Summary
تقدم هذه الدراسة منهجيات لدراسة الآليات البكولوجية والجزيئية الكامنة الكامنة في الحمص – تفاعلRhizoctonia bataticola. طريقة ورقة النشاف مفيد لدراسة بسرعة استجابات الحمص النمط الجيني، في حين أن الطريقة المريضة القائمة على وعاء يمكن استخدامها لفرض الجفاف في وقت واحد وعدوى R. bataticola والشاشة للنوعين الجينيين متسامح.
Abstract
يُشكل مرض تعفن الجذر الجاف (DRR) تهديدًا ناشئًا للإجهاد الحيوي لزراعة الحمص في جميع أنحاء العالم. ويتسبب في ذلك من قبل مسببات الأمراض الفطرية التي تحملها التربة، Rhizoctonia bataticola. في الأدبيات ، وشاملة ومفصلة بروتوكولات خطوة بخطوة على مقايسات المرض متناثرة. تقدم هذه المقالة تفاصيل كاملة عن الخطوات التي تتضمنها في إعداد تقنية الورق النشاف لفرز النماذج الجينية بسرعة لمقاومة DRR. تقنية الورق النشاف سهلة وأقل تكلفة. طريقة أخرى، استنادا إلى نهج وعاء المريض، هو تقليد العدوى الطبيعية ويمكن تطبيقها لدراسة المكونات التفاعل - النبات، الممرض، والبيئة- المشاركة في مثلث المرض.
وعلاوة على ذلك، يحدث في الطبيعة معدل الجفاف في معظم الأحيان في مناطق زراعة الحمص البعلي، حيث تنحسر رطوبة التربة مع تقدم نمو المحاصيل. ومن المعروف الإجهاد الجفاف لضمير نباتات الحمص لمرض DRR. يمكن أن يمهد الفهم الباثومورفولوجي والجزيئي للتفاعل بين النبات والأورام تحت ضغط الجفاف الطريق لتحديد أصناف مقاومة للحمض الكاسح من بركة الحمص الجرثومية. توفر هذه المقالة منهجية تدريجية لإعداد وعاء مريض ومقايسة المرض اللاحقة. وعموما، فإن المعلومات المقدمة هنا سوف تساعد الباحثين على إعداد R. bataticola inoculum الفطرية، والحفاظ على هذا الممرض، وإعداد تقنية ورقة النشاف، وإعداد الثقافة المريضة ووعاء المرضى، وتقييم العدوى المسببة للأمراض في نباتات الحمص.
Introduction
تعفن الجذر الجاف (DRR) هو واحد من الأمراض ذات الأهمية الاقتصادية في الحمص1،2. وهو مرض الجذر محددة الناجمة عن Rhizoctonia bataticola (teleomorph، Macrophomina phaseolina). النباتات المصابة تفتقر إلى الجذور الجانبي وتمتلك taproots هشة وأوراق الشجر الصفراء1,3. وقد أفيد عن أن DRR تحت ضغط الجفاف يشكل تهديدا ناشئا لزراعة الحمص1،2،3. وعلاوة على ذلك، أفيد أن حالات الحد من مخاطر الكوارث قد تفاقمت في ظل ضغوط الجفاف في ظل الظروف الميدانية1و2و3. DRR هو أكثر انتشارا في المناطق البعلية مما هو عليه في الحقول المروية4. استخدام أصناف مقاومة هو السبيل للتغلب على المرض والتحايل على استخدام مبيدات الفطريات1،13. لأن الجرثومة الحمص المتاحة في جميع أنحاء العالم الموانئ الاختلاف الجيني ل السمة5، والفرز وتحديد المقاومة / الأنماط الجينية المعرضة أمر بالغ الأهمية للتربية الجزيئية لتحسين المحاصيل.
قوية وسهلة وفعالة من حيث التكلفة اختبار المرض ضرورية للتحقيق في أنماط العدوى R. bataticola في الحمص. إن فحص المرض الأساسي المستخدم لمراقبة استجابة الأنماط الجينية للحمص إلى عدوى R. bataticola هو تقنية الورق النشاف1،4. بل هو تقنية بسيطة ويمكن تنفيذها باستخدام inoculum الفطرية السائلة، الشتلات مع الجذور، ورق النشاف العقيمة. ومع ذلك، لم يتم استخدام هذه التقنية إلى أقصى حد لأنه لا يوجد بروتوكول خطوة بخطوة متوفرة في الأدبيات.
وفي الوقت نفسه، ينطوي أسلوب وعاء المريض إعداد ثقافة المرضى المحتملين وفرض الإجهاد الجفاف. وبالنظر إلى أن الإجهاد الجفاف يؤدي إلى تفاقم الإصابة بمرض DRR3، فمن الضروري دراسة التفاعل النباتي - الممرض تحت ضغط الجفاف6،7. توفر تقنية الوعاء المريضة منصة لمثل هذه الدراسة المتزامنة ، وتعزيز إمكانيات أفضل لفحص الجرثومي وفهم الأساس الميكانيكي للتفاعل. يمكن معالجة التغيرات في علم المناخ مثل زيادة في طول الجذر والحد من عدد الجذر الجانبي — المتأصلة في مرض DRR — باستخدام تقنية وعاء المريض1,3,7.
هنا، يتم تقديم بروتوكول مفصل للورق النشاف وتقنيات وعاء المريضة، والتي يمكن استخدامها لدراسة التفاعل بين الحمص وR. bataticola وشاشة الحمص الجرثومية. وترد تفاصيل المواد المستخدمة في الدراسة في جدول المواد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. عزل R. bataticola وتخزين
- تفاصيل النمط الجيني للحمص وأعراض DRR
- استخدام النباتات الحمص (نوع وراثي، JG 62) التي تظهر عموما أعراض DRR نموذجية، مثل الجافة، وهشاشة الجذر الأساسي مع عدم وجود جذور جانبية وmicrosclerotia تحت لحاء وداخل11،3.
- جمع وغسل
- النباتات اقتلاع تظهر أعراض مثل الجافة القش الملونة ورقة وهشاشة الجذر الأساسي مع microsclerotia تحت طبقة البشرة. في حين اقتلاع، جزء كبير من الجذور سيبقى داخل التربة كما الجذور المصابة هشة. إزالة حطام التربة الخشنة تعلق على الجذر. قطع الجذور بشكل منفصل وجمعها في مغلفات ورقية (27.5 سم × 12 سم) مع التسمية المناسبة ووضعها في صندوق جمع العينات.
- بعد نقل العينات إلى المختبر، ضع الجذور في 200 مل من القارس وتغطية مع شبكة (شبكة نايلون مع حجم المسام من 3 مم قطر)، وغسل الجذور جيدا مع مياه الصنبور الجارية لإزالة جزيئات التربة التمسك.
- استخدام التناضح العكسي (RO) الماء لشطف مرة واحدة في نهاية.
- التعقيم السطحي
- كسر الجذور إلى أربع قطع بطول 2 سم مع كل من شفرة مشرط ووضعها في منقار 200 مل نظيفة.
- تجميع الماء RO autoclaved، 2٪ NaOCl، جرة التخلص، والورق النشاف autoclaved (5 سم2)داخل غرفة تدفق لارينار.
- غسل الجذور مع 50 مل من الماء RO autoclaved ثلاث مرات ثم مع 50 مل من 2٪ NaOCl لمدة 10 دقيقة. غسل الجذور مع 50 مل من الماء RO ثلاث مرات مرة أخرى لإزالة NaOCl.
- لطخة تجف الجذور عن طريق وضع الجذور على ورقة النشاف autoclaved وترك حتى يتم تجفيف الجذور.
- الإعلام والحضانة
- إزالة حواف الجذور مع شفرة مشرط معقمة. تقسيم الجذور باستخدام شفرة واستخدام ملقط تعقيم لوضعها على البطاطا dextrose أجار (المساعد الشخصي الرقمي) وسائل الإعلام بيتري لوحة تحتوي على كبريتات ستريبتوميسين (50 ملغ L-1)و ampicillin (50 ملغ L-1).
- أغلق الطبق، وختمه بالبارا فيلم، وحضن في حاضنة عند درجة حرارة 28 درجة مئوية لمدة يومين في الظلام.
- طريقة طرف الواصلة
- بعد يومين من الحضانة، وجلب لوحات في غرفة تدفق laminar. قطع غيض من نمو الواصلة8 تحت منظار مجسم (Leica EZ4 stereomicroscope التعليمية) ونقلها إلى لوحة المساعد الشخصي الرقمي الطازجة مع كبريتات الستربتومايسين و ampicillin.
- احتضان لوحات في الحاضنة في 28 درجة مئوية لمدة عشرة أيام في الظلام.
- تخزين وصيانة R. bataticola فطرية inoculum
- جعل الائلات المساعد الشخصي الرقمي في أنابيب الاختبار ونقل المكونات agar الفطرية من لوحة ثقافة عشرة أيام باستخدام حلقة التلقيح تعقيم لهب. ختم غطاء أنبوب الاختبار مع parafilm.
- احتضان الهات على 28 درجة مئوية لمدة عشرة أيام في الظلام.
- ختم الغطاء مع parafilm مرة أخرى وتخزينها في 4 درجة مئوية في الثلاجة للاستخدام في المستقبل.
- ثقافة فرعية كل ستة أشهر للحفاظ على الفطريات.
- الحفاظ على الفوعة
- تصيب النباتات مع inoculum الفطرية النقية أعدت كما ذكر في تقنية وعاء المريض3. عزل نفس الفطريات من النباتات المصابة (ستسلمات كوخ)9 واستخدامها لإجراء المزيد من التجارب.
ملاحظة: في هذه الدراسة، تم استخدام سلالة معزولة حقل من الفطريات (GenBank: MH509971.1 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MH509971)
- تصيب النباتات مع inoculum الفطرية النقية أعدت كما ذكر في تقنية وعاء المريض3. عزل نفس الفطريات من النباتات المصابة (ستسلمات كوخ)9 واستخدامها لإجراء المزيد من التجارب.
2. تقنية الورق النشاف
ملاحظة: تقنية الورق النشاف ينطوي على إعداد inoculum الفطرية السائلة، وإعداد الشتلات، وتقييم المرض.
- إعداد السائل R. bataticola inoculum
ملاحظة: السائل R. باتاتيتشولا الفطرية inoculum يحتوي على كل من الميكريلا وmicrosclerotia. وتعمل هذه الهياكل على حد سواء باعتبارها inoculum الأولية.- إعداد 500 مل من وسائل الإعلام PDB في قارورة 1000 مل وautoave في 121 رطلا لمدة 15 دقيقة.
- بعد تبريد وسائل الإعلام ، تلقيح المرق مع القابس من agar الفطرية loopful من ثقافة مائلة فطرية واحتضان في 28 درجة مئوية لمدة خمسة أيام في شاكر في 180 دورة في الدقيقة في الظلام.
- تجميع الزجاج أو قمع البلاستيك autoclaved (10 سم)، قارورة مخروطية لتر واحد، وطبقتين من شبكة (10 سم2 حجم) (شبكة نايلون مع حجم المسام من 3 مم قطر) على الطاولة. تصفية mycelia الفطرية وmicrosclerotia باستخدام شبكة. لطخة تجفيف الفطريات في ورقة النشاف autoclaved.
- تزن 100 غرام mycelia ل50٪ inoculum والحفاظ على درجة حرارة الغرفة.
- إعداد نبات الحمص
- حدد 50 بذور صحية (في هذه الدراسة، تم استخدام النمط الجيني DRR-عرضة JG 62)، ووضعها في 100 مل من الكوابر، وتغطية مع شبكة.
- غسل البذور مع مياه الصنبور أولا لإزالة حطام التربة.
- خذ القارص مع البذور في غرفة تدفق الفلامي وغسلها مع تعقيم 50 مل من الماء RO ثلاث مرات لمدة 1 دقيقة لكل غسل.
- تعقيم البذور مع 50 مل من 2٪ NaOCl مائي لمدة 2 دقيقة مع اهتزاز مستمر وغسل البذور مع 50 مل من المياه المعقمة خمس مرات لمدة 1 دقيقة لكل من.
- ملء كيس البوليثين (47.5 سم × 25 سم) مع Soilrite (خليط من الصف البستانية الموسع البيرلايت، الطحالب الخث الأيرلندية، والفيرميكوليت المقشر في نسبة متساوية أي، 1/3:1/3:1/3)، بذر البذور 50 معقم سطح 50 سم عمق، والحفاظ في غرفة النمو مع 28 درجة مئوية ± درجة حرارة 2 درجة مئوية، 16 ساعة photoperiod مع كثافة الضوء من 150 ميكرومولمتر −2 -1،والرطوبة النسبية من 70٪. المياه لهم مع المياه RO واقتلاع النباتات بعد ثمانية أيام من بذر.
- غسل الجذور في مياه الصنبور لإزالة جزيئات Soilrite. شطف الجذور مع المياه عقمة RO، والاحتفاظ بها في الماء RO في 1000 مل من القارص.
- إعداد الورق النشاف في الصواني
- خذ ورقة النشاف وقطعها إلى قطع (30 سم × 23 سم) بأعداد كافية لتلبية النسخ المتماثلة.
- احزم الأوراق في كيس البوليثين القابل للتكلاف التلقائي وأتلافها بـ 121 رطلاً لمدة 15 دقيقة واحفظها في فرن الهواء الساخن للتجفيف.
- أضعاف كل ورقة النشاف في النصف.
- ضع الورق على صينية بلاستيكية نظيفة ، مسحت الروح ، كما هو موضح في الشكل 2i-iv.
- تلقيح النبات عن طريق غمس
- قم بحل 100 غرام من inoculum الفطرية في 200 مل ماء RO autoclaved في 200 مل من الكأس للحصول على 50٪ inoculum.
- تراجع جذور النبات في inoculum المعدة لمدة 1 دقيقة مع حركة متقطعة صعودا وهبوطا لضمان التعلق موحدة من inoculum الفطرية.
- وضع النباتات في ورقة النشاف
- الرطب في الجانب السفلي من ورقة النشاف وضعت على صينية مع الماء RO العقيمة. ضع النباتات على الورق بطريقة لا تغطيها الورقة إلا الجذور، وتُترك البراعم خارجها.
- أغلقها عن طريق طي الجانب العلوي من الورق النشاف والرطب ورقة كاملة لتوفير ما يكفي من المياه للحفاظ على نمو النبات.
- اسقي الصينية مرة واحدة في اليوم وإبقاء الصواني عند 28 درجة مئوية. مراقبة الأعراض مثل نخر، تعفن الجذر، ورقة اصفرار يوميا.
3. المريضة وعاء تقنية
ملاحظة: تقنية وعاء المريضة ينطوي على إعداد inoculum خبيثة ووعاء المرضى، والحفاظ على مستوى الرطوبة، وتقييم أعراض المرض.
- إعداد الركيزة
- خذ كيلوغرام واحد من أي بذور الحمص المتاحة تجاريا. إزالة البذور المصابة (البذور مع النمو الفطري، وبقع العدوى، والأضرار الحشرية). وضعها في 5 لتر من البلاستيك واغسل بالماء الصنبور بدقة 3-4 مرات لإزالة الحطام الرئيسية.
- غسل البذور مع 2 لتر من الماء RO ثلاث مرات ونقع بذور 1 كجم في 5 لتر من الكوابر مع ثلاثة أضعاف المزيد من المياه لمدة خمسة ساعات.
- مرة واحدة البذور imbibed الماء، وإعادة غسلها بالماء RO ثلاث مرات لإزالة البذور exudates.
- إزالة الماء تماما وحزم البذور في زجاجات مربى (300 مل، 12 سم ارتفاع، 6 سم قطرها 155 غرام الوزن) إلى حوالي 1/4th القدرة (100 غرام لكل زجاجة مربى) وإغلاق الزجاجات مع قبعات. حزمة 10 زجاجات مربى في كيس بلاستيكي قابل للوتوماتيك (48 سم × 30 سم) الأوتلاك مرتين في 121 رطلا لمدة 15 دقيقة بشكل مستمر.
- جفف البذور على حرارة 40 درجة مئوية في فرن بين عشية وضحاها لإزالة قطرات الماء داخل الزجاجة.
- إعداد ثقافة المرضى
- قم بتشغيل غرفة تدفق الفارني BSL-2 مستوى. امسح الأرض بدقة مع 70٪ من الإيثانول، واقلب الأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة. ثم، والحفاظ على البذور داخل غرفة تدفق لارينار.
- خذ ثقافة R. bataticola المعزولة حديثًا لمدة 10 أيام (الجزء 1). ثم، واتخاذ ثلاثة المقابس أجار الفطرية (4 ملم قطر) باستخدام طرف ماصة معقمة أو الفلين بور، ووضعها في زجاجات مربى aseptically. تغطية الزجاجات مع قبعات وختم مع parafilm.
- يهز الزجاجات لخلط القرص الفطري مع بذور الحمص بشكل موحد.
- احتضان الزجاجات في 30 درجة مئوية لمدة 15 يوما في الظلام.
- خذ زجاجات المربى مع نمو الفطريات السوداء(الشكل 4iii)ونقل الثقافة المريضة (البذور مع microsclerotia) من زجاجات المربى إلى لوحة بيتري الزجاج باستخدام ملقط العقيمة. جففها في درجة حرارة الغرفة لمدة يومين في طبق من الزجاج.
- مسحوق كتلة الفطرية باستخدام هاون وحشرات، وتخزين مسحوق في 4 درجة مئوية.
- Autoclave Soilrite مرتين في 121 رطلا لمدة 15 دقيقة.
- جفف مزيج Soilrite المُتَرَكَف تحت اِشِدِة شمسية.
- اخلطي مسحوق الفطريات مع Soilrite بنسبة 50٪ ث/ث، واملأ الأواني بالخليط، واحفظيها في درجة حرارة الغرفة لمدة يوم.
- زرع بذور الحمص القابلة للجفاف القابلة للسطح في وعاء (10 سم جولة الأواني)(جدول المواد)والحفاظ على مستوى الرطوبة من 80٪ قدرة الحقل (FC).
- مراقبة الأعراض مثل نخر وتعفن الجذر عن طريق اقتلاع النباتات بعد الإنبات.
- تقييم كفاءة وعاء المرضى
ملاحظة: تظهر النباتات أعراض صفراء صفراء عندما تكون الجذور فاسدة تمامًا.- وضع درجة المرض على أساس الآفة (البقع النخرية) (الشكل التكميلي 2C)أرقام وشدة تعفن الجذر. يمكن استخدام الأواني المرضية التي تظهر 90٪ من وفيات النباتات.
- فحص النمط الجيني
- إعداد الثقافة المريضة بكميات كبيرة وخلطها إما مع Soilrite معقمة أو التربة الحقل (5٪ ث / ث) في الأواني 30 سم طويل القامة. المياه الأواني لتبلل السطح وتركها دون عائق لمدة سبعة أيام.
- زرع واحدة من البذور السطحية المعقمة لكل وعاء جولة 10 سم وثلاث بذور لكل 30 سم جولة الأواني والمياه لهم بشكل كاف.
- مراقبة صفراء ورقة وجذور أعراض التعفن.
- الجفاف المشترك وعدوى R. bataticola
- فرض ضغوط الجفاف باتباع البروتوكولات المذكورة في سنها وآخرون (2019).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تهدف هذه الدراسة إلى إظهار تقنيات مثل الورق النشاف وتقنيات الوعاء المريض لتسهيل الفهم ال pathomorphological والجزيئية للتفاعل بين النبات ومسببات الأمراض تحت ضغط الجفاف. لتحقيق ذلك، تم جمع النباتات التي تظهر أعراض DRR1،3،4 من حقل الحمص ، وتم عزل الفطريات باستخدام طريقة طرف الواصلة8. R. ثقافة فطرية bataticola يظهر رمادي داكن على لوحة المساعد الشخصي الرقمي ومائل على أربعة أيام بعد الحضانة (الشكل 1A & C) وأغمق في اللون الرمادي في وسط PDB على خمسة أيام بعد الحضانة(الشكل 1B). R. bataticola وقد septate mycelia (الشكل 1D)، وتنتج microsclerotia (الشكل 1E) ، والتي تعمل كما inoculum الابتدائي في التربة10.
وقد اتبعت الخطوات الواردة في الشكل 2 لتنفيذ تقنية الورق النشاف. وقد أصيبت النباتات التي يبلغ عمرها ثمانية أيام باللقح السائل (50 في المائة)، وبعد ثمانية أيام من الإصابة، لوحظت النباتات بسبب الأعراض. وأظهرت النباتات تعفن الجذر بسبب نخر واسعة النطاق، وكذلك اصفرار ورقة، وهو الجذر النموذجي والأعراض الورقية لمرض DRR(الشكل 3B والشكل التكميلي 1A).
تم تنفيذ تقنية وعاء المريضة باستخدام الخطوات المبينة في الشكل 4. وكانت تركيزات التهوكولوم الفطري في Soilrite والتربة الحقلية 10٪ و 5٪ على التوالي. DRR-البذور المعرضة لإظهار أعراض DRR نموذجية مثل تعفن الجذر، وعدم وجود جذور الجانبي، اصفرار ورقة، والموت المبكر، بالمقارنة مع النباتات التحكم (الشكل 5A و B). النباتات التي تعرضت للعدوى في وعاء المريضة المصنوعة من Soilrite توفي وأظهرت تعفن الجذر بعد سبعة أيام من بذر (الشكل 5C والشكل التكميلي 2C). وفي الوقت نفسه، أظهرت النباتات التي تنمو في وعاء المريضة المصنوعة من التربة الحقلية أعراضاً رقية نموذجية، أي أوراق الشجر الملونة بالقش بعد 48 يوماً من البذر(الشكل 5E).
كما تمت دراسة تأثير الجفاف على مرض DRR في الوعاء المريض في ظروف المختبر. وقد فرضت الإجهاد الجفاف عن طريق حجب المياه3. وأظهرت النباتات تحت ضغط الجفاف (30٪ FC) حدوث مرض متفاقم بالمقارنة مع النباتات المعالجة فقط للأمراض (90٪ FC)(الشكل 6A و B). ولم تظهر على النباتات المعالجة بالجفاف والنباتات المعالجة بالجفاف أي أعراض(الشكل 6ألف وباء). وكان جذور تحت الإجهاد مجتمعة أكثر البقع نخرية وتعفن بالمقارنة مع العوامل المسببة للأمراض فقط النباتات(الشكل 6B).
الشكل 1: السمات المورفولوجية المميزة لـ Rhizoctonia bataticola. تم عزل العامل السببي لتعفن الجذر الجاف (Rhizoctonia bataticola، ITCC 8635) عن الحقل (المعهد الوطني لبحوث الجينوم النباتي ، نيودلهي ، 28.6139 درجة شمالا ، 77.2090 درجة شرق). من الثقافات، تم عزل الفطريات باستخدام طريقة طرف واصلة8. تظهر الصور ثقافة R. bataticola التي يبلغ عمرها 4 أيام في dextrose agar البطاطس في لوحة بيتري (A) ، والثقافة السائلة 5 أيام القديمة (B) ، وثقافة مائلة عمرها 10 أيام (C). Fungal mycelia (D) و microsclerotia (الأسهم السوداء) (E) كان مثار على شريحة المجهر والملطخة مع WGA -FITC والأزرق aniline ، على التوالي. الصور(E، F،شريط مقياس، 20، و 50 ميكرومتر) تم التقاطها تحت عدسة الهدف 20x و 40x من المجهر epifluorescent. الأسهم البيضاء تظهر الجدران المتقاطعة في الـ(مسيليا) الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الخطوات التي ينطوي عليها تطعيم R. bataticola وRR في تقنية الورق النشاف. يقوم السطح بتعقيم البذور عن طريق تمريرها عبر مياه الصنبور الجارية وغسلها بنسبة 2٪ من هيبوكلوريت الصوديوم، تليها الغسيل بالماء المعقم RO 3-4 مرات (الخطوة 1). ثم، زرع 30 البذور في الأواني 15 سم عالية تحتوي على Soilrite (الخطوة 2) والسماح للبذور لتنمو لمدة ثمانية أيام في غرفة النمو مع 28 درجة مئوية ± 2 درجة مئوية درجة الحرارة، 16 ساعة photoperiod مع كثافة الضوء من 150 ميكرومول-2 S−1،والرطوبة النسبية من 70٪ (الخطوة 3). اقتلاع النباتات وغسلها بالماء المعقم (الخطوة 4). إعداد التلقيح الفطري عن طريق تلقيح 500 مل PDB وسائل الإعلام مع الفطريات (الخطوة 5). للعدوى، استخدم ثقافة مرق الفطريات التي يبلغ عمرها 5 أيام. ثم، تلقيح النباتات عن طريق غمس الجذور في inoculum الفطرية في منبر لمدة 30 ث وإزالة inoculum الزائدة عن طريق لمس الجدار الجانبي الداخلي من beaker (الخطوة 6). بعد العدوى، ضع نباتات مطعّمه بالفطريات وملهمة في أوراق النشاف المختلفة في صواني نظيفة منفصلة (الخطوة 7). ترطيب ورقة النشاف مع الماء العقيم الكافي يوميا ومراقبة الأعراض، viz.، ذرف قبالة الجذور الجانبي، اصفرار وذبول من أوراق النبات، والبذور الفاسدة، وتعفن جذور في ثمانية أيام بعد العدوى (الخطوة 8) (A). الصور تمثل الخطوات الأساسية (الخطوات 3-7) (B). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: أعراض مرض DRR في الحمص القائم على تقنية الورق النشاف. بعد البروتوكول المبين في الشكل 2، تعرضت النباتات المعرضة لل DRR (النمط الجيني، JG 62) للعدوى باستخدام تقنية الورق النشاف، وتم التقاط الأعراض بعد ثمانية أيام من العدوى. تظهر الصور النباتات التحكم التمثيلية (وهمية تلقيح) مع يطلق النار صحية (السهم الأحمر) والجذور مع جذور أكثر جانبية (السهم الأصفر) (A). تظهر الصور النباتات المصابة الممثل مع أعراض نموذجية، مثل الذبول، اصفرار، وتجفيف الأوراق (السهام الزرقاء) والجذور المجففة / نخرة مع جذور جانبية أقل (السهام البيضاء) (B). شريط مقياس هو 1 سم. وتكررت التجارب خمس مرات على الأقل. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: نظرة عامة على إعداد وعاء المريضة لR. باتاتيتشولا التطعيم وRR المرضى المقايسات. إعداد التلقيح الفطري عن طريق تلقيح لوحة المساعد الشخصي الرقمي مع قرص فطري 5 مم من الثقافة الفطرية المتنامية بنشاط واحتضان في 28 درجة مئوية لمدة عشرة أيام. ثم، لإعداد الركيزة، وغسل بذور الحمص مع ماء الصنبور، نقع البذور في الماء بين عشية وضحاها، والأتلاف في 121 رطلا لمدة 15 دقيقة. ثم، تلقيح 100 غرام من الركيزة مع ثلاثة مقابس أجار من ثقافة عمرها 10 أيام وخلط جيدا. ثم، احتضان الركيزة تلقيح في 30 درجة مئوية لمدة 15 يوما في حاضنة. سحق الثقافة المريضة (الركيزة نمت الفطرية)، الجافة ومسحوق، وتخزينها في 4 °C. ثم، مزيج 50 غرام من ثقافة المرضى مع 100 غرام من Soilrite الجافة جيدا (وعاء المريض) (A). ثم، زرع بذور الحمص عرضة سطح تعقيم ومراقبة الأعراض، viz.، الحنفية تعفن الجذر، نخر الجذر الجانبي، والأصفر ورقة. استيعاب النباتات التي تظهر عليها أعراض في نفس القدر. لمزيد من التجارب، استخدم الأواني التي تظهر 90٪ العدوى كنمط جيني عرضة. تمثل الصور التلقين (ط)، الركيزة (2)، والسيطرة على الثقافة المريضة (3)(ب). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: أعراض مرض DRR في الحمص القائم على تقنية وعاء المريض. لصنع وعاء مريض، تم استخدام البروتوكول الوارد في الشكل 4. ثم، تم زرع بذور الحمص القابلة للتعقيم السطحي (JG 62) في التحكم (A) ووعاء المريض (B). كل نبات في وعاء يمثل تكرار واحد، ولوحظ نمو النبات الميت أو توقف في وعاء المريض. تشير النباتات على الجانب الأيمن من اللوحة (C) إلى وجود و غياب الجذور الجانبية (السهم الأصفر) في التحكم والمعالجة على التوالي. الرسم البياني يظهر عدد من النباتات الميتة في علاج وعاء المريضة بالمقارنة مع التحكم (D). تم إعداد الوعاء المريض على التربة الميدانية المعقمة التي تم جمعها من حقل NIPGR ، وكانت الثقافة المريضة مختلطة. وزرعت البذور المعقمة السطح، وتم التقاط أعراض المرض بعد 48 يوما من البذر. تظهر الصورة محطات التحكم (E) ، والأعراض الزخرية النمطية لـ DRR ، وهي تجفيف النباتات ، يشار إليها (السهام البيضاء). تم تحديد الأهمية الإحصائية باستخدام اختبار -tللطالب. يمثل الشريط SEM من 9 نسخ متماثلة بيولوجية، وتشير العلامة النجمية قيمة ذات دلالة إحصائية في P < 0.0001. السهم الأصفر يشير إلى جذر / فاسد ، مجففة دون أي جذور صوتية. وتكررت التجارب عشر مرات على الأقل، وكانت نتائجها مماثلة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: طريقة وعاء المريضة مفيدة لدراسة تأثير الإجهاد الجفاف على التفاعل بين النبات وا إدراء الأمراض. وأجريت تجربة وعاء لدراسة تأثير الجفاف على عدوى ر. باتاتيتشولا. وشملت التجربة السيطرة، والجفاف فقط، المسببات للأمراض فقط(R. bataticola، مسببات الأمراض)، والجفاف مجتمعة وR. bataticola الإجهاد (الإجهاد مجتمعة). نمت النباتات في غرفة النمو مع 28 درجة مئوية ± درجة حرارة 2 درجة مئوية، 16 ساعة ضوئية مع شدة الضوء من 150 ميكرومول-2 s−1،و 70٪ الرطوبة النسبية. تم إعداد الوعاء المريض بعد البروتوكول الوارد في الشكل 4. ثم، تم زرع بذور الحمص القابلة للرقابة على السطح القابلة للرقابة والحمص (JG 62) في الوعاء المتحكم والأواني المريضة. تم ري العلاجات الخاضعة للرقابة والعوامل المسببة للأمراض طوال التجربة. وفرضت ضغوط الجفاف على النباتات في ظل الجفاف ومعالجة الإجهاد المشترك. وتم حجب المياه بعد 18 يوما من البذر، ووصل مستوى الجفاف المطلوب بعد 24 يوما من البذر. ولوحظت النباتات لأعراض 29 يوما بعد زرع. تظهر الصورة التغيرات في الورق والجذر تحت العلاجات (A). تظهر الصور جذور نباتية غير ملوثة لوحظت تحت عدسة الهدف 0.5X من منظار مجسم مجسي بحثي SMZ25/SMZ18 (B). يشير السهم الأحمر إلى الجذور الجانبيّة غير المصابة، وتشير الأسهم السوداء إلى الجذور الجانبيّة المُصابة. وتكررت التجارب عشر مرات على الأقل، وكانت نتائجها مماثلة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي S1: حجم Inoculum وانخفاض في عدد الجذر الجانبي في الحمص. وبعد البروتوكول المبين في الشكل 2، تعرضت النباتات المعرضة للتعرض لل DRR (النمط الجيني، JG 62) للعدوى مع حجم متنوع من inoculum باستخدام تقنية الورق النشاف، وتم التقاط الأعراض بعد ثمانية أيام من العدوى. تم تلقيح النباتات مع حجم التلقيح المتنوعة (0.1٪، 1٪، 10٪ و 20٪ ث / الخامس في الماء) وتظهر الصور النباتات المصابة ممثل مع أعراض نموذجية مثل الذبول، اصفرار، وتجفيف الأوراق والجذور المجففة / نخر مع جذور أقل جانبية (B). يُظهر الرسم البياني عدد الجذور الجانبيّة في النباتات التي تُصاب بالعدوى مع تباين الـ inoculum (B). شريط المقياس هو 1 سم. ن = 10. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.
الشكل التكميلي S2: أعراض رقية من DRR في الحمص في soilrite. وفي أعقاب البروتوكول الوارد في الشكل 4، بُت البذور المعقمة السطحية، وتم التقاط أعراض المرض في 14 يوماً بعد البذر. تظهر الصورة التمثيلية محطات التحكم (A) ، وتظهر الصورة أعراض DRR التقليدية ، وهي تجفيف النباتات (السهام البيضاء) (B). تم تطوير درجة المرض على أساس البقع النخرية على الجذور. تم تطوير التسجيل عبر الأيام (C). الصور (A & B) هي من نفس التجربة. شريط المقياس = 3 سم. ن = 10. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
توفر تقنية الورق النشاف نهجًا مباشرًا لفحص الأنماط الجينية للحمص في ظل ظروف المختبر. التلقيح الانخفاض تمكن من التحقيق في التفاعل على أساس زمني مع سهولة السيطرة على الحمل inoculum(الشكل التكميلي 1)ويسهل فحص في المختبر. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام الشتلات حتى الشباب. يمكن أن تعطي ثقافة فطرية عمرها خمسة أيام(الشكل 1B)ما يكفي من التلقيح لتصيب النباتات. يحتوي inoculum السائل على كل من الميكوليا وmicrosclerotia (الشكل 1D & E). يمكن استخدام أعراض تعفن الجذر(الشكل 3B) لتسجيل المرض وتحديد الأنماط الجينية المقاومة. وتأثر بشكل كبير حدوث DRR من الإجهاد الجفاف1,3,5. ومع ذلك ، مع هذه التقنية وحدها ، فإن فرض الإجهاد الجفاف مستحيل ، ولن يعكس الفحص باستخدام هذه التقنية الاستجابات الطبيعية.
تسمح تقنية الوعاء المريضة بدراسة التفاعلات بين النباتات ومسببات الأمراض والإجهاد الناجم عن الجفاف. وهو يوفر طريقة لفحص الأنماط الجينية تحت الجفاف الإجهاد المشترك والإجهاد الممرض لتحديد الأنماط الجينية المقاومة. في وعاء مريض ، يمكن فرض الإجهاد الجفاف في أي عمر من المصنع وفحص النباتات. تظهر النباتات أعراض DRR نموذجية(الشكل 5C & F والشكل التكميلي 2B & C)في طريقة وعاء المريض. وأظهرت النباتات التي تعرضت للجفاف المشترك والعدوى المسببة للأمراض تعفن جذر حاد بالمقارنة مع العلاج الممرض فقط. وهذا يعني أن الجرثومة الحمصية المتاحة تحتاج إلى فحص لتحديد نوع وراثي مقاوم ليس فقط لمسببات الأمراض ولكن أيضا مجتمعة مسببات الأمراض والإجهاد الجفاف. وقد حاولت العديد من الدراسات في وقت سابق لفحص الأنماط الجينية ولكن باستخدام تقنية الورق النشاف11,12. وإلى جانب ذلك، تم أيضا إجراء فحص ميداني ولكن دون فرض الإجهاد الجفاف11. ومن الأهمية بمكان فرض الإجهاد على الجفاف خلال مختلف مراحل الحمص وتقييم استجابة النمط الجيني.
مشكلة اطلاق النار
بالنسبة لتقنية الورق النشاف ، يجب أن يكون حجم inoculum في القارس على المستوى الذي يتم فيه غمس جذر النبات بأكمله. بالإضافة إلى ذلك، سوف يؤدي سقي الزائدة إلى العفن الرطب من جذور النبات. لا تستخدم مياه الصنبور لسقي النباتات لأنها يمكن أن تسبب التلوث.
بالنسبة لتقنية وعاء المريضة ، فإن أصناف الحمص Desi هي الأفضل. يمكن أن يختلف عدد البذور حسب احتياجات الباحثين. حجم المياه المستخدمة لنقع البذور ينبغي أن يكون ثلاثة أضعاف لأن المياه البذور imbibe. وسوف يحدث نمو البكتيريا إذا لم يتم غسل بشكل صحيح. يمكن استخدام المياه غير المُقلَدَة لـمَنَمَر البذور. يجب أن يكون لون البذور بعد الوتكلاف الأسود بدلاً من البني ، مما يشير إلى لصناعة أوتوكاتافين غير لائق. أكثر من التجفيف في فرن الهواء الساخن يؤدي إلى تجفيف البذور. لا يمكن استخدام هذه البذور لللقح الفطري. قد تلقيح الزجاجات خارج تدفق laminar يسبب التلوث. النمو الفطري الأبيض في وجبة الحمص الملقحة هو علامة على autoclaving غير لائق. وينبغي اتباع احتياطات السلامة البيولوجية في التخلص من التلقين المستعمل، والورق النشاف، والنباتات المصابة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدينا ما نكشفه
Acknowledgments
ويدعم المعهد الوطني لبحوث الجينوم النباتي المشاريع في مختبر M.S.K. 6- تعترف المنظمة السادسة بـ DBT-JRF (DBT/2015/NIPGR/430). نشكر الطلاب المتدربين، الآنسة ريشيكا، والسيد جاياشندرانيان، والآنسة دورغاديفي على المساعدة التقنية أثناء تصوير الفيديو، والسيد سانديب ديكسيت، والآنسة أنجالي، والدكتور أفانيش راي على تقييم البيانات الأولية وملفات المخطوطات تقييماً نقدياً. ونشكر السيد رحيم هـ طرافدار والسيد سوندر سولانكي على مساعدتهما في المختبر. ونحن نعترف DBT-eLibrary كونسورتيوم (DeLCON) ومكتبة NIPGR لتوفير الوصول إلى الموارد الإلكترونية ومرفق نمو النبات NIPGR لدعم نمو النبات / الفضاء.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fungus- Rhizoctonia bataticola | Pathogen inoculum | Indian Type Culture Collection No. 8365 | GenBank: MH509971.1, ITCC 8635 (https://www.iari.res.in/index.php?option=com_content&view=article& id=1251&Itemid=1370) |
| Soilrite mix | Soil medium in the lab | Keltech Energies Limited, Bangalore, India | http://www.keltechenergies.com/ |
| Filter paper | Blotting paper to support the plant growth | Himedia | http://himedialabs.com/catalogue/chemical2017/index.html#374 |
| Pot | Growing plants | 10 and 30 cm size pots | Routinely used nursery pots, for example, https://dir.indiamart.com/impcat/nursery-pots.html |
| Potato dextrose agar/broth | Culture and maintain the fungus | Cat# 213400, DifcoTM, MD, USA | https://www.fishersci.com/shop/products/bd-difco-dehydrated-culture-media-potato-dextrose-agar-3/p-4901946 |
| Incubator | Culture the fungus | LOM-150-2, S/N AI13082601-38, MRC, incubator, and shaker | http://www.mrclab.com/productDetails.aspx?pid=91131 |
| Growth chamber | Growing plants in controlled condition | Model No. A1000, Conviron, Canada | https://www.conviron.com/products/gen1000-reach-in-plant-growth-chamber |
| Laminar airflow | Carrying out aseptic exercises | Telstar, Bio II advance, Class II cabinet, EN-12469-2000 | https://www.telstar.com/lab-hospitals-equipment/biological-safety-cabinets/bio-ii-advance-plus/, http://www.atlantisindia.co.in/laminar-air-flow.html |
| Mesh | Filtering the fungal mycelia | Nylon mosquito net | Mesh with 0.6-1 mm diameter pore size |
| Autoclave | Autoclaving media and chickpea seeds | Autoclave | http://www.scientificsystems.in/autoclave |
| Microscopes | Visualizing the infection ang fungal mycelia | SMZ25 / SMZ18, Research Stereomicroscopes, Leica EZ4 educational stereomicroscope | https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18 https://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/p/leica-ez4/ https://www.microscopyu.com/museum/eclipse-80i |
| Weighing balance | Weighing fungus and chemicals | Sartorius Electronic Weighing Balance, BSA 4202S-CW | https://www.sartorius.com/en/products/weighing/laboratory-balances |
| WGA-FITC | Fungus staining | Sigma | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l4895?lang=en®ion=IN |
| Aniline blue | Fungus staining | Himedia | http://www.himedialabs.com/intl/en/products/Chemicals/Dyes-Indicators-and-Stains/Aniline-blue-Water-soluble-Practical-grade-GRM901 |
References
- Sharma, M., Ghosh, R., Pande, S. Dry root rot (Rhizoctonia bataticola (Taub.) Butler): an emerging disease of chickpea - where do we stand. Archives of Phytopathology and Plant Protection. 48 (13-16), 797-812 (2015).
- Srinivas, P. Studies on dry root rot of chickpea (Cicer arietinum L.). , Available from: http://krishikosh.egranth.ac.in/handle/1/93135 (2016).
- Sinha, R., Irulappan, V., Mohan-Raju, B., Suganthi, A., Senthil-Kumar, M. Impact of drought stress on simultaneously occurring pathogen infection in field-grown chickpea. Scientific Reports. 9 (1), (2019).
- Nene, Y., Haware, M., Reddy, M. Chickpea diseases: resistance screening techniques, information bulletins No. 10. Patancheru. Information Bulletin No. 10. Patancheru, A.P., India: International CroDS Research Institute for the Semi-Arid Tropics. , 1-10 (1981).
- Pande, S., Krishna Kishore, G., Upadhyaya, H. D., Narayana Rao, J. Identification of sources of multiple disease resistance in mini-core collection of chickpea. Plant Disease. , (2006).
- Pandey, P., Irulappan, V., Bagavathiannan, M. V., Senthil-Kumar, M. Impact of combined abiotic and biotic stresses on plant growth and avenues for crop improvement by exploiting physio-morphological traits. Frontiers in Plant Science. 8, (2017).
- Irulappan, V., Senthil-Kumar, M. Morpho-physiological traits and molecular intricacies associated with tolerance to combined drought and pathogen stress in plants. Biotechnologies of Crop Improvement, Volume 3: Genomic Approaches. , (2018).
- Jensen, A. B., et al. Standard methods for fungal brood disease research. Journal of Apicultural Research. 52 (1), 1-39 (2013).
- Agrios, G. Plant Pathology: Fifth Edition. , 9780080473 (2004).
- Coley-Smith, J. R., Cooke, R. C. Survival and germination of fungal sclerotia. Annual Review of Phytopathology. , (1971).
- Nagamma, G., Saifulla, M., Sab, J., Pavitra, S. Screening of chickpea genotypes against dry root rot caused by Macrophomina phaseolina (tassi) goid. 10 (4), 1795-1800 (2015).
- Infantino, A., et al. Screening techniques and sources of resistance to root diseases in cool season food legumes. Euphytica. 147 (1-2), 201-221 (2006).
- Khaliq, A., et al. Integrated control of dry root rot of chickpea caused by Rhizoctonia bataticola under the natural field condition. Biotechnology Reports. 25, 00423 (2020).
