Summary
Nous présentons une méthode simple pour isoler les cellules progénitrices adipeuses hautement viables des tampons graisseux épididymaux de souris utilisant le tri cellulaire activé par fluorescence.
Abstract
L’obésité et les désordres métaboliques tels que le diabète, la maladie cardiaque, et le cancer, sont tous associés au remodelage adipeux dramatique de tissu. Les cellules progénitrices adipeuses résidentes des tissus jouent un rôle clé dans l’homéostasie des tissus adipeux et peuvent contribuer à la pathologie tissulaire. L’utilisation croissante de technologies d’analyse à cellules individuelles – y compris le séquençage de l’ARN unicell cellules et la protéomique à cellules individuelles – transforme le champ des cellules souches/progénitrices en permettant une résolution sans précédent des changements d’expression cellulaire individuelle dans le contexte des changements à l’échelle de la population ou des tissus. Dans cet article, nous fournissons des protocoles détaillés pour disséquer le tissu adipeux épididymal de souris, isoler les cellules dérivées de tissus adipeux simples, et effectuer le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour enrichir pour viable Sca1+/CD31-/CD45-/Ter119- APC. Ces protocoles permettront aux chercheurs de préparer des APC de haute qualité adaptés aux analyses en aval, comme le séquençage de l’ARN à cellule unique.
Introduction
Le tissu adipeux joue un rôle clé dans le métabolisme énergétique. L’excès d’énergie est stocké sous forme de lipides, et le tissu adipeux est capable d’expansion ou de rétractation significative en fonction de l’état nutritionnel et de la demande énergétique. L’expansion du tissu adipeux peut résulter d’une augmentation de la taille des adipocytes (hypertrophie) et/ou d’une augmentation du nombre d’adipocytes (hyperplasie); ce dernier processus étroitement régulé par la prolifération et la différenciation des cellules progénitrices adipeuses1,2. Pendant l’obésité, le tissu adipeux se dilate excessivement, et le dysfonctionnement de tissu - y compris l’hypoxie, l’inflammation, et la résistance à l’insuline -développe souvent 3,4. Ces complications sont des facteurs de risque de nombreuses maladies chroniques, y compris l’hypertension, le diabète, les maladies cardiovasculaires, les accidents vasculaires cérébraux et le cancer5. Par conséquent, la limitation de l’expansion incontrôlée des tissus adipeux et l’atténuation des pathologies tissulaires adipeux sont les principales priorités de recherche biomédicale. Au cours de l’expansion des tissus adipeux, les cellules souches adipeuses résidentes dérivées des tissus prolifèrent et se différencient séquentiellement en préadipocytes (cellules progénitrices engagées) puis en adipocytes matures6. Des études récentes sur le séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq) montrent que ces populations de cellules progénitrices adipeux (APC) (ASC et préadipocytes) présentent une hétérogénéité moléculaire et fonctionnellesubstantielle 7,8,9,10,11,12. Par exemple, les ASC affichent une capacité de différenciation adpogénique réduite, tout en présentant des capacités de prolifération et d’expansion plus élevées, par rapport aux préadipocytes7. D’autres différences moléculaires sont rapportées au sein des populations de NC et de préadipocytes, bien que la pertinence fonctionnelle de ces différences restepeu claire 7. Ensemble, ces données mettent en évidence la complexité du pool de cellules progénitrices adipeux et soulignent la nécessité de mettre au point et de normaliser des outils pour mieux comprendre et manipuler ces populations cellulaires critiques.
Ce protocole détaille l’isolement des populations de cellules progénitrices épididymales à haute viabilité Sca1+ adipose provenant de tampons graisseux épididymaux de souris qui conviennent aux analyses sensibles en aval, y compris les études à cellules simples (scRNA-séquençage) et la culture cellulaire. L’isolement et la dissociation des garnitures épididymales de graisse ont été exécutéscomme précédemment décrit 7,13 avec de légères modifications qui améliorent la viabilité des APC isolés. En bref, les cellules dissociées des adipeuses épididymales sont tachées d’anticorps contre Sca1, un marqueur pour les ASC et les préadipocytes6,7, et d’autres marqueurs de lignée (Lin) : Ter119 (cellules érythroïdes), CD31 (cellules endothéliales) et CD45 (leucocytes). Viable Sca1+/Ter119-/CD31-/CD45-/DAPI- les cellules sont ensuite triées par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). Fait important, ce protocole a été validé par l’isolement et l’analyse réussis des cellules progénitrices viables de Sca1++/Lin- adipeuses rapportées dans une étude récente de séquençage d’ARN unicellulaire qui a identifié des sous-populations fonctionnellement hétérogènes dans les ASCs et les préadipocytes7.
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Protocol
Toutes les procédures expérimentales pour animaux ont été effectuées sous approbation par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de la Clinique Mayo.
1. Préparation de la solution
- Préparer la solution collagène 2% (w/v) en dissolvant la collagène II 2 g dans la solution de sel équilibrée (HBSS) de Hanks de 100 mL. Aliquot 200 μL chacun pour chaque utilisation.
- Préparer le milieu de neutralisation en mélangeant 84 mL de sérum de cheval F-12, 15 mL de sérum de cheval et 1 mL de pénicilline/streptomycine.
- Préparez le tampon de cytométrie d’écoulement en dissolvant 500 mg d’albumine bovine de sérum (BSA) et 400 μL de 0,5 M EDTA dans 100 mL de saline phosphate-tamponnée de Dulbecco (DPBS).
2. Dissection de la garniture épididymale de graisse et de la dissociation de tissu
- Euthanasier humainement (isoflurane/dislocation cervicale) une souris mâle. Dans ce protocole, une souris FVB de quatre mois a été utilisée.
- Appliquer/pulvériser 70% d’éthanol sur l’abdomen et exposer la cavité abdominale inférieure à l’aide de ciseaux et de forceps propres.
- Localiser la garniture épididymale de graisse (proximale/attachée aux testicules). Maintenez la jonction entre les testicules et la garniture épididymale de graisse avec des forceps émoussés et tirez doucement pour libérer le tampon épididymal de graisse.
- Retirer les testicules en coupant à l’aide de ciseaux et incuber la garniture épididymale de graisse dans 5 mL de HBSS complété avec 3% de BSA dans un tube conique de 50 mL à température ambiante pendant 15 min.
- Centrifugeuse à 150 x g pendant 7 min à 4 °C.
- Prenez la garniture épididymale flottante de graisse du tube conique de 50 mL et hachez finement le tissu utilisant les ciseaux propres.
- Ajouter 200 μL de collagène 2% solution dans 3,8 mL de HBSS dans un tube de culture de 13 mL. Ajouter le tissu haché et incuber dans un incubateur rotatif à 5 rpm pendant 1 h à 37 °C. Au lieu d’un incubateur rotatif, incubateur de culture cellulaire à 37 °C peut être alternativement utilisé avec des agitations occasionnelles.
- Transférer le contenu entier dans un tube conique de 50 mL et ajouter 10 mL de milieu de neutralisation. Mélanger délicatement en inversant le tube 2-3 fois.
- Préparer un autre tube conique de 50 mL équipé d’une passoire cellulaire de 70 μm. Filtrer le tissu digéré dans le nouveau tube à l’aide de la passoire cellulaire.
- Transférer le débit dans un tube conique de 15 mL et une centrifugeuse à 350 x g pendant 10 min à 4 °C.
- Retirez soigneusement les granulés de cellules supernatants et résuspendants avec 5 mL de DPBS. Centrifugeuse à 350 x g pendant 10 min à 4 °C.
- Retirez soigneusement le supernatant et ajoutez 50 μL de tampon de cytométrie d’écoulement. Bien mélanger en pipetting doucement et garder les cellules sur la glace. En raison du volume des granulés cellulaires et de la petite quantité de supernatant résiduel, le volume total des cellules dans le tampon de cytométrie de flux sera supérieur à 50 μL (environ 100 μL).
3. Étiquetage des anticorps et tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)
- Après avoir bien mélangé les cellules avec un tuyautage doux, transférer 54 μL de la suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugeuse de 1,7 mL. Ajouter 6 μL de réhésif de blocage FcR et bien mélanger en pipetting doucement. Incuber à 4 °C pendant 10 min. Enregistrez les cellules qui restent après avoir pris 54 μL et gardez-les dans la glace pour les utiliser comme un contrôle non taché à l’étape 3.5 et à l’étape 3.6.
- Pendant l’incubation à l’étape 3.1, préparer un cocktail d’anticorps en combinant 11 μL chacun d’anticorps anti-Sca1-APC, anti-Ter119-FITC, anti-CD31-FITC et anticorps anti-CD45-FITC dans un tube de microcentrifugeuse. Bien mélanger par pipetting doux et garder sur la glace à l’abri de la lumière.
- Après incubation avec le reagent de blocage FcR pendant 10 min, ajouter 40 μL du cocktail d’anticorps et bien mélanger par pipetting doux. Incuber à 4 °C pendant 10 min.
- Ajouter 500 μL de tampon de cytométrie d’écoulement complété par 1 μg/mL de DAPI dans les cellules tachées. Bien mélanger en utilisant un tube à essai de 5 mL avec un bouchon de pression de passoire cellulaire. Gardez les cellules sur la glace.
- Ajouter 500 μL de tampon de cytométrie d’écoulement aux cellules restantes à l’étape 3.1 et bien mélanger par pipetting doux. Filtrer les cellules à l’aide d’un tube à essai de 5 mL avec bouchon de pression de passoire cellulaire. Gardez ces cellules sur la glace et utilisez-les comme un contrôle non taché dans l’étape suivante.
- Prenez les cellules tachées et le contrôle non taché à l’instrument d’analyse ou de tri facs.
- Identifier et isoler l’APC+/FITC-/DAPI- population avec des stratégies de gating indiquées dans la figure 1. Ces cellules représentent viables Sca1+/Ter119-/CD31-/CD45- cellules. Les débris et les agrégats cellulaires sont épuisés à l’aide de parcelles avant (FSC) et latérales de dispersion (SSC). Ensuite, DAPI- la population est fermée, suivie d’un gating d’APC+/FITC- population. Les commandes non tachées doivent être utilisées pour aider à définir les paramètres de gating.
- Recueillir les cellules dans 500 μL de tampon de cytométrie d’écoulement dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL. À l’avenir, toutes les procédures devraient être effectuées dans des conditions stériles afin de minimiser une contamination. Environ 50 000 à 100 000 cellules sont collectées à partir d’une souris.
- Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre pour évaluer la viabilité des cellules. Étant donné que les agrégats cellulaires peuvent interférer avec d’autres analyses en aval, la présence d’agrégats cellulaires est également évaluée afin d’assurer une présence minimale (et non 5 % du nombre de cellules viables) de ces agrégats.
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Representative Results
Des souris FVB mâles de quatre mois ont été employées dans cette expérience. Après l’exclusion des débris et des doublets à l’aide de parcelles FSC/SSC, des cellules viables (DAPI- population) ont été fermées, suivies de la sélection d’APC+/FITC- population (figure 1). Les portes DAPI, APC et FITC ont été dessinées en fonction du contrôle non taché. Les stratégies de gating sont indiquées dans la figure 1.
Après 1 h de tri, la qualité de l’isolement a été évaluée quantitativement par analyse de cytométrie de débit(figures 2,3). Les cellules ont été souillées avec la solution d’iodure de propidium (1:100) pour la coloration de viabilité. Utilisant le même gating pour le tri, les cellules ont maintenu la viabilité et la pureté élevées : 92.6 ± 2.2% cellules simples (troisième panneau dans la figure 2),86.4 ± viabilité de 3.0% (PI- cellules), et 86.0 ± 2.8% APC+/FITC- cellules (n= 4, déviation standard ± moyenne). Ces pourcentages ont été définis comme des pourcentages de chaque population fermée (cellules individuelles, IP- cellules et IP-/APC+/FITC- population, respectivement, à la figure 2)par rapport au nombre total de cellules.
Figure 1 : Isolement des cellules individuelles viables de Sca1+ ancêtre adipeux par FACS. Les stratégies de gating sont montrées dans les cellules tachées et dans un contrôle non taché. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Analyse représentative de la cytométrie du débit pour évaluer la viabilité des cellules après l’isolement. La coloration de viabilité a été exécutée utilisant l’iodure de propidium. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Quantification du pourcentage de cellules 1 h après l’isolement dans l’analyse de la cytométrie du débit. Pourcentages de cellules individuelles, de cellules viables et d’APC+/FITC- les cellules ont été quantifiées pour évaluer la pureté et la viabilité après l’isolement des cellules. Les données présentées représentent la moyenne ± écart type. n=4. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Le séquençage à ARN à cellules simples (scRNA-seq) gagne rapidement du terrain en tant qu’outil puissant pour étudier simultanément diverses populations cellulaires au niveau d’une seule cellule. En raison des coûts élevés associés à la préparation de l’échantillon et au séquençage à haut débit, il est impératif d’optimiser les intrants cellulaires (grande viabilité et pureté) afin d’augmenter les chances de succès expérimental. Certains protocoles de préparation cellulaire reposent sur l’enlèvement des cellules mortes et des débris à l’aide de lavages à faible spin et d’une séparation à base de colonnes sans triFACS 14. Beaucoup de ces méthodes, cependant, réduisent considérablement le nombre de cellules récupérées viables, et dans beaucoup de cas, les cellules mortes ne sont pas complètementenlevées 14. Ce protocole décrit une méthode simple pour isoler les cellules progénitrices Sca1+ adipeuses hautement viables contenant un minimum de débris cellulaires, de doublets cellulaires et de cellules mortes. Bien que les cellules isolées à l’aide de ce protocole aient fait preuve d’une grande viabilité, nous recommandons toujours de réduire au minimum le temps entre l’isolement cellulaire et d’autres analyses en aval afin de maintenir une grande viabilité. En outre, l’étiquetage réussi d’anticorps est critique pour isoler des cellules progénitrices Sca1+ adipose avec la pureté élevée. Par conséquent, la détermination de la concentration optimale des anticorps est fortement recommandée pour chaque anticorps, et la dilution des anticorps dans l’étape 3.2 peut être ajustée en conséquence.
Ce protocole basé sur la cytométrie du flux peut être personnalisé en fonction de l’intérêt individuel pour des sous-populations spécifiques de cellules progénitrices adipeux. Ici, d’autres combinaisons d’anticorps peuvent être utilisées pour identifier et isoler la population d’intérêt. En effet, en raison de la diversité étendue des marqueurs APC, plusieurs laboratoires qui étudient les APC à l’aide de scRNA-seq signalent isoler les cellules à l’aide d’autres marqueurs de surface. Par exemple, PDGFRA+/CD44+ cellules, CD31-/CD45-/Ter119-/CD29+/CD34+/Sca1+ cellules, et Pdgfrb+ cellules ont été isolées par FACS pour les analyses apc scRNA-seq en aval8,9,11. Cd142+ sous-populations ont également été caractérisés et sont montrés pour montrer la capacité adipogenic limitée de différenciation et une capacité de supprimer l’adipogenèse10,11. En plus de Sca1, des combinaisons d’anticorps contre CD55, CD81 et CD9 ont été récemment utilisées pour isoler prospectivement les sous-populations de NCS et de préadipocytes (en utilisant ce protocole) et étudier l’hétérogénéité moléculaire et fonctionnelle de la sous-population7. En outre, puisque les cellules progénitrices adipeuses d’autres adipeuses comprenant les aumôniers inguinaux et les tissus adipeux bruns ont été isolées utilisant la dissociation de collagène comme le protocoleactuel 15,16,17,le protocole actuel peut être applicable à l’isolement des cellules progénitrices adipeuses d’autres tissus adipeux.
Une mise en garde de l’approche actuelle est qu’elle est adaptée à l’isolement des APC immatures. Bien que le protocole actuel donne des APC à haute viabilité, l’efficacité et l’efficacité de l’isolement d’autres types de cellules résidentes des tissus adipeux (c.-à-d. cellules immunitaires, fibroblastes, cellules endothéliales, etc.) ne sont pas claires. Fait important, ce protocole n’est pas adapté à l’isolement des adipocytes matures. Les adipocytes ont été extrêmement difficiles à isoler en utilisant facs en raison de leur grande taille cellulaire et la fragilité. Récemment, l’isolement des adipocytes matures par FACS a été rapporté utilisant une grande taille de buse (150 μm) et une basse pression de gaine (6 psi) avec une stratégie spécifique de gating de FSC/SSC18. Les études futures pourraient peut-être fusionner ce protocole d’isolement des adipocytes avec le protocole décrit ici pour établir un pipeline plus complet pour isoler et étudier divers types de cellules dans le tissu adipeux.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous reconnaissons l’installation de cytométrie de flux de base d’analyse cellulaire de microscopie de la Clinique Mayo pour l’aide au tri facs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | VWR | 87003-294 | |
| 13 mL culture tube | Thermo Fisher Scientific | 50-809-216 | |
| 15 mL conical tube | Greiner Bio-one | 188 271 | |
| 5 mL test tube with cell strainer snap cap | Thermo Fisher Scientific | 08-771-23 | |
| 50 mL conical tube | Greiner Bio-one | 227 261 | |
| 70 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| Anti-CD31-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-519 | |
| Anti-CD45-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-491 | |
| Anti-Sca1-APC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-833 | |
| Anti-Ter119-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-112-908 | |
| BSA | Gold Biotechnology | A-420-500 | |
| Collagenase type II | Thermo Fisher Scientific | 17101-015 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | |
| F-12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11765-054 | |
| FcR blocking reagent | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| Hanks' balanced salt solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| Horse serum | Thermo Fisher Scientific | 16050-122 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Propidium iodide solution | Miltenyi Biotec | 130-093-233 |
References
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