Summary
Vi præsenterer en enkel metode til at isolere meget levedygtige fedt stamceller fra mus epididymal fedt puder ved hjælp af fluorescens aktiveret celle sortering.
Abstract
Fedme og metaboliske lidelser såsom diabetes, hjertesygdomme, og kræft, er alle forbundet med dramatiske fedtvæv remodeling. Vævsbeboende fedt progenitorceller (APC'er) spiller en central rolle i fedtvævshomøostase og kan bidrage til vævspatologien. Den stigende brug af enkeltcelleanalyseteknologier – herunder enkeltcellede RNA-sekventering og enkeltcelleproteomics – transformerer stamcellefeltet med en enkelt celle ved at tillade en hidtil uset opløsning af individuelle celleudtryksændringer i forbindelse med ændringer i hele befolkningen eller vævet. I denne artikel leverer vi detaljerede protokoller til dissekering af epididymalt fedtvæv til mus, isolerer enkelt fedtvævsafledte celler og udfører fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) for at berige til levedygtig Sca1+/ CD31-/ CD45-/ Ter119- APC'er. Disse protokoller vil gøre det muligt for efterforskere at udarbejde apc'er af høj kvalitet, der er egnede til downstream-analyser såsom enkeltcellet RNA-sekventering.
Introduction
Fedtvæv spiller en central rolle i energimetabolismen. Overskydende energi opbevares i form af lipider, og fedtvæv er i stand til betydelig ekspansion eller tilbagetrækning afhængigt af ernæringsstatus og energisk efterspørgsel. Udvidelse af fedtvæv kan skyldes en stigning i adipocyt størrelse (hypertrofi) og / eller fra en stigning i adipocyt nummer (hyperplasi); sidstnævnte proces er stramt reguleret af spredning og differentiering af fedtprovenatorceller1,2. Under fedme, fedtvæv overdrevent udvider, og væv dysfunktion – herunder hypoxi, inflammation, og insulinresistens – ofte udvikler3,4. Disse komplikationer er risikofaktorer for mange kroniske sygdomme, herunder hypertension, diabetes, hjerte-kar-sygdomme, slagtilfælde og kræft5. Derfor er begrænsning af ukontrolleret fedtvævsudvidelse og afbødning af fedtvævspatologier de bedste biomedicinske forskningsprioriteter. Under adipose væv ekspansion, hjemmehørende fedtvæv-afledte stamceller (ASCs) formere sig og differentiere sekventielt i præadipocytter (begået stamceller) og derefter i modne adipocytter6. Nylige enkeltcellede RNA-sekventeringsundersøgelser (scRNA-seq) viser , at disse adipose progenitorcellepopulationer (ASC'er og præadipocytter) udviser betydelig molekylær og funktionel heterogenitet7,8,9,10,11,12. For eksempel viser ASC'er en reduceret adipogen differentieringskapacitet, samtidig med at de udviser højere sprednings- og ekspansionskapacitet sammenlignet med præadipocytter7. Yderligere molekylære forskelle rapporteres inden for ASC- og præadipocytpopulationer, selv om den funktionelle relevans af disse forskelle fortsat er uklar7. Tilsammen fremhæver disse data kompleksiteten af den fedtvenlige stamfadercellepulje og understreger behovet for at udvikle og standardisere værktøjer til bedre at forstå og manipulere disse kritiske cellepopulationer.
Denne protokol beskriver isoleringen af høj levedygtighed Sca1+ fedt progenitor cellepopulationer fra mus epididymal fedt puder, der er egnede til følsomme downstream analyser, herunder enkelt-celle undersøgelser (scRNA-sekventering) og cellekultur. Isolering og dissociation af epididymale fedtpuder blev udført som tidligere beskrevet7,13 med mindre ændringer, der forbedrer levedygtigheden af isolerede APC'er. Kort sagt, dissociated celler fra epididymal fedt puder er plettet med antistoffer mod Sca1, en markør for både ASCs og præadipocytter6,7, og andre afstamning (Lin) markører: Ter119 (erythroid celler), CD31 (endotelceller), og CD45 (leukocytter). Levedygtig Sca1+/Ter119-/CD31-/CD45-/DAPI- celler sorteres derefter efter fluorescensaktiveret cellesortering (FACS). Det er vigtigt, at denne protokol blev valideret ved vellykket isolering og analyse af levedygtige Sca1+/ Lin- fedt progenitor celler rapporteret i en nylig enkelt celle RNA sekventering undersøgelse, der identificerede funktionelt heterogene delpopulationer i ASC'er og præadipocytter7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev udført under godkendelse af Mayo Clinic Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Forberedelse af opløsning
- Forbered kollagen 2% (w/ v) opløsning ved at opløse kollagen II 2 g i 100 mL Hanks 'afbalanceret saltopløsning (HBSS). Aliquot 200 μL hver for hver anvendelse.
- Forbered neutraliseringsmedium ved at blande 84 mL F-12 medium, 15 ml hesteserum og 1 mL penicillin/streptomycin.
- Forbered flowcytometribuffer ved at opløse 500 mg kvægserumalbumin (BSA) og 400 μL 0,5 M EDTA i 100 mL dulbeccos fosfatbufferede saltvand (DPBS).
2. Dissektion af epididymal fedt pad og væv dissociation
- Humant aflive (isoflurane / cervikal dislokation) en mandlig mus. I denne protokol blev der brugt en fire måneder gammel FVB-mus.
- Påfør / spray 70% ethanol på maven og udsætte den nedre bughulen ved hjælp af ren saks og pincet.
- Find epididymal fedtpude (proksimal/fastgjort til testikler). Hold krydset mellem testikler og epididymal fedtpude med stumpe pincet og træk forsigtigt for at frigøre den epididymale fedtpude.
- Fjern testikler ved at skære med en saks og inkuber epididymal fedtpude i 5 mL HBSS suppleret med 3% BSA i et 50 mL konisk rør ved stuetemperatur i 15 min.
- Centrifuge ved 150 x g i 7 min ved 4 °C.
- Tag flydende epididymal fedtpude fra 50 mL konisk rør og fint hakke vævet ved hjælp af ren saks.
- Der tilsættes 200 μL kollagen 2% opløsning i 3,8 ml HBSS i et 13 ml kulturrør. Det hakkede væv tilsættes og inkuberes i en roterende inkubator ved 5 omdrejninger i minuttet i 1 time ved 37 °C. I stedet for en roterende inkubator kan cellekulturinkubator ved 37 °C alternativt bruges med lejlighedsvise omrøringer.
- Overfør hele indholdet til et 50 mL konisk rør og tilsæt 10 mL neutraliseringsmedium. Bland forsigtigt ved at vende røret 2-3 gange.
- Forbered et andet 50 mL konisk rør udstyret med en 70 μm celle si. Filtrer det fordøjede væv ind i det nye rør ved hjælp af cellesien.
- Gennemstrømningen overføres til et 15 mL konisk rør og centrifuge ved 350 x g i 10 minutter ved 4 °C.
- Fjern forsigtigt de supernatant og resuspend celle pellets med 5 mL DPBS. Centrifuge ved 350 x g i 10 minutter ved 4 °C.
- Fjern forsigtigt supernatanten og tilsæt 50 μL flowcytometribuffer. Bland godt ved pipetter forsigtigt og holde cellerne på is. På grund af mængden af cellepiller og en lille mængde restoverranaerende vil det samlede antal celler i flowcytometribufferen være større end 50 μL (ca. 100 μL).
3. Antistofmærkning og fluorescensaktiveret cellesortering (FACS)
- Efter at cellerne er blandet godt med skånsom pipetter, overføres 54 μL af celleaffjedringen til et mikrocentrifugerør på 1,7 mL. Der tilsættes 6 μL fcr-blokerende reagens, og der blandes godt ved forsigtigt pipettering. Inkuber ved 4 °C i 10 min. Gem eventuelle resterende celler efter at have taget 54 μL og hold dem i isen til brug som en ikke-rodfæstet kontrol i trin 3.5 og trin 3.6.
- Under inkubationen i trin 3.1 forberedes en antistofcocktail ved at kombinere 11 μL hver af anti-Sca1-APC,anti-Ter119-FITC, anti-CD31-FITC og anti-CD45-FITC antistoffer i et mikrocentrifugerør. Bland godt ved blid pipettering og hold på is beskyttet mod lys.
- Efter inkubation med FcR-blokeringsreagens i 10 minutter tilsættes 40 μL af antistofcocktailen og blandes godt ved blid pipettering. Inkuber ved 4 °C i 10 min.
- Der tilsættes 500 μL flowcytometribuffer suppleret med 1 μg/mL DAPI i de farvede celler. Bland godt ved blid pipetting og filtrer celler ved hjælp af et 5 mL reagensglas med celle si snap cap. Hold cellerne på is.
- Der tilsættes 500 μL flowcytometribuffer til de resterende celler i trin 3.1, og bland godt ved skånsom pipettering. Filtrer celler ved hjælp af et 5 mL reagensglas med fastgørelseshætte til celler. Hold disse celler på is og brug som en uhæmmet kontrol i det følgende trin.
- Tag de farvede celler og uhæmmet kontrol til FACS analyse eller sortering instrument.
- Identificer og isoler APC+/FITC-/DAPI- population med gatingstrategier vist i figur 1. Disse celler repræsenterer levedygtige Sca1+/Ter119-/CD31-/CD45- celler. Debris og celle aggregater er udtømt ved hjælp af fremad (FSC) og side scatter (SSC) plots. Derefter er DAPI- population gated, efterfulgt af gating af APC+/ FITC- befolkning. Ikke-besåede kontroller bør anvendes til at hjælpe med at fastsætte gatingparametre.
- Cellerne opsamles i 500 μL flowcytometribuffer i et mikrocentrifugerør på 1,5 mL. Fremadrettet skal alle procedurer udføres under sterile forhold for at minimere en forurening. Der indsamles ca. 50.000 – 100.000 celler fra én mus.
- Tæl celler ved hjælp af et hæmocytometer til at evaluere celle levedygtighed. Da celleaggregater kan forstyrre yderligere downstream-analyser, evalueres tilstedeværelsen af celleaggregater også for at sikre en minimal tilstedeværelse (<5% af levedygtigt cellenummer) af disse aggregater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fire måneder gamle mandlige FVB mus blev brugt i dette eksperiment. Efter udelukkelse af vragrester og doubletter ved hjælp af FSC/SSC-observationsområder blev levedygtige celler (DAPI- population) lukket, efterfulgt af udvælgelsen af APC+/FITC- population (Figur 1). DAPI-, APC- og FITC-portene blev tegnet på basis af den ikke-indgroede kontrol. Gating-strategierne er vist i figur 1.
Efter 1 h sortering blev isolationens kvalitet kvantitativt evalueret ved flowcytometrianalyse (Figur 2,3). Cellerne blev farvet med propidium jodopløsning (1:100) for levedygtighed farvning. Ved hjælp af samme gating til sortering opretholdt cellerne høj levedygtighed og renhed: 92,6 ± 2,2% enkeltceller (tredje panel i figur 2), 86,4 ± 3,0% levedygtighed (PI- celler) og 86,0 ± 2,8% APC+/ FITC- celler (n = 4, gennemsnitlig ± standardafvigelse). Disse procenter blev defineret som procentdele af hver lukket population (enkelte celler, PI- celler og PI-henholdsvis /APC+/FITC- population i figur 2) i forhold til det samlede celletal.
Figur 1: Isolering af levedygtige Sca1+ fedt stamfader enkelte celler ved FACS. Gating strategier er vist i både farvede celler og i en unstained kontrol. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Repræsentativ flowcytometrianalyse til vurdering af celledygtighed efter isolation. Farvning af levedygtigheden blev udført ved hjælp af propidium-jod. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Kvantificering af procentdelen af celler 1 time efter isolering i flowcytometrianalyse. Procentdele af enkelte celler, levedygtige celler og APC+/FITC- celler blev kvantificeret for at evaluere renhed og levedygtighed efter isolering af celler. De viste data repræsenterer gennemsnittet ± standardafvigelsen. n=4. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Enkeltcellet RNA-sekventering (scRNA-seq) får hurtigt trækkraft som et kraftfuldt værktøj til samtidig at studere forskellige cellepopulationer på enkeltcelleniveau. På grund af høje omkostninger forbundet med prøveforberedelse og høj gennemløbssekvensering er det vigtigt at optimere cellulære indgange (høj levedygtighed og renhed) for at øge sandsynligheden for eksperimentel succes. Nogle celleforberedelsesprotokoller er afhængige af fjernelse af døde celler og snavs ved hjælp af lavspinvask og kolonnebaseret adskillelse uden FACS-sortering14. Mange af disse metoder reducerer imidlertid betydeligt antallet af levedygtige genvundne celler, og i mange tilfælde fjernes døde celler ikke helt14. Denne protokol skitserer en enkel metode til at isolere meget levedygtige Sca1+ fedt progenitor celler, der indeholder minimal cellulære vragrester, celle doublets, og døde celler. Selvom celler isoleret ved hjælp af denne protokol udviste høj levedygtighed, anbefaler vi stadig at minimere tiden mellem celleisolation og yderligere downstream-analyse for at opretholde høj levedygtighed. Derudover er vellykket antistofmærkning afgørende for at isolere Sca1+ fedt progenitorceller med høj renhed. Derfor anbefales det kraftigt at bestemme den optimale koncentration af antistoffer for hvert antistof, og fortynding af antistofferne i trin 3.2 kan justeres i overensstemmelse hermed.
Denne flowcytometry-baserede protokol kan tilpasses afhængigt af individuel interesse i specifikke adipose progenitorcelleunderpopulationer. Her kan alternative antistofkombinationer bruges til at identificere og isolere den eller de populationer, der er af interesse. På grund af omfattende APC-markørdiversitet rapporterer flere laboratorier, der studerer APC'er ved hjælp af scRNA-seq, at celler isoleres ved hjælp af andre overflademarkører. PDGFRA+/CD44+ celler, CD31-/CD45-/Ter119-/CD29+/CD34+/Sca1+ celler og Pdgfrb+ celler er f.eks. CD142+ delpopulationer er også blevet karakteriseret og har vist sig at udvise begrænset adipogen differentieringskapacitet og en evne til at undertrykke adipogenesis10,11. Ud over Sca1 blev kombinationer af antistoffer mod CD55, CD81 og CD9 for nylig brugt til fremadrettet at isolere ASC og præadipocytunderpopulationer (ved hjælp af denne protokol) og studere subpopulation molekylær og funktionel heterogenitet7. Da fedt stamceller fra andre fedtpuder, herunder inguinal fedt puder og brun fedtvæv er blevet isoleret ved hjælp af kollagen dissociation som denne protokol15,16,17, denne protokol kan anvendes til isolering af fedt stamceller fra andre fedtvæv.
En advarsel i den nuværende tilgang er, at den er skræddersyet til isolering af umodne APC'er. Selv om den nuværende protokol giver høj levedygtighed APC'er, effekten og effektiviteten af isolering af andre fedtvæv bosiddende celletyper (dvs. immunceller, fibroblaster, endotelceller, osv.) er uklar. Det er vigtigt, at denne protokol ikke er egnet til isolering af modne adipocytter. Adipocytter har været yderst vanskelige at isolere ved hjælp af FACS på grund af deres store cellestørrelse og skrøbelighed. For nylig blev isolering af modne adipocytter fra FACS rapporteret ved hjælp af en stor dysestørrelse (150 μm) og lavt kappetryk (6 psi) med en specifik FSC/SSC-gatingstrategi18. Fremtidige undersøgelser kunne måske fusionere denne adipocyt isolation protokol med protokollen er beskrevet her for at etablere en mere omfattende rørledning til at isolere og studere forskellige celletyper i fedtvæv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi anerkender Mayo Clinic Microscopy Cell Analysis Core Flow Cytometry Facility for at få hjælp til FACS-sortering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | VWR | 87003-294 | |
| 13 mL culture tube | Thermo Fisher Scientific | 50-809-216 | |
| 15 mL conical tube | Greiner Bio-one | 188 271 | |
| 5 mL test tube with cell strainer snap cap | Thermo Fisher Scientific | 08-771-23 | |
| 50 mL conical tube | Greiner Bio-one | 227 261 | |
| 70 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| Anti-CD31-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-519 | |
| Anti-CD45-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-491 | |
| Anti-Sca1-APC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-833 | |
| Anti-Ter119-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-112-908 | |
| BSA | Gold Biotechnology | A-420-500 | |
| Collagenase type II | Thermo Fisher Scientific | 17101-015 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | |
| F-12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11765-054 | |
| FcR blocking reagent | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| Hanks' balanced salt solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| Horse serum | Thermo Fisher Scientific | 16050-122 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Propidium iodide solution | Miltenyi Biotec | 130-093-233 |
References
- Krotkiewski, M., Bjorntorp, P., Sjostrom, L., Smith, U. Impact of obesity on metabolism in men and women. Importance of regional adipose tissue distribution. The Journal of Clinical Investigation. 72, 1150-1162 (1983).
- Salans, L. B., Horton, E. S., Sims, E. A. Experimental obesity in man: cellular character of the adipose tissue. The Journal of Clinical Investigation. 50, 1005-1011 (1971).
- Trayhurn, P. Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity. Physiological Reviews. 93, 1-21 (2013).
- Halberg, N., et al. Hypoxia-inducible factor 1alpha induces fibrosis and insulin resistance in white adipose tissue. Molecular and Cellular Biology. 29, 4467-4483 (2009).
- Upadhyay, J., Farr, O., Perakakis, N., Ghaly, W., Mantzoros, C. Obesity as a Disease. Medical Clinics of North America. 102, 13-33 (2018).
- Cawthorn, W. P., Scheller, E. L., MacDougald, O. A. Adipose tissue stem cells meet preadipocyte commitment: going back to the future. Journal of Lipid Research. 53, 227-246 (2012).
- Cho, D. S., Lee, B., Doles, J. D. Refining the adipose progenitor cell landscape in healthy and obese visceral adipose tissue using single-cell gene expression profiling. Life Science Alliance. 2, 201900561 (2019).
- Burl, R. B., et al. Deconstructing Adipogenesis Induced by beta3-Adrenergic Receptor Activation with Single-Cell Expression Profiling. Cell Metabolism. 28, 300-309 (2018).
- Hepler, C., et al. Identification of functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic stromal subpopulations in visceral adipose tissue of adult mice. eLife. 7, 39636 (2018).
- Merrick, D., et al. Identification of a mesenchymal progenitor cell hierarchy in adipose tissue. Science. 364, 2501 (2019).
- Schwalie, P. C., et al. A stromal cell population that inhibits adipogenesis in mammalian fat depots. Nature. 559, 103-108 (2018).
- Raajendiran, A., et al. Identification of Metabolically Distinct Adipocyte Progenitor Cells in Human Adipose Tissues. Cell Reports. 27, 1528-1540 (2019).
- De Matteis, R., et al. In vivo physiological transdifferentiation of adult adipose cells. Stem Cells. 27, 2761-2768 (2009).
- Hanamsagar, R., et al. An optimized workflow for single-cell transcriptomics and repertoire profiling of purified lymphocytes from clinical samples. Scientific Reports. 10, 2219 (2020).
- Marinovic, M. P., et al. Crotamine induces browning of adipose tissue and increases energy expenditure in mice. Scientific Reports. 8, 5057 (2018).
- Takahashi, H., et al. Biological and clinical availability of adipose-derived stem cells for pelvic dead space repair. Stem Cells Translational Medicine. 1, 803-810 (2012).
- Cowan, C. M., et al. Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects. Nature Biotechnology. 22 (5), 560-567 (2004).
- Hagberg, C. E., et al. Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity. Cell Reports. 24, 2746-2756 (2018).
