Summary
Vi presenterer en enkel metode for å isolere svært levedyktige fett stamceller fra mus epididymal fett pads ved hjelp av fluorescens aktivert celle sortering.
Abstract
Fedme og metabolske forstyrrelser som diabetes, hjertesykdom og kreft, er alle forbundet med dramatisk fettvev remodeling. Vev-resident fett stamceller (APCer) spille en nøkkelrolle i fettvev homeostase og kan bidra til vev patologi. Den økende bruken av encellede analyseteknologier – inkludert encellede RNA-sekvensering og encellede proteomikk – forvandler stamcellefeltet ved å tillate enestående oppløsning av individuelle celleuttrykksendringer i sammenheng med endringer i hele befolkningen eller vev. I denne artikkelen gir vi detaljerte protokoller for å dissekere mus epididymal fettvev, isolere enkelt fettvev-avledede celler, og utføre fluorescens aktivert celle sortering (FACS) for å berike for levedyktig Sca1+/ CD31-/ CD45-/ Ter119- APCer. Disse protokollene vil tillate etterforskere å forberede høy kvalitet APCer egnet for nedstrøms analyser som enkeltcellede RNA sekvensering.
Introduction
Fettvev spiller en nøkkelrolle i energimetabolismen. Overflødig energi lagres i form av lipider, og fettvev er i stand til betydelig ekspansjon eller tilbaketrekking avhengig av ernæringsstatus og energisk etterspørsel. Utvidelse av fettvev kan skyldes en økning i adipocyttstørrelse (hypertrofi) og/eller fra en økning i adipocyttnummer (hyperplasi); den sistnevnte prosessen tett regulert av spredning og differensiering av fett stamceller1,2. Under fedme, fettvev utvider seg overdrevet, og vev dysfunksjon - inkludert hypoksi, betennelse, og insulinresistens – utvikler ofte3,4. Disse komplikasjonene er risikofaktorer for mange kroniske sykdommer, inkludert hypertensjon, diabetes, kardiovaskulære sykdommer, hjerneslag og kreft5. Derfor er det å begrense ukontrollert fettvevsutvidelse og redusere fettvevspatologier topp biomedisinske forskningsprioriteringer. Under fettvevsutvidelse sprer resident fettvevsavledede stamceller (ASCer) seg og differensierer sekvensielt til preadipocytter (engasjerte stamceller) og deretter til modne adipocytter6. Nyere encellede RNA-sekvenseringsstudier (scRNA-seq) viser at disse fettstamtamcellepopulasjonene (APC) (ASC og preadipocytter) viser betydelig molekylær og funksjonell heterogenitet7,8,9,10,11,12. AsCs viser for eksempel en redusert adipogenic differensieringskapasitet, samtidig som den viser høyere sprednings- og ekspansjonsfunksjoner, sammenlignet med preadipocytter7. Ytterligere molekylære forskjeller rapporteres innenfor ASC- og preadipocyttpopulasjoner, selv om den funksjonelle relevansen av disse forskjellene fortsatt er uklar7. Sammen fremhever disse dataene kompleksiteten i fettstamcelleutvalget og understreker behovet for å utvikle og standardisere verktøy for å bedre forstå og manipulere disse kritiske cellepopulasjonene.
Denne protokollen beskriver isoleringen av høy levedyktighet Sca1+ fett stamcellepopulasjoner fra mus epididymal fett pads som er egnet for sensitive nedstrøms analyser, inkludert encellede studier (scRNA-sekvensering) og cellekultur. Isolasjon og dissosiasjon av epididymale fettputer ble utført som tidligere beskrevet7,13 med små modifikasjoner som forbedrer levedyktigheten til isolerte APCer. Kort sagt er dissosierte celler fra epididymale fettputer farget med antistoffer mot Sca1, en markør for både ASC og preadipocytter6,7og andre lineage (Lin) markører: Ter119 (erythroid celler), CD31 (endotelceller) og CD45 (leukocytter). Levedyktig Sca1+/Ter119-/CD31-/CD45-/DAPI- celler sorteres deretter etter fluorescensaktivert cellesortering (FACS). Viktigere, denne protokollen ble validert ved vellykket isolasjon og analyse av levedyktig Sca1+/ Lin- fett stamceller rapportert i en nylig enkeltcellede RNA sekvensering studie som identifiserte funksjonelt heterogene underpopulasjoner innenfor ASCs og preadipocytes7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøksprosedyrer ble utført under godkjenning av Mayo Clinic Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Forberedelse av oppløsning
- Forbered kollagen 2 % (w/v) oppløsning ved å oppløse kollagenase II 2 g i 100 ml Hanks balanserte saltoppløsning (HBSS). Aliquot 200 μL hver for hver bruk.
- Forbered nøytraliseringsmediet ved å blande 84 ml F-12 medium, 15 ml hesteserum og 1 ml penicillin/streptomycin.
- Forbered strømningscytometribufferen ved å oppløse 500 mg storfe serumalbumin (BSA) og 400 μL på 0,5 M EDTA i 100 ml Dulbeccos fosfatbufret saltvann (DPBS).
2. Disseksjon av epididymal fettpute og vevdissosiasjon
- Humant euthanize (isofluran/cervical dislokasjon) en mannlig mus. I denne protokollen ble en fire måneder gammel FVB-mus brukt.
- Påfør / spray 70% etanol på magen og utsett nedre bukhulen ved hjelp av ren saks og tang.
- Finn epididymal fettpute (proksimal/festet til testiklene). Hold krysset mellom testiklene og epididymal fettpute med stumpe tang og trekk forsiktig for å frigjøre den epididymale fettputen.
- Fjern testiklene ved å kutte med saks og inkubere epididymal fettpute i 5 ml HBSS supplert med 3% BSA i et 50 ml konisk rør ved romtemperatur i 15 min.
- Sentrifuge ved 150 x g i 7 min ved 4 °C.
- Ta flytende epididymal fettpute fra 50 ml konisk rør og fin hakke vevet ved hjelp av ren saks.
- Tilsett 200 μL kollagenase 2% oppløsning i 3,8 ml HBSS i et 13 ml kulturrør. Tilsett hakket vev og inkuber i en roterende inkubator ved 5 omdr./min i 1 t ved 37 °C. I stedet for en roterende inkubator kan cellekulturinkubator ved 37 °C alternativt brukes med sporadiske agitasjoner.
- Overfør hele innholdet til et konisk rør på 50 ml og tilsett 10 ml nøytraliseringsmedium. Bland forsiktig ved å snu røret 2-3 ganger.
- Forbered ytterligere 50 ml konisk rør utstyrt med en 70 μm cellesil. Filtrer det fordøyde vevet inn i det nye røret ved hjelp av cellesilen.
- Overfør gjennomstrømningen til et konisk rør på 15 ml og sentrifuge ved 350 x g i 10 min ved 4 °C.
- Fjern forsiktig de overnaturlige og resuspend cellepellets med 5 ml DPBS. Sentrifuge ved 350 x g i 10 min ved 4 °C.
- Fjern forsiktig supernatanten og tilsett 50 μL av strømningscytometribufferen. Bland godt ved å pipetter forsiktig og hold cellene på is. På grunn av volumet av cellepellets og liten mengde gjenværende supernatant, vil totalt volum av celler i strømningscytometribufferen være større enn 50 μL (ca. 100 μL).
3. Antistoffmerking og fluorescensaktivert cellesortering (FACS)
- Etter å ha blandet cellene godt med mild pipettering, overfør 54 μL av cellefjæringen til et 1,7 ml mikrocentrifugerør. Tilsett 6 μL av FcR blokkerer reagens og bland godt ved å pipettering forsiktig. Inkuber ved 4 °C i 10 min. Lagre eventuelle restceller etter å ha tatt 54 μL og hold dem i isen for bruk som en uopphetet kontroll i trinn 3.5 og trinn 3.6.
- Under inkubasjonen i trinn 3.1, lag en antistoffcocktail ved å kombinere 11 μL hver av anti-Sca1-APC, anti-Ter119-FITC, anti-CD31-FITC og anti-CD45-FITC antistoffer i et mikrocentrifugerør. Bland godt ved skånsom pipettering og hold på isen beskyttet mot lys.
- Etter inkubasjon med FcR blokkerende reagens i 10 min, tilsett 40 μL av antistoffcocktailen og bland godt ved mild pipettering. Inkuber ved 4 °C i 10 min.
- Tilsett 500 μL av strømningscytometribuffer supplert med 1 μg/ml DAPI i de beisede cellene. Bland godt ved skånsom pipettering og filterceller ved hjelp av et 5 ml testrør med karabinhethette for celler. Hold cellene på is.
- Tilsett 500 μL av strømningscytometribuffer til gjenværende celler i trinn 3.1 og bland godt ved skånsom pipettering. Filtrer celler ved hjelp av et 5 ml testrør med karabinhethettehette for cellesil. Hold disse cellene på is og bruk som en uopphetet kontroll i følgende trinn.
- Ta de fargede cellene og uopphetet kontroll til FACS analyse eller sortering instrument.
- Identifiser og isoler APC+/FITC-/DAPI- populasjonen med gatingstrategier vist i figur 1. Disse cellene representerer levedyktige Sca1+/Ter119-/CD31-/CD45- celler. Rusk og celleaggregater tømmes ved hjelp av fremover (FSC) og sidespøs (SSC) tomter. Deretter er DAPI- befolkningen inngjerdet, etterfulgt av gating av APC+/ FITC- befolkning. Uopphetede kontroller bør brukes til å hjelpe til med å sette gating parametere.
- Samle cellene i 500 μL av strømningscytometribuffer i et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Fremover bør alle prosedyrer utføres under sterile forhold for å minimere en forurensning. Omtrent 50.000 - 100.000 celler samles inn fra en mus.
- Telle celler ved hjelp av et hemocytometer for å evaluere celle levedyktighet. Siden celleaggregater kan forstyrre ytterligere nedstrøms analyser, evalueres også tilstedeværelsen av celleaggregater for å sikre minimal tilstedeværelse (<5 % av levedyktig cellenummer) av disse aggregatene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fire måneder gamle hann FVB-mus ble brukt i dette eksperimentet. Etter utelukkelse av rusk og doble ved hjelp av FSC/ SSC tomter, levedyktige celler (DAPI- befolkning) ble inngjerdet, etterfulgt av valg av APC+/ FITC- populasjon (figur 1). DAPI-, APC- og FITC-portene ble trukket basert på den uopphetede kontrollen. Gating strategier er vist i figur 1.
Etter 1 t sortering ble isolasjonskvaliteten kvantitativt evaluert ved flytcytometrianalyse (figur 2,3). Cellene ble farget med propidiumjodidoppløsning (1:100) for levedyktighetsfarging. Ved hjelp av samme gating for sortering opprettholdt cellene høy levedyktighet og renhet: 92,6 ± 2,2% enkeltceller (tredje panel i figur 2),86,4 ± 3,0% levedyktighet (PI- celler) og 86,0 ± 2,8% APC+/ FITC- celler (n = 4, gjennomsnittlig ± standardavvik). Disse prosentene ble definert som prosenter av hver inngjerdede populasjon (enkeltceller, PI- celler og PI-/APC+/FITC- populasjon i henholdsvis figur 2) i forhold til totalt cellenummer.
Figur 1: Isolering av levedyktigE Sca1+ fett stamceller av FACS. Gating strategier er vist i både fargede celler og i en uopphetet kontroll. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Representativ flytcytometrianalyse for å vurdere celle levedyktighet etter isolasjon. Levedyktighet farging ble utført ved hjelp av propidiumjodid. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Kvantifisering av prosentandel av celler 1 timer etterisolering i flytcytometrianalyse. Prosentandeler av enkeltceller, levedyktige celler og APC+/FITC - cellerble kvantifisert for å evaluere renhet og levedyktighet etter isolering av celler. Dataene som vises representerer gjennomsnittlig ± standardavvik. n=4. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Enkeltcellede RNA-sekvensering (scRNA-seq) får raskt trekkraft som et kraftig verktøy for samtidig å studere ulike cellepopulasjoner på enkeltcellenivå. På grunn av høye kostnader forbundet med prøveforberedelse og høy gjennomstrømningssekvensering, er det viktig å optimalisere cellulære innganger (høy levedyktighet og renhet) for å øke sannsynligheten for eksperimentell suksess. Noen celleforberedelsesprotokoller er avhengige av fjerning av døde celler og rusk ved hjelp av lavspinnvasker og kolonnebasert separasjon uten FACS-sortering14. Mange av disse metodene reduserer imidlertid betydelig antall levedyktige gjenopprettede celler, og i mange tilfeller fjernes ikke døde celler helt14. Denne protokollen skisserer en enkel metode for å isolere svært levedyktige Sca1+ fett stamceller som inneholder minimal cellulært rusk, celle dobler og døde celler. Selv om celler isolert ved hjelp av denne protokollen viste høy levedyktighet, anbefaler vi fortsatt å minimere tiden mellom celleisolasjon og ytterligere nedstrøms analyse for å opprettholde høy levedyktighet. I tillegg er vellykket antistoffmerking avgjørende for å isolere Sca1+ fett stamceller med høy renhet. Derfor anbefales bestemmelse av optimal konsentrasjon av antistoffer sterkt for hvert antistoff, og fortynning av antistoffene i trinn 3.2 kan justeres tilsvarende.
Denne flow cytometry-baserte protokollen er mottagelig for tilpasning avhengig av individuell interesse i bestemte fett stamcelle underpopulasjoner. Her kan alternative antistoffkombinasjoner brukes til å identifisere og isolere befolkningen(e) av interesse. Faktisk, på grunn av omfattende APC markør mangfold, flere laboratorier studerer APCer ved hjelp av scRNA-seq rapportere isolere celler ved hjelp av andre overflatemarkører. For eksempel PDGFRA+/ CD44+ celler, CD31-/ CD45-/ Ter119-/ CD29+/ CD34+/ Sca1+ celler, og Pdgfrb+ celler har blitt isolert av FACS for nedstrøms APC scRNA-seq analyser8,9,11. CD142+ underpopulasjoner har også blitt karakterisert og viser seg å vise begrenset adipogenic differensiering kapasitet og en evne til å undertrykke adipogenese10,11. I tillegg til Sca1 ble kombinasjoner av antistoffer mot CD55, CD81 og CD9 nylig brukt til å isolere ASC og preadipocytt underpopulasjoner (ved hjelp av denne protokollen) og studere subpopulation molekylær og funksjonell heterogenitet7. Videre, siden fett stamceller fra andre fett pads inkludert inguinal fett pads og brune fettvev har blitt isolert ved hjelp av kollagennase dissosiasjon som dagensprotokoll 15,16,17, den nåværende protokollen kan være aktuelt for isolering av fett stamceller fra andre fettvev.
En påminnelse om den nåværende tilnærmingen er at den er skreddersydd mot isolering av umodne APCer. Selv om den nåværende protokollen gir høy levedyktighet APC, er effekten og effektiviteten av isolering av andre fettvevsbeboende celletyper (det vil at immunceller, fibroblaster, endotelceller osv.) er uklart. Viktigere, denne protokollen er ikke egnet for isolering av modne adipocytter. Adipocytter har vært ekstremt vanskelig å isolere ved hjelp av FACS på grunn av deres store cellestørrelse og skjørhet. Nylig ble isolering av modne adipocytter av FACS rapportert ved hjelp av en stor dysestørrelse (150 μm) og lavt skjedetrykk (6 psi) med en bestemt FSC / SSC gating strategi18. Fremtidige studier kan kanskje slå sammen denne adipocyte isolasjonsprotokollen med protokollen som er beskrevet her for å etablere en mer omfattende rørledning for å isolere og studere ulike celletyper i fettvev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi anerkjenner Mayo Clinic Microscopy Cell Analysis Core Flow Cytometry Facility for hjelp med FACS sortering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | VWR | 87003-294 | |
| 13 mL culture tube | Thermo Fisher Scientific | 50-809-216 | |
| 15 mL conical tube | Greiner Bio-one | 188 271 | |
| 5 mL test tube with cell strainer snap cap | Thermo Fisher Scientific | 08-771-23 | |
| 50 mL conical tube | Greiner Bio-one | 227 261 | |
| 70 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| Anti-CD31-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-519 | |
| Anti-CD45-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-491 | |
| Anti-Sca1-APC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-833 | |
| Anti-Ter119-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-112-908 | |
| BSA | Gold Biotechnology | A-420-500 | |
| Collagenase type II | Thermo Fisher Scientific | 17101-015 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | |
| F-12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11765-054 | |
| FcR blocking reagent | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| Hanks' balanced salt solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| Horse serum | Thermo Fisher Scientific | 16050-122 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Propidium iodide solution | Miltenyi Biotec | 130-093-233 |
References
- Krotkiewski, M., Bjorntorp, P., Sjostrom, L., Smith, U. Impact of obesity on metabolism in men and women. Importance of regional adipose tissue distribution. The Journal of Clinical Investigation. 72, 1150-1162 (1983).
- Salans, L. B., Horton, E. S., Sims, E. A. Experimental obesity in man: cellular character of the adipose tissue. The Journal of Clinical Investigation. 50, 1005-1011 (1971).
- Trayhurn, P. Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity. Physiological Reviews. 93, 1-21 (2013).
- Halberg, N., et al. Hypoxia-inducible factor 1alpha induces fibrosis and insulin resistance in white adipose tissue. Molecular and Cellular Biology. 29, 4467-4483 (2009).
- Upadhyay, J., Farr, O., Perakakis, N., Ghaly, W., Mantzoros, C. Obesity as a Disease. Medical Clinics of North America. 102, 13-33 (2018).
- Cawthorn, W. P., Scheller, E. L., MacDougald, O. A. Adipose tissue stem cells meet preadipocyte commitment: going back to the future. Journal of Lipid Research. 53, 227-246 (2012).
- Cho, D. S., Lee, B., Doles, J. D. Refining the adipose progenitor cell landscape in healthy and obese visceral adipose tissue using single-cell gene expression profiling. Life Science Alliance. 2, 201900561 (2019).
- Burl, R. B., et al. Deconstructing Adipogenesis Induced by beta3-Adrenergic Receptor Activation with Single-Cell Expression Profiling. Cell Metabolism. 28, 300-309 (2018).
- Hepler, C., et al. Identification of functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic stromal subpopulations in visceral adipose tissue of adult mice. eLife. 7, 39636 (2018).
- Merrick, D., et al. Identification of a mesenchymal progenitor cell hierarchy in adipose tissue. Science. 364, 2501 (2019).
- Schwalie, P. C., et al. A stromal cell population that inhibits adipogenesis in mammalian fat depots. Nature. 559, 103-108 (2018).
- Raajendiran, A., et al. Identification of Metabolically Distinct Adipocyte Progenitor Cells in Human Adipose Tissues. Cell Reports. 27, 1528-1540 (2019).
- De Matteis, R., et al. In vivo physiological transdifferentiation of adult adipose cells. Stem Cells. 27, 2761-2768 (2009).
- Hanamsagar, R., et al. An optimized workflow for single-cell transcriptomics and repertoire profiling of purified lymphocytes from clinical samples. Scientific Reports. 10, 2219 (2020).
- Marinovic, M. P., et al. Crotamine induces browning of adipose tissue and increases energy expenditure in mice. Scientific Reports. 8, 5057 (2018).
- Takahashi, H., et al. Biological and clinical availability of adipose-derived stem cells for pelvic dead space repair. Stem Cells Translational Medicine. 1, 803-810 (2012).
- Cowan, C. M., et al. Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects. Nature Biotechnology. 22 (5), 560-567 (2004).
- Hagberg, C. E., et al. Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity. Cell Reports. 24, 2746-2756 (2018).
