Summary
Мы представляем простой метод, чтобы изолировать весьма жизнеспособные клетки-предшественники жировой клетки из мыши эпидидимальных жировых подушечек с помощью флуоресценции активированной сортировки клеток.
Abstract
Ожирение и нарушения обмена веществ, такие как диабет, болезни сердца и рак, все связаны с драматическим жировой ткани ремоделирования. Ткань-резидент жировой клетки-предшественники (АПК) играют ключевую роль в жировой ткани гомеостаза и может способствовать патологии тканей. Растущее использование технологий анализа одноклеточных клеток, включая одноклеточное РНК-секвенирование и одноклеточную протеомику, преобразует поле стволовых/прагениторных клеток, позволяя беспрецедентное разрешение отдельных изменений экспрессии клеток в контексте демографических или тканевых изменений. В этой статье мы предоставляем подробные протоколы для вскрытия эпидидимальной жировой ткани мыши, изолируем одиночные клетки, полученные из жировой ткани, и выполняем флуоресценцию активированной клеточной сортировки (FACS) для обогащения для жизнеспособногоSca1/CD31-/CD45-/Ter119- БТР. Эти протоколы позволят следователям подготовить высококачественные БТР, пригодные для анализа ниже по течению, такие как секвенирование одноклеточной РНК.
Introduction
Жировая ткань играет ключевую роль в энергетическом метаболизме. Избыток энергии хранится в виде липидов, а жировая ткань способна значительно расшириться или опровержения в зависимости от питательного статуса и энергетического спроса. Расширение жировой ткани может быть результатом увеличения размера адипоцитов (гипертрофия) и/или увеличения числа адипоцитов (гиперплазия); последний процесс жестко регулируется пролиферацию и дифференциацию жировых клеток-предшественников1,2. Во время ожирения жировая ткань чрезмерно расширяется, а дисфункция тканей, включая гипоксию, воспаление и резистентность кинсулину, часто развивается 3,4. Эти осложнения являются факторами риска многих хронических заболеваний, включая гипертонию, диабет, сердечно-сосудистые заболевания, инсульт ирак 5. Таким образом, ограничение неконтролируемого расширения жировой ткани и смягчение патологий жировой ткани являются главными приоритетами биомедицинских исследований. Во время расширения жировой ткани, резидентов жировой ткани полученных стволовых клеток (ASCs) размножаются и дифференцировать последовательно в preadipocytes (совершенные клетки-предшественники), а затем в зрелые адипоциты6. Недавние одноклеточные РНК-секвенирования (scRNA-seq) исследованияпоказывают,что эти жировые клетки-предшественники (APC) популяций (ASCs и preadipocytes) обладают существенной молекулярнойи функциональной неоднородностью 7,8,9,10,11,12. Например, ASCs отображают уменьшенную адипогенную способность дифференциации, в то же время показывая более высокие возможности распространения и расширения, по сравнению с предадипоцитами7. Дальнейшие молекулярные различия сообщаются в популяциях ASC и preadipocyte, хотя функциональная актуальность этих различий остается неясной7. Вместе эти данные подчеркивают сложность жирового пула клеток-предшественников и подчеркивают необходимость разработки и стандартизации инструментов для лучшего понимания и управления этими критическими популяциями клеток.
В этом протоколе подробно рассматривается изоляция высокой жизнеспособности Sca1- жировых популяций клеток-предшественников от эпидидимальных жировых прокладок мыши, которые подходят для чувствительных анализов ниже по течению, включая одноклеточные исследования (секвенирование секвенирования) и клеточной культуры. Изоляция и диссоциация эпидидимальных жировых прокладокбыла выполнена, как описано ранее 7,13 с небольшими изменениями, которые улучшают жизнеспособность изолированных БТР. Короче говоря, диссоциированные клетки от эпидидимальных жировых подушечек окрашены антителами против Sca1, маркером как дляASCs,так и дляпредадипоцитов 6,7и других маркеров линии (Lin): Ter119 (эритроидные клетки), CD31 (эндотелиальные клетки) и CD45 (лейкоциты). ЖизнеспособныйSca1/Ter119-/CD31-/CD45-/DAPI- клетки затем сортируются по флуоресценции активированной сортировки клеток (FACS). Важно отметить, что этот протокол был подтвержден успешной изоляции и анализа жизнеспособныхSca1/Lin - жировыеклетки-предшественники сообщили в недавнем исследовании секвенирования одноклеточной РНК, которые определили функционально неоднородных субпопуляций в ASCs и preadipocytes7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все экспериментальные процедуры для животных были проведены в соответствии с утверждением Комитета по институциональному уходу и использованию животных клиники Майо.
1. Подготовка решения
- Приготовьте коллагеназу 2% (w/v) раствор путем растворения коллагеназы II 2 г в сбалансированном соляном растворе 100 мл Hanks (HBSS). Aliquot 200 йл каждый для каждого использования.
- Подготовка среды нейтрализации путем смешивания 84 мл F-12 среды, 15 мл лошади сыворотки, и 1 мл пенициллина / стрептомицина.
- Подготовка потока цитометрии буфера путем растворения 500 мг бычьего альбумин сыворотки (BSA) и 400 йл 0,5 М ЭДТА в 100 мл фосфатно-буферного солевого раствора Дулбекко (DPBS).
2. Рассечение эпидидимальной жировой прокладки и диссоциации тканей
- Гуманно усыпляйте (изофлюран/вывих шейки матки) одного самца мыши. В этом протоколе использовалась четырехмесячная мышь FVB.
- Нанесите/распылите 70% этанола на живот и подвергните нижнюю брюшную полость с помощью чистых ножниц и типсов.
- Найдите эпидидимальные жировые прокладки (проксимальные/прикрепленные к яичкам). Держите соединение между яичками и эпидидимальной жировой площадкой с тупыми типсами и осторожно потяните, чтобы освободить эпидидимальный жир площадку.
- Удалить яички путем резки с помощью ножниц и инкубировать эпидидимальной жировой прокладки в 5 мл HBSS дополняется 3% BSA в 50 мл конической трубки при комнатной температуре в течение 15 мин.
- Центрифуга при 150 x g в течение 7 мин при 4 градусах Цельсия.
- Возьмите плавающий эпидидимальный жир площадку из 50 мл конической трубки и мелко фарш ткани с помощью чистых ножниц.
- Добавьте 200 МКЛ коллагеназы 2% раствор в 3,8 мл HBSS в 13 мл культуры трубки. Добавить рубленую ткань и инкубировать в вращающемся инкубаторе при 5 об/мин при 1 ч при 37 градусах Цельсия. Вместо вращающегося инкубатора, инкубатор культуры клеток при 37 градусов по Цельсию может быть альтернативно использован с случайными агитациями.
- Перенесите все содержимое в коническую трубку 50 мл и добавьте 10 мл среды нейтрализации. Смешайте осторожно, инвертирование трубки 2-3 раза.
- Подготовь еще 50 мл конической трубки, оснащенной 70 мкм клеточного ситечкой. Фильтр переваренной ткани в новую трубку с помощью клеточного ситечко.
- Перенесите поток через коническую трубку и центрифугу 15 мл при 350 х г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия.
- Аккуратно удалите супернатант и повторно снимите клеточные гранулы с 5 мл DPBS. Центрифуга при 350 x g в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия.
- Аккуратно удалите супернатант и добавьте 50 МКЛ буфера цитометрии потока. Хорошо перемешать, мягко трубя и держать клетки на льду. Из-за объема клеточных гранул и небольшого количества остаточного супернатанта общий объем клеток в буфере цитометрии потока будет больше 50 МКЛ (примерно 100 МКЛ).
3. Маркировка антител и флуоресценция активированная сортировка клеток (FACS)
- После смешивания клеток хорошо с нежным пипетки, передача 54 йл клеточной подвески в 1,7 мл микроцентрифуг трубки. Добавьте 6 йл блокирующего реагента FcR и хорошо перемешайте с помощью пипетки. Инкубировать при 4 градусов по Цельсию в течение 10 мин. Сохранить любые оставшиеся клетки после принятия 54 йл и держать их во льду, чтобы использовать в качестве незапачканного контроля в шаге 3,5 и шаг 3,6.
- Во время инкубации в шаге 3.1, подготовить антитела коктейль путем объединения 11 йл каждый из анти-Sca1-APC, анти-Ter119-FITC, анти-CD31-FITC, и анти-CD45-FITC антител в микроцентрифуг трубки. Хорошо смешайте с помощью нежной трубы и держите на льду защищены от света.
- После инкубации с реагентом FcR блокирующий в течение 10 минут, добавить 40 йл антитела коктейль и хорошо перемешать нежным пипетки. Инкубировать при 4 градусов по Цельсию в течение 10 мин.
- Добавьте в окрашенные клетки 500 МКЛ буфера цитометрии потока, дополненного 1 мкг/мл DAPI. Хорошо смешайте с помощью нежной пипетки и фильтровать клетки с помощью пробирки 5 мл с крышкой оснастки ситечком клеток. Храните клетки на льду.
- Добавьте 500 МКЛ буфера цитометрии потока к оставшимся клеткам в шаге 3.1 и хорошо перемешайте с помощью нежной трубы. Фильтр клетки с помощью 5 мл пробирки с клеткой ситечко оснастки крышкой. Держите эти клетки на льду и использовать в качестве незапачканного контроля на следующем этапе.
- Возьмите окрашенные клетки и незапачканный контроль для анализа FACS или сортировки инструмента.
- Определить и изолировать БТР /FITC- /DAPI -населениес gating стратегии показано на рисунке 1. Эти клетки представляют собойжизнеспособныеSca1 /Ter119-/CD31-/CD45- клетки. Мусор и агрегаты ячеек истощаются с помощью участков вперед (FSC) и бокового рассеяния (SSC). Затем, DAPI- население закрыто, а затем gating БТР/FITC- население. Незапачканные элементы управления должны использоваться для оказания помощи в установлении параметров закрытости.
- Соберите клетки в 500 МКЛ цитометрии буфера потока в 1,5 мл микроцентрифуг трубки. Двигаясь вперед, все процедуры должны выполняться в стерильных условиях, чтобы свести к минимуму загрязнение. Приблизительно 50 000 – 100 000 ячеек собираются с одной мыши.
- Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра для оценки жизнеспособности клеток. Поскольку агрегаты ячеек могут препятствовать дальнейшему анализу ниже по течению, также оценивается наличие агрегатов клеток для обеспечения минимального присутствия (lt;5% от жизнеспособного числа клеток) этих агрегатов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этом эксперименте использовались четырехмесячные самцы FVB-мышей. После исключения мусора и дублетов с использованием участков FSC/SSC, жизнеспособные ячейки (DAPI- население) были закрыты, а затемвыборБТР /FITC- население(рисунок 1). Ворота DAPI, APC и FITC были нарисованы на основе незапачканного контроля. Стратегии Гэтинга показаны на рисунке 1.
После 1 ч сортировки, качество изоляции было количественно оценено с помощью анализа цитометрии потока(цифры 2,3). Клетки были окрашены раствором йодида пропидия (1:100) для окрашивания жизнеспособности. Используя тот же gating для сортировки, клетки поддерживали высокую жизнеспособность и чистоту: 92,6 ± 2,2% одиночных ячеек (третья панель на рисунке 2),86,4 ± 3,0% жизнеспособности (PI- клетки) и 86,0 ± 2,8%APCи /FITC- ячейки (n 4, среднее ± стандартное отклонение). Эти проценты были определены как проценты от каждой закрытой популяции (одиночные ячейки, PI- клетки, и PI-/APC/ FITC- население, соответственно, на рисунке 2) по отношению к общей численности клеток.
Рисунок 1: Изоляция жизнеспособных Sca1и жировой прародитель одиночных клеток FACS. Стратегии Гэтинга показаны как в окрашенных клетках, так и в неокрашиваемом контроле. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Репрезентативный анализ цитометрии потока для оценки жизнеспособности клеток после изоляции. Окрашивание жизнеспособности было выполнено с использованием йодида пропидия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Количественная оценка процента клеток 1 ч после изоляции в анализе цитометрии потока. Проценты одиночных клеток, жизнеспособных клеток иAPC/FITC- клетки были количественно оценены для оценки чистоты и жизнеспособности после изоляции клеток. Показанные данные представляют среднее ± стандартное отклонение. n No4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Одноклеточное секвенирование РНК (scRNA-seq) быстро набирает обороты в качестве мощного инструмента для одновременного изучения различных популяций клеток на уровне одной клетки. Из-за высоких затрат, связанных с подготовкой образца и высокой пропускной способностью секвенирования, крайне важно оптимизировать клеточные входы (высокая жизнеспособность и чистота), чтобы увеличить вероятность экспериментального успеха. Некоторые протоколы подготовки клеток опираются на удаление мертвых клеток и мусора с помощью низкого спина моет и столбец основе разделения без FACSсортировки 14. Многие из этих методов, однако, значительно уменьшить число жизнеспособных восстановленных клеток, и во многих случаях, мертвые клетки не полностью удалены14. В этом протоколе излагается простой метод изоляции высокоэффективных клеток-предшественниковSca1, содержащих минимальный клеточный мусор, дублеты клеток и мертвые клетки. Хотя ячейки, изолированные с помощью этого протокола, продемонстрировали высокую жизнеспособность, мы по-прежнему рекомендуем свести к минимуму время между изоляцией клеток и дальнейшим анализом ниже по течению для поддержания высокой жизнеспособности. Кроме того, успешная маркировка антител имеет решающее значение для изоляции клеток-предшественников Sca1 и adipose с высокой чистотой. Следовательно, определение оптимальной концентрации антител настоятельно рекомендуется для каждого антитела, и разбавление антител в шаге 3.2 может быть скорректировано соответствующим образом.
Этот протокол на основе цитометрии потока может быть настроен в зависимости от индивидуального интереса к конкретным поднаселениям клеток-предшественников. Здесь, альтернативные комбинации антител могут быть использованы для выявления и изоляции населения (ы) интересов. Действительно, из-за обширного разнообразия маркеров APC, несколько лабораторий, изучающих БТР с использованием scRNA-seq доклад изоляции клеток с использованием других маркеров поверхности. Например,PDGFRA/CD44 - клетки, CD31-/CD45-/Ter119-/CD29/CD34/Sca1 - клетки, и Клетки Pdgfrbбыли изолированы FACS для вниз по течению APC scRNA-seq анализирует8,9,11. CD142 - субпопуляции также были охарактеризованы и показаны, чтобы показать ограниченную способность адипогенной дифференциации и способность подавлять адипогенез10, 11. В дополнение к Sca1, комбинации антител против CD55, CD81 и CD9 были недавно использованы для предполагаемой изоляции ASC и доадипоцитов субпопуляции (с помощью этого протокола) и изучения субпопуляции молекулярной и функциональной неоднородности7. Кроме того, так как жировые клетки-предшественники из других жировых подушечек, включая паховые жировые прокладки и коричневые жировые ткани, были изолированы с помощью диссоциацииколлагеназы, как нынешний протокол 15,16,17, настоящий протокол может быть применим к изоляции жировых клеток-предшественников от других жировых тканей.
Одно из предостережений нынешнего подхода заключается в том, что он направлен на изоляцию незрелых БТР. Хотя настоящий протокол дает высокую жизнеспособность БТР, эффективность и эффективность изоляции других жировой ткани резидентных типов клеток (т.е. иммунных клеток, фибробластов, эндотелиальных клеток и т.д.) является неясным. Важно отметить, что этот протокол не подходит для изоляции зрелых адипоцитов. Адипоциты было чрезвычайно трудно изолировать с помощью FACS из-за их большой размер клеток и хрупкость. Недавно было сообщено об изоляции зрелых адипоцитов FACS с использованием большого размера сопла (150 мкм) и низкого давления оболочки (6 пси) с конкретной стратегией FSC/SSC gating18. Будущие исследования, возможно, могли бы объединить этот протокол изоляции адипоцитов с протоколом, описанным здесь, чтобы создать более всеобъемлющий трубопровод для изоляции и изучения различных типов клеток в жировой ткани.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторов нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы признаем, клиники Майо микроскопии клеточного анализа основного потока цитометрии фонда за помощь в сортировке FACS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | VWR | 87003-294 | |
| 13 mL culture tube | Thermo Fisher Scientific | 50-809-216 | |
| 15 mL conical tube | Greiner Bio-one | 188 271 | |
| 5 mL test tube with cell strainer snap cap | Thermo Fisher Scientific | 08-771-23 | |
| 50 mL conical tube | Greiner Bio-one | 227 261 | |
| 70 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| Anti-CD31-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-519 | |
| Anti-CD45-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-491 | |
| Anti-Sca1-APC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-833 | |
| Anti-Ter119-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-112-908 | |
| BSA | Gold Biotechnology | A-420-500 | |
| Collagenase type II | Thermo Fisher Scientific | 17101-015 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | |
| F-12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11765-054 | |
| FcR blocking reagent | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| Hanks' balanced salt solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| Horse serum | Thermo Fisher Scientific | 16050-122 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Propidium iodide solution | Miltenyi Biotec | 130-093-233 |
References
- Krotkiewski, M., Bjorntorp, P., Sjostrom, L., Smith, U. Impact of obesity on metabolism in men and women. Importance of regional adipose tissue distribution. The Journal of Clinical Investigation. 72, 1150-1162 (1983).
- Salans, L. B., Horton, E. S., Sims, E. A. Experimental obesity in man: cellular character of the adipose tissue. The Journal of Clinical Investigation. 50, 1005-1011 (1971).
- Trayhurn, P. Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity. Physiological Reviews. 93, 1-21 (2013).
- Halberg, N., et al. Hypoxia-inducible factor 1alpha induces fibrosis and insulin resistance in white adipose tissue. Molecular and Cellular Biology. 29, 4467-4483 (2009).
- Upadhyay, J., Farr, O., Perakakis, N., Ghaly, W., Mantzoros, C. Obesity as a Disease. Medical Clinics of North America. 102, 13-33 (2018).
- Cawthorn, W. P., Scheller, E. L., MacDougald, O. A. Adipose tissue stem cells meet preadipocyte commitment: going back to the future. Journal of Lipid Research. 53, 227-246 (2012).
- Cho, D. S., Lee, B., Doles, J. D. Refining the adipose progenitor cell landscape in healthy and obese visceral adipose tissue using single-cell gene expression profiling. Life Science Alliance. 2, 201900561 (2019).
- Burl, R. B., et al. Deconstructing Adipogenesis Induced by beta3-Adrenergic Receptor Activation with Single-Cell Expression Profiling. Cell Metabolism. 28, 300-309 (2018).
- Hepler, C., et al. Identification of functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic stromal subpopulations in visceral adipose tissue of adult mice. eLife. 7, 39636 (2018).
- Merrick, D., et al. Identification of a mesenchymal progenitor cell hierarchy in adipose tissue. Science. 364, 2501 (2019).
- Schwalie, P. C., et al. A stromal cell population that inhibits adipogenesis in mammalian fat depots. Nature. 559, 103-108 (2018).
- Raajendiran, A., et al. Identification of Metabolically Distinct Adipocyte Progenitor Cells in Human Adipose Tissues. Cell Reports. 27, 1528-1540 (2019).
- De Matteis, R., et al. In vivo physiological transdifferentiation of adult adipose cells. Stem Cells. 27, 2761-2768 (2009).
- Hanamsagar, R., et al. An optimized workflow for single-cell transcriptomics and repertoire profiling of purified lymphocytes from clinical samples. Scientific Reports. 10, 2219 (2020).
- Marinovic, M. P., et al. Crotamine induces browning of adipose tissue and increases energy expenditure in mice. Scientific Reports. 8, 5057 (2018).
- Takahashi, H., et al. Biological and clinical availability of adipose-derived stem cells for pelvic dead space repair. Stem Cells Translational Medicine. 1, 803-810 (2012).
- Cowan, C. M., et al. Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects. Nature Biotechnology. 22 (5), 560-567 (2004).
- Hagberg, C. E., et al. Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity. Cell Reports. 24, 2746-2756 (2018).
