Summary
Apresentamos um método simples para isolar células progenitoras adiposas altamente viáveis de almofadas de gordura epidímica do rato usando a triagem celular ativada por fluorescência.
Abstract
Obesidade e distúrbios metabólicos, como diabetes, doenças cardíacas e câncer, estão todos associados à dramática remodelação do tecido adiposo. As células progenitoras adiposas residentes em tecido (APCs) desempenham um papel fundamental na homeostase tecidual e podem contribuir para a patologia do tecido. O uso crescente de tecnologias de análise celular única – incluindo sequenciamento de RNA unicelular e proteômica unicelular – está transformando o campo de células-tronco/progenitora, permitindo uma resolução sem precedentes de mudanças individuais de expressão celular no contexto de mudanças populacionais ou teciduais. Neste artigo, fornecemos protocolos detalhados para dissecar tecido adiposo epidímico do camundongo, isolar células derivadas de tecido adiposo único e realizar a triagem celular ativada de fluorescência (FACS) para enriquecer para Sca1+/CD31 viável-/CD45-/Ter119- APCs. Esses protocolos permitirão que os pesquisadores preparem APCs de alta qualidade adequados para análises a jusante, como sequenciamento de RNA de célula única.
Introduction
O tecido adiposo desempenha um papel fundamental no metabolismo energético. O excesso de energia é armazenado na forma de lipídios, e o tecido adiposo é capaz de expansão ou retração significativa, dependendo do estado nutricional e da demanda energética. A expansão do tecido adiposo pode resultar de um aumento no tamanho do adipócito (hipertrofia) e/ou de um aumento no número de adipócitos (hiperplasia); este último processo fortemente regulado pela proliferação e diferenciação das células progenitorasadiposas 1,2. Durante a obesidade, o tecido adiposo se expande excessivamente, e a disfunção tecidual – incluindo hipóxia, inflamação e resistência à insulina – muitas vezes desenvolve3,4. Essas complicações são fatores de risco para muitas doenças crônicas, incluindo hipertensão arterial, diabetes, doenças cardiovasculares, acidente vascular cerebral e câncer5. Assim, limitar a expansão descontrolada do tecido adiposo e mitigar as patologias do tecido adiposo são prioridades de pesquisa biomédica. Durante a expansão do tecido adiposo, as células-tronco derivadas do tecido adiposo residente (ASCs) proliferam e diferenciam-se sequencialmente em pré-adipócitos (células progenitoras comprometidas) e, em seguida, em adipócitos maduros6. Estudos recentes de sequenciamento de RNA unicelular (scRNA-seq) mostram que essas populações de células progenitoras adiposas (APC) (ASCs e preadipócitos) apresentam heterogeneidade molecular e funcional substancial7,8,9,10,11,12. Por exemplo, as ASCs apresentam uma capacidade de diferenciação adipogênica reduzida, ao mesmo tempo em que apresentam maiores capacidades de proliferação e expansão, em comparação com os pré-apócitos7. Outras diferenças moleculares são relatadas nas populações asc e pré-doença, embora a relevância funcional dessas diferenças ainda não esteja clara7. Juntos, esses dados destacam a complexidade do pool de células progenitoras adiposas e ressaltam a necessidade de desenvolver e padronizar ferramentas para melhor entender e manipular essas populações celulares críticas.
Este protocolo detalha o isolamento de populações de células progenitoras de alta viabilidade Sca1+ adiposas de blocos de gordura epidídica de camundongos que são adequados para análises sensíveis a jusante, incluindo estudos unicelulares (scRNA-sequenciamento) e cultura celular. O isolamento e dissociação de almofadas de gordura epidídica foi realizado como descrito anteriormente7,13 com pequenas modificações que melhoram a viabilidade de APCs isolados. Em suma, células dissociadas de almofadas de gordura epidídimo são manchadas com anticorpos contra Sca1, um marcador para ambos os ASCs e preadipócitos6,7, e outros marcadores de linhagem (Lin): Ter119 (células eritróides), CD31 (células endoteliais) e CD45 (leucócitos). As células Viável Sca1+/Ter119-/CD31-/CD45-/DAPI- são então classificadas por fluorescência ativada de classificação celular (FACS). É importante ressaltar que este protocolo foi validado pelo isolamento e análise bem-sucedidos de células progenitoras viáveis Sca1+/Lin- adiposas relatadas em um estudo recente de sequenciamento de RNA de célula única que identificou subpopulações funcionalmente heterogêneas dentro de ASCs e preadipócitos7.
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Protocol
Todos os procedimentos experimentais em animais foram realizados sob aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Clínica Mayo.
1. Preparação da solução
- Prepare a solução de colagenase 2% (w/v) dissolvendo a colagemnase II 2 g na solução de sal balanceada (HBSS) de 100 mL da Hanks. Alíquota de 200 μL cada para cada uso.
- Prepare o meio de neutralização misturando 84 mL F-12 médio, 15 mL de serum de cavalo e penicilina/estreptomicina de 1 mL.
- Prepare o tampão de citometria de fluxo dissolvendo 500 mg de albumina de soro bovino (BSA) e 400 μL de 0,5 M EDTA em 100 mL da linha salina tamponada de fosfato de Dulbecco (DPBS).
2. Dissecção da almofada de gordura epidídica e dissociação tecidual
- Eutanize humanamente (luxação isoflurane/cervical) de um rato macho. Neste protocolo, foi usado um rato FVB de quatro meses de idade.
- Aplique/pulverize 70% de etanol no abdômen e exponha a cavidade abdominal inferior usando tesoura limpa e fórceps.
- Localizar almofada de gordura epidídica (proximal/ligada a testículos). Segure a junção entre testículos e almofada de gordura epidídica com fórceps contundentes e puxe suavemente para liberar a almofada de gordura epidídica.
- Remova os testículos cortando usando uma tesoura e incubar a almofada de gordura epidídica em 5 mL de HBSS suplementada com 3% de BSA em um tubo cônico de 50 mL em temperatura ambiente por 15 minutos.
- Centrifugar a 150 x g por 7 min a 4 °C.
- Pegue a almofada de gordura epidímica flutuante do tubo cônico de 50 mL e pique finamente o tecido usando uma tesoura limpa.
- Adicione 200 μL de solução de colagenase 2% em 3,8 mL de HBSS em um tubo de cultura de 13 mL. Adicione o tecido picado e incubar em uma incubadora rotativa a 5 rpm por 1h a 37 °C. Em vez de uma incubadora rotativa, a incubadora de cultura celular a 37 °C pode ser usada alternativamente com agitações ocasionais.
- Transfira o conteúdo inteiro para um tubo cônico de 50 mL e adicione 10 mL de meio de neutralização. Misture suavemente invertendo o tubo 2-3 vezes.
- Prepare outro tubo cônico de 50 mL equipado com um coador de células de 70 μm. Filtre o tecido digerido no novo tubo usando o coador celular.
- Transfira o fluxo para um tubo cônico de 15 mL e centrífuga a 350 x g por 10 min a 4 °C.
- Remova cuidadosamente as pelotas de células supernascidas e resuspendas com 5 mL de DPBS. Centrifugar a 350 x g por 10 min a 4 °C.
- Remova cuidadosamente o supernascimento e adicione 50 μL de tampão de citometria de fluxo. Misture bem por pipetar suavemente e mantenha as células no gelo. Devido ao volume das pelotas celulares e à pequena quantidade de supernanato residual, o volume total de células no tampão de citometria de fluxo será superior a 50 μL (aproximadamente 100 μL).
3. Rotulagem de anticorpos e fluorescência ativada de classificação celular (FACS)
- Depois de misturar bem as células com tubulação suave, transfira 54 μL da suspensão celular para um tubo de microcentrifuge de 1,7 mL. Adicione 6 μL de reagente de bloqueio fcr e misture bem por pipetar suavemente. Incubar a 4 °C por 10 min. Salve as células restantes depois de tomar 54 μL e mantenha-as no gelo para usar como um controle não manchado na etapa 3.5 e passo 3.6.
- Durante a incubação na etapa 3.1, prepare um coquetel de anticorpos combinando anticorpos de 11 μL cada um de anticorpos anti-Sca1-APC, anti-Ter119-FITC, anti-CD31-FITC e anticorpos anti-CD45-FITC em um tubo de microcentrifuuge. Misture bem com tubos suaves e mantenha no gelo protegido da luz.
- Após a incubação com o reagente de bloqueio fcr por 10 minutos, adicione 40 μL do coquetel de anticorpos e misture bem por pipetação suave. Incubar a 4 °C por 10 min.
- Adicione 500 μL de tampão de citometria de fluxo suplementado com 1 μg/mL de DAPI nas células manchadas. Misture bem por células de tubulação suaves e filtros usando um tubo de ensaio de 5 mL com tampa de encaixe do filtro celular. Mantenha células no gelo.
- Adicione 500 μL de tampão de citometria de fluxo às células remanescentes na etapa 3.1 e misture bem por tubulação suave. Células filtradoras usando um tubo de ensaio de 5 mL com tampa de encaixe do filtro celular. Mantenha essas células no gelo e use como um controle não manchado na etapa seguinte.
- Leve as células manchadas e o controle não manchado para análise ou instrumento de classificação FACS.
- Identifique e isole a população APC+/FITC-/DAPI- com estratégias de gating mostradas na Figura 1. Essas células representam células viável sca1+/Ter119-/CD31-/CD45. Detritos e agregados de células são esgotados usando parcelas para a frente (FSC) e dispersão lateral (SSC). Em seguida, o DAPI- população é fechada, seguido de gating de APC+/FITC- população. Os controles não manchados devem ser usados para auxiliar na definição de parâmetros de gating.
- Colete as células em 500 μL de tampão de citometria de fluxo em um tubo de microcentrifuge de 1,5 mL. Seguindo em frente, todos os procedimentos devem ser realizados em condições estéreis para minimizar uma contaminação. Aproximadamente 50.000 – 100.000 células são coletadas de um rato.
- Conte células usando um hemócito para avaliar a viabilidade celular. Uma vez que os agregados celulares podem interferir com novas análises a jusante, a presença de agregados celulares também é avaliada para garantir uma presença mínima (<5% do número celular viável) desses agregados.
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Representative Results
Camundongos FVB machos de quatro meses de idade foram usados neste experimento. Após a exclusão de detritos e dobras utilizando lotes FSC/SSC, células viáveis (DAPI- população) foram fechadas, seguidas pela seleção de APC+/FITC- população (Figura 1). Os portões DAPI, APC e FITC foram desenhados com base no controle não manchado. As estratégias de gating são mostradas na Figura 1.
Após 1h de triagem, a qualidade do isolamento foi avaliada quantitativamente pela análise de citometria de fluxo (Figuras 2,3). As células foram manchadas com solução de iodeto propidium (1:100) para coloração de viabilidade. Usando o mesmo gating para classificação, as células mantiveram alta viabilidade e pureza: 92,6 ± 2,2% de células únicas (terceiro painel na Figura 2),86,4 ± viabilidade de 3,0% (PI- células) e 86,0 ± 2,8% APC+/FITC- células (n= 4, desvio padrão médio ±). Esses percentuais foram definidos como percentuais de cada população fechada (células únicas, PI- células e PI-/APC+/FITC- população, respectivamente, na Figura 2) em relação ao número total de células.
Figura 1: Isolamento de células únicas sca1+ adiposas progenitoras por FACS. As estratégias de gating são mostradas em ambas as células manchadas e em um controle não manchado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Análise representativa da citometria de fluxo para avaliar a viabilidade celular pós-isolamento. A coloração de viabilidade foi realizada utilizando-se iodeto de propídio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Quantificação da porcentagem das células 1 h pós-isolamento na análise de citometria de fluxo. Percentuais de células únicas, células viáveis e células APC+/FITCforam quantificadas para avaliar a pureza e a viabilidade após o isolamento das células. Os dados apresentados representam o desvio padrão médio ±. n=4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) está rapidamente ganhando tração como uma ferramenta poderosa para estudar simultaneamente diversas populações celulares no nível único celular. Devido aos altos custos associados à preparação da amostra e ao sequenciamento de alto rendimento, é imperativo otimizar as entradas celulares (alta viabilidade e pureza) para aumentar a probabilidade de sucesso experimental. Alguns protocolos de preparação celular dependem da remoção de células mortas e detritos usando lavagens de baixa rotação e separação baseada em colunas sem a classificaçãoFACS 14. Muitos desses métodos, no entanto, reduzem significativamente o número de células recuperadas viáveis e, em muitos casos, as células mortas não são completamente removidas14. Este protocolo descreve um método simples para isolar células progenitoras Sca1+ adiposas altamente viáveis contendo detritos celulares mínimos, dobras celulares e células mortas. Embora as células isoladas usando este protocolo tenham apresentado alta viabilidade, ainda recomendamos minimizar o tempo entre o isolamento celular e a análise mais a jusante para manter alta viabilidade. Além disso, a rotulagem de anticorpos bem sucedidas é fundamental para isolar células progenitoras Sca1+ adiposas com alta pureza. Assim, a determinação da concentração ideal de anticorpos é fortemente recomendada para cada anticorpo, e a diluição dos anticorpos na etapa 3.2 pode ser ajustada em conformidade.
Este protocolo baseado em citometria de fluxo é favorável à personalização, dependendo do interesse individual em subsu populações específicas de células progenitoras adiposas. Aqui, combinações alternativas de anticorpos podem ser usadas para identificar e isolar a população de interesse. De fato, devido à ampla diversidade de marcadores APC, vários laboratórios estudando APCs usando scRNA-seq relatam isolar células usando outros marcadores de superfície. Por exemplo, células PDGFRA+/CD44+ cd31-/CD45-/Ter119-/CD29+/CD34+/Sca1+ células e Pdgfrb+ células foram isoladas pela FACS para análises a jusante APC scRNA-seq8,9,11. CD142+ subpopulações também foram caracterizadas e são mostradas para apresentar capacidade limitada de diferenciação adipogênica e capacidade de suprimir adipogênese10,11. Além do Sca1, combinações de anticorpos contra CD55, CD81 e CD9 foram recentemente usadas para isolar prospectivamente as subpopulações ASC e pré-doença (usando este protocolo) e estudar a subpopulação molecular e a heterogeneidade funcional7. Além disso, uma vez que células progenitoras adiposas de outras almofadas de gordura, incluindo almofadas de gordura inguinal e tecidos adiposos marrons foram isoladas usando dissociação de colagenase como o presente protocolo15,16,17, o presente protocolo pode ser aplicável ao isolamento de células progenitoras adiposas de outros tecidos adiposos.
Uma ressalva da abordagem atual é que ela é adaptada para o isolamento de APCs imaturos. Embora o presente protocolo produza APCs de alta viabilidade, a eficácia e eficiência do isolamento de outros tipos de células residentes de tecido adiposo (ou seja, células imunes, fibroblastos, células endoteliais, etc.) não é clara. É importante ressaltar que este protocolo não é adequado para o isolamento de adipócitos maduros. Os adipócitos têm sido extremamente difíceis de isolar usando FACS devido ao seu grande tamanho celular e fragilidade. Recentemente, o isolamento de adipócitos maduros pela FACS foi relatado utilizando um grande tamanho de bocal (150 μm) e baixa pressão de baia (6 psi) com uma estratégia específica de gating FSC/SSC18. Estudos futuros poderiam talvez fundir este protocolo de isolamento adipócito com o protocolo descrito aqui para estabelecer um pipeline mais abrangente para isolar e estudar diversos tipos de células dentro do tecido adiposo.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Reconhecemos a Instalação de Citometria do Núcleo de Análise celular da Clínica Mayo clinic para assistência com a triagem FACS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | VWR | 87003-294 | |
| 13 mL culture tube | Thermo Fisher Scientific | 50-809-216 | |
| 15 mL conical tube | Greiner Bio-one | 188 271 | |
| 5 mL test tube with cell strainer snap cap | Thermo Fisher Scientific | 08-771-23 | |
| 50 mL conical tube | Greiner Bio-one | 227 261 | |
| 70 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| Anti-CD31-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-519 | |
| Anti-CD45-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-491 | |
| Anti-Sca1-APC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-833 | |
| Anti-Ter119-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-112-908 | |
| BSA | Gold Biotechnology | A-420-500 | |
| Collagenase type II | Thermo Fisher Scientific | 17101-015 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | |
| F-12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11765-054 | |
| FcR blocking reagent | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| Hanks' balanced salt solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| Horse serum | Thermo Fisher Scientific | 16050-122 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Propidium iodide solution | Miltenyi Biotec | 130-093-233 |
References
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