Summary
В этом исследовании представлены методологии для изучения патоморфологических и молекулярных механизмов, лежащих в основенут-Ризоктония бататикола взаимодействия. Метод blotting бумаги полезн для того чтобы быстро изучить реакции генотипа нута, пока больной бак-основанный метод можно использовать для того чтобы одновременно навести засуху и инфекцию R. bataticola и экран для толерантных генотипов.
Abstract
Сухая корневая гниль (DRR) болезнь представляет собой возникающие биотические угрозы стресса для выращивания нута во всем мире. Это вызвано почвенным грибкового патогена, Rhizoctonia bataticola. В литературе всеобъемлющие и подробные пошаговие протоколы по анализу заболеваний являются редкими. В этой статье приводится полная информация о шагах, связанных с созданием метода блоттинг бумаги для быстрого скрининга генотипов на устойчивость к DRR. Техника blotting бумаги легка и более менее дорогая. Другой метод, основанный на подходе больной горшок, является имитацией естественной инфекции и может быть применен для изучения взаимодействующих компонентов- растений, патогенов и окружающей среды, участвующих в треугольнике болезни.
Кроме того, в природе, DRR происходит в основном в дождевых районах выращивания нута, где влажность почвы отступает по мере роста урожая. Засуха стресс, как известно, предрасполагают растения нута к drR болезни. Патоморфологическое и молекулярное понимание взаимодействия растений и патогенов в условиях засухоустойчивого стресса может проложить путь для выявления элитных сортов, устойчивых к ДРР, из бассейна зародышевой плазмы нута. В этой статье приводится пошаговая методология подготовки больного горшка и последующего анализа заболеваний. В целом, информация, представленная в настоящем документе поможет исследователям подготовить R. bataticola грибковый инокулум, поддерживать этот патоген, создать технику blotting бумаги, подготовить больную культуру и больной горшок, и оценить патогенной инфекции в растениях нута.
Introduction
Сухая корневая гниль (DRR) является одним из экономически значимых заболеваний внуте 1,2. Это корень конкретных заболеваний, вызванных Rhizoctonia bataticola (телеоморф, Макрофомина phaseolina). Зараженные растения не имеют бокового корня и обладают хрупкими тапрутами и желтойлиствой 1,3. DRR под засухой стресс, как сообщается, возникающие угрозы для выращиваниянута 1,2,3. Кроме того, заболеваемость ДРР, как сообщается, усугубляется в условиях засухив полевых условиях 1,2,3. DRR более распространен в дождевых районах, чем на орошаемых полях4. Использование устойчивых сортов является способом преодоления болезни и обойти фунгицид использования1,13. Поскольку зародышевая плазма нута, доступная по всему миру, имеетгенетические вариации для черты 5,скрининг и выявление устойчивых/восприимчивых генотипов имеют решающее значение для молекулярного разведения для улучшения урожая.
Надежные, легкие и экономически эффективные анализы заболеваний имеют важное значение для исследования R. bataticola инфекции моделей в нуте. Первичное заболевание анализ используется для наблюдения за реакцией генотипов нута на R. bataticola инфекции является blotting бумагитехники 1,4. Это простой метод и может быть выполнена с помощью жидких грибковых инокулов, саженцы с корнями, и стерильные blotting бумаги. Однако этот метод не был использован по максимуму, поскольку в литературе нет пошагового протокола.
Между тем, больной горшок техника включает в себя подготовку потенциальной больной культуры и введение засухи стресса. Учитывая, что засуха стресс усугубляет заболеваемость DRRзаболеваемости 3, важно изучить растительно-патогенного взаимодействия в условияхзасухи стресс 6,7. Техника больного горшка обеспечивает платформу для такого одновременного исследования, способствуя лучшим возможностям для скрининга зародышевой плазмы и понимания механистической основы взаимодействия. Патоморфологические изменения, такие как увеличение длины корня и уменьшение бокового числа корней, присущих болезни DRR, могут быть решены с помощью методабольной горшок 1,3,7.
В этом документе представлен подробный протокол для blotting бумаги и больных горшок методы, которые могут быть использованы для изучения взаимодействия между нута и R. bataticola и экран нута зародышевой плазмы, представлен. Подробная информация о материалах, используемых в исследовании, представлена в таблице материалов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Изоляция R. bataticola и хранение
- Подробная информация о генотипе нута и симптомах DRR
- Используйте нут растений (генотип, JG 62), которые обычно показывают типичные симптомы DRR, такие как сухой, хрупкий первичный корень без бокового корня и микросклероции под корой и внутрисердцевины 1,3.
- Сбор и стирка
- Выкорчевывание растений, проявляя такие симптомы, как сухой соломенный цвет флоры и хрупкий первичный корень с микросклеротия под слоем эпидермиса. При выкорчевывании большая часть корней останется внутри почвы, так как зараженные корни хрупкие. Удалите грубый почвенный мусор, прикрепленный к корню. Вырезать корни отдельно и собирать их в бумажные конверты (27,5 см х 12 см) с надлежащей этикеткой и поместить их в коробку для сбора образцов.
- После транспортировки образцов в лабораторию поместите корни в стакан 200 мл и накройте сеткой (нейлоновая сетка диаметром 3 мм) и тщательно промыть корни проточной водопроводной водой, чтобы удалить прилипающие частицы почвы.
- Используйте обратный осмос (RO) воды для полоскания один раз в конце.
- Поверхностная стерилизация
- Разбейте корни на четыре части длиной 2 см каждый скальпелем и положите их в чистый стакан 200 мл.
- Соберите автоматическую воду RO, 2% NaOCl, отбрасывая банку, и автоклавную бумагу (5см 2) внутри ламинарный поток камеры.
- Вымойте корни с 50 мл автоматической воды RO трижды, а затем с 50 мл 2% NaOCl в течение 10 мин. Вымойте корни с 50 мл воды RO три раза снова, чтобы удалить NaOCl.
- Пятно высушить корни, поместив корни на автоклавной бумаги и оставить до тех пор, пока корни высушиваются.
- Средства массовой информации и инкубация
- Удалите края корней с стерилизованным лезвием скальпеля. Разделите корни с помощью лезвия и использовать стерилизованные типсы, чтобы поместить их на картофель декстроза агар (PDA) СМИ Петри пластины, содержащие стрептомицин сульфат (50 мг L-1) и ампициллин (50 мг L-1).
- Закройте пластину, запечатате парафильмом и инкубировать в инкубаторе при 28 градусов по Цельсию в течение двух дней в темноте.
- Метод наконечника Hyphal
- После двух дней инкубации, принести пластины в камеру ламинарного потока. Вырежьте кончик гипхаляроста 8 под стереомикроскопом (Leica E-4 образовательный стереомикроскоп) и передать его в свежей пластины КПК со стрептомицином сульфатом и ампициллином.
- Инкубировать пластины в инкубаторе при 28 градусов по Цельсию в течение десяти дней в темноте.
- Хранение и техническое обслуживание грибкового инокулума R. bataticola
- Сделать КПК наклоны в пробирках и передачи грибковых агар штепсельная вилка из десятидневной пластины культуры с помощью пламени стерилизованной цикл прививки. Печать крышки пробирки с парафильмом.
- Инкубировать наклоны при 28 градусов по Цельсию в течение десяти дней в темноте.
- Печать крышку с парафильмом снова и хранить его при 4 градусов по Цельсию в холодильнике для использования в будущем.
- Субкультура каждые шесть месяцев для поддержания грибка.
- Поддержание вирулентности
- Заразить растения с чистой грибковой инокулума подготовлены, как уже упоминалось в больной горшоктехники 3. Изолировать тот же грибок от инфицированных растений (постулаты Коха)9 и использовать для дальнейших экспериментов.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании использовался полевой изолированный штамм гриба (GenBank: MH509971.1 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MH509971)
- Заразить растения с чистой грибковой инокулума подготовлены, как уже упоминалось в больной горшоктехники 3. Изолировать тот же грибок от инфицированных растений (постулаты Коха)9 и использовать для дальнейших экспериментов.
2. Техника blotting бумаги
ПРИМЕЧАНИЕ: Метод blotting бумаги влечет за собой подготовку жидких грибковых инокулов, рассады подготовки, а также оценки заболеваний.
- Приготовление жидкого инокулума R. bataticola
ПРИМЕЧАНИЕ: Жидкий R. bataticola грибковый inoculum содержит как мицелия и микроклеротия. Обе эти структуры выступают в качестве основного инокулума.- Подготовь 500 мл PDB-медиа в колбе 1000 мл и автоклав в 121 фунт за 15 минут.
- После того, как средства массовой информации охлаждается, привить бульон с loopful грибковых агар штепсельная вилка из грибковых наклонной культуры и инкубировать при 28 градусов по Цельсию в течение пяти дней в шейкере при 180 об / мин в темноте.
- Соберите на столе автоклавное стекло или пластиковую воронку (10 см), однолитровую коническую колбу идва слоя сетки (размер 10 см 2) (нейлоновая сетка диаметром 3 мм). Отфильтруйте грибковую мицелию и микросклероцию с помощью сетки. Пятно высушить грибок в автоклавной бумаге.
- Взвесить 100 г мизелии на 50% инокулума и держать при комнатной температуре.
- Приготовление растения нута
- Выберите 50 здоровых семян (в данном исследовании использовался генотип JG 62, подверженный DRR, поместите их в стакан 100 мл и накройте сеткой.
- Вымойте семена водопроводной водой, чтобы удалить почвенный мусор.
- Возьмите стакан с семенами в камеру ламинарного потока и мыть их стерилизованными 50 мл воды RO трижды в течение 1 мин за стирку.
- Стерилизовать семена с 50 мл 2% aqueous NaOCl в течение 2 мин с непрерывной встряхивания и мыть семена с 50 мл стерилизованной воды пять раз в течение 1 мин каждый.
- Заполните полиэтиленовый пакет (47,5 см х 25 см) с Soilrite (смесь садоводства класса расширена перлит, ирландский торфяной мох, и отшелушивается вермикулит в равном соотношении т.е., 1/3:1/3:1/3), сеять поверхностно стерилизованные 50 семян на глубину два см, и держать в камере роста / комнате с 28 градусов по Цельсию ± 2 градусов по Цельсию температуры, 16 ч фотопериод с интенсивностью света 150 ммм 2 с 1, и относительная влажность 70%. Поливайте их водой RO и выкорчевывать растения через восемь дней после посева.
- Вымойте корни в водопроводной воде, чтобы удалить частицы Soilrite. Промыть корни стерилизованной водой RO, и держать их в воде RO в стакане 1000 мл.
- Приготовление бумаги в лотках
- Возьмите бумагу и разрежьте их на кусочки (30 см × 23 см) в достаточном количестве, чтобы удовлетворить репликации.
- Упакуйте листы в автоклавируемый полиэтиленовый пакет и автоклав их на 121 фунтов в течение 15 минут и держать его в духовке горячего воздуха для сушки.
- Сложите каждый лист бумаги пополам.
- Поместите бумагу на чистый, вытертый духом пластиковый лоток, как показано на рисунке 2i-iv.
- Прививка растений путем погружения
- Растворите 100 г грибкового инокулума в 200 мл автоматической воды RO в стакане 200 мл, чтобы получить 50% инокулум.
- Dip корни растений в подготовленном inoculum в течение 1 мин с прерывистым вверх-вниз движения для обеспечения равномерного крепления грибковых инокулум.
- Размещение растений в бумаге для помарки
- Влажная нижняя сторона бумаги, помещенной на поднос со стерильной водой RO. Поместите растения на бумагу таким образом, чтобы только корни были покрыты бумагой, а побеги остались в стороне.
- Закройте его, сложив верхнюю сторону бумаги и мокрой всей бумаги, чтобы обеспечить достаточно воды для поддержания роста растений.
- Поливать лоток один раз в день и держать лотки при 28 градусов по Цельсию. Наблюдайте такие симптомы, как некроз, корневая гниль и пожелтения листьев ежедневно.
3. Больной горшок техники
ПРИМЕЧАНИЕ: Больной горшок техника влечет за собой подготовку вирулентного инокулума и больной горшок, поддержание уровня влаги, а также оценка симптомов заболевания.
- Подготовка субстрата
- Возьмите один кг любых коммерчески доступных семян нута. Удалите зараженные семена (семена с грибкового роста, инфекции пятна, и повреждения насекомых). Поместите их в 5 Л пластиковый стакан и мыть с водопроводной водой тщательно 3-4 раза, чтобы удалить крупный мусор.
- Вымойте семена с 2 л воды RO трижды и замочить 1 кг семян в стакане 5 л с трехкратным больше воды в течение пяти часов.
- После того, как семена впитал воду, перемойте их ro воды трижды, чтобы удалить семена экссудатов.
- Полностью удалите воду и упакуйте семена в бутылки с вареньем (300 мл, рост 12 см, диаметр 6 см и вес 155 г) примерно до 1/4тыс. (100 г на бутылку варенья) и закройте бутылки крышками. Упакуйте десять бутылок варенья в автоматический полиэтиленовый пакет (48 см х 30 см) автоклав дважды при 121 фунте в течение 15 мин непрерывно.
- Высушите семена при температуре 40 градусов по Цельсию в духовке на ночь, чтобы удалить капли воды внутри бутылки.
- Подготовка больной культуры
- Включите камеру ламинарного потока уровня BSL-2. Протрите пол тщательно с 70% этанола, и включите УФ в течение 15 мин. Затем держите семена внутри камеры ламинарного потока.
- Возьмите 10-дневную недавно изолированную культуру R. bataticola (часть 1). Затем возьмите три грибковых агара пробки (диаметр 4 мм) с помощью стерильной наконечник пипетки или пробки борер, и положить их в варенье бутылки асептически. Обложка бутылки с крышками и печать с парафильмом.
- Встряхните бутылки, чтобы смешать грибковый диск с семенами нута равномерно.
- Инкубировать бутылки при 30 градусов по Цельсию в течение 15 дней в темноте.
- Возьмите бутылки варенья с черным грибковым ростом(рисунок 4iii) и перенесите больную культуру (семена с микросклероцией) из бутылок варенья в стеклянную тарелку Петри с помощью стерильных типсов. Высушите их при комнатной температуре в течение двух дней в стеклянной тарелке Петри.
- Порошок грибковой массы с помощью раствора и пестика, и хранить порошок при 4 градусов по Цельсию.
- Автоклав Soilrite дважды на 121 фунтов в течение 15 мин.
- Высушите автоклавную смесь Soilrite под шезлонгом.
- Смешайте грибковый порошок с Soilrite на 50% ж / в, заполнить горшки со смесью, и держать их при комнатной температуре в течение дня.
- Посеять поверхностно стерилизованных DRR-восприимчивых семян нута на горшок (10 см круглые горшки) (Таблица материалов) и поддерживать уровень влаги 80% полевой мощности (FC).
- Наблюдайте за такими симптомами, как некроз и корневая гниль, выкорчевывание растений после прорастания.
- Оценка эффективности больного горшка
ПРИМЕЧАНИЕ: Растения показывают желтые симптомы флоры, когда корни полностью гнилые.- Разработка оценки заболевания на основе поражения (некротические пятна) (Дополнительный рисунок 2C) номера и тяжесть корневой гнили. Больные горшки, показывающие 90% смерти растений могут быть использованы далее.
- Генотипный скрининг
- Подготовьте больную культуру в больших количествах и смешайте ее либо с стерилизованным soilrite, либо с полевой почвой (5% ж/у) в горшках высотой 30 см. Вода горшки, чтобы мокрой поверхности и оставить их спокойно в течение семи дней.
- Посеять одно поверхностно-стерилизованное семя на 10 см круглый горшок и три семена на 30 см круглые горшки и поливать их адекватно.
- Наблюдайте желтые foliar и симптомы гнили корня.
- Комбинированная засуха и инфекция R. bataticola
- Навязать засуху стресс, следуя протоколам, упомянутым в Sinha et al. (2019).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Это исследование было направлено на демонстрацию таких методов, как blotting бумаги и больных горшок методы для облегчения патоморфологических и молекулярных понимание растительно-патогенного взаимодействия в условиях засухи стресса. Для достижения этой цели, растения, выставленные симптомы DRR1,3,4 были собраны из нута поле, и грибок был изолирован с помощью метода hyphal отзыв8. R. bataticola грибковая культура появляется темно-серый на пластине КПК и наклона на четыре дня после инкубации (Рисунок 1И C) и темнее в сером цвете в среде PDB через пять дней после инкубации (Рисунок 1B). R. bataticola имеет перегородку mycelia(рисунок 1D), и он производит микросклеротия (Рисунок 1E), которые выступают в качестве первичного инокулума в почве10.
Шаги, данные на рисунке 2, были соблюдены для выполнения метода blotting бумаги. Восьмидневные растения были инфицированы жидким инокулем (50%), а через восемь дней после заражения наблюдались симптомы заболевания растений. Растения показали корневую гниль из-за обширного некроза, а также пожелтения листьев, что является типичным корневыми и лиственными симптомами болезни DRR(рисунок 3B и дополнительный рисунок 1A).
Техника больного горшка была проведена с использованием шагов, показанных на рисунке 4. Концентрации грибковых инокул в soilrite и полевой почве составили 10% и 5%, соответственно. Семена DRR-восприимчивых показывают типичные симптомы DRR, такие как корневая гниль, отсутствие бокового корня, пожелтения листьев и преждевременной смерти, по сравнению с контрольными растениями(рисунок 5A и B). Растения, подвергаемые инфекции в больном горшке, сделанном с Soilrite, умерли и показали корневую гнильчерез семь дней после посева (рисунок 5C и дополнительный рисунок 2C). Между тем, растения, растущие в больной горшок с полевой почвой показали типичные симптомы листвы, т.е. соломенного цвета листвы 48 дней после посева (рисунок 5E).
Влияние засухи на болезнь ДРР было также изучено в больном горшке в лабораторных условиях. Засуха стресс был введен путем удержания воды3. Растения, на которые распространяется засуха (30% FC), показали обострение заболеваемости по сравнению с растениями, обработанными только патогенами (90% FC)(рисунок 6A и B). Контрольные и засушливые растения не проявляют никаких симптомов(рисунок 6A и B). Корни при комбинированном стрессе имели больше некротических пятен и гнили по сравнению с патогенными только растениями(рисунок 6B).
Рисунок 1: Характерные морфологические особенности Rhizoctonia bataticola. Причинный агент сухой корневой гнили(Rhizoctonia bataticola, ITCC 8635) был изолирован от поля (Национальный институт исследований генома растений, Нью-Дели, 28.6139'N, 77.2090'E). Из культур, грибок был изолирован с помощью метода hyphal отзыв8. Изображения показывают 4-дней R. bataticola культуры в картофеле декстроза агар в плите Петри (A), 5-дней-старой жидкойкультуры( B ), и 10-дней назад наклонной культуры (C). Грибковая мицелия(D)и микросклеротия (черныестрелки)( E ) дразнили на слайде микроскопа и окрашенные wGA-FITC и анилин синий, соответственно. Изображения(E, F, масштаб бар, 20, и 50 мкм) были захвачены под 20x и 40x объектив объективного эпифлуоресцентного микроскопа. Белые стрелы показывают поперечные стены в мизелии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Шаги, участвующие в R. bataticola прививки и DRR анализы в blotting бумаги техники. Поверхность стерилизовать семена, передавая их через проточной водопроводной воды и мыть с 2% гипохлорита натрия, а затем мыть с стерильной водой RO 3-4 раза (шаг 1). Затем посеять 30 семян в горшках высотой 15 см, содержащих soilrite (шаг 2) и позволить семенам расти в течение восьми дней в комнате роста с температурой 28 градусов по Цельсию ± 2 градуса по Цельсию, 16 ч фотопериод с интенсивностью света 150 ммм -2 с и относительнойвлажностью 70% (шаг 3). Выкорчевывать растения и мыть их стерилизованной водой (шаг 4). Подготовьте грибковый инокулум путем инокуляции 500 мл PDB-медиа с грибком (шаг 5). Для инфекции используйте 5-дней старую культуру грибкового бульона. Затем, привить растения, окунув корни в грибковый инокулум в стакане в течение 30 с и удалить избыток инокулума, касаясь внутренней боковины стакана (шаг 6). После заражения поместите грибковые привитые и инсценированные растения в различные бумаги для помарки в отдельные чистые лотки (шаг 7). Смочение blotting бумаги с адекватной стерильной водой ежедневно и наблюдать симптомы, viz., проливая от боковой корни, пожелтение и увядание листьев растений, гнилые семена, и корневой гнили в восемь дней после заражения (шаг 8) (A). Изображения представляют собой важные шаги (шаги 3-7) (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Симптомы болезни DRR в нуте на основе blotting бумаги техники. В соответствии с протоколом, изображенным на рисунке 2, drR-чувствительные растения (генотип, JG 62) подверглись инфекции с помощью метода блоттинг бумаги, и симптомы были захвачены через восемь дней после заражения. Изображения показывают репрезентативные контрольные растения (мок-прививки) со здоровыми побегами (красная стрелка) и корнями с более боковой корнями (желтая стрелка) (A). Изображения показывают, представитель инфицированных растений с типичными симптомами, такими как увядание, пожелтление и сушка листьев (голубые стрелки) и сушеные / некротические корни с меньшим количеством боковой корни (белые стрелки) (B). Шкала бар 1 см. Эксперименты повторялись не менее пяти раз. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Обзор подготовки больной горшок для R. bataticola прививки и DRR болезни анализов. Приготовьте грибковый инокулум, инокулируя пластину КПК с 5-мм грибковым диском активно растущей грибковой культуры и инкубировать при 28 градусов по Цельсию в течение десяти дней. Затем, для подготовки субстрата, мыть семена нута с водопроводной водой, замочить семена в воде на ночь, и автоклав на 121 фунтов в течение 15 мин. Затем привить 100 г субстрата с тремя агар пробками из 10-дневной культуры и хорошо перемешать. Затем инкубировать привитый субстрат при 30 градусов по Цельсию в течение 15 дней в инкубаторе. Измельчите больную культуру (грибковый выращенный субстрат), высушите и пудрите ее, и храните при 4 градусах Цельсия. Затем смешайте 50 г больной культуры с 100 г сухого почвочистита тщательно (больной горшок) (A). Затем посеять поверхностно стерилизованных восприимчивых семян нута и наблюдать симптомы, виз., корень крана гнили, боковой некроз корня, и лист пожелтения. Усваивать растения, показывающие симптомы в том же горшке. Для дальнейших экспериментов используйте горшки, показывающие 90% инфекции в качестве восприимчивого генотипа. Изображения представляют собой инокулум (i), субстрат (ii), а также контроль и прививку больной культуры (iii) (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Симптомы болезни DRR в нуте на основе больной горшок техники. Для изготовления больного горшка использовался протокол, изображенный на рисунке 4. Затем, поверхностно стерилизованных DRR-восприимчивых генотипа нута (JG 62) семена были посеяны в управлении (A) и больнойгоршок( B ). Каждое растение в горшке представляет собой одну репликацию, и мертвый или замедленный рост растений наблюдался в больном горшке. Растения на правой стороне панели(C) указывают на наличие и отсутствие боковых корней (желтая стрелка) в управлении и обработке, соответственно. График показывает количество мертвых растений в больной лечения горшок по сравнению с контролем (D). Больной горшок был подготовлен на стерилизованной полевой почве, собранной с поля NIPGR, и больная культура была смешанной. Поверхностные стерилизованные семена были посеяны, и симптомы болезни были захвачены через 48 дней после посева. На снимке показаны контрольныеустановки (E), а также типичные симптомы ДРР-молиар, а именно, высыхание растений (белые стрелки). Статистическая значимость была определена с помощью студенческогоt-test. Бар представляет SEM из девяти биологических репликаций, а звездочка обозначает статистически значимое значение на P lt; 0.0001. желтая стрелка указывает на некротический/гнилой, высушенный первичный корень без каких-либо боковой корни. Эксперименты повторялись не менее десяти раз, с аналогичными результатами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Метод больного горшка полезен для изучения влияния засухи на взаимодействие растений и патогенов. Был проведен эксперимент по изучению влияния засухи на инфекцию Р. бататиола. Эксперимент включал в себя контроль, только от засухи, только патогенные микроорганизмы(R. bataticola, патоген), а также комбинированные засухи и R. bataticola стресс (комбинированный стресс). Растения выращивались в комнате роста с температурой 28 градусов по Цельсию ± 2 градусов по Цельсию, 16 ч фотопериод с интенсивностью света 150м/с и70% относительной влажности. Больной горшок был подготовлен в соответствии с протоколом, изображенным на рисунке 4. Затем, поверхностно стерилизованных DDR-восприимчивых генотипа нута (JG 62) семена были посеяны в контроле и больных горшках. Контроль и патогенные методы лечения орошались на протяжении всего эксперимента. Засуха была введена на растениях в условиях засухи и комбинированного лечения стресса. Вода была удержана через 18 дней после посева, а желаемый уровень засухи был достигнут через 24 дня после посева. Растения наблюдались при симптомах через 29 дней после посева. Изображение показывает, лихие и корневые изменения в рамках лечения( A). На снимках показаны неоближенные корни растений, наблюдаемые под объективом 0.5X объективного стереомикроскопа SM-25/SM-18(B). Красная стрелка указывает на неинфицированные боковой корни, а черные стрелки указывают на зараженные боковой корни. Эксперименты повторялись не менее десяти раз, с аналогичными результатами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительная цифра S1: размер инокулума и уменьшение бокового числа корней в нуте. В соответствии с протоколом, изображенным на рисунке 2, растения DRR susceptible (генотип, JG 62) подверглись инфекции с различными размерами инокулума с использованием метода блотой бумаги, и симптомы были захвачены через восемь дней после заражения. Растения были привиты с различными размерами инокулы (0,1%, 1%, 10% и 20% ж / в воде)Изображения показывают представитель инфицированных растений с типичными симптомами, такими как увядание, пожелтение, и сушки листьев и сушеных / некротических корней с менее поздними корнями (B). На графике показано количество бокового корня растений, помещих инфекцией с инокульной вариацией (В). Шкала бара составляет 1 см. n-10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.
Дополнительная цифра S2: Foliar симптомы DRR в нуте в soilrite. В соответствии с протоколом, изображенным на рисунке 4, поверхностные стерилизованные семена были посеяны, а симптомы заболевания были захвачены через 14 дней после посева. На репрезентативном изображении показаны контрольные установки (A), а на рисунке показаны типичные симптомы флоры DRR, а именно высыхание растений (белые стрелки) (B). Оценка заболеваний была разработана на основе некротических пятен на корнях. Скоринг был разработан в течение нескольких дней (C). Фотографии (A и B) из того же эксперимента. Масштабная планка 3 см. n' 10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Техника blotting бумаги обеспечивает простой подход к экрану генотипов нута в лабораторных условиях. Прививка от погружения позволяет исследование взаимодействия на временной основе с легким контролем над инокулум нагрузки(Дополнительная цифра 1) и облегчает in vitro скрининга. Кроме того, даже молодые саженцы могут быть использованы. Пятидневная грибковая культура(рисунок 1B) может дать достаточно инокулума, чтобы заразить растения. Инокулум жидкости содержит как мицелия, так и микросклеротия(рисунок 1D и E). Симптомы корневой гнили(рисунок 3B) могут быть использованы для оценки заболевания и выявления устойчивых генотипов. DrR возникновения в значительной степени зависит от засухистресс 1,3,5. Однако, только с помощью этого метода, засуха стресс введение невозможно, и скрининг с помощью этого метода не будет отражать естественные реакции.
Техника больного горшка позволяет изучать взаимодействия между растениями, патогенными микроорганизмами и засухой. Он обеспечивает способ проверки генотипов в условиях комбинированной засухи и патогенного стресса для выявления устойчивых генотипов. В больном горшке, засуха стресс может быть введен в любом возрасте завода и экран растений. Растения показывают типичные симптомы DRR(рисунок 5C и F и дополнительный рисунок 2B и C) в методе больного горшка. Растения, подвергаемые комбинированной засухе и патогенной инфекции, показали сильную корневую гниль по сравнению с лечением только патогенами. Это означает, что доступная зародышевая плазма нута должна быть проверена для выявления резистентного генотипа не только к патогену, но и комбинированию патогенного микроорганизма и засухи. Несколько исследований были предприняты ранее для проверки генотипов, но с помощью blotting бумагитехники 11,12. Кроме того, был также проведен скрининг на местах, но без введениязасухи 11. Крайне важно навязать засуху на различных стадиях нута и оценить реакцию генотипа.
ПРОБЛЕМНАЯ СТРЕЛЬБА
Для метода blotting бумаги, том inoculum в стакане должен быть на уровне где весь корень завода окунут. Кроме того, избыток полива приведет к влажной гнили корней растений. Не используйте водопроводную воду для полива растений, потому что это может привести к загрязнению.
Для больной техники горшок, Desi нута сортов предпочтительнее. Количество семян может варьироваться в зависимости от потребностей исследователей. Объем воды, используемой для замачивания семян, должен быть в три раза больше, потому что семена впитывают воду. Бактериальный рост будет происходить, если стирка не делается правильно. Не-автоклавной воды могут быть использованы для замачивания семян. Цвет семян после автоклавирования должен быть черным, а не коричневым, что указывает на неправильное автоклавирование. Над сушкой в горячей печи воздуха водит к высыханию семян; такие семена не могут быть использованы для грибковой прививки. Инокулирование бутылок за пределами ламинарного потока может привести к загрязнению. Белый грибковой рост в привитой еды нута является признаком неправильного автоклавирования. Меры предосторожности биобезопасности должны соблюдаться при отказе от используемого инокулума, бумаги и зараженных растений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нам нечего раскрывать
Acknowledgments
Проекты в лаборатории M.S.K поддерживаются основным финансированием Национального института исследований генома растений. VI признает DBT- JRF (DBT/2015/NIPGR/430). Мы благодарим студентов-стажеров, мисс Ришика, г-на Джаячендраяна и мисс Дургадеви за техническую помощь во время видеосъемки, а также г-на Сандипа Диксита, мисс Анджали и д-ра Аваниш Рай за критическую оценку необработанных данных и рукописных файлов. Мы благодарим г-на Рахима Тарафдара и г-на Сандера Соланки за помощь в работе лаборатории. Мы признаем, DBT-eLibrary консорциум (DeLCON) и NIPGR библиотека для обеспечения доступа к электронным ресурсам и NIPGR завод роста фонда для поддержки роста растений / пространства.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fungus- Rhizoctonia bataticola | Pathogen inoculum | Indian Type Culture Collection No. 8365 | GenBank: MH509971.1, ITCC 8635 (https://www.iari.res.in/index.php?option=com_content&view=article& id=1251&Itemid=1370) |
| Soilrite mix | Soil medium in the lab | Keltech Energies Limited, Bangalore, India | http://www.keltechenergies.com/ |
| Filter paper | Blotting paper to support the plant growth | Himedia | http://himedialabs.com/catalogue/chemical2017/index.html#374 |
| Pot | Growing plants | 10 and 30 cm size pots | Routinely used nursery pots, for example, https://dir.indiamart.com/impcat/nursery-pots.html |
| Potato dextrose agar/broth | Culture and maintain the fungus | Cat# 213400, DifcoTM, MD, USA | https://www.fishersci.com/shop/products/bd-difco-dehydrated-culture-media-potato-dextrose-agar-3/p-4901946 |
| Incubator | Culture the fungus | LOM-150-2, S/N AI13082601-38, MRC, incubator, and shaker | http://www.mrclab.com/productDetails.aspx?pid=91131 |
| Growth chamber | Growing plants in controlled condition | Model No. A1000, Conviron, Canada | https://www.conviron.com/products/gen1000-reach-in-plant-growth-chamber |
| Laminar airflow | Carrying out aseptic exercises | Telstar, Bio II advance, Class II cabinet, EN-12469-2000 | https://www.telstar.com/lab-hospitals-equipment/biological-safety-cabinets/bio-ii-advance-plus/, http://www.atlantisindia.co.in/laminar-air-flow.html |
| Mesh | Filtering the fungal mycelia | Nylon mosquito net | Mesh with 0.6-1 mm diameter pore size |
| Autoclave | Autoclaving media and chickpea seeds | Autoclave | http://www.scientificsystems.in/autoclave |
| Microscopes | Visualizing the infection ang fungal mycelia | SMZ25 / SMZ18, Research Stereomicroscopes, Leica EZ4 educational stereomicroscope | https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18 https://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/p/leica-ez4/ https://www.microscopyu.com/museum/eclipse-80i |
| Weighing balance | Weighing fungus and chemicals | Sartorius Electronic Weighing Balance, BSA 4202S-CW | https://www.sartorius.com/en/products/weighing/laboratory-balances |
| WGA-FITC | Fungus staining | Sigma | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l4895?lang=en®ion=IN |
| Aniline blue | Fungus staining | Himedia | http://www.himedialabs.com/intl/en/products/Chemicals/Dyes-Indicators-and-Stains/Aniline-blue-Water-soluble-Practical-grade-GRM901 |
References
- Sharma, M., Ghosh, R., Pande, S. Dry root rot (Rhizoctonia bataticola (Taub.) Butler): an emerging disease of chickpea - where do we stand. Archives of Phytopathology and Plant Protection. 48 (13-16), 797-812 (2015).
- Srinivas, P. Studies on dry root rot of chickpea (Cicer arietinum L.). , Available from: http://krishikosh.egranth.ac.in/handle/1/93135 (2016).
- Sinha, R., Irulappan, V., Mohan-Raju, B., Suganthi, A., Senthil-Kumar, M. Impact of drought stress on simultaneously occurring pathogen infection in field-grown chickpea. Scientific Reports. 9 (1), (2019).
- Nene, Y., Haware, M., Reddy, M. Chickpea diseases: resistance screening techniques, information bulletins No. 10. Patancheru. Information Bulletin No. 10. Patancheru, A.P., India: International CroDS Research Institute for the Semi-Arid Tropics. , 1-10 (1981).
- Pande, S., Krishna Kishore, G., Upadhyaya, H. D., Narayana Rao, J. Identification of sources of multiple disease resistance in mini-core collection of chickpea. Plant Disease. , (2006).
- Pandey, P., Irulappan, V., Bagavathiannan, M. V., Senthil-Kumar, M. Impact of combined abiotic and biotic stresses on plant growth and avenues for crop improvement by exploiting physio-morphological traits. Frontiers in Plant Science. 8, (2017).
- Irulappan, V., Senthil-Kumar, M. Morpho-physiological traits and molecular intricacies associated with tolerance to combined drought and pathogen stress in plants. Biotechnologies of Crop Improvement, Volume 3: Genomic Approaches. , (2018).
- Jensen, A. B., et al. Standard methods for fungal brood disease research. Journal of Apicultural Research. 52 (1), 1-39 (2013).
- Agrios, G. Plant Pathology: Fifth Edition. , 9780080473 (2004).
- Coley-Smith, J. R., Cooke, R. C. Survival and germination of fungal sclerotia. Annual Review of Phytopathology. , (1971).
- Nagamma, G., Saifulla, M., Sab, J., Pavitra, S. Screening of chickpea genotypes against dry root rot caused by Macrophomina phaseolina (tassi) goid. 10 (4), 1795-1800 (2015).
- Infantino, A., et al. Screening techniques and sources of resistance to root diseases in cool season food legumes. Euphytica. 147 (1-2), 201-221 (2006).
- Khaliq, A., et al. Integrated control of dry root rot of chickpea caused by Rhizoctonia bataticola under the natural field condition. Biotechnology Reports. 25, 00423 (2020).
