 में शेष कोशिकाओं में प्रवाह साइटोमेट्री बफर के 500 माइक्रोन जोड़ें और कोमल पिपटिंग द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं। सेल छलनी स्नैप कैप के साथ 5 एमएल टेस्ट ट्यूब का उपयोग करके सेल फ़िल्टर करें। इन कोशिकाओं को बर्फ पर रखें और निम्नलिखित चरण में एक अन दाग नियंत्रण के रूप में उपयोग करें।
- दाग कोशिकाओं और FACS विश्लेषण या छंटाई उपकरण के लिए दाग नियंत्रण ले लो।
- चित्रा 1में दिखाए गए गेटिंग रणनीतियों के साथ एपीसी+/FITC-/DAPI-जनसंख्या की पहचान और उन्हें अलग करें । ये कोशिकाएं व्यवहार्य Sca1 +/Ter119-/CD31-/CD45-कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करती हैं । मलबे और सेल समुच्चय आगे (एफएससी) और साइड स्कैटर (एसएससी) भूखंडों का उपयोग करके समाप्त हो जाते हैं। फिर,DAPI-जनसंख्या gated है, एपीसी+/FITC-जनसंख्या की गेटिंगके बाद । गेटिंग मापदंडों को स्थापित करने में सहायता करने के लिए अन दागित नियंत्रणों का उपयोग किया जाना चाहिए।
- कोशिकाओं को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में 500 माइक्रोनल फ्लो साइटोमेट्री बफर में इकट्ठा करें। आगे बढ़ते हुए, संदूषण को कम करने के लिए बाँझ परिस्थितियों में सभी प्रक्रियाओं का प्रदर्शन किया जाना चाहिए। लगभग 50,000 - 100,000 कोशिकाओं को एक माउस से एकत्र किया जाता है।
- कोशिका व्यवहार्यता का मूल्यांकन करने के लिए हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें। चूंकि सेल समुच्चय आगे डाउनस्ट्रीम विश्लेषणों में हस्तक्षेप कर सकते हैं, इसलिए इन समुच्चय की न्यूनतम उपस्थिति (और व्यवहार्य सेल संख्या का 5%) सुनिश्चित करने के लिए सेल समुच्चय की उपस्थिति का भी मूल्यांकन किया जाता है।
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Representative Results
इस प्रयोग में चार महीने के पुरुष एफबी चूहों का इस्तेमाल किया गया। एफएससी/एसएससी भूखंडों का उपयोग करके मलबे और डबल्स के बहिष्कार के बाद, व्यवहार्य कोशिकाओं (DAPI-जनसंख्या) को गेट किया गया था, जिसके बाद एपीसी+ /फिटसी-जनसंख्या(चित्रा 1)का चयन किया गया था । DAPI, एपीसी, और फिटसी गेट्स अन दाग नियंत्रण के आधार पर तैयार किए गए थे । गेटिंग रणनीतियों को चित्रा 1में दिखाया गया है ।
छंटाई के 1 घंटे के बाद, अलगाव की गुणवत्ता मात्रात्मक प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण(आंकड़े 2,3)द्वारा मूल्यांकन किया गया था। कोशिकाओं को व्यवहार्यता धुंधला करने के लिए प्रोपिडियम आयोडाइड समाधान (1:100) के साथ दाग दिया गया था। छंटाई के लिए एक ही गेटिंग का उपयोग करना, कोशिकाओं ने उच्च व्यवहार्यता और शुद्धता बनाए रखी: 92.6 ± 2.2% एकल कोशिकाएं (चित्रा 2में तीसरा पैनल), 86.4 ± 3.0% व्यवहार्यता (पीआई- सेल), और 86.0 ± 2.8% एपीसी+/ फिटसी- सेल (एन= 4, औसत ± मानक विचलन)। इन प्रतिशतों को कुल सेल संख्या के सापेक्ष क्रमशः चित्रा 2में प्रत्येकगेटेड आबादी (एकल कोशिकाओं,पीआई-सेल, औरपीआई-/एपीसी+ /फिटसी-जनसंख्या) के प्रतिशत के रूप में परिभाषित किया गया था ।
चित्रा 1: FACS द्वारा व्यवहार्य Sca1+ adipose जनक एकल कोशिकाओं का अलगाव । गेटिंग रणनीतियों को दागदार कोशिकाओं और एक दागदार नियंत्रण दोनों में दिखाया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: अलगाव के बाद सेल व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण। प्रॉपिडियम आयोडाइड का उपयोग करके व्यवहार्यता धुंधला किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 3: कोशिकाओं के प्रतिशत का मात्राकरण 1 एच के बाद प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण में अलगाव। कोशिकाओं के अलगाव के बाद शुद्धता और व्यवहार्यता का मूल्यांकन करने के लिए एकल कोशिकाओं, व्यवहार्य कोशिकाओं और एपीसी+/फिटसी-कोशिकाओं के प्रतिशत की मात्रा निर्धारित की गई थी । दिखाया गया डेटा औसत ± मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करता है। n=4. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
एकल सेल आरएनए अनुक्रमण (स्क्रर्ना-एसईक्यू) एक साथ एकल सेल स्तर पर विविध कोशिका आबादी का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में तेजी से कर्षण प्राप्त कर रहा है। नमूना तैयार करने और उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण से जुड़ी उच्च लागतों के कारण, प्रयोगात्मक सफलता की संभावना को बढ़ाने के लिए सेलुलर इनपुट (उच्च व्यवहार्यता और शुद्धता) को अनुकूलित करना अनिवार्य है। कुछ सेल तैयारी प्रोटोकॉल14FACS छंटाई के बिना कम स्पिन वॉश और कॉलम आधारित जुदाई का उपयोग कर मृत कोशिकाओं और मलबे को हटाने पर भरोसा करते हैं । इनमें से कई तरीके, हालांकि, व्यवहार्य बरामद कोशिकाओं की संख्या को काफी कम करते हैं, और कई मामलों में, मृत कोशिकाओं को पूरी तरह से14नहीं हटाया जाता है। यह प्रोटोकॉल अत्यधिक व्यवहार्य Sca1+ adipose जनक कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक सरल विधि को रेखांकित करता है जिसमें न्यूनतम सेलुलर मलबे, सेल डबल्स और मृत कोशिकाओं शामिल हैं। यद्यपि इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके अलग की गई कोशिकाओं ने उच्च व्यवहार्यता का प्रदर्शन किया है, फिर भी हम उच्च व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए सेल अलगाव और आगे डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के बीच समय को कम करने की सलाह देते हैं। इसके अलावा, सफल एंटीबॉडी लेबलिंग उच्च शुद्धता के साथ Sca1+ adipose जनक कोशिकाओं को अलग करने के लिए महत्वपूर्ण है । इसलिए, एंटीबॉडी की इष्टतम एकाग्रता के निर्धारण की प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए दृढ़ता से सिफारिश की जाती है, और चरण 3.2 में एंटीबॉडी को कमजोर करने के लिए तदनुसार समायोजित किया जा सकता है।
यह प्रवाह साइटोमेट्री-आधारित प्रोटोकॉल विशिष्ट एडिपोज प्रोजेनिटर सेल उप-आबादी में व्यक्तिगत रुचि के आधार पर अनुकूलन के लिए उत्तरदायी है। यहां, वैकल्पिक एंटीबॉडी संयोजनों का उपयोग आबादी (ओं) की रुचि को पहचानने और अलग करने के लिए किया जा सकता है। दरअसल, व्यापक एपीसी मार्कर विविधता के कारण, कई प्रयोगशालाओं SCRNA-seq रिपोर्ट का उपयोग कर APCs का अध्ययन अंय सतह मार्कर का उपयोग कर कोशिकाओं को अलग । उदाहरण के लिए, PDGFRA +/CD44+ कोशिकाओं, CD31-/CD45-/Ter119-/CD29+ /CD34+/Sca1+ कोशिकाओं, और PDgfrb+ कोशिकाओं को नीचे एपीसी scRNA-seq विश्लेषण के लिए FACS द्वारा अलग किया गया है8,9,11। CD142+ उपजनसंख्या की भी विशेषता है और सीमित एडिपोजेनिक विभेदक क्षमता और एडिपोजेनेसिस को दबाने की क्षमता प्रदर्शित करने के लिए दिखाया गया है10,11. Sca1 के अलावा, CD55, CD81, और CD9 के खिलाफ एंटीबॉडी के संयोजन हाल ही में संभावित ASC और preadipocyte उपजनसंख्या (इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर) को अलग करने और उपजनसंख्या आणविक और कार्यात्मक विषमता7का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया । इसके अलावा, चूंकि वर्तमानप्रोटोकॉल15, 16,17जैसे कोलेजनेस वियोजन का उपयोग करके अन्य वसा पैडों से आदिपोज जनक कोशिकाओं को अलग किया गया है, इसलिए वर्तमान प्रोटोकॉल अन्य आदिपोस ऊतकों से आदिपोज प्रोजेनिटर कोशिकाओं के अलगाव पर लागू हो सकता है।
वर्तमान दृष्टिकोण की एक चेतावनी यह है कि यह अपरिपक्व APCs के अलगाव की ओर सिलवाया है । यद्यपि वर्तमान प्रोटोकॉल उच्च व्यवहार्यता एपीसी पैदा करता है, लेकिन अन्य एडीपोज ऊतक निवासी सेल प्रकार (यानी प्रतिरक्षा कोशिकाओं, फाइब्रोब्लास्ट, एंडोथेलियल कोशिकाओं आदि) के अलगाव की प्रभावकारिता और दक्षता अस्पष्ट है। महत्वपूर्ण बात यह है कि यह प्रोटोकॉल परिपक्व एडिपोसाइट्स के अलगाव के लिए उपयुक्त नहीं है। Adipocytes अपने बड़े सेल आकार और कमजोरी के कारण FACS का उपयोग कर अलग करने के लिए बेहद मुश्किल हो गया है । हाल ही में, FACS द्वारा परिपक्व adipocytes के अलगाव एक विशिष्ट एफएससी/एसएससी गेटिंग रणनीति18के साथ एक बड़े नोजल आकार (१५० माइक्रोन) और कम म्यान दबाव (6 साई) का उपयोग कर सूचित किया गया था । भविष्य के अध्ययन शायद इस एडिपोसाइट आइसोलेशन प्रोटोकॉल को इस प्रोटोकॉल के साथ मर्ज कर सकते हैं ताकि एडीपोज ऊतक के भीतर विविध सेल प्रकारों को अलग करने और अध्ययन करने के लिए अधिक व्यापक पाइपलाइन स्थापित की जा सके।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
हम FACS छंटाई के साथ सहायता के लिए मेयो क्लिनिक माइक्रोस्कोपी सेल विश्लेषण कोर फ्लो साइटोमेट्री सुविधा स्वीकार करते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | VWR | 87003-294 | |
| 13 mL culture tube | Thermo Fisher Scientific | 50-809-216 | |
| 15 mL conical tube | Greiner Bio-one | 188 271 | |
| 5 mL test tube with cell strainer snap cap | Thermo Fisher Scientific | 08-771-23 | |
| 50 mL conical tube | Greiner Bio-one | 227 261 | |
| 70 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| Anti-CD31-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-519 | |
| Anti-CD45-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-491 | |
| Anti-Sca1-APC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-833 | |
| Anti-Ter119-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-112-908 | |
| BSA | Gold Biotechnology | A-420-500 | |
| Collagenase type II | Thermo Fisher Scientific | 17101-015 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | |
| F-12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11765-054 | |
| FcR blocking reagent | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| Hanks' balanced salt solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| Horse serum | Thermo Fisher Scientific | 16050-122 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Propidium iodide solution | Miltenyi Biotec | 130-093-233 |
References
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