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Biology

सूखी जड़ सड़ांध रोग छोला में परख: एक विस्तृत पद्धति

Published: January 17, 2021 doi: 10.3791/61702
Automatic Translation
1, 1
1National Institute of Plant Genome Research

Summary

यह अध्ययन छोले-राइजोक्टोनियाबाटाटिकोला इंटरैक्शन में अंतर्निहित पथोमोर्फिक और आणविक तंत्र का अध्ययन करने के तरीकों को प्रस्तुत करता है। ब्लॉटिंग पेपर विधि तेजी से छोला जीनोटाइप प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए उपयोगी है, जबकि बीमार पॉट-आधारित विधि का उपयोग एक साथ सूखा और आर बटटिकोला संक्रमण और सहिष्णु जीनोटाइप के लिए स्क्रीन लगाने के लिए किया जा सकता है।

Abstract

सूखी जड़ सड़ांध (डीआरआर) रोग दुनिया भर में छोला की खेती के लिए एक उभरते बायोटिक तनाव का खतरा है। यह मिट्टी जनित फंगल रोगजनक, राइजोक्टोनिया बटाटिकोला केकारण होता है। साहित्य में, रोग परख पर व्यापक और विस्तृत कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल विरल हैं। यह लेख DRR के प्रतिरोध के लिए जल्दी से स्क्रीनिंग जीनोटाइप के लिए एक ब्लॉटिंग पेपर तकनीक स्थापित करने में शामिल कदमों पर पूरा विवरण प्रदान करता है। ब्लॉटिंग पेपर तकनीक आसान और कम खर्चीली है। बीमार बर्तन दृष्टिकोण के आधार पर एक और विधि, प्राकृतिक संक्रमण की नकल है और रोग त्रिकोण में शामिल-पौधे, रोगजनक और पर्यावरण-बातचीत घटकों का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है।

इसके अलावा, प्रकृति में, DRR ज्यादातर वर्षाफेड चना खेती क्षेत्रों में होता है, जहां मिट्टी की नमी फसल विकास अग्रिम के रूप में घटती है । सूखे का तनाव डीआरआर रोग के लिए छोला पौधों को संवेदनशील करने के लिए जाना जाता है। सूखे के तनाव के तहत पौधे-रोगजनक बातचीत की रोगरूपात्मक और आणविक समझ छोला जर्मप्लाज्म पूल से अभिजात वर्ग डीआरआर प्रतिरोधी किस्मों की पहचान का मार्ग प्रशस्त कर सकती है। यह लेख एक बीमार बर्तन और बाद में बीमारी परख की तैयारी के लिए एक स्टेपवाइज कार्यप्रणाली प्रदान करता है। कुल मिलाकर, यहां प्रस्तुत जानकारी शोधकर्ताओं को आर बटाटिकोला फंगल इनोकुलम तैयार करने, इस रोगजनक को बनाए रखने, ब्लॉटिंग पेपर तकनीक स्थापित करने, बीमार संस्कृति और बीमार बर्तन तैयार करने और छोला पौधों में रोगजनक संक्रमण का आकलन करने में मदद करेगी ।

Introduction

सूखी जड़ सड़ांध (डीआरआर) चना1,2में आर्थिक रूप से महत्वपूर्ण बीमारियों में से एक है। यह एक जड़-विशिष्ट रोग है जो राइजोक्टोनिया बाटेटिकोला (टेलीओमॉर्फ, मैक्रोफोमिना फेफोलिना)के कारण होता है। संक्रमित पौधों में पार्श्व जड़ों की कमी होती है और उनके पास भंगुर नलूट और पीले पत्ते होते हैं1,3. सूखे के तनाव में डीआरआर को चना की खेती के लिए एक उभरता हुआ खतरा बताया गया है1,2,3. इसके अलावा , क्षेत्र की स्थितियों 1 , 2,3के तहत सूखे के तनाव मेंडीआरआरघटनाओं के बढ़ जाने की सूचना है । डीआरआर सिंचित क्षेत्रों की तुलना में वर्षाफेड क्षेत्रों में अधिक प्रचलित है4. प्रतिरोधी किस्मों का उपयोग रोग को दूर करने और कवकनाशक उपयोग को दरकिनार करने का तरीका है1,13. क्योंकि दुनिया भर में उपलब्ध चना जर्मप्लाज्म विशेषता5के लिए आनुवंशिक भिन्नता बंदरगाहों, स्क्रीनिंग और प्रतिरोधी की पहचान/

छोले में आर बटाटिकोला संक्रमण पैटर्न की जांच करने के लिए मजबूत, आसान और लागत प्रभावी बीमारी परख आवश्यक है। आर बटाटिकोला संक्रमण के लिए छोला जीनोटाइप की प्रतिक्रिया का पालन करने के लिए उपयोग की जाने वाली प्राथमिक बीमारी परख1,4ब्लॉटिंग पेपर तकनीक है। यह एक सरल तकनीक है और तरल फंगल इनोकुलम, जड़ों के साथ रोपण, और बाँझ ब्लॉटिंग पेपर का उपयोग करके निष्पादित किया जा सकता है। हालांकि, इस तकनीक का अधिकतम उपयोग नहीं किया गया है क्योंकि साहित्य में कोई कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल उपलब्ध नहीं है।

इस बीच, बीमार पॉट तकनीक एक संभावित बीमार संस्कृति की तैयारी और सूखे तनाव के अधिरोपण शामिल है । यह देखतेहुएकि सूखे के तनाव से डीआरआर रोग की घटना बढ़ जाती है , सूखा तनाव6, 7के तहत पौधे-रोगजनक बातचीत का अध्ययन करना आवश्यक है । बीमार पॉट तकनीक इस तरह के एक साथ अध्ययन के लिए मंच प्रदान करता है, जर्मप्लाज्म स्क्रीनिंग के लिए बेहतर संभावनाओं को बढ़ावा देने और बातचीत के यंत्रवादी आधार को समझने । पथिक परिवर्तन जैसे रूट की लंबाई में वृद्धि और पार्श्व जड़ संख्या में कमी- डीआरआर रोग के लिए अंतर्निहित -बीमार बर्तन तकनीक1,3,7का उपयोग करके संबोधित किया जा सकता है।

इसके साथ ही, कागज और बीमार बर्तन तकनीकों को ब्लोटिंग करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल, जिसका उपयोग छोला और आर बटाटिकोला और स्क्रीन छोला जर्मप्लाज्म के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है, प्रस्तुत किया गया है। अध्ययन में उपयोग की जाने वाली सामग्रियों का विवरण सामग्री तालिकामें दिया गया है ।

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Protocol

1. आर बटाटिकोला और भंडारण का अलगाव

  1. छोला जीनोटाइप और डीआरआर लक्षणों का विवरण
    1. चना पौधों (जीनोटाइप, जेजी 62) का उपयोग करें जो आम तौर पर विशिष्ट डीआरआर लक्षण दिखाते हैं, जैसे कि सूखी, भंगुर प्राथमिक जड़ जिसमें छाल के नीचे और पिथ1,3के अंदर कोई पार्श्व जड़ और माइक्रोस्क्लेरोटिया नहीं है।
  2. संग्रह और धुलाई
    1. एपिडर्मिस परत के नीचे माइक्रोस्क्लेरोटिया के साथ सूखे भूसे के रंग के पत्ते और भंगुर प्राथमिक जड़ जैसे लक्षण दिखाने वाले पौधों को उखाड़ फेंकें। जबकि उखाड़, जड़ों का एक बड़ा हिस्सा मिट्टी के अंदर रहेगा क्योंकि संक्रमित जड़ें भंगुर हैं। जड़ से जुड़े मोटे मिट्टी के मलबे को हटा दें। जड़ों को अलग से काटें और उन्हें उचित लेबल के साथ कागज के लिफाफे (27.5 सेमी x 12 सेमी) में इकट्ठा करें और उन्हें एक नमूना संग्रह बॉक्स में रखें।
    2. प्रयोगशाला में नमूनों के परिवहन के बाद, जड़ों को 200 मिलीएल बीकर में रखें और जाल (नायलॉन जाल 3 मिमी व्यास के पोर आकार के साथ) के साथ कवर करें, और मिट्टी के कणों का पालन करने के लिए नल के पानी को चलाने के साथ जड़ों को अच्छी तरह से धोएं।
    3. अंत में एक बार कुल्ला करने के लिए रिवर्स ऑस्मोसिस (आरओ) पानी का उपयोग करें।
  3. सतह नसबंदी
    1. जड़ों को एक स्केलपेल ब्लेड के साथ 2 सेमी लंबाई के साथ चार टुकड़ों में तोड़ें और उन्हें एक साफ 200 एमएल बीकर में डाल दें।
    2. लैमिनार फ्लो चैंबर के अंदर ऑटोक्लेवेड आरओ वाटर, 2% नाओसीएल, डिस्कार्डिंग जार, और ऑटोक्लेव्ड ब्लॉटिंग पेपर(5 सेमी 2)को इकट्ठा करें।
    3. जड़ों को 50 एमएल ऑटोक्लेवेड आरओ वाटर से तीन बार और फिर 10 मिनट के लिए 2% नाओसीएल के 50 एमएल के साथ धोएं। नाओसीएल को हटाने के लिए तीन बार फिर से आरओ वाटर के 50 एमएल से जड़ों को धोएं।
    4. दाग जड़ों को ऑटोक्लेवेड ब्लॉटिंग पेपर पर रखकर सूख जाता है और जड़ों के सूखने तक छोड़ देता है।
  4. मीडिया और इनक्यूबेशन
    1. एक निष्फल स्केलपेल ब्लेड के साथ जड़ों के किनारों को हटा दें। ब्लेड का उपयोग करके जड़ों को विभाजित करें और उन्हें आलू डेक्सट्रोस एगर (पीडीए) मीडिया पेट्री प्लेट पर रखने के लिए निष्फल संदंश का उपयोग करें जिसमें स्ट्रेप्टोमाइसिन सल्फेट (50 मिलीग्राम एल-1)और एम्पिसिलिन (50 मिलीग्राम एल-1)शामिल हैं।
    2. प्लेट को बंद करें, पैराफिल्म के साथ सील करें, और अंधेरे में दो दिनों के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें।
  5. हाइफल टिप विधि
    1. दो दिन इनक्यूबेशन के बाद प्लेटों को लैमिनार फ्लो चैंबर में लाएं। एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप (लीका EZ4 शैक्षिक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप) के तहत हाइफाल विकास8 की नोक काटें और इसे स्ट्रेप्टोमाइसिन सल्फेट और एम्पिसिलिन के साथ एक ताजा पीडीए प्लेट में स्थानांतरित करें।
    2. अंधेरे में दस दिन तक इनक्यूबेटर में प्लेटों को 28 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  6. आर बटाटिकोला फंगल इनोकुलम का भंडारण और रखरखाव
    1. टेस्ट ट्यूब में पीडीए slants बनाने के लिए और लौ निष्फल टीका पाश का उपयोग कर एक दस दिन पुरानी संस्कृति प्लेट से एक कवक आगर प्लग हस्तांतरण । पैराफिल्म के साथ टेस्ट ट्यूब कैप को सील करें।
    2. अंधेरे में दस दिनों के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर स्लेंट इनक्यूबेट।
    3. पैराफिल्म के साथ कैप को फिर से सील करें और भविष्य के इस्तेमाल के लिए फ्रिज में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    4. कवक को बनाए रखने के लिए हर छह महीने में उपसंस्कृति।
  7. उग्रता का रखरखाव
    1. पौधों को शुद्ध फंगल इनोकुलम से संक्रमित करें जो बीमार बर्तनतकनीकमें उल्लिखित है । संक्रमित पौधों (कोच के अभ्युदय)9 से एक ही कवक को अलग करें और आगे के प्रयोगों के लिए उपयोग करें।
      नोट: इस अध्ययन में, कवक के एक क्षेत्र अलग तनाव का इस्तेमाल किया गया था (GenBank: MH509971.1 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MH509971)

2. ब्लॉटिंग पेपर तकनीक

नोट: ब्लॉटिंग पेपर तकनीक में तरल फंगल इनोकुलम, अंकुर तैयार करने और रोग मूल्यांकन की तैयारी पर जोर दिया गया है।

  1. लिक्विड आर बटाटिकोला इनोकुलम की तैयारी
    नोट: लिक्विड आर बटाटिकोला फंगल इनोकुलम में माइसेलिया और माइक्रोस्क्लेरोटिया दोनों होते हैं। ये दोनों संरचनाएं प्राथमिक इनोकुलम के रूप में कार्य करती हैं।
    1. 1,000 एमएल फ्लास्क में पीडीबी मीडिया के 500 एमएल तैयार करें और इसे 15 मिनट के लिए 121 एलबीएस पर ऑटोक्लेव करें।
    2. मीडिया ठंडा होने के बाद, एक फंगल तिरछा संस्कृति से फंगल एगर प्लग के एक पाशन के साथ शोरबा टीका और अंधेरे में १८० आरपीएम पर एक शेखर में पांच दिनों के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट ।
    3. मेज पर एक ऑटोक्लेव ग्लास या प्लास्टिक कीप (10 सेमी), एक लीटर शंकु फ्लास्क, और जाल (10 सेमी2 आकार) (3 मिमी व्यास के ताकना आकार के साथ नायलॉन जाल) की दो परतें इकट्ठा करें। जाल का उपयोग करके फंगल माइसेलिया और माइक्रोस्क्लेरोटिया को फ़िल्टर करें। दाग ऑटोक्लेव्ड ब्लॉटिंग पेपर में कवक को सुखा लें।
    4. 50% इनोकुलम के लिए 100 ग्राम माइसेलिया का वजन करें और कमरे के तापमान पर रखें।
  2. चने के पौधे की तैयारी
    1. 50 स्वस्थ बीजों का चयन करें (इस अध्ययन में, डीआरआर-अतिसंवेदनशील जीनोटाइप जेजी 62 का उपयोग किया गया था), उन्हें 100 मिलीएल बीकर में रखें, और एक जाल के साथ कवर करें।
    2. मिट्टी के मलबे को हटाने के लिए पहले नल के पानी से बीज धोएं।
    3. बीज के साथ बीकर को लेमिनार फ्लो चैंबर में लें और उन्हें 1 मिनट प्रति वॉश के लिए तीन बार बंधी 50 एमएल आरओ वाटर से धोएं।
    4. लगातार मिलाते हुए 2 मिनट के लिए 2% जलीय नाओसीएल के 50 एमएल के साथ बीजों को स्टरलाइज करें और बीजों को 1 मिनट प्रत्येक के लिए पांच बार स्टरलाइज्ड पानी के 50 एमएल से धोएं।
    5. मिट्टी के साथ एक पॉलीथिन बैग (47.5 सेमी x 25 सेमी) भरें (बागवानी ग्रेड का मिश्रण विस्तारित पेरिलाइट, आयरिश पीट मॉस, और समान अनुपात में एक्सफोलिएटेड वर्मीकुलाइट यानी, 1/3:1/3:1/3), सतह-निष्फल 50 बीज दो सेमी गहरी बोना, और 2 डिग्री सेल्सियस ± 2 डिग्री सेल्सियस तापमान के साथ एक विकास कक्ष/कमरे में रखें, 16 घंटे फोटोपीरियोड 150 माइक्रोमोल एम−2 एस− 1,और 70% की सापेक्ष आर्द्रता के साथ। इन्हें आरओ के पानी से पानी पिलाएं और बुवाई के आठ दिन बाद पौधों को उखाड़ दें।
    6. मिट्टी के कणों को हटाने के लिए नल के पानी में जड़ों को धोएं। जड़ों को निष्फल आरओ के पानी से कुल्ला करें, और उन्हें 1000 एमएल बीकर में आरओ के पानी में रखें।
  3. ट्रे में कागज ब्लॉटिंग की तैयारी
    1. एक ब्लॉटिंग पेपर लें और उन्हें पर्याप्त संख्या में टुकड़ों (30 सेमी × 23 सेमी) में काट लें ताकि प्रतिकृतिओं को पूरा किया जा सके।
    2. चादरों को ऑटोक्लेवेबल पॉलीथिन बैग में पैक करें और उन्हें 15 मिनट के लिए 121 पौंड पर ऑटोक्लेव करें और इसे सुखाने के लिए गर्म हवा के ओवन में रखें।
    3. प्रत्येक ब्लॉटिंग पेपर शीट को आधे में मोड़ें।
    4. पेपर को एक साफ, आत्मा-मिटा प्लास्टिक ट्रे पर रखें, जैसा कि चित्र 2आई-ivमें दिखाया गया है।
  4. सूई लगाकर पौधे टीका
    1. 50% इनोकुलम प्राप्त करने के लिए 200 एमएल ऑटोक्लेवेड आरओ पानी में 100 ग्राम फंगल इनोकुलम को भंग करें।
    2. कवक इनोकुलम की एक समान लगाव सुनिश्चित करने के लिए रुक-रुक कर ऊपर और नीचे आंदोलन के साथ 1 मिनट के लिए तैयार इनोकुलम में पौधे की जड़ों को डुबोएं।
  5. पौधों को ब्लॉटिंग पेपर में रखना
    1. बाँझ आरओ पानी के साथ ट्रे पर रखा दाग कागज के नीचे की ओर गीला। पौधों को कागज पर इस तरह रखें जहां केवल जड़ों को कागज से ढका गया हो, और शूटिंग छोड़ी जाती है।
    2. इसे ब्लॉटिंग पेपर के शीर्ष पक्ष को मोड़कर बंद करें और पौधों के विकास को बनाए रखने के लिए पर्याप्त पानी प्रदान करने के लिए पूरे कागज को गीला करें।
    3. दिन में एक बार ट्रे को पानी पिलाएं और ट्रे को 28 डिग्री सेल्सियस पर रखें। रोजाना परिगलन, जड़ सड़ांध और पत्ती पीले होने जैसे लक्षणों का निरीक्षण करें।

3. बीमार बर्तन तकनीक

नोट: बीमार पॉट तकनीक उग्र inoculum और एक बीमार बर्तन की तैयारी, नमी के स्तर के रखरखाव, और रोग के लक्षणों का आकलन जरूरत पर जोर देता है ।

  1. सब्सट्रेट की तैयारी
    1. किसी भी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध छोला बीज का एक किलो लें। संक्रमित बीज (फंगल विकास, संक्रमण धब्बे और कीट क्षति वाले बीज) को हटा दें। प्रमुख मलबे को हटाने के लिए उन्हें 5 एल प्लास्टिक बीकर में रखें और नल के पानी से अच्छी तरह से 3-4 बार धोएं।
    2. बीजों को 2 एल आरओ पानी से तीन बार धोएं और 1 किलो बीज को 5 एल बीकर में पांच घंटे के लिए तीन गुना अधिक पानी के साथ भिगो दें ।
    3. एक बार जब बीज पानी को आत्मसात कर लें, तो बीज को निकालने के लिए उन्हें तीन बार आरओ के पानी से फिर से धोएं ।
    4. पानी को पूरी तरह से निकालें और जाम की बोतलों (300 मिली, 12 सेमी ऊंचाई, 6 सेमी व्यास, और 155 ग्राम वजन) में बीज पैक करने के लिए लगभग 1/4 क्षमता (100 ग्राम प्रति जाम बोतल) और टोपियां के साथ बोतलों को बंद करें। एक ऑटोक्लेवेबल प्लास्टिक बैग (48 सेमी x 30 सेमी) ऑटोक्लेव में दस जाम की बोतलों को लगातार 15 मिनट के लिए 121 एलबीएस पर दो बार पैक करें।
    5. बोतल के अंदर पानी की बूंदों को हटाने के लिए रात भर ओवन में 40 डिग्री सेल्सियस पर बीज सुखाएं।
  2. बीमार संस्कृति की तैयारी
    1. बीएसएल-2 लेवल लैमिनार फ्लो चैंबर चालू करें। 70% इथेनॉल के साथ फर्श को अच्छी तरह से पोंछें, और 15 मिनट के लिए यूवी चालू करें। इसके बाद बीज को लैमिनार फ्लो चैंबर के अंदर रखें।
    2. 10 दिन पुराने हौसले से अलग आर बटाटिकोला कल्चर (पार्ट 1) लें। फिर, बाँझ पिपेट टिप या कॉर्क बोरर का उपयोग करके तीन फंगल एगर प्लग (4 मिमी व्यास) लें, और उन्हें जाम की बोतलों में डाल दें। पैराफिल्म के साथ कैप और सील के साथ बोतलों को कवर करें।
    3. छोला के बीजों के साथ फंगल डिस्क को समान रूप से मिलाने के लिए बोतलों को हिलाएं।
    4. अंधेरे में 15 दिनों के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर बोतलों को इनक्यूबेट करें।
    5. काले कवक विकास(चित्रा 4iii)के साथ जाम की बोतलें लें और बीमार संस्कृति (माइक्रोस्क्लेरोटिया के साथ बीज) को बाँझ संदंश का उपयोग करके एक ग्लास पेट्री प्लेट में जाम की बोतलों से स्थानांतरित करें। उन्हें एक ग्लास पेट्री प्लेट में दो दिनों के लिए कमरे के तापमान पर सुखाएं।
    6. एक मोर्टार और मूसल का उपयोग करके कवक द्रव्यमान को पाउडर करें, और पाउडर को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    7. ऑटोक्लेव मिट्टी दो बार 15 मिनट के लिए १२१ एलबीएस पर ।
    8. एक सनशेड के तहत ऑटोक्लेव्ड सॉकरराइट मिश्रण को सुखाएं।
    9. फंगल पाउडर को 50% w/w पर मिट्टी के साथ मिलाएं, बर्तनों को मिश्रण से भरें, और उन्हें एक दिन के लिए कमरे के तापमान पर रखें।
    10. प्रति बर्तन (10 सेमी गोल बर्तन)(सामग्री की तालिका)एक सतह-निष्फल डीआरआर-अतिसंवेदनशील छोला बीज बोना और 80% क्षेत्र क्षमता (एफसी) का नमी स्तर बनाए रखता है।
    11. अंकुरण के बाद पौधों को उखाड़कर परिगलन और जड़ सड़न जैसे लक्षणों का निरीक्षण करें।
  3. बीमार बर्तन दक्षता का आकलन
    नोट: पौधे पीले पत्ते के लक्षण दिखाते हैं जब जड़ें पूरी तरह से सड़ जाती हैं।
    1. घाव (परिगलित धब्बे)(अनुपूरक चित्रा 2C)संख्या और जड़ सड़ांध की गंभीरता के आधार पर एक रोग स्कोर विकसित करना। बीमार बर्तन 90% पौधे की मौत दिखा आगे इस्तेमाल किया जा सकता है।
  4. जीनोटाइप स्क्रीनिंग
    1. बीमार संस्कृति को बड़ी मात्रा में तैयार करें और इसे 30 सेमी लंबे बर्तनों में निष्फल मिट्टी या क्षेत्र की मिट्टी (5% w/w) के साथ मिलाएं। सतह को गीला करने के लिए बर्तनों को पानी दें और उन्हें सात दिनों तक अशान्त छोड़ दें।
    2. प्रति 10 सेमी गोल पॉट और 30 सेमी गोल बर्तन में एक सतह-निष्फल बीज बोएं और उन्हें पर्याप्त रूप से पानी दें।
    3. पीले पत्ते और जड़ सड़न के लक्षणों का निरीक्षण करें।
  5. संयुक्त सूखा और आर बटाटिकोला संक्रमण
    1. सिन्हा एट अल (2019) में उल्लिखित प्रोटोकॉल का पालन करके सूखे का तनाव लागू करें।

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Representative Results

इस अध्ययन का उद्देश्य सूखे के तनाव के तहत पौधे-रोगजनक बातचीत की रोगरूप और आणविक समझ को सुविधाजनक बनाने के लिए कागज और बीमार पॉट तकनीकों को दागना जैसी तकनीकों को प्रदर्शित करना है । इसे पूरा करने के लिए,डीआरआर लक्षणों काप्रदर्शन करने वाले पौधे1,3,4 को छोला क्षेत्र से एकत्र किया गया था, और कवक को हाइफाल टिप विधि का उपयोग करके अलग किया गया था8। आर बटाटिकोला फंगल संस्कृति पीडीए प्लेट पर गहरे भूरे रंग की दिखाई देती है और इनक्यूबेशन के चार दिन बादतिरछा (चित्रा 1ए और सी)और इनक्यूबेशन(चित्रा 1B)के पांच दिनों बाद पीडीबी माध्यम में ग्रे रंग में गहरा । आर बटाटिकोला में माइकेलिया(चित्र 1डी)है और यह माइक्रोस्क्लेरोटिया(चित्र 1 ई)पैदा करता है, जो मिट्टी10में प्राथमिक इनोकुलम के रूप में कार्य करता है ।

चित्रा 2 में दिए गए कदमों का पालन दाग कागज तकनीक को निष्पादित करने के लिए किया गया था। आठ दिन पुराने पौधे तरल इनोकुलम (५०%) से संक्रमित थे, और संक्रमण के आठ दिन बाद, पौधों को लक्षणों के लिए देखा गया । पौधों ने व्यापक परिगलन के साथ-साथ पत्ती को पीला होने के कारण जड़ सड़ांध दिखाई, जो डीआरआर रोग(चित्रा 3B और अनुपूरक चित्रा 1 ए)के विशिष्ट जड़ और पत्ते के लक्षण हैं।

बीमार बर्तन तकनीक को चित्र 4में दिखाए गए चरणों का उपयोग करके किया गया था । मृदा और खेत की मिट्टी में फंगल इनोकुलम की सांद्रता क्रमशः 10% और 5% थी। डीआरआर-अतिसंवेदनशील बीज नियंत्रण पौधों (चित्र 5ए और बी)की तुलना में जड़ सड़न, पार्श्व जड़ों की कमी, पत्ती पीले और अकाल मृत्यु जैसे विशिष्ट डीआरआर लक्षणदिखाते हैं। मिट्टी के साथ बने बीमार बर्तन में संक्रमण के अधीन पौधों की मृत्यु हो गई और बुवाई के सात दिन बाद जड़सड़ांध (चित्रा 5C और अनुपूरक चित्रा 2C) दिखाया। इस बीच, खेत की मिट्टी के साथ बने बीमार बर्तन में उगने वाले पौधों में बुवाई के 48 दिन बाद भूसे के रंग के पत्ते(चित्रा 5E)के विशिष्ट पत्ते के लक्षण दिखाई दिए।

प्रयोगशाला स्थितियों के तहत बीमार बर्तन में डीआरआर रोग पर सूखे के प्रभाव का भी अध्ययन किया गया। पानी रोककर सूखा तनाव लगाया गया था3. सूखे के तनाव (30% एफसी) के तहत पौधों रोगजनक केवल इलाज (९०% एफसी) पौधों(चित्रा 6ए और बी)की तुलना में बढ़ रोग घटना दिखाया । नियंत्रण और सूखे से इलाज करने वाले पौधों में कोई लक्षण नहीं दिखाईदिया (चित्र 6ए और बी)। संयुक्त तनाव के तहत जड़ों में रोगजनक केवल पौधों(चित्रा 6B)की तुलना में अधिक परिगलित धब्बे और सड़ांध थे।

Figure 1
चित्रा 1: राइजोक्टोनिया बाटाटिकोलाकी विशेषता रूपात्मक विशेषताएं । शुष्क जड़सड़ांध (राइजोक्टोनिया बाटेटिकोला,आईटीसीसी 8635) के कारण एजेंट को क्षेत्र (नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ प्लांट जीनोम रिसर्च, नई दिल्ली, 28.6139 डिग्री एन, 77.2090 ° ई) से अलग किया गया था। संस्कृतियों से, कवक को हाइफाल टिप विधि8का उपयोग करके अलग किया गया था। छवियां आलू डेक्सट्रोस एगर में 4 दिन पुरानी आर बटाटिकोला संस्कृति को पेट्री प्लेट(ए),5 दिन पुरानी तरल संस्कृति(बी)और 10 दिन पुरानी तिरछी संस्कृति(सी)में दिखाती हैं । फंगल माइसेलिया(डी)और माइक्रोस्क्लेरोटिया (काले तीर)(ई)को माइक्रोस्कोप स्लाइड पर छेड़ा गया था और क्रमशः WGA-FITC और aniline ब्लू के साथ दाग दिया गया था । छवियां(ई, एफ,स्केल बार, 20, और 50 माइक्रोन) एक epifluorescent माइक्रोस्कोप के 20x और 40x उद्देश्य लेंस के तहत कब्जा कर लिया गया। सफेद तीर मायसेलिया में क्रॉस की दीवारों को दिखाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: आर बटाटिकोला टीका और DRR में शामिल कदम ब्लॉटिंग पेपर तकनीक में कहते हैं । सतह उन्हें नल के पानी के माध्यम से गुजर कर बीज को बंध्यकृत करती है और 2% सोडियम हाइपोक्लोराइट के साथ धोने के बाद, बाँझ आरओ पानी के साथ धोने के बाद 3-4 बार (चरण 1)। फिर, मिट्टी (चरण 2) युक्त 15-सेमी-उच्च बर्तनों में 30 बीज बोएं और बीजों को 28 डिग्री सेल्सियस ± 2 डिग्री सेल्सियस तापमान के साथ विकास कक्ष में आठ दिनों तक बढ़ने दें, 16 घंटे की तीव्रता के साथ 150 माइक्रोमोल मीटर−2 एस−1,और 70% (चरण 3) की सापेक्ष आर्द्रता के साथ। पौधों को उखाड़कर स्टरलाइज्ड पानी (स्टेप 4) से धोएं। फंगस (स्टेप 5) के साथ 500 एमएल पीडीबी मीडिया को इनोक्यूलेट करके फंगल इनोकुलम तैयार करें। संक्रमण के लिए, 5 दिन पुरानी फंगल शोरबा संस्कृति का उपयोग करें। फिर, 30 एस के लिए एक बीकर में फंगल इनोकुलम में जड़ों को डुबोकर पौधों को टीका लगाएं और बीकर (चरण 6) के भीतरी साइडवॉल को छूकर अतिरिक्त इनोकुलम को हटा दें। संक्रमण के बाद, अलग-अलग साफ ट्रे (चरण 7) में विभिन्न ब्लॉटिंग पेपर्स में फंगल-टीका और नकली टीका लगाने वाले पौधों को रखें। रोजाना पर्याप्त बाँझ पानी के साथ ब्लॉटिंग पेपर को गीला करें और लक्षणों का निरीक्षण करें, अर्थात्, पार्श्व जड़ों को बहाना, पौधों की पत्तियों का पीला और मुरझाना, सड़े हुए बीज, और जड़ सड़न आठ दिनों के बाद संक्रमण (चरण 8)(ए)में। छवियां आवश्यक चरणों (चरण 3-7) (बी) का प्रतिनिधित्वकरते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: ब्लॉटिंग पेपर तकनीक के आधार पर छोला में डीआरआर रोग के लक्षण। चित्रा 2 में चित्रित प्रोटोकॉल के बाद, DRR-अतिसंवेदनशील पौधों (जीनोटाइप, जेजी ६२) को ब्लॉटिंग पेपर तकनीक का उपयोग करके संक्रमण के अधीन किया गया था, और संक्रमण के आठ दिन बाद लक्षणों को पकड़ लिया गया था । छवियां स्वस्थ शूटिंग (लाल तीर) और अधिक पार्श्व जड़ों (पीले तीर)(ए)के साथ जड़ों के साथ प्रतिनिधि नियंत्रण पौधों (नकली टीका) दिखाती हैं। छवियां प्रतिनिधि संक्रमित पौधों को विशिष्ट लक्षणों के साथ दिखाती हैं, जैसे कि मुरझाना, पीला होना और पत्तियों का सूखना (नीला तीर) और कम पार्श्व जड़ों (सफेद तीर)(बी)के साथ सूखे/परिगलित जड़ें । स्केल बार 1 सेमी है। प्रयोग कम से कम पांच बार दोहराए गए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4: आर बटाटिकोला टीका और DRR रोग परख के लिए बीमार बर्तन की तैयारी का अवलोकन। एक पीडीए प्लेट को सक्रिय रूप से बढ़ती फंगल संस्कृति और दस दिनों के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट के 5 मिमी फंगल डिस्क के साथ इनोक्यूलम तैयार करें। फिर, सब्सट्रेट तैयार करने के लिए, चने के बीजों को नल के पानी से धोएं, बीजों को रात भर पानी में भिगोएं, और 15 मिनट के लिए 121 एलबीएस पर ऑटोक्लेव करें। फिर, 10 दिन पुरानी संस्कृति से तीन आगार प्लग के साथ सब्सट्रेट के 100 ग्राम टीका और अच्छी तरह से मिश्रण। इसके बाद इनक्यूबेटर में 15 दिन के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इन्क्यूलेट सब्सट्रेट को इनक्यूबेट करें। बीमार संस्कृति को क्रश करें (फंगल उगाया सब्सट्रेट), सूखा और पाउडर इसे, और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। फिर, 100 ग्राम सूखी मिट्टी के साथ 50 ग्राम बीमार संस्कृति को अच्छी तरह से मिलाएं (बीमार बर्तन)(ए)। फिर, सतह-निष्फल अतिसंवेदनशील छोला बीज बोना और लक्षणों का निरीक्षण करें, अर्थात, रूट सड़ांध, पार्श्व जड़ परिगलन, और पत्ती पीला। एक ही बर्तन में लक्षण दिखाने वाले पौधों को आत्मसात करें। आगे के प्रयोगों के लिए, 90% संक्रमण को अतिसंवेदनशील जीनोटाइप के रूप में दिखाने वाले बर्तनों का उपयोग करें। छवियां इनोकुलम (i), सब्सट्रेट (ii) और नियंत्रण और टीकाबद्ध बीमार संस्कृति (iii)(बी)का प्रतिनिधित्व करती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: बीमार बर्तन तकनीक के आधार पर छोला में DRR रोग के लक्षण। एक बीमार बर्तन बनाने के लिए, चित्रा 4 में चित्रित प्रोटोकॉल का उपयोग किया गया था। फिर, सतह-निष्फल डीआरआर-अतिसंवेदनशील चना जीनोटाइप (जेजी 62) बीज नियंत्रण(ए)और बीमार बर्तन(बी)में बोए गए थे। बर्तन में प्रत्येक पौधे एक दोहराने का प्रतिनिधित्व करता है, और बीमार बर्तन में मृत या अवरुद्ध पौधे के विकास को देखा गया था। पैनल(सी)के दाईं ओर के पौधे क्रमशः नियंत्रण और उपचार में पार्श्व जड़ों (पीले तीर) की उपस्थिति और अनुपस्थिति को इंगित करते हैं। ग्राफ नियंत्रण(डी)की तुलना में बीमार बर्तन उपचार में मृत पौधों की संख्या से पता चलता है । बीमार बर्तन NIPGR क्षेत्र से एकत्र निष्फल क्षेत्र मिट्टी पर तैयार किया गया था, और बीमार संस्कृति मिलाया गया था । सतह-निष्फल बीज बोए गए थे, और बुवाई के ४८ दिन बाद रोग के लक्षणों पर कब्जा कर लिया गया था । छवि नियंत्रण पौधों(ई)को दिखाती है, और विशिष्ट डीआरआर पत्ते के लक्षण, अर्थात् पौधों के सूखने, (सफेद तीर) इंगित किए जाते हैं। सांख्यिकीय महत्व छात्र टीपरीक्षण का उपयोग कर निर्धारित किया गया था । बार नौ जैविक प्रतिकृति के एसईएम का प्रतिनिधित्व करता है, और तारक पी & 0.0001 पर सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण मूल्य को दर्शाता है। पीला तीर बिना किसी पार्श्व जड़ों के परिगलित/सड़ा हुआ, सूखे प्राथमिक जड़ को इंगित करता है । प्रयोगों को कम से दस बार दोहराया गया, इसी तरह के परिणामों के साथ । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्र 6: बीमार बर्तन विधि संयंत्र रोगजनक बातचीत पर सूखे तनाव के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए उपयोगी है । आर बटाटिकोला संक्रमण पर सूखे के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक पॉट प्रयोग किया गया था । प्रयोग में नियंत्रण, सूखा-केवल, रोगजनक-केवल(आर बटाटिकोला,रोगजनक), और संयुक्त सूखा और आर बटाटिकोला तनाव (संयुक्त तनाव) शामिल थे। पौधों को 28 डिग्री सेल्सियस ± 2 डिग्री सेल्सियस तापमान के साथ एक विकास कक्ष में उगाया गया था, 16 घंटे फोटोपीरियोड 150 माइक्रोमोल मीटर−2 एस−1की हल्की तीव्रता के साथ, और 70% सापेक्ष आर्द्रता। बीमार बर्तन चित्रा 4 में चित्रित प्रोटोकॉल के बाद तैयार किया गया था । फिर, सतह-निष्फल डीडीआर-अतिसंवेदनशील चना जीनोटाइप (जेजी 62) बीज नियंत्रण और बीमार बर्तनों में बोए गए थे। पूरे प्रयोग में नियंत्रण और रोगजनक उपचार की सिंचाई की गई । सूखे और संयुक्त तनाव उपचार के तहत पौधों पर सूखा तनाव लगाया गया था। बुवाई के 18 दिन बाद पानी रोक दिया गया और बुवाई के 24 दिन बाद वांछित सूखा स्तर पहुंच गया। बुवाई के 29 दिन बाद लक्षणों के लिए पौधे देखे गए। छवि उपचार(ए)के तहत पत्ते और जड़ परिवर्तन दिखाती है। छवियां एक SMZ25/SMZ18 अनुसंधान स्टीरियोमाइक्रोस्कोप(बी)के 0.5X उद्देश्य लेंस के तहत मनाया दागदार संयंत्र जड़ों को दिखाने के लिए । लाल तीर असंक्रमित पार्श्व जड़ों को इंगित करता है, और काले तीर संक्रमित पार्श्व जड़ों को इंगित करते हैं। प्रयोगों को कम से दस बार दोहराया गया, इसी तरह के परिणामों के साथ । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्रा S1: इनोकुलम आकार और छोला में पार्श्व जड़ संख्या में कमी। चित्रा 2 में चित्रित प्रोटोकॉल के बाद, DRR अतिसंवेदनशील पौधों (जीनोटाइप, जेजी 62) को ब्लॉटिंग पेपर तकनीक का उपयोग करके विभिन्न आकार के इनोकुलम के साथ संक्रमण के अधीन किया गया था, और संक्रमण के आठ दिन बाद लक्षणों को पकड़ लिया गया था। पौधों को विभिन्न अयोकुलम आकार (0.1%, 1%, 10% और पानी में 20% w/v) के साथ टीका लगाया गया था, छवियां प्रतिनिधि संक्रमित पौधों को गर्माने, पीले रंग और पत्तियों के सूखने और कम पार्श्व जड़ों (बी) के साथ सूखे/परिगलित जड़ों जैसे विशिष्ट लक्षणों के साथ दिखाती हैं। ग्राफ इनोकुलम भिन्नता (बी) के साथ संक्रमण के तहत पौधों में पार्श्व जड़ों की संख्या को दर्शाता है। स्केल बार 1 सेमी एन = 10 है। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्रा S2: मिट्टी में छोला में डीआरआर के पत्तेदार लक्षण। आंकड़ा 4 में चित्रित प्रोटोकॉल के बाद, सतह निष्फल बीज बोए गए थे, और बुवाई के 14 दिनों के बाद रोग के लक्षणों पर कब्जा कर लिया गया था । प्रतिनिधि छवि नियंत्रण पौधों (ए) को दिखाती है, और तस्वीर विशिष्ट डीआरआर पत्तेदार लक्षणों को दिखाती है, अर्थात् पौधों का सूखने (सफेद तीर) (बी)। रोग स्कोर जड़ों पर परिगलित धब्बे के आधार पर विकसित किया गया था। स्कोरिंग दिन (सी) भर में विकसित किया गया था । तस्वीरें (ए एंड बी) एक ही प्रयोग से हैं। स्केल बार = 3 सेमी एन = 10। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

ब्लॉटिंग पेपर तकनीक प्रयोगशाला की स्थितियों के तहत छोला जीनोटाइप स्क्रीन करने के लिए एक सीधा दृष्टिकोण प्रदान करती है। डुबकी टीका इनोकुलम लोड(अनुपूरक चित्रा 1)पर आसान नियंत्रण के साथ एक लौकिक आधार पर बातचीत की जांच में सक्षम बनाता है और इन विट्रो स्क्रीनिंग में सुविधा प्रदान करता है। इसके अलावा, यहां तक कि युवा रोपण का उपयोग किया जा सकता है। पांच दिन पुरानी फंगल कल्चर(चित्रा 1B)पौधों को संक्रमित करने के लिए पर्याप्त इनोकुलम पैदा कर सकती है । लिक्विड इनोकुलम में माइसेलिया और माइक्रोस्क्लेरोटिया(चित्रा 1डी और ई)दोनों होते हैं । रूटसड़ांध लक्षण (चित्रा 3B)रोग स्कोर और प्रतिरोधी जीनोटाइप की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। डीआरआर घटना मुख्य रूप से सूखे के तनाव से प्रभावित होती है1,3,5. हालांकि, अकेले इस तकनीक के साथ, सूखा तनाव अधिरोपण असंभव है, और इस तकनीक के साथ स्क्रीनिंग प्राकृतिक प्रतिक्रियाओं को प्रतिबिंबित नहीं करेगा ।

बीमार बर्तन तकनीक पौधों, रोगजनकों और सूखे तनाव के बीच बातचीत के अध्ययन की अनुमति देती है। यह प्रतिरोधी जीनोटाइप की पहचान करने के लिए संयुक्त सूखे और रोगजनक तनाव के तहत जीनोटाइप को स्क्रीन करने का एक तरीका प्रदान करता है। एक बीमार बर्तन में, सूखे का तनाव पौधे के किसी भी उम्र में लगाया जा सकता है और पौधों को स्क्रीन किया जा सकता है। पौधे बीमार बर्तन विधि में विशिष्ट डीआरआर लक्षण(चित्रा 5सी और एफ और पूरक चित्रा 2बी और सी)दिखाते हैं। संयुक्त सूखे और रोगजनक संक्रमण के अधीन पौधों रोगजनक केवल उपचार की तुलना में गंभीर जड़ सड़ांध दिखाया । इसका तात्पर्य यह है कि उपलब्ध छोला जर्मप्लाज्म को न केवल रोगजनक बल्कि संयुक्त रोगजनक और सूखे तनाव के लिए प्रतिरोधी जीनोटाइप की पहचान करने के लिए जांच की आवश्यकता है। जीनोटाइप को स्क्रीन करने के लिए पहले कई अध्ययनों का प्रयास किया गया था लेकिन11, 12, ब्लॉटिंगपेपर तकनीक का उपयोग करके। इसके अलावा, फील्ड स्क्रीनिंग भी आयोजित की गई है लेकिन सूखा तनाव11को लागू किए बिना । चना के विभिन्न चरणों के दौरान सूखे का तनाव लगाना और जीनोटाइप प्रतिक्रिया का आकलन करना महत्वपूर्ण है ।

मुसीबत शूटिंग

ब्लॉटिंग पेपर तकनीक के लिए बीकर में इनोकुलम की मात्रा उस स्तर पर होनी चाहिए जहां पूरे पौधे की जड़ डूबा हुआ है। इसके अतिरिक्त, अतिरिक्त पानी पौधे की जड़ों की गीली सड़ांध का कारण बनेगा। पौधों को पानी देने के लिए नल के पानी का उपयोग न करें क्योंकि इससे प्रदूषण हो सकता है।

बीमार बर्तन तकनीक के लिए देसी चना किस्में बेहतर हैं। शोधकर्ताओं की जरूरतों के आधार पर बीजों की संख्या भिन्न हो सकती है । बीजों को भिगोने के लिए उपयोग किए जाने वाले पानी की मात्रा तीन गुना अधिक होनी चाहिए क्योंकि बीज पानी को धारण करते हैं। अगर धुलाई सही ढंग से नहीं की गई तो बैक्टीरियल ग्रोथ होगी। बीजों को भिगोने के लिए गैर-ऑटोक्लेवित पानी का उपयोग किया जा सकता है। ऑटोक्लेविंग के बाद बीजों का रंग भूरे रंग के बजाय काला होना चाहिए, जो अनुचित ऑटोक्लेविंग को इंगित करता है। एक गर्म हवा ओवन में सूखने पर बीज के सूखने की ओर जाता है; ऐसे बीजों का उपयोग फंगल टीका के लिए नहीं किया जा सकता है। लैमिनार प्रवाह के बाहर बोतलों को इनोक्यूल करने से प्रदूषण हो सकता है। टीका छोला भोजन में सफेद कवक वृद्धि अनुचित ऑटोक्लेविंग का संकेत है। इस्तेमाल किए गए इनोकुलम, ब्लॉटिंग पेपर और संक्रमित पौधों को त्यागने में जैवसेफ्टी सावधानियों का पालन किया जाना चाहिए।

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Disclosures

हमारे पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है

Acknowledgments

एम.एस.के. प्रयोगशाला में परियोजनाओं को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ प्लांट जीनोम रिसर्च कोर फंडिंग द्वारा समर्थित किया जाता है। VI ने डीबीटी-जेआरएफ (डीबीटी/2015/एनआईपीजीआर/430) को स्वीकार किया । हम ट्रेनी स्टूडेंट्स को धन्यवाद देते हैं मिस ऋषिका, मिस्टर जयेंद्रयान और मिस दुर्गादेवी वीडियो शूटिंग के दौरान तकनीकी मदद के लिए और मिस्टर संदीप दीक्षित, मिस अंजलि और डॉ अवनीश राय ने रॉ डेटा और पांडुलिपि फाइलों का समीक्षकों का आकलन करने के लिए । हम श्री रहीम एच तराफदार और श्री सुंदर सोलंकी को प्रयोगशाला में उनकी मदद के लिए धन्यवाद देते हैं। हम संयंत्र विकास सहायता/अंतरिक्ष के लिए ई-संसाधनों और एनआईपीजीआर संयंत्र विकास सुविधा तक पहुंच प्रदान करने के लिए डीबीटी-ईलिब्रेरी कंसोर्टियम (डीईएलकॉन) और एनआईपीजीआर लाइब्रेरी को स्वीकार करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fungus- Rhizoctonia bataticola Pathogen inoculum Indian Type Culture Collection No. 8365 GenBank: MH509971.1, ITCC 8635 (https://www.iari.res.in/index.php?option=com_content&view=article&
id=1251&Itemid=1370)
Soilrite mix Soil medium in the lab Keltech Energies Limited, Bangalore, India http://www.keltechenergies.com/
Filter paper Blotting paper to support the plant growth Himedia http://himedialabs.com/catalogue/chemical2017/index.html#374
Pot Growing plants 10 and 30 cm size pots Routinely used nursery pots, for example, https://dir.indiamart.com/impcat/nursery-pots.html
Potato dextrose agar/broth Culture and maintain the fungus Cat# 213400, DifcoTM, MD, USA https://www.fishersci.com/shop/products/bd-difco-dehydrated-culture-media-potato-dextrose-agar-3/p-4901946
Incubator Culture the fungus LOM-150-2, S/N AI13082601-38, MRC, incubator, and shaker http://www.mrclab.com/productDetails.aspx?pid=91131
Growth chamber Growing plants in controlled condition Model No. A1000, Conviron, Canada https://www.conviron.com/products/gen1000-reach-in-plant-growth-chamber
Laminar airflow Carrying out aseptic exercises Telstar, Bio II advance, Class II cabinet, EN-12469-2000 https://www.telstar.com/lab-hospitals-equipment/biological-safety-cabinets/bio-ii-advance-plus/, http://www.atlantisindia.co.in/laminar-air-flow.html
Mesh Filtering the fungal mycelia Nylon mosquito net Mesh with 0.6-1 mm diameter pore size
Autoclave Autoclaving media and chickpea seeds Autoclave http://www.scientificsystems.in/autoclave
Microscopes Visualizing the infection ang fungal mycelia SMZ25 / SMZ18, Research Stereomicroscopes, Leica EZ4 educational stereomicroscope https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18

https://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/p/leica-ez4/

https://www.microscopyu.com/museum/eclipse-80i
Weighing balance Weighing fungus and chemicals Sartorius Electronic Weighing Balance, BSA 4202S-CW https://www.sartorius.com/en/products/weighing/laboratory-balances
WGA-FITC Fungus staining Sigma https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l4895?lang=en&region=IN
Aniline blue Fungus staining Himedia http://www.himedialabs.com/intl/en/products/Chemicals/Dyes-Indicators-and-Stains/Aniline-blue-Water-soluble-Practical-grade-GRM901

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References

  1. Sharma, M., Ghosh, R., Pande, S. Dry root rot (Rhizoctonia bataticola (Taub.) Butler): an emerging disease of chickpea - where do we stand. Archives of Phytopathology and Plant Protection. 48 (13-16), 797-812 (2015).
  2. Srinivas, P. Studies on dry root rot of chickpea (Cicer arietinum L.). , Available from: http://krishikosh.egranth.ac.in/handle/1/93135 (2016).
  3. Sinha, R., Irulappan, V., Mohan-Raju, B., Suganthi, A., Senthil-Kumar, M. Impact of drought stress on simultaneously occurring pathogen infection in field-grown chickpea. Scientific Reports. 9 (1), (2019).
  4. Nene, Y., Haware, M., Reddy, M. Chickpea diseases: resistance screening techniques, information bulletins No. 10. Patancheru. Information Bulletin No. 10. Patancheru, A.P., India: International CroDS Research Institute for the Semi-Arid Tropics. , 1-10 (1981).
  5. Pande, S., Krishna Kishore, G., Upadhyaya, H. D., Narayana Rao, J. Identification of sources of multiple disease resistance in mini-core collection of chickpea. Plant Disease. , (2006).
  6. Pandey, P., Irulappan, V., Bagavathiannan, M. V., Senthil-Kumar, M. Impact of combined abiotic and biotic stresses on plant growth and avenues for crop improvement by exploiting physio-morphological traits. Frontiers in Plant Science. 8, (2017).
  7. Irulappan, V., Senthil-Kumar, M. Morpho-physiological traits and molecular intricacies associated with tolerance to combined drought and pathogen stress in plants. Biotechnologies of Crop Improvement, Volume 3: Genomic Approaches. , (2018).
  8. Jensen, A. B., et al. Standard methods for fungal brood disease research. Journal of Apicultural Research. 52 (1), 1-39 (2013).
  9. Agrios, G. Plant Pathology: Fifth Edition. , 9780080473 (2004).
  10. Coley-Smith, J. R., Cooke, R. C. Survival and germination of fungal sclerotia. Annual Review of Phytopathology. , (1971).
  11. Nagamma, G., Saifulla, M., Sab, J., Pavitra, S. Screening of chickpea genotypes against dry root rot caused by Macrophomina phaseolina (tassi) goid. 10 (4), 1795-1800 (2015).
  12. Infantino, A., et al. Screening techniques and sources of resistance to root diseases in cool season food legumes. Euphytica. 147 (1-2), 201-221 (2006).
  13. Khaliq, A., et al. Integrated control of dry root rot of chickpea caused by Rhizoctonia bataticola under the natural field condition. Biotechnology Reports. 25, 00423 (2020).

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Irulappan, V., Senthil-Kumar, M. Dry Root Rot Disease Assays in Chickpea: a Detailed Methodology. J. Vis. Exp. (167), e61702, doi:10.3791/61702 (2021).

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