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Biology

Ensayos de la enfermedad de ladrido de raíz seca en el garbanzo: una metodología detallada

doi: 10.3791/61702 Published: January 17, 2021

Summary

Este estudio presenta metodologías para estudiar los mecanismos patomorfoológicos y moleculares subyacentes a la interacción entre garbanzo yrizoctonia bataticola. El método del papel hinchado es útil para estudiar rápidamente las respuestas del genotipo del garbanzo, mientras que el método de la olla enferma se puede utilizar para imponer simultáneamente la sequía y la infección por R. bataticola y la pantalla tolerante a los genotipos.

Abstract

La enfermedad de la putrefacción de la raíz seca (DRR) es una amenaza emergente de estrés biótico para el cultivo de garbanzos en todo el mundo. Es causada por un patógeno fúngico transmitido por el suelo, Rhizoctonia bataticola. En la literatura, los protocolos paso a paso completos y detallados sobre los ensayos de enfermedades son escasos. Este artículo proporciona detalles completos sobre los pasos involucrados en la configuración de una técnica de papel hinchado para la detección rápida de genotipos para la resistencia a la RR. La técnica del papel hinchado es fácil y menos costosa. Otro método, basado en el enfoque de la olla enferma, es una imitación de la infección natural y se puede aplicar para estudiar los componentes que interactúan (planta, patógeno y medio ambiente) involucrados en el triángulo de la enfermedad.

Además, en la naturaleza, la RR se produce principalmente en las zonas de cultivo de garbanzos de secano, donde la humedad del suelo retrocede a medida que avanza el crecimiento de los cultivos. Se sabe que el estrés por sequía predispone a las plantas de garbanzos a la enfermedad de la RR. La comprensión patomorfológica y molecular de la interacción entre plantas y patógenos bajo estrés por sequía puede allanar el camino para la identificación de variedades élite resistentes a la RR desde la reserva de germoplasma de garbanzos. Este artículo proporciona una metodología escalonada para la preparación de una olla enferma y el posterior ensayo de la enfermedad. En general, la información presentada en este documento ayudará a los investigadores a preparar el inóculo fúngico R. bataticola, mantener este patógeno, establecer la técnica de papel de hinchazón, preparar el cultivo enfermo y la olla enferma, y evaluar la infección por patógenos en plantas de garbanzos.

Introduction

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La podredumbre de la raíz seca (DRR) es una de las enfermedades económicamente significativas en el garbanzo1,2. Es una enfermedad específica de la raíz causada por Rhizoctonia bataticola (teleomorfo, Macrofomina phaseolina). Las plantas infectadas carecen de raíces laterales y poseen raíces quebradizas y follaje amarillo1,3. Se ha informado que el estrés por DRR bajo sequía es una amenaza emergente para el cultivo de garbanzos1,2,3. Además, se ha informado que la incidencia de la RR se ha agravado en condiciones de sequía en condiciones de campo1,2,3. DrR es más frecuente en las zonas de secano que en los campos de regadío4. La utilización de variedades resistentes es la manera de superar la enfermedad y eludir el uso defungicidas 1,13. Debido a que el germoplasma de garbanzos disponible en todo el mundo alberga una variación genética para el rasgo5,el cribado e identificación de genotipos resistentes/susceptibles son críticos para la cría molecular para la mejora de los cultivos.

Los ensayos de enfermedades robustos, fáciles y rentables son esenciales para investigar los patrones de infección por R. bataticola en el garbanzo. El ensayo de enfermedad primaria utilizado para observar la respuesta de los genotipos de garbanzos a la infección por R. bataticola es la técnica de papel hinchado1,4. Es una técnica simple y se puede ejecutar utilizando inóculo de hongos líquidos, plántulas con raíces y papel de hinchazón estéril. Sin embargo, esta técnica no se ha utilizado al máximo porque no hay ningún protocolo paso a paso disponible en la literatura.

Mientras tanto, la técnica de la olla enferma implica la preparación de un posible cultivo enfermo y la imposición de estrés por sequía. Dado que el estrés por sequía agrava la incidencia de la enfermedad de la RR3, es esencial estudiar la interacción planta-patógeno bajo estrés por sequía6,7. La técnica de la olla enferma proporciona la plataforma para un estudio simultáneo, promoviendo mejores posibilidades para el cribado del germoplasma y la comprensión de la base mecanicista de la interacción. Los cambios patomorfológicos, como el aumento de la longitud de la raíz y la reducción del número de raíz lateral, inherentes a la enfermedad de RR, se pueden abordar utilizando la técnica de la maceta enferma1,3,7.

En este documento, se presenta un protocolo detallado para el papel hinchado y las técnicas de maceta enferma, que se puede utilizar para estudiar la interacción entre el garbanzo y R. bataticola y el germoplasma de garbanzos de pantalla. Los detalles de los materiales utilizados en el estudio se indican en la Tabla de materiales.

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Protocol

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1. Aislamiento de R. bataticola y almacenamiento

  1. Detalles del genotipo de garbanzos y los síntomas de la RR
    1. Utilice plantas de garbanzos (genotipo, JG 62) que generalmente muestran síntomas típicos de DRR, como raíz primaria seca y quebradiza sin raíces laterales y microesclerotia debajo de la corteza y dentro de la pith1,3.
  2. Recogida y lavado
    1. Desarraiga las plantas que muestran síntomas como raíz primaria foliar de color paja seca y raíz primaria quebradiza con microsclerotia bajo la capa de epidermis. Durante el desarraigo, una parte importante de las raíces permanecerá dentro del suelo ya que las raíces infectadas son frágiles. Retire los restos de tierra gruesos unidos a la raíz. Cortar las raíces por separado y recogerlas en sobres de papel (27,5 cm x 12 cm) con la etiqueta adecuada y colocarlas en una caja de recogida de muestras.
    2. Después de transportar muestras al laboratorio, coloque las raíces en un vaso de precipitados de 200 ml y cúbralas con malla (malla de nylon con el tamaño de poro de 3 mm de diámetro), y lave bien las raíces con agua corriente del grifo para eliminar las partículas de suelo adherentes.
    3. Use agua de ósmosis inversa (RO) para enjuagar una vez al final.
  3. Esterilización superficial
    1. Romper las raíces en cuatro trozos con 2 cm de longitud cada una con una cuchilla de bisturí y ponerlas en un vaso limpio de 200 ml.
    2. Montar agua RO autoclavada, 2% NaOCl, tarro de descarte y papel de hinchazón autoclavado (5 cm2) dentro de la cámara de flujo laminar.
    3. Lavar las raíces con 50 ml de agua RO autoclaveda tres veces y luego con 50 mL de 2% NaOCl durante 10 min. Lavar las raíces con 50 ml de agua RO tres veces más para eliminar el NaOCl.
    4. Blot secar las raíces colocando las raíces en papel hinchado autoclavado y dejar hasta que las raíces se sequen.
  4. Medios de comunicación e incubación
    1. Retire los bordes de las raíces con una hoja de bisturí esterilizada. Divida las raíces con la cuchilla y utilice los fórceps esterilizados para colocarlas en un agar dextrosa de patata (PDA) media petri placa que contiene sulfato de estreptomicina (50 mg L-1) y ampicilina (50 mg L-1).
    2. Cierre la placa, selle con parafilma e incubar en una incubadora a 28oC durante dos días en la oscuridad.
  5. Método de punta hyphal
    1. Después de dos días de incubación, lleve las placas a la cámara de flujo laminar. Corte la punta del crecimiento hiphal8 bajo un estereomicroscopio (estereomicroscopio educativo Leica EZ4) y transfiéralo a una placa PDA fresca con sulfato de estreptomicina y ampicilina.
    2. Incubar las placas en la incubadora a 28oC durante diez días en la oscuridad.
  6. Almacenamiento y mantenimiento del inóculo fúngico R. bataticola
    1. Haga inclinaciones PDA en tubos de ensayo y transfiera un tapón de agar fúngico desde una placa de cultivo de diez días de edad utilizando el bucle de inoculación esterilizado por llama. Selle la tapa del tubo de ensayo con parafilm.
    2. Incubar las inclinaciones a 28oC durante diez días en la oscuridad.
    3. Selle la tapa con parafilm y guárdela a 4oC en el frigorífico para su uso futuro.
    4. Subcultura cada seis meses para mantener el hongo.
  7. Mantenimiento de la virulencia
    1. Infectar las plantas con puro inóculo fúngico preparado como se menciona en la técnica de la olla enferma3. Aislar el mismo hongo de las plantas infectadas (posttes de Koch)9 y utilizarlo para otros experimentos.
      NOTA: En este estudio, se utilizó una cepa aislada de campo del hongo (GenBank: MH509971.1 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MH509971)

2. Técnica de papel de hinchazón

NOTA: La técnica del papel hinchado implica la preparación de inóculo de hongos líquidos, preparación de plántulas y evaluación de enfermedades.

  1. Preparación del líquido R. bataticola inoculum
    NOTA: El inóculo fúngico líquido R. bataticola contiene micelia y microsclerotia. Ambas estructuras actúan como inóculo primario.
    1. Preparar 500 ml de medios PDB en un matraz de 1.000 ml y autoclavelo a 121 lb durante 15 min.
    2. Después de que el medio se enfríe, inocular el caldo con un bucle lleno de tapón de agar fúngico de un cultivo de inclinación fúngica e incubar a 28 oC durante cinco días en una coctelera a 180 rpm en la oscuridad.
    3. Montar un embudo de vidrio autoclaved o plástico (10 cm), matraz cónico de un litro y dos capas de malla (10 cm2 tamaño) (malla de nylon con el tamaño de los poros de 3 mm de diámetro) en la mesa. Filtra los micelios y microesclerotias fúngicas usando la malla. Seque el hongo en papel hinchado autoclavado.
    4. Pesar 100 g de micelio para 50% de inóculo y mantener a temperatura ambiente.
  2. Preparación de la planta de garbanzos
    1. Seleccione 50 semillas sanas (en este estudio, se utilizó el genotipo JG 62 susceptible de DRR), colóquelas en un vaso de precipitados de 100 ml y cúbralas con una malla.
    2. Lave primero las semillas con agua del grifo para eliminar los restos del suelo.
    3. Tome el vaso de precipitados con semillas en la cámara de flujo laminar y lávelas con 50 ml esterilizadas de agua RO tres veces durante 1 min por lavado.
    4. Esterilice las semillas con 50 ml de 2% de NaOCl acuoso durante 2 min con agitación continua y lave las semillas con 50 ml de agua esterilizada cinco veces durante 1 min cada una.
    5. Llenar una bolsa de polietileno (47,5 cm x 25 cm) con Soilrite (una mezcla de perlita expandida de grado hortícola, musgo de turba irlandesa y vermiculita exfoliada en igual proporción, es decir, 1/3:1/3:1/3), sembrar las 50 semillas esterilizadas en superficie de dos cm de profundidad, y mantener en una cámara/habitación de crecimiento con 28 oC ± temperatura de 2oC, fotoperiodo de 16 h con una intensidad de luz de 150 ma 2 s a1s y humedad relativa del 70%. Regarlos con agua RO y arrancar las plantas ocho días después de la siembra.
    6. Lave las raíces en el agua del grifo para eliminar las partículas de Soilrite. Enjuague las raíces con agua RO esterilizada y guárdalas en el agua RO en un vaso de precipitados de 1000 ml.
  3. Preparación de papel hinchado en bandejas
    1. Tome un papel hinchado y córtelo en trozos (30 cm × 23 cm) en números suficientes para cumplir con las réplicas.
    2. Empaque las hojas en una bolsa de polietileno autoclaveable y autoclavelas a 121 libras durante 15 minutos y guárdalas en un horno de aire caliente para secarlo.
    3. Doble cada hoja de papel hinchada por la mitad.
    4. Coloque el papel sobre una bandeja de plástico limpia y limpia, como se muestra en la Figura 2i-iv.
  4. Inoculación de plantas por inmersión
    1. Disolver 100 g de inóculo fúngico en agua RO autoclaveada de 200 ml en un vaso de precipitados de 200 ml para obtener un 50% de inóculo.
    2. Sumerja las raíces de la planta en el inóculo preparado durante 1 min con movimiento intermitente hacia arriba y hacia abajo para asegurar la fijación uniforme del inóculo fúngico.
  5. Colocar las plantas en el papel hinchado
    1. Humedezca el lado inferior del papel de hinchazón colocado en la bandeja con agua RO estéril. Coloque las plantas en el papel de una manera donde sólo las raíces están cubiertas por el papel, y las tomas se dejan fuera.
    2. Ciérralo doblando la parte superior del papel hinchado y moje todo el papel para proporcionar suficiente agua para sostener el crecimiento de la planta.
    3. Regar la bandeja una vez al día y mantener las bandejas a 28 oC. Observe los síntomas como necrosis, pudrición de la raíz y amarilleo de las hojas diariamente.

3. Técnica de la olla enferma

NOTA: La técnica de la olla enferma implica la preparación de un inóculo virulento y una maceta enferma, el mantenimiento del nivel de humedad y la evaluación de los síntomas de la enfermedad.

  1. Preparación del sustrato
    1. Tome un kg de cualquier semilla de garbanzo disponible comercialmente. Retire las semillas infectadas (semillas con crecimiento de hongos, manchas de infección y daños por insectos). Colóquelos en vaso de plástico de 5 L y lávelos con agua del grifo a fondo de 3 a 4 veces para eliminar los desechos principales.
    2. Lavar las semillas con 2 L de agua RO tres veces y remojar las semillas de 1 kg en un vaso de precipitados de 5 L con tres veces más de agua durante cinco h.
    3. Una vez que las semillas absorben el agua, vuelva a lavarlas con agua RO tres veces para eliminar los exudados de la semilla.
    4. Retire el agua por completo y empaque las semillas en botellas de mermelada (300 ml, 12 cm de altura, 6 cm de diámetro y 155 g de peso) a aproximadamente 1/4de capacidad (100 g por botella de mermelada) y cierre las botellas con tapas. Empaque diez botellas de mermelada en una bolsa de plástico autoclavable (48 cm x 30 cm) autoclave dos veces a 121 libras durante 15 minutos continuamente.
    5. Secar las semillas a 40oC en un horno durante la noche para eliminar las gotas de agua dentro de la botella.
  2. Preparación de la cultura enferma
    1. Encienda la cámara de flujo laminar de nivel BSL-2. Limpie bien el suelo con 70% de etanol y encienda UV durante 15 minutos. A continuación, mantenga las semillas dentro de la cámara de flujo laminar.
    2. Tomar 10 días de edad recién aislado cultivo de R. bataticola (parte 1). Luego, tome tres tapones de agar fúngico (4 mm de diámetro) usando una punta de pipeta estéril o un barrenador de corcho, y colóquelos en botellas de mermelada asépticamente. Cubra las botellas con tapas y selle con parafilm.
    3. Agitar las botellas para mezclar el disco de hongos con las semillas de garbanzo uniformemente.
    4. Incubar las botellas a 30oC durante 15 días o la oscuridad.
    5. Tome botellas de mermelada con crecimiento de hongos negros(Figura 4iii)y transfiera el cultivo enfermo (semillas con microsclerotia) de botellas de mermelada a una placa petri de vidrio utilizando fórceps estériles. Secarlos a temperatura ambiente durante dos días en una placa de petri de vidrio.
    6. Polvo de la masa fúngica utilizando un mortero y pestillo, y almacenar el polvo a 4 oC.
    7. Autoclave Soilrite dos veces a 121 lbs durante 15 min.
    8. Seque la mezcla de Soilrite autoclaved bajo una sombrilla.
    9. Mezclar el polvo de hongos con Soilrite al 50% p/p, llenar las ollas con la mezcla y mantenerlas a temperatura ambiente durante un día.
    10. Sembrar una semilla de garbanzo susceptible de DRR esterilizada por superficie (macetas redondas de 10 cm)(Tabla de Materiales)y mantener un nivel de humedad del 80% de capacidad de campo (FC).
    11. Observe los síntomas como necrosis y pudrición de la raíz desarraigando las plantas después de la germinación.
  3. Evaluación de la eficiencia de la maceta enferma
    NOTA: Las plantas muestran síntomas foliares amarillos cuando las raíces están completamente podridas.
    1. Desarrollar una puntuación de la enfermedad basada en los números de la lesión (manchas necróticas)(Figura suplementaria 2C)y la gravedad de la podredumbre de la raíz. Las macetas enfermas que muestran el 90% de la muerte de las plantas se pueden utilizar más.
  4. Examen de genotipos
    1. Preparar el cultivo enfermo en grandes cantidades y mezclarlo con Soilrite esterilizado o suelo de campo (5% p/p) en macetas de 30 cm de altura. Regar las ollas para humedecer la superficie y dejarlas intactas durante siete días.
    2. Sembrar una semilla esterilizada en superficie por maceta redonda de 10 cm y tres semillas por macetas redondas de 30 cm y regarlas adecuadamente.
    3. Observe los síntomas de pudrición foliar amarilla y de la raíz.
  5. Sequía combinada e infección por R. bataticola
    1. Imponer estrés por sequía siguiendo los protocolos mencionados en Sinha et al. (2019).

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Representative Results

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Este estudio tenía como objetivo demostrar técnicas como el papel hinchado y las técnicas de la olla enferma para facilitar la comprensión patomorfológica y molecular de la interacción entre plantas y patógenos bajo estrés por sequía. Para lograr esto, las plantas que presentan síntomas de DRR1,3,4 fueron recogidos de un campo de garbanzos, y el hongo fue aislado utilizando el método de punta hipórica8. R. el cultivo de hongos bataticola aparece de color gris oscuro en la placa PDA y se inclina en cuatro días después de la incubación (Figura 1A y C) y más oscuro en color gris en el medio PDB en cinco días después de la incubación (Figura 1B). R. bataticola tiene micelio septato(Figura 1D),y produce microesclerotia (Figura 1E), que actúan como inóculo primario en el suelo10.

Se siguieron los pasos indicados en la Figura 2 para ejecutar la técnica del papel hinchado. Las plantas de ocho días de edad se infectaron con inóculo líquido (50%), y ocho días después de la infección, se observaron plantas para los síntomas. Las plantas mostraron pudrición de la raíz debido a la necrosis extensa, así como el amarillento de las hojas, que es la raíz típica y los síntomas foliares de la enfermedad drR(Figura 3B y Figura suplementaria 1A).

La técnica de la olla enferma se llevó a cabo siguiendo los pasos que se muestran en la Figura 4. Las concentraciones de inóculo fúngico en Soilrite y suelo de campo fueron del 10% y 5%, respectivamente. Las semillas susceptibles a la RDR muestran los síntomas típicos de la RDR, como la podredumbre de la raíz, la falta de raíces laterales, el amarilleo de las hojas y la muerte prematura, en comparación con las plantas de control(Figura 5A y B). Las plantas sometidas a infección en la olla enferma hecha con Soilrite murieron y mostraron pudrición de la raíz siete días después de la siembra(Figura 5C y Figura Complementaria 2C). Mientras tanto, las plantas que crecen en la olla enferma hecha con suelo de campo mostraron síntomas foliares típicos, es decir, follaje de color paja 48 días después de la siembra (Figura 5E).

La influencia de la sequía en la enfermedad de DRR también se estudió en la olla enferma en condiciones de laboratorio. El estrés por sequía se impuso reteniendo el agua3. Las plantas sometidas a estrés por sequía (30% FC) mostraron una incidencia agravada de la enfermedad en comparación con las plantas tratadas con patógenos (90% FC)(Figura 6A y B). Las plantas de control y tratadas por sequía no mostraron ningún síntoma(Figura 6A y B). Las raíces bajo estrés combinado tenían más manchas necróticas y pudrición en comparación con las plantas sólo patógenas(Figura 6B).

Figure 1
Figura 1: Características morfológicas de Rhizoctonia bataticolaEl agente causal de la podredumbre de la raíz seca (Rhizoctonia bataticola, ITCC 8635) se aisló del campo (Instituto Nacional de Investigación del Genoma Vegetal, Nueva Delhi, 28.6139o N, 77.2090o E). De las culturas, el hongo fue aislado usando el método de puntahifalal 8. Las imágenes muestran el cultivo de R. bataticola de 4 días de edad en agar dextrosa de patata en una placa de Petri(A),cultivo líquido de 5 días de edad (B), y 10 días de edad de edad cultivo inclinado (C). El micelio fúngico (D) y la microsclerotia (flechas negras) (E) se burlaron de un portaobjetos del microscopio y se teñiron con WGA-FITC y azul anilina, respectivamente. Las imágenes(E, F,barra de escala, 20 y 50 m) fueron capturadas bajo la lente objetivo 20x y 40x de un microscopio epifluorescente. Las flechas blancas muestran las paredes cruzadas en el micelio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Pasos involucrados en la inoculación de R. bataticola y en los ensayos de DRR en la técnica del papel hinchado. La superficie esteriliza las semillas pasándolas a través del agua corriente del grifo y lavándolas con un 2% de hipoclorito de sodio, seguido de un lavado con agua RO estéril de 3 a 4 veces (paso 1). A continuación, sembrar 30 semillas en macetas de 15 cm de altura que contengan Soilrite (paso 2) y permitir que las semillas crezcan durante ocho días en una sala de crecimiento con 28 oC ± temperatura de 2oC, fotoperiodo de 16 h con una intensidad de luz de 150 ma 2 sa 1s y humedad relativa del 70% (paso 3). Desarraigue las plantas y lávelas con agua esterilizada (paso 4). Preparar el inóculo fúngico inoculando medios PDB de 500 ml con hongos (paso 5). Para la infección, utilice el cultivo de caldo fúngico de 5 días de edad. Luego, inocular las plantas sumergiendo las raíces en el inóculo fúngico en un vaso de precipitados durante 30 s y eliminar el exceso de inóculo tocando la pared lateral interna del vaso de precipitados (paso 6). Después de la infección, coloque las plantas inoculadas y simuladas de hongos en diferentes papeles de hinchazón en bandejas limpias separadas (paso 7). Humedezca diariamente el papel hinchado con agua estéril adecuada y observe los síntomas, viz., desprendimiento de raíces laterales, amarillento y marchitamiento de las hojas de las plantas, semillas podridas y pudrición de la raíz a los ocho días después de la infección (paso 8) (A). Las imágenes representan pasos esenciales (pasos 3–7) (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Síntomas de la enfermedad de RR en garbanzos basados en la técnica del papel hinchado. Siguiendo el protocolo descrito en la Figura 2, las plantas susceptibles a la RR (genotipo, JG 62) fueron sometidas a infección utilizando la técnica del papel hinchado, y los síntomas fueron capturados ocho días después de la infección. Las imágenes muestran las plantas de control representativas (inoculadas) con brotes sanos (flecha roja) y raíces con más raíces laterales (flecha amarilla) (A). Las imágenes muestran las plantas infectadas representativas con síntomas típicos, como marchitamiento, amarillento y secado de hojas (flechas azules) y raíces secas/necróticas con menos raíces laterales (flechas blancas) (B). La barra de escala es de 1 cm. Los experimentos se repitieron al menos cinco veces. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Visión general de la preparación de la maceta enferma para la inoculación de R. bataticola y los ensayos de la enfermedad de RR. Preparar el inóculo fúngico inoculando una placa PDA con un disco fúngico de 5 mm de cultivo de hongos en crecimiento activo e incubar a 28oC durante diez días. Luego, para preparar el sustrato, lavar las semillas de garbanzo con agua del grifo, remojar las semillas en agua durante la noche, y autoclave a 121 libras durante 15 min. A continuación, inocular 100 g del sustrato con tres tapones de agar de cultivo de 10 días de edad y mezclar bien. A continuación, incubar el sustrato inoculado a 30oC durante 15 días en una incubadora. Aplastar el cultivo enfermo (sustrato cultivado por hongos), secarlo y en polvo, y almacenarlo a 4 oC. A continuación, mezclar 50 g de cultivo enfermo con 100 g de Soilrite seco a fondo (olla enferma) (A). Luego, siembra las semillas de garbanzo susceptibles esterilizadas en la superficie y observa los síntomas, viz., pudrición de la raíz del grifo, necrosis de raíz lateral y coloración amarillenta de las hojas. Asimilar las plantas mostrando síntomas en la misma olla. Para otros experimentos, utilice las macetas que muestran 90% de infección como el genotipo susceptible. Las imágenes representan el inóculo (i), el sustrato (ii) y el cultivo enfermo de control e inoculado (iii) (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Síntomas de la enfermedad de RR en el garbanzo basados en la técnica de la olla enferma. Para hacer una olla enferma, se utilizó el protocolo representado en la Figura 4. A continuación, se sembraron semillas de garbanzos susceptibles de DRR esterilizadas por superficie (JG 62) en el control (A) y en la olla enferma (B). Cada planta en la olla representa una réplica, y el crecimiento de la planta muerta o atrofiada se observó en la olla enferma. Las plantas en el lado derecho del panel (C) indican la presencia y ausencia de raíces laterales (flecha amarilla) en el control y tratamiento, respectivamente. El gráfico muestra el número de plantas muertas en el tratamiento de la olla enferma en comparación con el control (D). La olla enferma se preparó en suelo de campo esterilizado recogido del campo NIPGR, y el cultivo enfermo fue mixto. Se se sembraron semillas esterilizadas con superficie y se capturaron los síntomas de la enfermedad 48 días después de la siembra. La imagen muestra las plantas de control (E), y se indican los síntomas foliares típicos de DRR, a saber, el secado de plantas (flechas blancas). La importancia estadística se determinó usando la prueba tdel estudiante. La barra representa el SEM de nueve réplicas biológicas, y el asterisco denota un valor estadísticamente significativo en P < 0.0001. La flecha amarilla indica la raíz primaria necrótica/podrida y seca sin raíces laterales. Los experimentos se repitieron al menos diez veces, con resultados similares. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: El método de la olla enferma es útil para estudiar la influencia del estrés por sequía en la interacción entre plantas y patógenos. Se llevó a cabo un experimento de maceta para estudiar el efecto de la sequía en la infección por R. bataticola. El experimento comprendía control, solo por sequía, solo patógenos(R. bataticola,patógeno), y sequía combinada y estrés R. bataticola (estrés combinado). Las plantas se cultivaron en una sala de crecimiento con una temperatura de 28oC ± 2oC, un fotoperiodo de 16 h con una intensidad lumínica de 150 ma 2 s a1y una humedad relativa del 70%. La olla enferma se preparó siguiendo el protocolo descrito en la Figura 4. Luego, se sembraron semillas de genotipo de garbanzos susceptibles de DDR (JG 62) esterilizadas en superficie en macetas de control y enfermas. Los tratamientos de control y patógenos fueron regados a lo largo del experimento. Se impuso estrés por sequía a las plantas sometidas a sequías y al tratamiento combinado del estrés. El agua se retuvo 18 días después de la siembra, y el nivel de sequía deseado se alcanzó 24 días después de la siembra. Se observaron plantas para los síntomas 29 días después de la siembra. La imagen muestra los cambios foliares y de raíz bajo tratamientos (A). Las imágenes muestran raíces vegetales no manchadas observadas bajo la lente objetivo 0.5X de un estereomicroscopio de investigación SMZ25/SMZ18 (B). La flecha roja indica las raíces laterales no infectadas, y las flechas negras indican las raíces laterales infectadas. Los experimentos se repitieron al menos diez veces, con resultados similares. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura suplementaria S1: Tamaño del inóculo y reducción del número de raíz lateral en el garbanzo. Siguiendo el protocolo descrito en la figura 2, las plantas susceptibles a la RR (genotipo, JG 62) fueron sometidas a infección con un tamaño variado de inóculo utilizando la técnica de papel hinchado, y los síntomas fueron capturados ocho días después de la infección. Las plantas fueron inoculadas con un tamaño de inóculo variado (0,1%, 1%, 10% y 20% p/v en agua)Las imágenes muestran las plantas infectadas representativas con síntomas típicos como marchitamiento, amarilleo y secado de hojas y raíces secas/necróticas con raíces laterales menos (B). Gráfico muestra el número de raíces laterales en plantas bajo infección con variación de inóculo (B). La barra de la báscula es de 1 cm. n.o 10. Haga clic aquí para descargar esta figura.

Figura suplementaria S2: Síntomas foliares de DRR en garbanzos en suelo. Siguiendo el protocolo descrito en la figura 4, se sembraron semillas esterilizadas superficiales, y los síntomas de la enfermedad fueron capturados los 14 días después de la siembra. La imagen representativa muestra las plantas de control (A), y la imagen muestra los síntomas foliares típicos de DRR, a saber, el secado de plantas (flechas blancas) (B). La puntuación de la enfermedad se desarrolló a partir de manchas necróticas en las raíces. La puntuación se desarrolló a lo largo de los días (C). Las fotografías (A&B) son del mismo experimento. Barra de escala de 3 cm. no 10. Haga clic aquí para descargar esta figura.

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Discussion

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La técnica del papel hinchado proporciona un enfoque sencillo para examinar los genotipos de garbanzos en condiciones de laboratorio. La inoculación por inmersión permite la investigación de la interacción de forma temporal con un fácil control sobre la carga de inóculo(Figura complementaria 1) y facilita el cribado in vitro. Además, incluso se pueden utilizar plántulas jóvenes. El cultivo de hongos de cinco días de edad (Figura 1B) puede producir suficiente inóculo para infectar las plantas. El inóculo líquido contiene micelio y microsclerotia(Figura 1D & E). Los síntomas de pudrición de raíz (Figura 3B) se pueden utilizar para puntuar la enfermedad e identificar genotipos resistentes. La ocurrencia de RR está influenciada principalmente por la tensión de sequía1,3,5. Sin embargo, solo con esta técnica, la imposición del estrés por sequía es imposible, y el cribado con esta técnica no reflejará las respuestas naturales.

La técnica de la olla enferma permite el estudio de las interacciones entre plantas, patógenos y estrés por sequía. Proporciona una manera de examinar los genotipos bajo sequía combinada y estrés patógeno para identificar genotipos resistentes. En una olla enferma, el estrés por sequía se puede imponer a cualquier edad de la planta y examinar las plantas. Las plantas muestran síntomas típicos de DRR(Figura 5C y F y Figura Suplementaria 2B y C) en el método de la olla enferma. Las plantas sometidas a sequía combinada e infección por patógenos mostraron una grave podredumbre de la raíz en comparación con el tratamiento solo con patógenos. Esto implica que el germoplasma de garbanzo disponible necesita ser examinado para identificar un genotipo resistente no sólo al patógeno, sino también al estrés combinado de patógenos y sequías. Se intentaron varios estudios antes para examinar los genotipos, pero mediante el uso de la técnica de papel hinchado11,12. Además, también se ha llevado a cabo un cribado sobre el terreno, pero sin imponer el estrés por sequía11. Es crucial imponer estrés por sequía durante las diferentes etapas del garbanzo y evaluar la respuesta del genotipo.

Problemas

Para la técnica de papel hinchado, el volumen del inóculo en el vaso de precipitados debe estar en el nivel donde se sumerge toda la raíz de la planta. Además, el exceso de riego conducirá a la podredumbre húmeda de las raíces de la planta. No utilice agua del grifo para regar las plantas porque puede causar contaminación.

Para la técnica de la olla enferma, las variedades de garbanzo Desi son preferibles. El número de semillas puede variar dependiendo de las necesidades de los investigadores. El volumen de agua utilizado para remojar las semillas debe ser tres veces más porque las semillas absorben agua. El crecimiento bacteriano se producirá si el lavado no se realiza correctamente. El agua no autoclavada se puede utilizar para remojar las semillas. El color de las semillas después del autoclaving debe ser negro en lugar de marrón, lo que indica un autoclavo incorrecto. Sobre el secado en un horno de aire caliente conduce al secado de semillas; tales semillas no se pueden utilizar para la inoculación de hongos. La inoculación de las botellas fuera del flujo laminar puede causar contaminación. El crecimiento de hongos blancos en la comida de garbanzos inoculadas es un signo de autoclaving inadecuado. Se deben seguir las precauciones de bioseguridad al desechar el inóculo, el papel hinchado y las plantas infectadas utilizadas.

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Disclosures

No tenemos nada que revelar

Acknowledgments

Los proyectos en el laboratorio M.S.K cuentan con el apoyo de la financiación básica del Instituto Nacional de Investigación del Genoma Vegetal. VI reconoce DBT- JRF (DBT/2015/NIPGR/430). Agradecemos a las estudiantes en prácticas, a la señorita Rishika, al Sr. Jayachendrayan y a la señorita Durgadevi por la ayuda técnica durante el rodaje de vídeo y al Sr. Sandeep Dixit, a la señorita Anjali y al Dr. Avanish Rai por evaluar críticamente los datos en bruto y los archivos manuscritos. Agradecemos al Sr. Rahim H Tarafdar y al Sr. Sunder Solanki su ayuda en el laboratorio. Reconocemos al Consorcio DBT-eLibrary (DeLCON) y a la Biblioteca NIPGR por proporcionar acceso a los recursos electrónicos y al Fondo de Crecimiento de Plantas NIPGR para el apoyo/espacio para el crecimiento de la planta.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fungus- Rhizoctonia bataticola Pathogen inoculum Indian Type Culture Collection No. 8365 GenBank: MH509971.1, ITCC 8635 (https://www.iari.res.in/index.php?option=com_content&view=article&
id=1251&Itemid=1370)
Soilrite mix Soil medium in the lab Keltech Energies Limited, Bangalore, India http://www.keltechenergies.com/
Filter paper Blotting paper to support the plant growth Himedia http://himedialabs.com/catalogue/chemical2017/index.html#374
Pot Growing plants 10 and 30 cm size pots Routinely used nursery pots, for example, https://dir.indiamart.com/impcat/nursery-pots.html
Potato dextrose agar/broth Culture and maintain the fungus Cat# 213400, DifcoTM, MD, USA https://www.fishersci.com/shop/products/bd-difco-dehydrated-culture-media-potato-dextrose-agar-3/p-4901946
Incubator Culture the fungus LOM-150-2, S/N AI13082601-38, MRC, incubator, and shaker http://www.mrclab.com/productDetails.aspx?pid=91131
Growth chamber Growing plants in controlled condition Model No. A1000, Conviron, Canada https://www.conviron.com/products/gen1000-reach-in-plant-growth-chamber
Laminar airflow Carrying out aseptic exercises Telstar, Bio II advance, Class II cabinet, EN-12469-2000 https://www.telstar.com/lab-hospitals-equipment/biological-safety-cabinets/bio-ii-advance-plus/, http://www.atlantisindia.co.in/laminar-air-flow.html
Mesh Filtering the fungal mycelia Nylon mosquito net Mesh with 0.6-1 mm diameter pore size
Autoclave Autoclaving media and chickpea seeds Autoclave http://www.scientificsystems.in/autoclave
Microscopes Visualizing the infection ang fungal mycelia SMZ25 / SMZ18, Research Stereomicroscopes, Leica EZ4 educational stereomicroscope https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18

https://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/p/leica-ez4/

https://www.microscopyu.com/museum/eclipse-80i
Weighing balance Weighing fungus and chemicals Sartorius Electronic Weighing Balance, BSA 4202S-CW https://www.sartorius.com/en/products/weighing/laboratory-balances
WGA-FITC Fungus staining Sigma https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l4895?lang=en&region=IN
Aniline blue Fungus staining Himedia http://www.himedialabs.com/intl/en/products/Chemicals/Dyes-Indicators-and-Stains/Aniline-blue-Water-soluble-Practical-grade-GRM901

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sharma, M., Ghosh, R., Pande, S. Dry root rot (Rhizoctonia bataticola (Taub.) Butler): an emerging disease of chickpea - where do we stand. Archives of Phytopathology and Plant Protection. 48, (13-16), 797-812 (2015).
  2. Srinivas, P. Studies on dry root rot of chickpea (Cicer arietinum L.). Available from: http://krishikosh.egranth.ac.in/handle/1/93135 (2016).
  3. Sinha, R., Irulappan, V., Mohan-Raju, B., Suganthi, A., Senthil-Kumar, M. Impact of drought stress on simultaneously occurring pathogen infection in field-grown chickpea. Scientific Reports. 9, (1), (2019).
  4. Nene, Y., Haware, M., Reddy, M. Chickpea diseases: resistance screening techniques, information bulletins No. 10. Patancheru. Information Bulletin No. 10. Patancheru, A.P., India: International CroDS Research Institute for the Semi-Arid Tropics. 1-10 (1981).
  5. Pande, S., Krishna Kishore, G., Upadhyaya, H. D., Narayana Rao, J. Identification of sources of multiple disease resistance in mini-core collection of chickpea. Plant Disease. (2006).
  6. Pandey, P., Irulappan, V., Bagavathiannan, M. V., Senthil-Kumar, M. Impact of combined abiotic and biotic stresses on plant growth and avenues for crop improvement by exploiting physio-morphological traits. Frontiers in Plant Science. 8, (2017).
  7. Irulappan, V., Senthil-Kumar, M. Morpho-physiological traits and molecular intricacies associated with tolerance to combined drought and pathogen stress in plants. Biotechnologies of Crop Improvement, Volume 3: Genomic Approaches. (2018).
  8. Jensen, A. B., et al. Standard methods for fungal brood disease research. Journal of Apicultural Research. 52, (1), 1-39 (2013).
  9. Agrios, G. Plant Pathology: Fifth Edition. 9780080473 (2004).
  10. Coley-Smith, J. R., Cooke, R. C. Survival and germination of fungal sclerotia. Annual Review of Phytopathology. (1971).
  11. Nagamma, G., Saifulla, M., Sab, J., Pavitra, S. Screening of chickpea genotypes against dry root rot caused by Macrophomina phaseolina (tassi) goid. 10, (4), 1795-1800 (2015).
  12. Infantino, A., et al. Screening techniques and sources of resistance to root diseases in cool season food legumes. Euphytica. 147, (1-2), 201-221 (2006).
  13. Khaliq, A., et al. Integrated control of dry root rot of chickpea caused by Rhizoctonia bataticola under the natural field condition. Biotechnology Reports. 25, 00423 (2020).
Ensayos de la enfermedad de ladrido de raíz seca en el garbanzo: una metodología detallada
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Irulappan, V., Senthil-Kumar, M. Dry Root Rot Disease Assays in Chickpea: a Detailed Methodology. J. Vis. Exp. (167), e61702, doi:10.3791/61702 (2021).More

Irulappan, V., Senthil-Kumar, M. Dry Root Rot Disease Assays in Chickpea: a Detailed Methodology. J. Vis. Exp. (167), e61702, doi:10.3791/61702 (2021).

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