Biology

הכנת תאי אדיפוס אבות מרקמות שומן אפידימליות עכבר

Published: August 25, 2020 doi: 10.3791/61694

¹Department of Biochemistry and Molecular Biology, Mayo Clinic

Summary

אנו מציגים שיטה פשוטה לבודד תאי אב שומן קיימא מאוד מרפידות שומן אפידיליות עכבר באמצעות מיון תאים המופעלים פלואורסצנטיות.

Abstract

השמנת יתר והפרעות מטבוליות כגון סוכרת, מחלות לב וסרטן, כולם קשורים לשיפוץ דרמטי של רקמת השומן. תאים אב שומן תושב רקמה (נגמ"שים) לשחק תפקיד מפתח הומאוסטזיס רקמת שומן והוא יכול לתרום פתולוגיה רקמה. השימוש הגובר בטכנולוגיות ניתוח תאים בודדים – כולל רצף רנ"א חד-תאי ופרוטאומיקה של תא יחיד – משנה את שדה תאי הגזע/אב בכך שהוא מאפשר רזולוציה חסרת תקדים של שינויים בודדים בביטוי התא בהקשר של שינויים באוכלוסייה או ברקמות. במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקולים מפורטים כדי לנתח רקמת שומן אפידימלית של העכבר, לבודד תאים בודדים שמקורם ברקמת שומן, ולבצע מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות (FACS) כדי להעשיר עבור Sca1⁺/CD31^{קיימא -}/CD45^-/Ter119^- נגמ"שים. פרוטוקולים אלה יאפשרו לחוקרים להכין נגמ"שים באיכות גבוהה המתאימים לניתוחים במורד הזרם כגון רצף RNA של תא יחיד.

Introduction

רקמת שומן ממלאת תפקיד מפתח בחילוף החומרים של האנרגיה. עודף אנרגיה מאוחסן בצורה של שומנים, ורקמת שומן מסוגל התרחבות משמעותית או נסיגה בהתאם למצב תזונתי וביקוש אנרגטי. הרחבת רקמת השומן יכולה לנבוע מגידול בגודל adipocyte (היפרטרופיה) ו/או מעלייה במספר adipocyte (היפרפלזיה); התהליך האחרון מוסדר בחוזקה על ידי התפשטות ובידול של תאים אב שומן¹^,². במהלך השמנת יתר, רקמת השומן מתרחבת יתר על המידה, ותפקוד לקוי של רקמות – כולל היפוקסיה, דלקת ועמידות לאינסולין – מתפתח לעתים^{קרובות 3}^,⁴. סיבוכים אלה הם גורמי סיכון למחלות כרוניות רבות כולל יתר לחץ דם, סוכרת, מחלות לב וכלי^{דם, שבץ}מוחי וסרטן 5 . לפיכך, הגבלת הרחבת רקמת שומן בלתי מבוקרת והפתולוגיות של רקמת שומן מקלות הן בראש סדר העדיפויות המחקרי הביו-רפואי. במהלך הרחבת רקמת השומן, תאי גזע שמקורם ברקמת שומן (ASCs) מתרבים ומבדילים ברצף לתוך preadipocytes (תאי אב מחויבים) ולאחר מכן לתוך adipocytes^{בוגרת 6}. מחקרים אחרונים על רצף רנ"א חד-תאי (scRNA-seq) מראים כי אוכלוסיות אלה של תאי אב שומן (APC) (ASCs ו preadipocytes) מפגינים הטרוגניות מולקולרית ופונקציונלית משמעותית⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹². לדוגמה, ASCs מציגים יכולת בידול אדיפוגנית מופחתת, תוך הפגנת יכולות התפשטות והרחבה גבוהות יותר, בהשוואה ל- preadipocytes⁷. הבדלים מולקולריים נוספים מדווחים בתוך ASC ואוכלוסיות preadipocyte, אם כי הרלוונטיות התפקודית של הבדלים אלה עדיין לא ברור⁷. יחד, נתונים אלה מדגישים את המורכבות של מאגר התאים האב השומן ומדגישים את הצורך לפתח ולתקנן כלים כדי להבין ולטפל טוב יותר באוכלוסיות תאים קריטיות אלה.

פרוטוקול זה מפרט את הבידוד של Sca1⁺ אוכלוסיות תאים אב שומן אדידימאלי העכבר המתאימים ניתוחים רגישים במורד הזרם, כולל מחקרים חד-תאיים (scRNA-רצף) ותרבות התא. בידוד ודיסוציאציה של רפידות שומן אפידיליות בוצעו כפי שתואר קודם לכן⁷^,¹³ עם שינויים קלים המשפרים את הכדאיות של נגמ"שים מבודדים. בקצרה, תאים מנותקים מרפידות שומן אפידימליות מוכתמים בנוגדנים נגד Sca1, סמן הן עבור ASCs והן עבור preadipocytes⁶^,⁷, וסמני שושלת אחרים (לין): Ter119 (תאי אריתרואיד), CD31 (תאי אנדותל), ו- CD45 (לויקוציטים). Sca1⁺/Ter119^{קיימא -}/CD31^-/CD45^-/DAPI^- תאים ממוינים לאחר מכן לפי מיון תאים המופעל על-ידי פלואורסצנטיות (FACS). חשוב לציין, פרוטוקול זה אומת על ידי בידוד וניתוח מוצלחים של Sca1⁺/ Lin^{קיימא -} תאי אב שומן דיווחו במחקר רצף RNA תא יחיד האחרון שזיהה תת-אוכלוסיות הטרוגניות תפקודית בתוך ASCs ו preadipocytes⁷.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים הניסיוניים בבעלי חיים בוצעו באישור הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של מאיו קליניק.

1. הכנת פתרון

הכן קולאז 2% (w / v) פתרון על ידי המסת קולגנאז II 2 גרם ב 100 מ"ל הנקס' פתרון מלח מאוזן (HBSS). Aliquot 200 μL כל אחד לכל שימוש.
הכן מדיום נטרול על ידי ערבוב 84 מ"ל F-12 בינוני, 15 מ"ל סרום סוס, ו 1 מ"ל פניצילין / סטרפטומיצין.
הכן מאגר cytometry זרימה על ידי המסת 500 מ"ג של אלבומין סרום שור (BSA) ו 400 μL של 0.5 M EDTA ב 100 מ"ל של מלוחים אגירה פוספט של Dulbecco (DPBS).

2. ניתוח של כרית שומן אפידילית ניתוק רקמות

המתת חסד אנושית (נקע isoflurane / צוואר הרחם) עכבר זכר אחד. בפרוטוקול זה נעשה שימוש בעכבר FVB בן ארבעה חודשים.
יש למרוח/לרסס 70% אתנול על הבטן ולחשוף את חלל הבטן התחתון באמצעות מספריים נקיים ומלקחיים.
אתר כרית שומן אפידילית (פרוקסימלית / מחוברת לאשכים). להחזיק את הצומת בין האשכים כרית שומן epididymal עם מלקחיים קהים למשוך בעדינות כדי לשחרר את כרית שומן epididymal.
הסר אשכים על ידי חיתוך באמצעות מספריים כרית שומן אפידילית דגירה ב 5 מ"ל של HBSS בתוספת 3% BSA בצינור חרוט 50 מ"ל בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות.
צנטריפוגה ב 150 x גרם במשך 7 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
קח כרית שומן אפידילית צפה מצינור חרוט 50 מ"ל וטחון דק את הרקמה באמצעות מספריים נקיים.
הוסף 200 μL קולגנאז 2% פתרון לתוך 3.8 מ"ל של HBSS בצינור תרבות 13 מ"ל. מוסיפים את הרקמה הטחונית ואת הדגירה באינקובטור מסתובב ב 5 סל"ד עבור 1 שעה ב 37 מעלות צלזיוס. במקום אינקובטור מסתובב, חממת תרבית תאים ב 37 °C (69 °F) ניתן להשתמש לחילופין עם תסיסה מדי פעם.
מעבירים את כל התוכן לצינור חרוט של 50 מ"ל ומוסיפים 10 מ"ל של מדיום נטרול. מערבבים בעדינות על ידי היפוך הצינור 2-3 פעמים.
הכן עוד צינור חרוט 50 מ"ל מצויד מסננת תאים 70 מיקרומטר. לסנן את הרקמה המתעכלת לתוך הצינור החדש באמצעות מסננת התא.
להעביר את הזרימה דרך צינור חרוט 15 מ"ל וצנטריפוגה ב 350 x g במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
בזהירות להסיר את כדורי תא supernatant ו resuspend עם 5 מ"ל של DPBS. צנטריפוגה ב 350 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
בזהירות להסיר את supernatant ולהוסיף 50 μL של מאגר cytometry זרימה. מערבבים היטב על ידי pipeting בעדינות ולשמור על התאים על הקרח. בשל נפח כדורי התא וכמות קטנה של supernatant שיורית, נפח כולל של תאים במאגר cytometry זרימה יהיה גדול מ 50 μL (כ 100 μL).

3. תיוג נוגדנים ופלואורסצנטיות מופעל מיון תאים (FACS)

לאחר ערבוב התאים היטב עם pipetting עדין, להעביר 54 μL של המתלה התא לתוך צינור microcentrifuge 1.7 מ"ל. הוסף 6 μL של מגיב חסימת FcR ומערבבים היטב על ידי pipetting בעדינות. דגירה ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. שמור את כל התאים שנותרו לאחר נטילת 54 μL ולשמור אותם בקרח להשתמש כשליטה מוכתמת בשלב 3.5 וצעד 3.6.
במהלך הדגירה בשלב 3.1, הכינו קוקטייל נוגדנים על ידי שילוב של 11 μL כל אחד נוגדנים אנטי סקא1-APC, אנטי Ter119-FITC, אנטי CD31-FITC, נוגדנים נגד CD45-FITC בצינור microcentrifuge. מערבבים היטב על ידי צינור עדין ולשמור על קרח מוגן מפני אור.
לאחר הדגירה עם FcR חסימת ריאגנט במשך 10 דקות, להוסיף 40 μL של קוקטייל הנוגדנים ומערבבים היטב על ידי pipetting עדין. דגירה ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
הוסף 500 μL של מאגר cytometry זרימה בתוספת 1 מיקרוגרם / מ"ל של DAPI לתוך התאים המוכתמים. מערבבים היטב על ידי צינור עדין לתאי סינון באמצעות מבחנה 5 מ"ל עם כובע הצמדה מסננת תאים. שמור תאים על קרח.
הוסף 500 μL של מאגר cytometry זרימה לתאים הנותרים בשלב 3.1 ומערבבים היטב על ידי pipetting עדין. סנן תאים באמצעות מבחנה של 5 מ"ל עם מכסה הצמדה למסננת תאים. שמור תאים אלה על הקרח ולהשתמש כפקד מוכתם בשלב הבא.
קח את התאים המוכתמים ואת השליטה הבלתי מוכתמת לניתוח FACS או למכשיר מיון.
1. זהה ובודד את אוכלוסיית APC⁺/FITC^-/DAPI^- עם אסטרטגיות גטינג המוצגות באיור 1. תאים אלה מייצגים^תאים מעשיים מסוג Sca1⁺/Ter119^-/CD31^-/CD45. פסולת וצבירות תאים מתרוקנות באמצעות החלקות קדימה (FSC) ופיזור צדדי (SSC). לאחר מכן, DAPI^- האוכלוסייה מגודרת, ואחריו gating של APC⁺/ FITC^- אוכלוסייה. יש להשתמש בפקדים לא מוכתמים כדי לסייע בהגדרת פרמטרי gating.
2. לאסוף את התאים לתוך 500 μL של חיץ cytometry זרימה בצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל. בהמשך, כל ההליכים צריכים להתבצע בתנאים סטריליים כדי למזער זיהום. כ 50,000 – 100,000 תאים נאספים מעכבר אחד.
ספירת תאים באמצעות המוציטרומטר כדי להעריך את הכדאיות של התא. מאחר שצבירות תאים עלולות להפריע לניתוחים נוספים במורד הזרם, נוכחותם של צבירות תאים מוערכת גם היא כדי להבטיח נוכחות מינימלית (<5% ממספר התאים בר-הקיימא) של אגרגטים אלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בניסוי זה נעשה שימוש בעכברי FVB זכרים בני ארבעה חודשים. לאחר הדרה של פסולת וכפולים באמצעות חלקות FSC / SSC, תאים קיימא (DAPI^- אוכלוסייה) היו מגודרים, ואחריו הבחירה של APC⁺/ FITC^- אוכלוסייה (איור 1). שערי DAPI, APC ו- FITC צוירו בהתבסס על הפקד הבלתי מוכתם. אסטרטגיות גטינג מוצגות באיור 1.

לאחר שעה של מיון, איכות הבידוד הוערכה כמותית על ידי ניתוח ציטומטריית זרימה (איורים 2,3). התאים היו מוכתמים בתמיסת פרופידיום יודיד (1:100) עבור כתמי הכדאיות. באמצעות אותו גיתור למיון, התאים שמרו על כדאיות גבוהה וטוהר: 92.6 ± 2.2% תאים בודדים (פאנל שלישי באיור 2),86.4 ± 3.0% כדאיות (PI^- תאים), ו- 86.0 ± 2.8% APC⁺/ FITC^- תאים (n = 4, ממוצע ± סטיית תקן). אחוזים אלה הוגדרו כאחוזים של כל אוכלוסייה מגודרת (תאים בודדים, PI^- תאים^ו-PI - /APC⁺/FITC^- אוכלוסייה, בהתאמה, באיור 2) ביחס למספר התא הכולל.

איור 1: בידוד של Sca1 בר קיימא⁺ תאים בודדים אב שומן על ידי FACS. אסטרטגיות גטינג מוצגות הן בתאים מוכתמים והן בשליטה לא מוכתמת. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: ניתוח cytometry זרימה מייצג כדי להעריך את הכדאיות של תאים לאחר הבידוד. כתמי הכדאיות בוצעו באמצעות יודיד פרופידיום. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: כימות אחוז התאים 1 שעות לאחר הבידוד בניתוח ציטומטריית זרימה. אחוזים של תאים בודדים, תאים בני קיימא, ו- APC⁺/ FITC^- תאים כמתו כדי להעריך טוהר וכדאיות לאחר בידוד של תאים. הנתונים המוצגים מייצגים את סטיית התקן ± הממוצעת. n=4. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

רצף RNA של תא יחיד (scRNA-seq) צובר תאוצה במהירות ככלי רב עוצמה לחקור בו זמנית אוכלוסיות תאים מגוונות ברמת התא הבודד. בשל עלויות גבוהות הקשורות להכנת מדגם רצף תפוקה גבוהה, זה הכרחי כדי לייעל את התשומות הסלולר (כדאיות גבוהה וטוהר) כדי להגדיל את הסבירות להצלחה ניסיונית. פרוטוקולים מסוימים להכנת תאים מסתמכים על הסרת תאים מתים ופסולת באמצעות שטיפות ספין נמוך והפרדה מבוססת עמודה ללא^{FACS מיון 14}. עם זאת, רבות משיטות אלה מפחיתות באופן משמעותי את מספר התאים המשוחזרים, ובמקרים רבים, תאים מתים אינם מוסרים לחלוטין¹⁴. פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה לבידוד תאי Sca1⁺ אב שומן המכילים פסולת תאית מינימלית, כפילויות תאים ותאים מתים. למרות שתאים מבודדים באמצעות פרוטוקול זה הפגינו כדאיות גבוהה, אנו עדיין ממליצים למזער את הזמן בין בידוד התאים וניתוח נוסף במורד הזרם כדי לשמור על כדאיות גבוהה. בנוסף, תיוג נוגדנים מוצלח הוא קריטי כדי לבודד Sca1⁺ תאי אב שומן עם טוהר גבוה. לפיכך, קביעת ריכוז אופטימלי של נוגדנים מומלץ מאוד עבור כל נוגדן, ודילול של הנוגדנים בשלב 3.2 ניתן להתאים בהתאם.

פרוטוקול מבוסס ציטומטריית זרימה זה נוח להתאמה אישית בהתאם לעניין פרטני באוכלוסיות משנה ספציפיות של תאים אב שומן. כאן, שילובי נוגדנים חלופיים יכולים לשמש כדי לזהות ולבודד את האוכלוסייה של עניין. ואכן, בשל מגוון נרחב של סמן APC, מעבדות מרובות החוקרות נגמ"שים באמצעות scRNA-seq מדווחות על בידוד תאים באמצעות סמני שטח אחרים. לדוגמה, PDGFRA⁺/CD44⁺ תאים, CD31^-/CD45^-/Ter119^-/CD29⁺/CD34⁺/Sca1⁺ תאים, ותאי Pdgfrb⁺ בודדו על ידי FACS עבור ניתוחי APC scRNA-seq במורד הזרם⁸^,⁹^,¹¹. CD142⁺ תתי-אוכלוסיות התאפיינו גם הן והוכח כי הן מציגות יכולת בידול אדיפוגנית מוגבלת ויכולת לדכא אדיפוגנזה¹⁰^,¹¹. בנוסף Sca1, שילובים של נוגדנים נגד CD55, CD81, ו CD9 שימשו לאחרונה כדי לבודד פוטנציאלית ASC ו preadipocyte תת-אוכלוסיות (באמצעות פרוטוקול זה) ו מחקר תת אוכלוסיית הטרוגניות מולקולרית ותפקודית⁷. יתר על כן, מאז תאי אב שומן מרפידות שומן אחרות כולל רפידות שומן מפשעתי ורקמות שומן חום בודדו באמצעות דיסוציאציה קולגנאז כמו הפרוטוקול הנוכחי¹⁵^,¹⁶^,¹⁷, הפרוטוקול הנוכחי עשוי להיות ישים לבידוד של תאי אב שומן מרקמות שומן אחרות.

אזהרה אחת של הגישה הנוכחית היא שהיא מותאמת לבידוד של נגמ"שים לא בוגרים. למרות שהפרוטוקול הנוכחי מניב נגמ"שים בעלי כדאיות גבוהה, היעילות והיעילות של בידוד של סוגי תאים אחרים של רקמת שומן (כלומר, תאים חיסוניים, פיברובלסטים, תאי אנדותל וכו') אינה ברורה. חשוב לציין, פרוטוקול זה אינו מתאים לבידוד של אדיפוציטים בוגרים. Adipocytes היו קשים מאוד לבודד באמצעות FACS בשל גודל התא הגדול שלהם שבריריות. לאחרונה, בידוד של adipocytes בוגרת על ידי FACS דווח באמצעות גודל זרבובית גדולה (150 מיקרומטר) ולחץ נדן נמוך (6 psi) עם אסטרטגיה ספציפית FSC / SSC gating¹⁸. מחקרים עתידיים יכולים אולי למזג פרוטוקול בידוד adipocyte זה עם הפרוטוקול המתואר כאן כדי להקים צינור מקיף יותר כדי לבודד וללמוד סוגי תאים מגוונים בתוך רקמת שומן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

אנו מכירים את מאיו קליניק מיקרוסקופיה ניתוח תאים הליבה Cytometry מתקן לסיוע עם מיון FACS.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL microcentrifuge tube	VWR	87003-294
13 mL culture tube	Thermo Fisher Scientific	50-809-216
15 mL conical tube	Greiner Bio-one	188 271
5 mL test tube with cell strainer snap cap	Thermo Fisher Scientific	08-771-23
50 mL conical tube	Greiner Bio-one	227 261
70 µm cell strainer	Thermo Fisher Scientific	22-363-548
Anti-CD31-FITC antibody	Miltenyi Biotec	130-102-519
Anti-CD45-FITC antibody	Miltenyi Biotec	130-102-491
Anti-Sca1-APC antibody	Miltenyi Biotec	130-102-833
Anti-Ter119-FITC antibody	Miltenyi Biotec	130-112-908
BSA	Gold Biotechnology	A-420-500
Collagenase type II	Thermo Fisher Scientific	17101-015
DAPI	Thermo Fisher	D1306
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Thermo Fisher Scientific	14190-144
F-12 medium	Thermo Fisher Scientific	11765-054
FcR blocking reagent	Miltenyi Biotec	130-092-575
Hanks' balanced salt solution (HBSS)	Thermo Fisher Scientific	14025-092
Horse serum	Thermo Fisher Scientific	16050-122
Penicillin-streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140-122
Propidium iodide solution	Miltenyi Biotec	130-093-233