Summary
Deze studie presenteert methodologieën om de pathomorfologische en moleculaire mechanismen te bestuderen die ten grondslag liggen aan kikkererwten:Rhizoctonia bataticola-interactie. De blotting papier methode is nuttig om snel te bestuderen kikkererwten genotype reacties, terwijl de zieke pot-gebaseerde methode kan worden gebruikt om tegelijkertijd droogte en R. bataticola infectie en scherm voor tolerante genotypen op te leggen.
Abstract
Droge wortelrot (DRR) ziekte is een opkomende biotische stress bedreiging voor kikkererwten teelt over de hele wereld. Het wordt veroorzaakt door een door de bodem overgedragen schimmelpathogene ziekteverwekker Rhizoctonia bataticola. In de literatuur zijn uitgebreide en gedetailleerde stapsgewijze protocollen over ziektetesten schaars. Dit artikel bevat volledige details over de stappen die betrokken zijn bij het opzetten van een blotting papier techniek voor het snel screenen genotypen voor weerstand tegen DRR. De blotting papier techniek is eenvoudig en minder duur. Een andere methode, gebaseerd op de zieke pot benadering, is een nabootsing van natuurlijke infectie en kan worden toegepast op de interactie componenten-plant, ziekteverwekker, en omgeving-betrokken bij de ziekte driehoek te bestuderen.
Bovendien komt DRR in de natuur vooral voor in geregen kikkererwtenteeltgebieden, waar bodemvocht afneemt naarmate de gewasgroei vordert. Droogte stress is bekend dat kikkererwten planten predisponeren om drr ziekte. Pathomorfologische en moleculaire kennis van de interactie tussen plant en ziekteverwekker bij droogtestress kan de weg vrijmaken voor de identificatie van elite DRR-resistente rassen uit de kikkererwtenkiempool. Dit artikel biedt een stapsgewijze methodologie voor de bereiding van een zieke pot en de daaropvolgende ziektetest. Over het algemeen zal de hierin gepresenteerde informatie onderzoekers helpen bij het voorbereiden van R. bataticola schimmelinoculum, het handhaven van deze ziekteverwekker, het opzetten van de blotting papiertechniek, het voorbereiden van zieke cultuur en zieke pot, en het beoordelen van ziekteverwekkerinfectie in kikkererwtenplanten.
Introduction
Droge wortelrot (DRR) is een van de economisch belangrijke ziekten bij kikkererwten1,2. Het is een wortel-specifieke ziekte veroorzaakt door Rhizoctonia bataticola (teleomorf, Macrophomina phaseolina). Geïnfecteerde planten missen laterale wortels en bezitten broze taproots en geel gebladerte1,3. DRR onder droogte stress is gemeld als een opkomende bedreiging voor kikkererwten teelt1,2,3. Bovendien wordt gemeld dat de drr-incidentie onder droogtestress onder veldomstandigheden1,2,3wordt verergerd . DRR komt vaker voor in regengebieden dan in geïrrigeerde velden4. Het gebruik van resistente rassen is de manier om de ziekte te overwinnen en fungicide gebruik te omzeilen1,13. Omdat kikkererwtenkiem kiemplasma beschikbaar over de hele wereld herbergt genetische variatie voor de eigenschap5, de screening en identificatie van resistente / vatbare genotypes zijn van cruciaal belang voor moleculaire veredeling voor gewas verbetering.
Robuuste, eenvoudige en kosteneffectieve ziektetesten zijn essentieel om r. bataticola-infectiepatronen in kikkererwten te onderzoeken. De primaire ziektetest die wordt gebruikt om de reactie van kikkererwtengenypes op R. bataticola-infectie waar te nemen, is de blotting papiertechniek1,4. Het is een eenvoudige techniek en kan worden uitgevoerd met behulp van vloeibare schimmel inoculum, zaailingen met wortels, en steriele blotting papier. Deze techniek is echter niet maximaal gebruikt omdat er geen stap-voor-stap-protocol beschikbaar is in de literatuur.
Ondertussen, de zieke pot techniek omvat de voorbereiding van een potentiële zieke cultuur en het opleggen van droogte stress. Aangezien droogtestress drr-ziekteincidentie3verergert , is het van essentieel belang om de interactie tussen plant en ziekteverwekker onder droogtestress te bestuderen6,7. De zieke pot techniek biedt het platform voor een dergelijke gelijktijdige studie, het bevorderen van betere mogelijkheden voor kiemplasma screening en het begrijpen van de mechanistische basis van de interactie. Pathomorfologische veranderingen, zoals een toename van de wortellengte en vermindering van het laterale wortelaantal — inherent aan de DRR-ziekte — kunnen worden aangepakt met behulp van de zieke pottechniek1,3,7.
Hierin wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd voor blotting papier en zieke pottechnieken, die kunnen worden gebruikt om de interactie tussen kikkererwten en R. bataticola en het scherm van kikkererwtenkiemen te bestuderen. De details van de in de studie gebruikte materialen zijn vermeld in de tabel met materialen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Isolatie van R. bataticola en opslag
- Details van de kikkererwtengenype en DRR symptomen
- Gebruik kikkererwtenplanten (genotype, JG 62) die over het algemeen typische DRR-symptomen vertonen, zoals droge, broze primaire wortel zonder laterale wortels en microsclerotie onder de schors en in de pith1,3.
- Inzameling en wassen
- Ontwortel planten met symptomen zoals droog strokleurig blad en broze primaire wortel met microsclerotie onder de opperhuidlaag. Tijdens het ontwortelen, een groot deel van de wortels zal blijven in de bodem als de geïnfecteerde wortels zijn broos. Verwijder het grove grondpuin dat aan de wortel is bevestigd. Snijd de wortels apart en verzamel ze in papieren enveloppen (27,5 cm x 12 cm) met het juiste etiket en leg ze in een monsterophaaldoos.
- Na het transport van monsters naar het laboratorium, plaats de wortels in een bekerglas van 200 mL en bedek met gaas (Nylon gaas met de poriegrootte van 3 mm diameter) en was de wortels grondig met stromend leidingwater om aanhangende bodemdeeltjes te verwijderen.
- Gebruik omgekeerd osmose (RO) water om eenmaal aan het einde te spoelen.
- Oppervlaktesterilisatie
- Breek de wortels in vier stukken met elk 2 cm lengte met een scalpelmes en doe ze in een schone beker van 200 mL.
- Monteer autoclaved RO water, 2% NaOCl, weggooien pot, en autoclaved blotting papier (5 cm2) in de laminaire flow kamer.
- Was de wortels met 50 mL autoclaved RO water driemaal en vervolgens met 50 mL van 2% NaOCl gedurende 10 minuten. Was de wortels met 50 mL RO-water drie keer opnieuw om de NaOCl te verwijderen.
- Dep droog de wortels door het plaatsen van de wortels op autoclaved blotting papier en laat tot de wortels zijn gedroogd.
- Media en incubatie
- Verwijder de randen van de wortels met een gesteriliseerd scalpelblad. Splits de wortels met behulp van het blad en gebruik de gesteriliseerde tangen om ze op een aardappel dextrose agar (PDA) media Petri plaat met streptomycine sulfaat (50 mg L-1) en ampicilline (50 mg L-1).
- Sluit de plaat, verzegel met parafilm en broed in een couveuse bij 28 °C gedurende twee dagen in het donker.
- Hyphal tip methode
- Breng de platen na twee dagen incubatie in de laminaire stroomkamer. Snijd het puntje van de hyphal groei8 onder een stereomicroscoop (Leica EZ4 educatieve stereomicroscoop) en breng deze over in een verse PDA-plaat met streptomycinesulfaat en ampicilline.
- Incubeer de platen in de couveuse tien dagen in het donker bij 28 °C.
- Opslag en onderhoud van R. bataticola schimmelinoculum
- Maak PDA schuine in reageerbuizen en breng een schimmelagar plug van een tien dagen oude cultuurplaat met behulp van de vlam gesteriliseerde inenting lus. Sluit de reageerbuisd af met parafilm.
- Broed de schuine kanten tien dagen in het donker op 28 °C.
- Sluit de dop opnieuw af met parafilm en bewaar deze op 4 °C in de koelkast voor toekomstig gebruik.
- Subcultuur om de zes maanden om de schimmel te behouden.
- Behoud van virulentie
- Infecteer de planten met pure schimmel entculum bereid zoals vermeld in de zieke pot techniek3. Isoleer dezelfde schimmel van de geïnfecteerde planten (Koch's postulaten)9 en gebruik voor verdere experimenten.
OPMERKING: In deze studie werd een veld geïsoleerde stam van de schimmel gebruikt (GenBank: MH509971.1 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MH509971)
- Infecteer de planten met pure schimmel entculum bereid zoals vermeld in de zieke pot techniek3. Isoleer dezelfde schimmel van de geïnfecteerde planten (Koch's postulaten)9 en gebruik voor verdere experimenten.
2. Blotting papier techniek
OPMERKING: De blotting papier techniek omvat de voorbereiding van vloeibare schimmel entmateriaal, zaailing voorbereiding, en ziekte beoordeling.
- Bereiding van vloeibare R. bataticola enoculum
OPMERKING: Vloeibare R. bataticola schimmelintmateriaal bevat zowel mycelia als microsclerotie. Beide structuren fungeren als primaire entmateriaal.- Bereid 500 mL PDB media in een 1.000 mL kolf en autoclave het op 121 pond voor 15 min.
- Nadat de media is afgekoeld, inentuleer de bouillon met een lus vol schimmelagar plug uit een schimmelschuincultuur en incubaal vijf dagen in een shaker bij 180 rpm in het donker.
- Monteer een autoclaved glas of plastic trechter (10 cm), een liter conische kolf, en twee lagen gaas (10 cm2 grootte) (Nylon gaas met de porie grootte van 3 mm diameter) op de tafel. Filter de schimmelsycecelia en microsclerotia met behulp van het gaas. Dep droog de schimmel in autoclaved blotting papier.
- Weeg 100 g mycelia voor 50% entmateriaal en houd op kamertemperatuur.
- Bereiding van kikkererwtenplant
- Selecteer 50 gezonde zaden (in deze studie werd het DRR-vatbare genotype JG 62 gebruikt), plaats ze in een bekerglas van 100 mL en bedek ze met een gaas.
- Was de zaden eerst met leidingwater om bodemafval te verwijderen.
- Neem het bekerglas met zaden in de laminaire stroomkamer en was ze met gesteriliseerd 50 mL RO water driemaal gedurende 1 min per wasbeurt.
- Steriliseer de zaden met 50 mL van 2% waterige NaOCl gedurende 2 minuten met continu schudden en was de zaden met 50 mL gesteriliseerd water vijf keer gedurende 1 min per stuk.
- Vul een polytheenzak (47,5 cm x 25 cm) met Soilrite (een mengsel van uitgevouwen perliet van tuinbouwkwaliteit, Iers veenmos en geëxfolieerd vermiculiet in gelijke verhouding d.w.z., 1/3:1/3:1/3), zeug de oppervlakte-gesteriliseerde 50 zaden twee cm diep, en bewaar in een groeikamer/ruimte met 28 °C ± 2 °C temperatuur, 16 uur fotoperiode met een lichtintensiteit van 150 μmol m−2 s−1, en relatieve vochtigheid van 70%. Geef ze water met RO-water en ontwortel de planten acht dagen na het zaaien.
- Was de wortels in leidingwater om de Soilrite deeltjes te verwijderen. Spoel de wortels af met gesteriliseerd RO-water en bewaar ze in het RO-water in een bekerglas van 1000 mL.
- Bereiding van blotting papier in trays
- Neem een blotting papier en snijd ze in stukken (30 cm × 23 cm) in voldoende aantallen om de replicaties te voldoen.
- Pak de vellen in autoclavable polytheen zak en autoclave ze op 121 pond gedurende 15 minuten en bewaar het in een hete lucht oven voor het drogen.
- Vouw elke blotting papier vel in de helft.
- Leg het papier op een schone, met een geest afgeveegde plastic lade, zoals aangegeven in figuur 2i-iv.
- Planteninenting door onder te dompelen
- Los 100 g schimmelenoculum op in 200 mL autoclaved RO water in een bekerglas van 200 mL om 50% entmateriaal te verkrijgen.
- Dompel de plantenwortels in het voorbereide entmateriaal gedurende 1 min met intermitterende op- en neerbeweging om een uniforme bevestiging van schimmelenoculum te garanderen.
- Het plaatsen van de planten in het blotting papier
- Maak de onderkant van het blottingpapier op de lade nat met steriel RO-water. Plaats de planten op het papier op een manier waar alleen de wortels zijn bedekt door het papier, en scheuten worden weggelaten.
- Sluit het door het vouwen van de bovenkant van het blotting papier en nat het hele papier om voldoende water te bieden aan de groei van planten te ondersteunen.
- Geef de lade één keer per dag water en houd de trays op 28 °C. Observeer de symptomen zoals necrose, wortelrot en bladverkleuring dagelijks.
3. Zieke pottechniek
OPMERKING: De zieke pot techniek omvat de voorbereiding van virulente entmateriaal en een zieke pot, onderhoud van vochtgehalte, en de beoordeling van de symptomen van de ziekte.
- Bereiding van substraat
- Neem een kg van alle commercieel verkrijgde kikkererwtenzaden. Verwijder geïnfecteerde zaden (zaden met schimmelgroei, infectievlekken en insectenschade). Plaats ze in 5 L plastic bekerglas en wassen met kraanwater grondig 3-4 keer om grote puin te verwijderen.
- Was de zaden driemaal met 2 L RO water en week de 1 kg zaden in een 5 L beker met drie maal meer water voor vijf uur.
- Zodra de zaden het water indrongen, opnieuw wassen ze met RO water driemaal om het zaad te verwijderen straalt.
- Verwijder het water volledig en verpak de zaden in jamflessen (300 mL, 12 cm hoog, 6 cm diameter en 155 g gewicht) tot ongeveer 1/4e capaciteit (100 g per jamfles) en sluit de flessen met doppen. Pak tien jamflessen in een autoclalavable plastic zak (48 cm x 30 cm) autoclave tweemaal op 121 pond gedurende 15 min continu.
- Droog de zaden bij 40 °C 's nachts in een oven om de waterdruppels in de fles te verwijderen.
- Voorbereiding van de zieke cultuur
- Schakel de BSL-2-niveau laminaire stroomkamer in. Veeg de vloer grondig af met 70% ethanol en zet UV 15 minuten aan. Houd vervolgens de zaden in de laminaire stroomkamer.
- Neem de vers geïsoleerde R. bataticola-cultuur van 10 dagen oud (deel 1). Neem vervolgens drie schimmelagarpluggen (4 mm diameter) met behulp van een steriele pipetpunt of kurkboor en stop ze aseptisch in jamflessen. Bedek de flessen met doppen en verzegel met parafilm.
- Schud de flessen om de schimmelschijf gelijkmatig te mengen met de kikkererwtenzaden.
- Incubeer de flessen 15 dagen in het donker bij 30 °C.
- Neem jamflessen met zwarte schimmelgroei(figuur 4iii)en breng de zieke cultuur (zaden met microsclerotia) over van jamflessen naar een glazen petriplaat met steriele tangen. Droog ze twee dagen op kamertemperatuur in een glazen petrischaal.
- Poeder de schimmelmassa met een vijzel en stamper en bewaar het poeder op 4 °C.
- Autoclave Soilrite twee keer op 121 pond voor 15 min.
- Droog de autoclaved Soilrite mix onder een parasol.
- Meng het schimmelpoeder met Soilrite op 50% w/w, vul de potten met het mengsel en bewaar ze een dag op kamertemperatuur.
- Zaai een oppervlakte-gesteriliseerd DRR-vatbaar kikkererwtenzaad per pot (10 cm ronde potten) (Tabel van materialen)en handhaven van een vochtgehalte van 80% veldcapaciteit (FC).
- Observeer de symptomen zoals necrose en wortelrot door de planten te ontwortelen na ontkieming.
- Beoordeling van de efficiëntie van zieke wiet
OPMERKING: Planten vertonen gele bladsymptomen wanneer de wortels volledig verrot zijn.- Ontwikkel een ziektescore op basis van de laesie (necrotische vlekken)(aanvullende figuur 2C)nummers en de ernst van wortelrot. Zieke potten met 90% plantensterfte kunnen verder worden gebruikt.
- Genotype screening
- Bereid de zieke cultuur in grote hoeveelheden voor en meng het met gesteriliseerde Soilrite of veldbodem (5% w/w) in 30 cm hoge potten. Geef de potten water om het oppervlak nat te maken en laat ze zeven dagen ongestoord.
- Zaai één oppervlakte-gesteriliseerd zaad per 10 cm ronde pot en drie zaden per 30 cm ronde potten en geef ze voldoende water.
- Observeer de gele blad- en wortelrotsymptomen.
- Gecombineerde droogte en R. bataticola infectie
- Leg droogtestress op door de in Sinha et al. (2019) genoemde protocollen te volgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze studie was gericht op het aantonen van technieken zoals blotting papier en zieke pot technieken om pathomorfologische en moleculaire begrip van plant-pathogen interactie onder droogte stress te vergemakkelijken. Om dit te bereiken, planten vertonen DRR symptomen1,3,4 werden verzameld uit een kikkererwten veld, en de schimmel werd geïsoleerd met behulp van de hyphal tip methode8. R. bataticola schimmelcultuur lijkt donkergrijs op de PDA-plaat en schuin op vier dagen na incubatie (Figuur 1A & C) en donkerder in grijze kleur in het PDB-medium op vijf dagen na incubatie ( Figuur1B). R. bataticola heeft septaat mycelia (Figuur 1D), en het produceert microsclerotie (Figuur 1E), die fungeren als primaire entmateriaal in de bodem10.
De stappen in figuur 2 werden gevolgd om de blotting papier techniek uit te voeren. Acht dagen oude planten waren besmet met vloeibaar entmateriaal (50%), en acht dagen na infectie werden planten waargenomen voor symptomen. Planten toonden wortelrot als gevolg van uitgebreide necrose, evenals bladverkleuring, dat is de typische wortel en blad symptomen van drr ziekte (Figuur 3B en aanvullende figuur 1A).
De zieke pottechniek werd uitgevoerd met behulp van de in figuur 4vermelde stappen . De concentraties schimmelinentmateriaal in Soilrite en veldbodem bedroegen respectievelijk 10% en 5%. DRR-vatbare zaden tonen de typische DRR-symptomen zoals wortelrot, gebrek aan laterale wortels, bladverkleuring en vroegtijdige dood, in vergelijking met controleplanten(figuur 5A en B). Planten die in de zieke pot met Soilrite werden besmet, stierven en vertoonden zeven dagen na het zaaien wortelrot(figuur 5C en aanvullende figuur 2C). Ondertussen, planten groeien in de zieke pot gemaakt met veldgrond toonde typische blad symptomen, dat wil zeggen, stro-gekleurde bladeren 48 dagen na het zaaien (Figuur 5E).
De invloed van droogte op de ziekte van DRR werd ook onderzocht in de zieke pot onder laboratoriumomstandigheden. Droogte stress werd opgelegd door het achterhouden van water3. De planten onder droogte stress (30% FC) toonde verergerde ziekte incidentie in vergelijking met de pathogen-only-behandelde (90% FC) planten (Figuur 6A en B). Bestrijdings- en met droogte behandelde planten vertonen geen symptomen (figuur 6A en B). Wortels onder gecombineerde stress hadden meer necrotische vlekken en rot in vergelijking met pathogene only-planten (Figuur 6B).
Figuur 1: Karakteristieke morfologische kenmerken van Rhizoctonia bataticola. Het oorzakelijk middel van droge wortelrot (Rhizoctonia bataticola, ITCC 8635) werd geïsoleerd van het veld (National Institute of Plant Genome Research, New Delhi, 28.6139°N, 77.2090°E). Van de culturen, de schimmel werd geïsoleerd met behulp van de hyphal tip methode8. Beelden tonen de 4 dagen oude R. bataticola cultuur in aardappel dextrose agar in een petri plaat (A), 5 dagen oude vloeibare cultuur (B), en 10 dagen oude schuine cultuur (C). Schimmel mycelia (D) en microsclerotia (zwarte pijlen) (E) werd geplaagd op een microscoop dia en gekleurd met WGA-FITC en aniline blauw, respectievelijk. Afbeeldingen (E, F, schaalbalk, 20 en 50 μm) werden vastgelegd onder de 20x en 40x objectieve lens van een epifluorescente microscoop. Witte pijlen tonen de kruiswanden in de mycelia. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Stappen die betrokken zijn bij R. bataticola-inenting en DRR-tests in de blotting papiertechniek. Oppervlakte steriliseren de zaden door ze door stromend leidingwater en wassen met 2% natriumhypochloriet, gevolgd door wassen met steriel RO water 3-4 keer (stap 1). Zaai vervolgens 30 zaden in 15 cm hoge potten met Soilrite (stap 2) en laat de zaden acht dagen groeien in een groeiruimte met 28 °C ± 2 °C-temperatuur, 16 uur fotoperiode met een lichtintensiteit van 150 μmol m−2 s−1, en relatieve vochtigheid van 70% (stap 3). Ontwortel de planten en was ze met gesteriliseerd water (stap 4). Bereid het schimmelenoculum voor door 500 mL PDB-media te inenten met schimmel (stap 5). Voor de infectie, gebruik 5 dagen oude schimmelbouillon cultuur. Inentuleer de planten vervolgens door de wortels in het schimmelentmateriaal in een beker voor 30 s te dompelen en overtollig inoculum te verwijderen door de binnenzijgevel van het bekerglas aan te raken (stap 6). Na infectie, plaats schimmel-ingeënt en mock-ingeënt planten in verschillende blotting papier in aparte schone trays (stap 7). Bevochtig het blotting papier met voldoende steriel water per dag en observeer de symptomen, namelijk, vergieten van laterale wortels, vergeling en verwelking van plantenbladeren, rotte zaden, en wortelrot op acht dagen na infectie (stap 8) (A). Afbeeldingen vertegenwoordigen essentiële stappen (stap 3–7) (B). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: DRR-ziektesymptomen bij kikkererwten op basis van de blotting papiertechniek. Volgens het protocol afgebeeld in figuur 2, DRR-vatbare planten (genotype, JG 62) werden onderworpen aan infectie met behulp van de blotting papier techniek, en symptomen werden gevangen acht dagen na infectie. Afbeeldingen tonen de representatieve controleplanten (mock-ingeënt) met gezonde scheuten (rode pijl) en wortels met meer laterale wortels (gele pijl) (A). Afbeeldingen tonen de representatieve geïnfecteerde planten met typische symptomen, zoals verwelking, vergeling en drogen van bladeren (blauwe pijlen) en gedroogde /necrotische wortels met minder laterale wortels (witte pijlen)(B). De schaalbalk is 1 cm. Experimenten werden minstens vijf keer herhaald. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Overzicht van zieke potpreparaat voor R. bataticola-inenting en DRR-ziektetesten. Bereid het schimmelenoculum voor door tien dagen lang een PDA-plaat te inenten met een 5 mm schimmelschijf van actief groeiende schimmelcultuur en incubeer bij 28 °C. Dan, voor de voorbereiding van het substraat, was de kikkererwten zaden met kraanwater, weken de zaden in water 's nachts, en autoclave op 121 pond voor 15 min. Inent vervolgens 100 g van het substraat met drie agar-pluggen uit de 10 dagen oude cultuur en meng goed. Vervolgens het ingeënte substraat 15 dagen in een couveuse in een couveuse in te broeden op 30 °C. Plet de zieke cultuur (schimmelgekweekt substraat), droog en poeder het en bewaar op 4 °C. Meng vervolgens 50 g zieke cultuur met 100 g droge Soilrite grondig (zieke pot)(A). Zaai vervolgens de oppervlakte-gesteriliseerde vatbare kikkererwtenzaden en observeer de symptomen, namelijk, tapwortelrot, laterale wortelnecrose en bladverneeuwing. Assimileren de planten die symptomen vertonen in dezelfde pot. Voor verdere experimenten, gebruik maken van de potten met 90% infectie als de vatbare genotype. Beelden vertegenwoordigen het entmateriaal (i), het substraat (ii), en controle en ingeënt zieke cultuur (iii) (B). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: DRR ziekte symptomen in kikkererwten op basis van de zieke pot techniek. Voor het maken van een zieke pot werd het protocol in figuur 4 gebruikt. Vervolgens werden oppervlakte-gesteriliseerde DRR-vatbare kikkererwten genotype (JG 62) zaden gezaaid in de controle(A) en zieke pot (B). Elke plant in de pot vertegenwoordigt een repliceren, en dode of onvolgroeide plantengroei werd waargenomen in de zieke pot. Planten aan de rechterkant van het paneel (C) geven de aanwezigheid en afwezigheid van laterale wortels (gele pijl) in de controle en behandeling, respectievelijk. De grafiek toont het aantal dode planten in de zieke pot behandeling in vergelijking met de controle(D). De zieke pot werd bereid op gesteriliseerde veldbodem verzameld uit het NIPGR-veld, en de zieke cultuur werd gemengd. Oppervlakte-gesteriliseerde zaden werden gezaaid, en ziekte symptomen werden gevangen 48 dagen na het zaaien. De afbeelding toont de controleplanten(E),en de typische DRR bladsymptomen, namelijk het drogen van planten, worden aangegeven (witte pijlen). Statistische significantie werd bepaald aan de hand van student's t-test. De balk vertegenwoordigt de SEM van negen biologische replica's en het sterretje geeft een statistisch significante waarde aan bij P < 0,0001. De gele pijl geeft necrotische/rotte, gedroogde primaire wortel aan zonder laterale wortels. Experimenten werden minstens tien keer herhaald, met vergelijkbare resultaten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: De zieke potmethode is nuttig om de invloed van droogtestress op de interactie tussen plant en ziekteverwekker te bestuderen. Er werd een wietexperiment uitgevoerd om het effect van droogte op r. bataticola-infectie te onderzoeken. Het experiment bestond uit controle, alleen droogte, pathogene -only(R. bataticola, ziekteverwekker), en gecombineerde droogte en R. bataticola stress (gecombineerde stress). Planten werden gekweekt in een groeiruimte met 28 °C ± 2 °C temperatuur, 16 uur fotoperiode met een lichtintensiteit van 150 μmol m−2 s−1, en 70% relatieve vochtigheid. De zieke pot werd bereid volgens het protocol afgebeeld in figuur 4. Vervolgens werden oppervlakte-gesteriliseerde DDR-vatbare kikkererwten genotype (JG 62) zaden gezaaid in de controle en zieke potten. Controle- en pathogene behandelingen werden gedurende het hele experiment geïrrigeerd. Droogte stress werd opgelegd aan planten bij droogte en gecombineerde stress behandeling. Water werd 18 dagen na het zaaien ingehouden en het gewenste droogteniveau werd 24 dagen na het zaaien bereikt. Planten werden 29 dagen na het zaaien waargenomen voor symptomen. Het beeld toont de blad- en wortelveranderingen onder behandelingen(A). Afbeeldingen tonen onbevlekte plantenwortels waargenomen onder de 0.5X objectieve lens van een SMZ25/SMZ18 onderzoek stereomicroscope(B). De rode pijl geeft de niet-geïnfecteerde laterale wortels aan en de zwarte pijlen geven de geïnfecteerde laterale wortels aan. Experimenten werden minstens tien keer herhaald, met vergelijkbare resultaten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullende figuur S1: Inoculumgrootte en vermindering van het laterale wortelaantal in kikkererwten. Volgens het protocol afgebeeld in figuur 2, DRR vatbare planten (genotype, JG 62) werden onderworpen aan infectie met een gevarieerde grootte van entmateriaal met behulp van blotting papier techniek, en symptomen werden gevangen acht dagen na infectie. Planten werden ingeënt met een gevarieerde inoculumgrootte (0,1%, 1%, 10% en 20% w/v in water)Beelden tonen de representatieve geïnfecteerde planten met typische symptomen zoals verwelking, vergeling en drogen van bladeren en gedroogde/necrotische wortels met minder laterale wortels (B). De grafiek toont het aantal laterale wortels in planten onder infectie met inoculumvariatie (B). De schaalbalk is 1 cm. n=10. Klik hier om dit cijfer te downloaden.
Aanvullende figuur S2: Bladsymptomen van DRR in kikkererwten in soilrite. Volgens het protocol afgebeeld in figuur 4, oppervlakte gesteriliseerde zaden werden gezaaid, en ziekte symptomen werden gevangen op 14 dagen na het zaaien. De representatieve afbeelding toont de controleplanten (A), en de foto toont de typische DRR bladsymptomen, namelijk het drogen van planten (witte pijlen) (B). Ziekte score werd ontwikkeld op basis van necrotische vlekken op de wortels. De score werd ontwikkeld over de dagen (C). De foto's (A&B) zijn van hetzelfde experiment. Schaalbalk= 3 cm. n= 10. Klik hier om dit cijfer te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De blotting papier techniek biedt een eenvoudige aanpak voor het scherm kikkererwten genotypen onder laboratoriumomstandigheden. Dip-inenting maakt het onderzoeken van interactie op tijdelijke basis mogelijk met eenvoudige controle over entmateriaalbelasting(aanvullende figuur 1)en vergemakkelijkt in vitro screening. Bovendien kunnen zelfs jonge zaailingen worden gebruikt. Vijf dagen oude schimmelcultuur (Figuur 1B) kan voldoende inentmateriaal opleveren om de planten te infecteren. Vloeibaar entmateriaal bevat zowel mycelia als microsclerotie (figuur 1D & E). Wortelrot symptomen (Figuur 3B) kan worden gebruikt om de ziekte te scoren en resistente genotypen te identificeren. DRR optreden wordt sterk beïnvloed door droogte stress1,3,5. Echter, met deze techniek alleen, droogte stress opleggen is onmogelijk, en screening met deze techniek zal geen natuurlijke reacties weerspiegelen.
De zieke pot techniek maakt het mogelijk de studie van de interacties tussen planten, ziekteverwekkers, en droogte stress. Het biedt een manier om de genotypen te screenen bij gecombineerde droogte en pathogene stress om resistente genotypen te identificeren. In een zieke pot kan droogtestress worden opgelegd op elke leeftijd van de plant en de planten screenen. Planten vertonen typische DRR-symptomen(figuur 5C & F en aanvullende figuur 2B & C) in de zieke potmethode. Planten die werden blootgesteld aan gecombineerde droogte en ziekteverwekkerinfectie vertoonden ernstige wortelrot in vergelijking met een behandeling met alleen ziekteverwekkers. Dit houdt in dat het beschikbare kiemplasma van kikkererwten moet worden gescreend om een resistent genotype te identificeren tegen niet alleen ziekteverwekkers, maar ook gecombineerde pathogene en droogtestress. Verschillende studies werden eerder geprobeerd om de genotypen te screenen, maar met behulp van blotting papier techniek11,12. Bovendien is er ook veldscreening uitgevoerd, maar zonder droogtestress op te leggen11. Het is van cruciaal belang om droogtestress op te leggen in verschillende stadia van kikkererwten en de reactie op genotype te beoordelen.
TROUBLE SHOOTING
Voor de blotting papier techniek, het volume van het entmateriaal in het bekerglas moet op het niveau waar de hele plant wortel wordt ondergedompeld. Bovendien zal overtollig water geven leiden tot nat rot van de plantenwortels. Gebruik geen kraanwater voor het besproeien van de planten, omdat het verontreiniging kan veroorzaken.
Voor de zieke pot techniek, Desi kikkererwten variëteiten hebben de voorkeur. Het aantal zaden kan variëren afhankelijk van de behoeften van de onderzoekers. Het volume van het water dat wordt gebruikt om zaden te weken zou drievoudig meer moeten zijn omdat de zaden water inbeuwen. Bacteriële groei zal optreden als het wassen niet correct wordt gedaan. Niet-automatisch gelavend water kan worden gebruikt om de zaden te weken. De kleur van de zaden na autoclaving moet zwart zijn in plaats van bruin, wat duidt op onjuiste autoclaving. Over het drogen in een hete lucht oven leidt tot het drogen van zaden; dergelijke zaden kunnen niet worden gebruikt voor schimmelinenting. Het inenten van de flessen buiten de laminaire stroming kan besmetting veroorzaken. Witte schimmelgroei in ingeënte kikkererwten maaltijd is een teken van onjuiste autoclaving. Bioveiligheidsmaatregelen moeten worden gevolgd bij het weggooien van het gebruikte entmateriaal, het blottingpapier en de besmette planten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
We hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Projecten in het M.S.K lab worden ondersteund door het National Institute of Plant Genome Research kernfinanciering. VI erkent DBT- JRF (DBT/2015/NIPGR/430). Wij danken studenten in opleiding, Miss Rishika, de heer Jayachendrayan, en Miss Durgadevi voor technische hulp tijdens video-opnamen en de heer Sandeep Dixit, Miss Anjali en Dr. Avanish Rai voor het kritisch beoordelen van ruwe gegevens en de manuscriptbestanden. We danken Mr Rahim H Tarafdar en Mr. Sunder Solanki voor hun hulp in het laboratorium. Wij erkennen DBT-eLibrary Consortium (DeLCON) en NIPGR Library voor het verstrekken van toegang tot e-resources en NIPGR Plant Growth Facility voor de groei van planten ondersteuning / ruimte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fungus- Rhizoctonia bataticola | Pathogen inoculum | Indian Type Culture Collection No. 8365 | GenBank: MH509971.1, ITCC 8635 (https://www.iari.res.in/index.php?option=com_content&view=article& id=1251&Itemid=1370) |
| Soilrite mix | Soil medium in the lab | Keltech Energies Limited, Bangalore, India | http://www.keltechenergies.com/ |
| Filter paper | Blotting paper to support the plant growth | Himedia | http://himedialabs.com/catalogue/chemical2017/index.html#374 |
| Pot | Growing plants | 10 and 30 cm size pots | Routinely used nursery pots, for example, https://dir.indiamart.com/impcat/nursery-pots.html |
| Potato dextrose agar/broth | Culture and maintain the fungus | Cat# 213400, DifcoTM, MD, USA | https://www.fishersci.com/shop/products/bd-difco-dehydrated-culture-media-potato-dextrose-agar-3/p-4901946 |
| Incubator | Culture the fungus | LOM-150-2, S/N AI13082601-38, MRC, incubator, and shaker | http://www.mrclab.com/productDetails.aspx?pid=91131 |
| Growth chamber | Growing plants in controlled condition | Model No. A1000, Conviron, Canada | https://www.conviron.com/products/gen1000-reach-in-plant-growth-chamber |
| Laminar airflow | Carrying out aseptic exercises | Telstar, Bio II advance, Class II cabinet, EN-12469-2000 | https://www.telstar.com/lab-hospitals-equipment/biological-safety-cabinets/bio-ii-advance-plus/, http://www.atlantisindia.co.in/laminar-air-flow.html |
| Mesh | Filtering the fungal mycelia | Nylon mosquito net | Mesh with 0.6-1 mm diameter pore size |
| Autoclave | Autoclaving media and chickpea seeds | Autoclave | http://www.scientificsystems.in/autoclave |
| Microscopes | Visualizing the infection ang fungal mycelia | SMZ25 / SMZ18, Research Stereomicroscopes, Leica EZ4 educational stereomicroscope | https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18 https://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/p/leica-ez4/ https://www.microscopyu.com/museum/eclipse-80i |
| Weighing balance | Weighing fungus and chemicals | Sartorius Electronic Weighing Balance, BSA 4202S-CW | https://www.sartorius.com/en/products/weighing/laboratory-balances |
| WGA-FITC | Fungus staining | Sigma | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l4895?lang=en®ion=IN |
| Aniline blue | Fungus staining | Himedia | http://www.himedialabs.com/intl/en/products/Chemicals/Dyes-Indicators-and-Stains/Aniline-blue-Water-soluble-Practical-grade-GRM901 |
References
- Sharma, M., Ghosh, R., Pande, S. Dry root rot (Rhizoctonia bataticola (Taub.) Butler): an emerging disease of chickpea - where do we stand. Archives of Phytopathology and Plant Protection. 48 (13-16), 797-812 (2015).
- Srinivas, P. Studies on dry root rot of chickpea (Cicer arietinum L.). , Available from: http://krishikosh.egranth.ac.in/handle/1/93135 (2016).
- Sinha, R., Irulappan, V., Mohan-Raju, B., Suganthi, A., Senthil-Kumar, M. Impact of drought stress on simultaneously occurring pathogen infection in field-grown chickpea. Scientific Reports. 9 (1), (2019).
- Nene, Y., Haware, M., Reddy, M. Chickpea diseases: resistance screening techniques, information bulletins No. 10. Patancheru. Information Bulletin No. 10. Patancheru, A.P., India: International CroDS Research Institute for the Semi-Arid Tropics. , 1-10 (1981).
- Pande, S., Krishna Kishore, G., Upadhyaya, H. D., Narayana Rao, J. Identification of sources of multiple disease resistance in mini-core collection of chickpea. Plant Disease. , (2006).
- Pandey, P., Irulappan, V., Bagavathiannan, M. V., Senthil-Kumar, M. Impact of combined abiotic and biotic stresses on plant growth and avenues for crop improvement by exploiting physio-morphological traits. Frontiers in Plant Science. 8, (2017).
- Irulappan, V., Senthil-Kumar, M. Morpho-physiological traits and molecular intricacies associated with tolerance to combined drought and pathogen stress in plants. Biotechnologies of Crop Improvement, Volume 3: Genomic Approaches. , (2018).
- Jensen, A. B., et al. Standard methods for fungal brood disease research. Journal of Apicultural Research. 52 (1), 1-39 (2013).
- Agrios, G. Plant Pathology: Fifth Edition. , 9780080473 (2004).
- Coley-Smith, J. R., Cooke, R. C. Survival and germination of fungal sclerotia. Annual Review of Phytopathology. , (1971).
- Nagamma, G., Saifulla, M., Sab, J., Pavitra, S. Screening of chickpea genotypes against dry root rot caused by Macrophomina phaseolina (tassi) goid. 10 (4), 1795-1800 (2015).
- Infantino, A., et al. Screening techniques and sources of resistance to root diseases in cool season food legumes. Euphytica. 147 (1-2), 201-221 (2006).
- Khaliq, A., et al. Integrated control of dry root rot of chickpea caused by Rhizoctonia bataticola under the natural field condition. Biotechnology Reports. 25, 00423 (2020).
