Summary
Presentamos un método simple para aislar células progenitoras adiposas altamente viables de las almohadillas de grasa epidídmica del ratón usando clasificación celular activada por fluorescencia.
Abstract
La obesidad y los trastornos metabólicos como la diabetes, las enfermedades cardíacas y el cáncer están asociados con la remodelación dramática del tejido adiposo. Las células progenitoras adiposas residentes en tejidos (APC) desempeñan un papel clave en la homeostasis del tejido adiposo y pueden contribuir a la patología tisular. El creciente uso de tecnologías de análisis unicelular ,incluida la secuenciación de ARN unicelular y la proteómica unicelular, está transformando el campo celular madre/progenitor al permitir una resolución sin precedentes de los cambios en la expresión celular individual en el contexto de cambios en toda la población o en todo el tejido. En este artículo, proporcionamos protocolos detallados para diseccionar el tejido adiposo epidídmico del ratón, aislar células derivadas de tejido adiposo único y realizar la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para enriquecer para Sca1viable +/CD31-/CD45-/Ter119- APCs. Estos protocolos permitirán a los investigadores preparar APCs de alta calidad adecuados para análisis posteriores, como la secuenciación de ARN de una sola célula.
Introduction
El tejido adiposo desempeña un papel clave en el metabolismo energético. El exceso de energía se almacena en forma de lípidos, y el tejido adiposo es capaz de expansión o retracción significativa dependiendo del estado nutricional y la demanda energética. La expansión del tejido adiposo puede ser el resultado de un aumento en el tamaño de los adipocitos (hipertrofia) y/o de un aumento en el número de adipocitos (hiperplasia); este último proceso estrictamente regulado por la proliferación y diferenciación de las células progenitoras adiposas1,2. Durante la obesidad, el tejido adiposo se expande excesivamente, y la disfunción tisular – incluyendo hipoxia, inflamación y resistencia a la insulina – a menudo desarrolla3,4. Estas complicaciones son factores de riesgo para muchas enfermedades crónicas como hipertensión, diabetes, enfermedades cardiovasculares, accidente cerebrovascular y cáncer5. Por lo tanto, limitar la expansión incontrolada del tejido adiposo y mitigar las patologías del tejido adiposo son las principales prioridades de investigación biomédica. Durante la expansión del tejido adiposo, las células madre derivadas del tejido adiposo residentes (ASC) proliferan y diferencian secuencialmente en preadipocitos (células progenitoras comprometidas) y luego en adipocitos maduros6. Estudios recientes de secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) muestran que estas poblaciones de células progenitoras adiposas (APC) (ASC y preadipocitos) exhiben heterogeneidad molecular y funcional sustancial7,8,9,10,11,12. Por ejemplo, los ASC muestran una capacidad de diferenciación adipogénica reducida, al tiempo que exhiben mayores capacidades de proliferación y expansión, en comparación con los preadipocitos7. Se notifican nuevas diferencias moleculares en las poblaciones de ASC y preadipocitos, aunque la relevancia funcional de estas diferencias sigue sin estar clara7. Juntos, estos datos resaltan la complejidad del grupo de células progenitoras adiposas y subrayan la necesidad de desarrollar y estandarizar herramientas para comprender y manipular mejor estas poblaciones celulares críticas.
Este protocolo detalla el aislamiento de la alta viabilidad Sca1+ poblaciones de células progenitoras adiposas de almohadillas de grasa epidídmica del ratón que son adecuadas para análisis sensibles aguas abajo, incluyendo estudios unicelulares (secuenciación de SCRNA) y cultivo celular. El aislamiento y la disociación de las almohadillas de grasa epidídmica se realizaron como se describió anteriormente7,13 con ligeras modificaciones que mejoran la viabilidad de los APCs aislados. En resumen, las células disociadas de las almohadillas de grasa epidídmica están manchadas con anticuerpos contra Sca1, un marcador tanto para ASC como para preadipocitos6,7,y otros marcadores de linaje (Lin): Ter119 (células eritroides), CD31 (células endoteliales) y CD45 (leucocitos). Viable Sca1+/Ter119-/CD31-/CD45-/DAPI- las células se ordenan por la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Es importante destacar que este protocolo fue validado por el aislamiento y análisis exitosos de células progenitoras Sca1+/Linviables - adiposas notificadas en un estudio reciente de secuenciación de ARN de una sola célula que identificó subpoblaciones funcionalmente heterogéneas dentro de ASC y preadipocitos7.
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Protocol
Todos los procedimientos experimentales con animales fueron realizados bajo la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Mayo Clinic.
1. Preparación de soluciones
- Preparar solución de colágeno 2% (w/v) disolviendo la colágenasa II 2 g en la solución de sal equilibrada (HBSS) de Hanks de 100 ml. Aliquot 200 μL cada uno para cada uso.
- Prepare el medio de neutralización mezclando 84 mL F-12 medio, 15 ml de suero de caballo y 1 mL de penicilina/estreptomicina.
- Prepare el amortiguador de la citometría de flujo disolviendo 500 mg de albúmina sérica bovina (BSA) y 400 μL de 0,5 M EDTA en 100 ml de solución salina tamponada por fosfato de Dulbecco (DPBS).
2. Disección de la almohadilla de grasa epidímica y la disociación tisular
- Eutanasia humana (dislocación isoflurano/cervical) un ratón macho. En este protocolo, se utilizó un ratón FVB de cuatro meses de antigüedad.
- Aplicar/rociar 70% etanol en el abdomen y exponer la cavidad abdominal inferior usando tijeras y fórceps limpios.
- Localice la almohadilla de grasa epidímica (proximal/unida a los testículos). Sostenga la unión entre los testículos y la almohadilla de grasa epididímica con fórceps contundentes y tire suavemente para liberar la almohadilla de grasa epididímica.
- Retire los testículos cortando con tijeras e incubar la almohadilla de grasa epidídmica en 5 ml de HBSS complementado con 3% BSA en un tubo cónico de 50 ml a temperatura ambiente durante 15 minutos.
- Centrífuga a 150 x g durante 7 min a 4 °C.
- Tome almohadilla flotante de grasa epidímica del tubo cónico de 50 ml y mince finamente el tejido usando tijeras limpias.
- Añadir 200 μL de solución de colágeno 2% en 3,8 ml de HBSS en un tubo de cultivo de 13 ml. Añadir el tejido picado e incubar en una incubadora giratoria a 5 rpm durante 1 h a 37 °C. En lugar de una incubadora giratoria, la incubadora de cultivo celular a 37 °C se puede utilizar alternativamente con agitaciones ocasionales.
- Transfiera contenido completo a un tubo cónico de 50 ml y añada 10 ml de medio de neutralización. Mezcle suavemente invirtiendo el tubo 2-3 veces.
- Prepare otro tubo cónico de 50 ml equipado con un colador de células de 70 μm. Filtre el tejido digerido en el nuevo tubo utilizando el colador celular.
- Transfiera el flujo a un tubo cónico de 15 ml y centrífuga a 350 x g durante 10 minutos a 4 °C.
- Retire cuidadosamente el sobrenadante y los pellets celulares resuspend con 5 ml de DPBS. Centrífuga a 350 x g durante 10 min a 4 °C.
- Retire cuidadosamente el sobrenadante y agregue 50 μL de tampón de citometría de flujo. Mezcle bien pipeteando suavemente y mantenga las células sobre hielo. Debido al volumen de los pellets celulares y la pequeña cantidad de sobrenadante residual, el volumen total de células en el búfer de citometría de flujo será mayor que 50 μL (aproximadamente 100 μL).
3. Etiquetado de anticuerpos y clasificación celular activada por fluorescencia (FACS)
- Después de mezclar bien las células con pipeteo suave, transfiera 54 μL de la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga de 1,7 ml. Agregue 6 μL de reactivo de bloqueo FcR y mezcle bien pipeteando suavemente. Incubar a 4 °C durante 10 min. Guarde las células sobrantes después de tomar 54 μL y guárdelas en el hielo para usarlas como control no manchado en los pasos 3.5 y 3.6.
- Durante la incubación en el paso 3.1, prepara un cóctel de anticuerpos combinando 11 μL cada uno de anticuerpos anti-Sca1-APC, anti-Ter119-FITC, anti-CD31-FITC y anticuerpos anti-CD45-FITC en un tubo de microcentrífuga. Mezcle bien con tuberías suaves y mantenga el hielo protegido de la luz.
- Después de la incubación con reactivo de bloqueo FcR durante 10 minutos, añadir 40 μL del cóctel de anticuerpos y mezclar bien mediante pipeteo suave. Incubar a 4 °C durante 10 min.
- Añadir 500 μL de tampón de citometría de flujo complementado con 1 μg/ml de DAPI en las células manchadas. Mezcle bien con suaves células de pipeteo y filtro utilizando un tubo de ensayo de 5 ml con tapa de presión del colador celular. Mantenga las células en el hielo.
- Añadir 500 μL de tampón de citometría de flujo a las células restantes en el paso 3.1 y mezclar bien mediante pipeteo suave. Filtre las células usando un tubo de ensayo de 5 ml con tapa de presión del colador celular. Mantenga estas células sobre hielo y utilícelas como control sin manchar en el siguiente paso.
- Lleve las células manchadas y el control sin manchar al instrumento de análisis o clasificación FACS.
- Identifique y aísle la población APC+/FITC-/DAPI- con las estrategias de gating mostradas en la Figura 1. Estas células representan células Sca1+/Ter119-/CD31-/CD45- viables. Los desechos y los agregados celulares se agotan utilizando gráficas de dispersión hacia delante (FSC) y laterales (SSC). A continuación, DAPI- población está cerrada, seguido de gating de APC+/FITC- población. Los controles no manchados deben utilizarse para ayudar a establecer parámetros de gating.
- Recoja las células en 500 μL de tampón de citometría de flujo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. En el futuro, todos los procedimientos deben realizarse en condiciones estériles para minimizar una contaminación. Aproximadamente 50.000 – 100.000 células se recogen de un ratón.
- Cuente las células usando un hemociclograma para evaluar la viabilidad celular. Dado que los agregados celulares pueden interferir con más análisis posteriores, la presencia de agregados celulares también se evalúa para garantizar una presencia mínima (<5% del número de células viables) de estos agregados.
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Representative Results
En este experimento se utilizaron ratones FVB machos de cuatro meses de edad. Después de la exclusión de escombros y dobletes utilizando parcelas FSC/SSC, las células viables (DAPI- población) fueron cerradas, seguidas por la selección de APC+/FITC- población (Figura 1). Las puertas DAPI, APC y FITC se dibujaron sobre la base del control sin manchar. Las estrategias de Gating se muestran en la Figura 1.
Después de 1 h de clasificación, la calidad del aislamiento fue evaluada cuantitativamente por el análisis de citometría de flujo (Cifras 2,3). Las células fueron manchadas con solución de yoduro de propicio (1:100) para la tinción de viabilidad. Utilizando la misma clasificación para la clasificación, las células mantuvieron alta viabilidad y pureza: 92,6 ± 2,2% células individuales (tercer panel en la Figura 2),86,4 ± 3,0% viabilidad (PI- células), y 86,0 ± 2,8% células APC+/FITC- (n= 4, desviación media ± estándar). Estos porcentajes se definieron como porcentajes de cada población cerrada (celdas individuales, PI- celdas y PI-/APC+/FITC- población, respectivamente, en la Figura 2)en relación con el número total de celdas.
Figura 1: Aislamiento de células individuales progenitoras viables Sca1+ adiposas por FACS. Las estrategias de gating se muestran tanto en las células manchadas como en un control sin manchar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Análisis representativo de la citometría de flujo para evaluar la viabilidad celular posterior al aislamiento. La tinción de viabilidad se realizó utilizando yoduro de propidio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Cuantificación del porcentaje de células 1 h post-aislamiento en el análisis de citometría de flujo. Porcentajes de células individuales, células viables y APC+/FITC- las células se cuantificaron para evaluar la pureza y viabilidad después del aislamiento de las células. Los datos mostrados representan el promedio ± desviación estándar. n=4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) está ganando rápidamente tracción como una poderosa herramienta para estudiar simultáneamente diversas poblaciones celulares a nivel de una sola célula. Debido a los altos costos asociados con la preparación de muestras y la secuenciación de alto rendimiento, es imperativo optimizar las entradas celulares (alta viabilidad y pureza) para aumentar la probabilidad de éxito experimental. Algunos protocolos de preparación celular se basan en la eliminación de células muertas y desechos mediante lavados de giro bajo y separación basada en columnas sin ordenarFACS 14. Muchos de estos métodos, sin embargo, reducen significativamente el número de células recuperadas viables, y en muchos casos, las células muertas no se eliminan por completo14. Este protocolo describe un método simple para aislar células progenitoras Sca1+ adiposas altamente viables que contienen residuos celulares mínimos, dobletes celulares y células muertas. Aunque las células aisladas mediante este protocolo mostraron una alta viabilidad, todavía recomendamos minimizar el tiempo entre el aislamiento celular y un análisis posterior aguas abajo para mantener una alta viabilidad. Además, el etiquetado exitoso de anticuerpos es fundamental para aislar células progenitoras Sca1+ adiposas con alta pureza. Por lo tanto, la determinación de la concentración óptima de anticuerpos se recomienda encarecidamente para cada anticuerpo, y la dilución de los anticuerpos en el paso 3.2 se puede ajustar en consecuencia.
Este protocolo basado en citometría de flujo es apto para la personalización dependiendo del interés individual en sub-poblaciones específicas de células progenitoras adiposas. Aquí, las combinaciones alternativas de anticuerpos se pueden utilizar para identificar y aislar a las poblacións de interés. De hecho, debido a la amplia diversidad de marcadores APC, varios laboratorios que estudian apcs utilizando el informe scRNA-seq aislan las células utilizando otros marcadores de superficie. Por ejemplo, pdgfra+/CD44+ celdas, CD31-/CD45-/Ter119-/CD29+/CD34+/Sca1+ celdas, y Pdgfrb+ celdas han sido aislados por FACS para los análisis aguas abajo APC scRNA-seq8,9,11. Cd142+ subpoblaciones también se han caracterizado y se muestra que exhiben una capacidad de diferenciación adipogénica limitada y una capacidad para suprimir la adipogénesis10,11. Además de Sca1, las combinaciones de anticuerpos contra CD55, CD81 y CD9 se utilizaron recientemente para aislar prospectivamente las subpoblaciones asc y preadipocitos (utilizando este protocolo) y estudiar la heterogeneidad molecular y funcional de subpoblación7. Además, dado que las células progenitoras adiposas de otras almohadillas de grasa, incluidas las almohadillas de grasa inguinales y los tejidos adiposos marrones, se han aislado utilizando la disociación de la colágenasa como el protocolo actual15,16,17,el presente protocolo puede ser aplicable al aislamiento de células progenitoras adiposas de otros tejidos adiposos.
Una advertencia del enfoque actual es que se adapta al aislamiento de apcs inmaduros. Aunque el protocolo actual produce APCs de alta viabilidad, la eficacia y eficiencia del aislamiento de otros tipos de células residentes de tejido adiposo (es decir, células inmunes, fibroblastos, células endoteliales, etc.) no está clara. Es importante destacar que este protocolo no es adecuado para el aislamiento de adipocitos maduros. Los adipocitos han sido extremadamente difíciles de aislar usando FACS debido a su gran tamaño de celda y fragilidad. Recientemente, el aislamiento de adipocitos maduros por FACS se informó utilizando un gran tamaño de boquilla (150 μm) y baja presión de vatina (6 psi) con una estrategia específica fsc/SSC gating18. Estudios futuros tal vez podrían fusionar este protocolo de aislamiento de adipocitos con el protocolo descrito aquí para establecer una tubería más completa para aislar y estudiar diversos tipos de células dentro del tejido adiposo.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Reconocemos el Centro de Citometría de Flujo de Flujo de Núcleo de Análisis celular microscopía de Mayo Clinic para obtener ayuda con la clasificación de FACS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | VWR | 87003-294 | |
| 13 mL culture tube | Thermo Fisher Scientific | 50-809-216 | |
| 15 mL conical tube | Greiner Bio-one | 188 271 | |
| 5 mL test tube with cell strainer snap cap | Thermo Fisher Scientific | 08-771-23 | |
| 50 mL conical tube | Greiner Bio-one | 227 261 | |
| 70 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| Anti-CD31-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-519 | |
| Anti-CD45-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-491 | |
| Anti-Sca1-APC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-833 | |
| Anti-Ter119-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-112-908 | |
| BSA | Gold Biotechnology | A-420-500 | |
| Collagenase type II | Thermo Fisher Scientific | 17101-015 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | |
| F-12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11765-054 | |
| FcR blocking reagent | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| Hanks' balanced salt solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| Horse serum | Thermo Fisher Scientific | 16050-122 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Propidium iodide solution | Miltenyi Biotec | 130-093-233 |
References
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