Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

鹰嘴豆的干根罗特病测定:详细方法

Published: January 17, 2021 doi: 10.3791/61702

Summary

本研究提出了研究鹰嘴豆-瑞佐克托马基亚相互作用背后的病理形态和分子机制 的方法。印迹纸方法可用于快速研究鹰嘴豆基因型反应,而病锅基方法可用于同时 施加干旱和R.巴塔蒂奥拉感染 和筛选耐受基因型。

Abstract

干根腐烂 (DRR) 疾病是世界各地鹰嘴豆种植的一种新兴生物压力威胁。它是由土壤传播的真菌病原体 Rhizoctonia巴塔蒂奥拉引起的。在文献中,关于疾病测定的全面和详细的分步协议是稀疏的。本文详细介绍了设置印迹纸技术以快速筛选基因型以抵抗 DRR 的步骤。印迹纸技术简单易用,成本更低。另一种基于病锅方法的方法是自然感染的模仿,可用于研究疾病三角中涉及的相互作用的成分——植物、病原体和环境。

此外,在自然界中,DRR主要发生在雨中鹰嘴豆种植区,那里的土壤水分随着作物生长的推进而消退。众所周知,干旱压力使鹰嘴豆植物容易患 DRR 疾病。对干旱压力下植物-病原体相互作用的病理和分子理解可以为从鹰嘴豆种质池中鉴定优质耐数 DRR 品种铺平道路。本文提供了一个逐步的方法,用于准备病锅和随后的疾病测定。总体而言,本文提供的信息将帮助研究人员准备 R.巴 塔基托真菌孵化,维持这种病原体,建立印迹纸技术,准备病菌培养和病锅,并评估鹰嘴豆植物的病原体感染。

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

干根腐烂(DRR)是鹰嘴豆1,2中具有经济意义的疾病之一。这是一种根特异性疾病,由Rhizoctonia巴塔蒂奥拉(电图,巨管,相相) 引起。受感染的植物缺乏横向根,并拥有脆脆的锥根和黄叶1,3。据报道,在干旱压力下,DRR对鹰嘴豆种植1、2、3构成一种新威胁此外,据报道,在干旱压力下,在1、2、3的干旱压力下,DRR发生率会加剧。DRR在雨水灌溉地区比在灌溉田中更为普遍。利用耐药品种是战胜疾病和规避杀菌剂使用的方法。由于全球现有的鹰嘴豆种质具有遗传变异,因此对耐药/易感基因型的筛选和鉴定对于作物改良的分子育种至关重要。

强健、简单且具有成本效益的疾病检测对于调查鹰嘴豆的R.巴塔蒂奥拉感染模式至关重要。用于观察鹰嘴豆基因型对R.巴塔基奥拉感染反应的主要疾病分析是印迹纸技术1,4。这是一种简单的技术,可以使用液体真菌注射液,带根的幼苗和无菌印迹纸执行。但是,由于文献中没有提供分步协议,因此未充分利用此技术。

同时,病锅技术涉及准备潜在的病文化,并施加干旱压力。鉴于干旱压力加重了干旱病的发病率3,研究干旱压力下植物病原体相互作用6、7至关重要。病锅技术为这种同步研究提供了平台,促进种质筛选的更好可能性,并理解相互作用的机械基础。病理变化,如根长增加和横向根数减少(DRR疾病固有的)可以使用病锅技术1、3、7加以解决

本文介绍了印迹纸和病锅技术的详细方案,可用于研究鹰嘴豆与 R.蝙 蝠豆和网眼鹰嘴豆种质之间的相互作用。研究中使用的材料的详细信息见《材料》。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. 分离 R. 巴塔蒂科拉 和储存

  1. 鹰嘴豆基因型和 DRR 症状的详细信息
    1. 使用鹰嘴豆植物(基因型,JG 62),通常显示典型的DR症状,如干燥,脆原根没有侧根和微丝皮皮下树皮和皮1,3。
  2. 收集和清洗
    1. 背井离乡的植物,如干稻草色叶和脆原根与微分皮下表皮层下的症状。在连根拔起时,大部分根茎将留在土壤内,因为受感染的根部是脆弱的。清除根部上的粗糙土壤碎屑。分别切割根部,用正确的标签将它们收集在纸信封(27.5 厘米 x 12 厘米)中,并放在样品收集盒中。
    2. 将样品运送到实验室后,将根放在 200 mL 烧杯中,用网状(直径为 3 mm 的孔径的尼龙网)覆盖,用自来水彻底清洗根部,以去除粘附的土壤颗粒。
    3. 使用反渗透 (RO) 水在结束时冲洗一次。
  3. 表面灭菌
    1. 将根部分成四块,每块长2厘米,每个片用手术刀刀片,并把它们放在一个干净的200 mL烧杯。
    2. 在层流室内组装自动处理RO水、2%NaOCl、丢弃罐和自动检装印迹纸(5厘米2)。
    3. 用 50 mL 的自动洗涤 RO 水三次清洗根部,然后用 50 mL 的 2% NaOCl 洗涤 10 分钟。用 50 mL RO 水再次清洗根部三次,以去除 NaOCl。
    4. 将根放在自动洗的印迹纸上,然后离开,直到根干。
  4. 媒体和孵化
    1. 用消毒手术刀刀片去除根部的边缘。使用刀片分割根部,并使用灭菌钳将它们放在含有硫酸链霉素 (50 mgL-1)和氨基林 (50 mg L -1 ) 的马铃薯葡萄糖琼脂 (PDA)介质培养盘上
    2. 关闭盘子,用副膜密封,并在28°C的培养箱中在黑暗中孵化两天。
  5. 催眠技巧方法
    1. 经过两天的孵育,将板放入层流室。在立体显微镜(LeicaEZ4 教育立体显微镜)下切开催眠生长8的尖端,将其转移到含有硫酸链霉素和氨基林的新鲜PDA板中。
    2. 在28°C下孵化板,在黑暗中孵育10天。
  6. R.巴塔蒂托拉真菌的储存和维护
    1. 在试管中制作PDA倾斜,并使用火焰消毒接种回路从十天大的培养板中转移真菌琼脂塞。用副膜密封试管盖。
    2. 在黑暗中在28°C下孵育倾斜物十天。
    3. 再次用准膜密封盖子,并将其存放在冰箱 4°C 中,供将来使用。
    4. 亚栽培每六个月维持真菌。
  7. 维持毒性
    1. 感染植物与纯真菌的真菌,如在生病的锅技术3中提到的准备。从受感染的植物中分离出相同的真菌(科奇的假设)9, 并用于进一步的实验。
      注:在这项研究中,使用了真菌的田间分离菌株(GenBank:MH509971.1 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MH509971)

2. 膨胀纸技术

注:印迹纸技术需要制备液体真菌,准备幼苗和疾病评估。

  1. 液体 R.巴塔蒂奥拉 花的制备
    注: 液体 R. 巴塔 蒂托拉真菌 inculum 含有菌丝和微丝。这两种结构都起到主孵化。
    1. 在 1,000 mL 烧瓶中准备 500 mL 的 PDB 介质,并在 121 磅下自动进行 15 分钟。
    2. 介质冷却后,用真菌倾斜培养的真菌加糖塞环为肉汤接种,并在 28 °C 下在黑暗中以 180 rpm 的摇床孵育五天。
    3. 组装一个自动处理的玻璃或塑料漏斗(10 厘米)、一升圆锥形烧瓶和两层网状(10 厘米2 大小)(尼龙网,孔径为 3 mm)。使用网格过滤掉真菌真菌和微丝。在自动洗的印迹纸中干燥真菌。
    4. 重量 100 g mycelia 为 50% 的幼崽,并保持在室温下。
  2. 鹰嘴豆植物的制备
    1. 选择50个健康的种子(在这项研究中,使用DR-易感基因型JG 62),将它们放在100 mL烧杯中,并覆盖一个网。
    2. 先用自来水清洗种子,清除土壤碎片。
    3. 将带种子的烧杯放入层流室,用消毒的 50 mL RO 水洗涤三次,每次洗涤 1 分钟。
    4. 用50 mL的2%水性NaOCl消毒种子2分钟,持续摇晃,用50 mL的灭菌水清洗种子5次,每次1分钟。
    5. 用土壤(园艺等级扩大的紫土、爱尔兰泥炭苔和去角质的紫土石的混合物,以相等的比例填充聚乙烯袋(47.5 厘米 x 25 厘米), 即, 1/3:1/3:1/3),播种表面消毒的50种子2厘米深,并保持在生长室/房间与28°C± 2°C温度,16小时光度,光度强度为150μmolm+2 s+1,相对湿度为70%。用RO水浇水,播种8天后将植物连根拔起。
    6. 在自来水中清洗根部以去除土壤颗粒。用消毒的 RO 水冲洗根部,并将它们放在 1000 mL 烧杯中的 RO 水中。
  3. 纸盒中印迹纸的准备
    1. 拿一张印迹纸,切成片(30 厘米× 23 厘米),数量足以满足复制要求。
    2. 将床单装在可自动可烘硅乙烯袋中,在 121 磅下进行自动处理 15 分钟,并放在热空气烤箱中晾干。
    3. 将每个印迹纸折成两半。
    4. 将纸张放在干净、精神饱满的塑料托盘上,如图 2i-iv 所示
  4. 通过浸渍进行植物接种
    1. 在200 mL的200 mL烧杯中溶解100克真菌的真菌,获得50%的入库。
    2. 将植物根在准备好的内分中浸1分钟,间歇性上下运动,以确保真菌的均匀附着。
  5. 将植物放在印迹纸中
    1. 用无菌 RO 水将印迹纸放在托盘上的底侧润湿。将植物放在纸上,只有根被纸覆盖,而芽则被抛在纸上。
    2. 通过折叠印迹纸的顶部并润湿整个纸张来关闭它,以提供足够的水来维持植物的生长。
    3. 每天为托盘浇水一次,将托盘保持 28 °C。 每天观察坏死、根部腐烂和叶黄等症状。

3. 病锅技术

注:病锅技术需要准备致命的心和病锅,保持水分水平,并评估疾病症状。

  1. 基材的制备
    1. 服用一公斤任何市售鹰嘴豆种子。去除受感染的种子(有真菌生长的种子、感染斑和昆虫损伤)。将它们放在 5 L 塑料烧杯中,用自来水彻底清洗 3~4 次,以清除主要碎屑。
    2. 用2升RO水洗涤三次,将1公斤种子浸泡在5升烧杯中,用3倍以上的水浸泡5小时。
    3. 一旦种子吸收水,用RO水重新洗涤三次,以去除种子出水。
    4. 完全去除水,将种子装在果酱瓶中(300 mL,12 厘米高,6 厘米直径,155 克重量)到约1/4 容量(每个果酱瓶 100 g),然后用瓶盖关闭瓶子。将 10 个果酱瓶装在可自动可回收塑料袋(48 厘米 x 30 厘米)中,在 121 磅时连续两次,连续 15 分钟。
    5. 在40°C的烤箱中将种子干燥一夜,以去除瓶内的水滴。
  2. 病态文化的准备
    1. 打开 BSL-2 级层流室。用 70% 乙醇彻底擦拭地板,然后打开紫外线 15 分钟。然后,将种子放在层流室内。
    2. 以10天大的新鲜隔离R. 巴塔蒂科拉文化( 第1部分)。然后,使用无菌移液器尖端或软木孔,服用三个真菌阿加塞(直径4毫米),并无菌地放入果酱瓶中。用盖子盖住瓶子,用副膜封住。
    3. 摇动瓶子,将真菌盘与鹰嘴豆种子均匀地混合。
    4. 在黑暗中在30°C下孵育瓶子15天。
    5. 以黑真菌生长的果酱瓶 (图 4i)和转移生病的培养(种子与微孢子)从果酱瓶到玻璃培养板使用无菌钳子。在室温下在玻璃培养皿中干燥两天。
    6. 使用砂浆和害虫粉状真菌质量,并在4°C下储存粉末。
    7. 在 121 磅下两次自动保存土壤,15 分钟。
    8. 在遮阳布下干燥自动洗干的土壤混合物。
    9. 将真菌粉与土壤混合在50%w/w,用混合物填充锅,并在室温下保持一天。
    10. 每盆(10厘米圆锅)播种表面消毒的DDR易感鹰嘴豆种子(材料),并保持80%的田间容量(FC)的水分水平。
    11. 观察症状,如坏死和根腐烂,通过连根拔起植物发芽后。
  3. 病锅效率评估
    注:当根部完全腐烂时,植物会出现黄叶状症状。
    1. 根据病变(坏死斑)(补充图2C)数和根性腐烂的严重程度制定疾病评分。显示 90% 植物死亡的病盆可以进一步使用。
  4. 基因型筛查
    1. 大量准备病菌,并在30厘米高的锅中与灭菌的土壤或田间土壤(5%w/w)混合。给锅浇水,使水罐湿润表面,让它们不受干扰七天。
    2. 每10厘米圆锅播种一个表面消毒种子,每30厘米圆锅播种三颗种子,并充分浇水。
    3. 观察黄色叶和根腐烂症状。
  5. 合并干旱 和 R. 巴塔蒂奥拉 感染
    1. 遵守Sinha等人(2019年)中提到的协议,施加干旱压力。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

本研究旨在展示印迹纸和病锅技术等技术,以促进病理和分子对干旱压力下植物-病原体相互作用的理解。为此,从鹰嘴豆田中采集出出现 DRR症状的植物 1、3、4,使用催眠技巧方法8分离真菌。R. 巴塔蒂托拉真菌培养在孵育后四天内在PDA板块上出现深灰色,在孵化后五天内在PDB介质中以灰色出现较深(图1B)。R.巴塔蒂科拉有隔膜的麦芽糖(图1D),它产生微丝细胞(图1E),在土壤10中作为初级的钙化物。

遵循图2 中给出的步骤来执行印迹纸技术。八天大的植物感染了液体内分(50%),感染后8天,观察到植物出现症状。植物出现根腐,因为广泛的坏死,以及叶黄,这是典型的根和叶症状的 DRR 疾病(图3B和补充图1A)。

病锅技术是使用图4所示的步骤进行的。土壤和田间土壤中真菌的浓度分别为10%和5%。与对照植物相比,DRR-易感种子显示典型的 DRR 症状,如根腐、缺乏横向根、叶黄和过早死亡(图5A 和 B)。用土壤制造的病盆中受感染的植物在播种后7天死亡并出现根部腐烂(5C和补充图2C)。同时,生长在用田间土壤制作的病盆中的植物表现出典型的叶质症状,即播种后48天出现稻草色叶(图5E)。

在实验室条件下,对干旱对病患疾病的影响进行了研究。干旱压力是由扣水3造成的。受干旱压力(30%FC)的植物与仅经过病原体治疗的植物(90%FC)相比,疾病发病率加重(图6A和B)。控制和干旱处理植物没有表现出任何症状(图6A和B)。与仅使用病原体的植物相比,联合应力下的根有更多的坏死斑和腐烂(图6B)。

Figure 1
图1:里佐佐尼亚巴塔蒂奥拉的特征形态特征干根腐烂的因果剂(Rhizoctonia巴塔蒂奥拉,ITCC 8635)从该领域分离(新德里国家植物基因组研究所,28.6139°N,77.2090°E)。从培养物中,用催眠技巧法8分离真菌。图片显示,在培养板(A),5天大的液体培养(B)和10天大的倾斜文化(C),马铃薯葡萄糖糖的R.巴蒂托拉文化。真菌真菌真菌 (D) 和微纤维 (黑色箭头) (E) 被戏弄在显微镜幻灯片上, 并分别沾染 WGA-FITC 和 Aniline 蓝色.图像(E、F、比例杆、20和50μm)是在荧光显微镜的20倍和40倍客观透镜下拍摄的。白色箭头显示在米西莉亚的十字墙。请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图2:在印迹 纸技术 中涉及R.巴他拉接种和 DRR 测定的步骤。表面通过自来水和洗涤2%次氯酸钠对种子进行消毒,然后用无菌RO水清洗3~4次(步骤1)。然后,在含有土壤的15厘米高的盆中播种30个种子(第2步),让种子在生长室生长8天,温度为28°C±2°C,16小时光度,光度为150μmol m+2 s+1,相对湿度为70%(步骤3)。将植物连根拔起,用消毒水清洗(步骤4)。通过用真菌接种 500 mL PDB 介质来准备真菌接种(步骤 5)。对于感染,使用5天大的真菌汤培养。然后,通过将根浸入烧杯中的真菌接种30 s,通过触摸烧杯的内侧壁(步骤6)去除多余的接种。感染后,将真菌接种和模拟接种的植物放在不同的印迹纸中,放在单独的清洁托盘中(步骤7)。每天用足够的无菌水润湿印迹纸,观察症状,即,从横向根脱落,植物叶子发黄和枯萎,腐烂的种子,和根腐烂在感染后八天(步骤8)(A)。图像表示基本步骤(步骤 3~7) (B)。 请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图3:基于印迹纸技术的鹰嘴豆的 DRR 疾病症状。按照图2中描述的协议,DRR-易感植物(基因型,JG 62)使用印迹纸技术受到感染,感染8天后发现症状。图像显示具有健康芽(红色箭头)和带更多横向根(黄色箭头)(A)的有代表性的控制植物(模拟接种)。图像显示具有典型症状的代表性感染植物,如枯萎、发黄和干燥的叶子(蓝色箭头)和干燥/坏死根,其横向根(白色箭头) (B).比例线为 1 厘米。实验至少重复了五次。 请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 4
图4:R.巴塔蒂 奥拉接种和 DRR 疾病测定的病锅准备概述。用5毫米真菌盘接种PDA盘,使真菌孵化,在28°C下孵育10天。然后,为了准备基板,用自来水清洗鹰嘴豆种子,将种子浸泡在水中过夜,并在121磅下进行15分钟的洗涤。然后,用10天养殖的三个阿加塞接种100克的基材,并很好地混合。然后,在30°C下在培养箱中孵育接种基板15天。粉碎病菌(真菌生长的基质),干燥和粉状,并储存在4°C。 然后,将50克病培养与100克干土石彻底混合(病锅)(A)。然后,播种表面灭菌的易感鹰嘴豆种子,观察症状,即,点击根腐烂,侧根坏死,和叶发黄。同化在同一锅中表现出症状的植物。对于进一步的实验,使用显示90%感染的锅作为易感基因型。图像表示接种 (i)、基板 (ii) 以及控制和接种的病种 (iii)(B)。 请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 5
图5:基于病锅技术的鹰嘴豆的 DRR 疾病症状。对于制造病锅,使用了图 4 中描述的协议。然后,在控制(A)和病锅(B)中播种表面灭菌-易感性鹰嘴豆基因型(JG62)种子。锅中的每一种植物代表一个复制,在病锅中观察到死亡或发育迟缓的植物生长。面板右侧的植物 (C) 分别表示控制和处理中存在和不存在侧根(黄箭头)。该图显示了与控制(D)相比,病锅治疗中死亡植物的数量。病锅是在从NIPGR田间收集的灭菌田土壤上准备的,病种混合。播种了表面灭菌种子,播种48天后就捕捉到了疾病症状。图像显示控制植物 (E), 和典型的 DRR 叶症状, 即植物的干燥, 指示 (白色箭头).统计显著性是使用学生 t-test 确定的。柱表示九个生物复制的 SEM,星号表示 P < 0.0001 时的统计显著值。黄色箭头表示坏死/腐烂,干主根没有任何横向根。实验至少重复了十次,结果相似。 请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 6
图6:病锅法有助于研究干旱应力对植物-病原体相互作用的影响。进行了一次盆栽实验,研究干旱对 R.巴塔蒂奥拉感染 的影响。实验包括控制、仅抗旱、仅病原体(R.巴塔蒂奥拉、病原体)以及干旱 和R.巴塔基奥拉压力( 联合应激)。植物生长在生长室,温度为28°C±2°C,16小时光度,光度为150°mol m±2 s+1,相对湿度为70%。病锅是按照图4中描述的协议准备的。然后,表面灭菌DDR易感鹰嘴豆基因型(JG 62)种子在控制和生病的锅中播种。在整个实验中,对照和病原体治疗都进行了灌溉。干旱压力强加于干旱和联合压力处理的植物。播种18天后缺水,播种后24天达到预期干旱水平。植物在播种后29天观察到症状。图像显示了治疗下的叶和根的变化 (A)。图像显示在 SMZ25/SMZ18 研究立体显微镜(B)的 0.5 倍客观透镜下观察到的未沾污的植物根。红色箭头表示未感染的横向根,黑色箭头表示受感染的横向根。实验至少重复了十次,结果相似。 请单击此处查看此图的较大版本。

补充图S1:鹰嘴豆中侧根数的内分体大小和侧根数的减少。 按照图2中描述的协议,DRR易感植物(基因型,JG 62)使用印迹纸技术受到不同大小的内分体感染,感染8天后发现症状。植物接种的接种大小各不相同(0.1%、1%、10%和20%w/v在水中)图像显示,具有典型症状的代表性受感染植物,如枯萎、发黄、树叶干燥和干燥/坏死根,其后生根较少(B)。图表显示了受真菌变异(B)感染的植物的横向根数。比例线为 1 厘米 n=10。 请点击这里下载此图。

补充图S2:土壤中鹰嘴豆中 DRR 的叶状症状。 按照图4中描述的协议,播种表面灭菌种子,在播种后14天内捕获疾病症状。代表性的图像显示控制植物 (A),图片显示典型的 DRR 叶状症状,即植物干燥(白箭头) (B)。疾病评分是根据根部上的坏死点而开发的。评分是跨天开发的 (C)。照片(A&B)来自同一个实验。比例线= 3 厘米 n= 10。 请点击这里下载此图。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

印迹纸技术为在实验室条件下筛选鹰嘴豆基因型提供了一种简单的方法。滴接种使在时间基础上的相互作用调查,易于控制接种负荷(补充图1),并方便体外筛查。此外,即使是年轻的幼苗也可以使用。五天大的真菌培养(图1B)可以产生足够的幼崽来感染植物.液体中分含有 mycelia 和微分体(图 1D & E)。根腐症状( 图 3B) 可用于评分疾病和识别耐药基因型.DRR 的发生主要受干旱应力1、3、5的影响。然而,仅靠这种技术,干旱压力的施加是不可能的,使用这种技术进行筛选不会反映自然反应。

病锅技术允许研究植物、病原体和干旱压力之间的相互作用。它提供了一种在干旱和病原体压力结合下筛选基因型以识别抗性基因型的方法。在生病的锅中,干旱压力可以在植物的任何年龄施加,并筛选植物。植物在病锅法中显示典型的 DRR 症状 (图5C & F和补充图2B & C)。与仅使用病原体的治疗相比,受干旱和病原体感染的植物出现严重的根腐。这意味着,现有的鹰嘴豆种质需要筛查,以确定一种抗性基因型,不仅病原体,而且结合病原体和干旱压力。早些时候曾尝试进行一些研究来筛选基因型,但使用印迹纸技术11,12。此外,现场筛查也进行了,但没有施加干旱压力11。在鹰嘴豆的不同阶段施加干旱压力并评估基因型反应至关重要。

故障拍摄

对于印迹纸技术,烧杯中的烧液体积应位于浸入整个植物根的水平上。此外,过量浇水会导致植物根部湿腐烂。请勿使用自来水给植物浇水,因为这样会导致污染。

对于生病的锅技术,德西鹰嘴豆品种是可取的。种子的数量可能因研究人员的需要而异。用来浸泡种子的体积应该增加三倍,因为种子吸收水。如果洗涤工作不正确,细菌就会生长。非自动处理水可用于浸泡种子。高压灭灭后种子的颜色应为黑色而不是棕色,表示高压灭灭不当。在热空气烤箱中过度干燥会导致种子干燥;这种种子不能用于真菌接种。在层流外给瓶子接种疫苗可能会导致污染。接种鹰嘴豆粉中的白真菌生长是不当高压灭菌的标志。在丢弃用过的花果、印迹纸和受感染的植物时,应遵循生物安全预防措施。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

我们没有什么可透露的

Acknowledgments

M.S.K 实验室的项目得到了国家植物基因组研究所核心资助的支持。VI 确认 DBT- JRF (DBT/2015/NIPGR/430)。我们感谢见习学生Rishika小姐、贾亚亨德拉扬先生和杜尔加德维小姐在录像拍摄期间提供技术帮助,并感谢桑迪普·迪克西特先生、安贾利小姐和阿瓦尼什·雷博士对原始数据和手稿文件进行批判性评估。我们感谢拉希姆·塔拉夫达尔先生和桑德·索兰基先生对实验室的帮助。我们感谢 DBT-e 图书馆联盟 (DeLCON) 和 NIPGR 图书馆提供访问电子资源和 NIPGR 工厂生长设施,用于植物生长支持/空间。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fungus- Rhizoctonia bataticola Pathogen inoculum Indian Type Culture Collection No. 8365 GenBank: MH509971.1, ITCC 8635 (https://www.iari.res.in/index.php?option=com_content&view=article&
id=1251&Itemid=1370)
Soilrite mix Soil medium in the lab Keltech Energies Limited, Bangalore, India http://www.keltechenergies.com/
Filter paper Blotting paper to support the plant growth Himedia http://himedialabs.com/catalogue/chemical2017/index.html#374
Pot Growing plants 10 and 30 cm size pots Routinely used nursery pots, for example, https://dir.indiamart.com/impcat/nursery-pots.html
Potato dextrose agar/broth Culture and maintain the fungus Cat# 213400, DifcoTM, MD, USA https://www.fishersci.com/shop/products/bd-difco-dehydrated-culture-media-potato-dextrose-agar-3/p-4901946
Incubator Culture the fungus LOM-150-2, S/N AI13082601-38, MRC, incubator, and shaker http://www.mrclab.com/productDetails.aspx?pid=91131
Growth chamber Growing plants in controlled condition Model No. A1000, Conviron, Canada https://www.conviron.com/products/gen1000-reach-in-plant-growth-chamber
Laminar airflow Carrying out aseptic exercises Telstar, Bio II advance, Class II cabinet, EN-12469-2000 https://www.telstar.com/lab-hospitals-equipment/biological-safety-cabinets/bio-ii-advance-plus/, http://www.atlantisindia.co.in/laminar-air-flow.html
Mesh Filtering the fungal mycelia Nylon mosquito net Mesh with 0.6-1 mm diameter pore size
Autoclave Autoclaving media and chickpea seeds Autoclave http://www.scientificsystems.in/autoclave
Microscopes Visualizing the infection ang fungal mycelia SMZ25 / SMZ18, Research Stereomicroscopes, Leica EZ4 educational stereomicroscope https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18

https://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/p/leica-ez4/

https://www.microscopyu.com/museum/eclipse-80i
Weighing balance Weighing fungus and chemicals Sartorius Electronic Weighing Balance, BSA 4202S-CW https://www.sartorius.com/en/products/weighing/laboratory-balances
WGA-FITC Fungus staining Sigma https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l4895?lang=en&region=IN
Aniline blue Fungus staining Himedia http://www.himedialabs.com/intl/en/products/Chemicals/Dyes-Indicators-and-Stains/Aniline-blue-Water-soluble-Practical-grade-GRM901

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sharma, M., Ghosh, R., Pande, S. Dry root rot (Rhizoctonia bataticola (Taub.) Butler): an emerging disease of chickpea - where do we stand. Archives of Phytopathology and Plant Protection. 48, (13-16), 797-812 (2015).
  2. Srinivas, P. Studies on dry root rot of chickpea (Cicer arietinum L.). Available from: http://krishikosh.egranth.ac.in/handle/1/93135 (2016).
  3. Sinha, R., Irulappan, V., Mohan-Raju, B., Suganthi, A., Senthil-Kumar, M. Impact of drought stress on simultaneously occurring pathogen infection in field-grown chickpea. Scientific Reports. 9, (1), (2019).
  4. Nene, Y., Haware, M., Reddy, M. Chickpea diseases: resistance screening techniques, information bulletins No. 10. Patancheru. Information Bulletin No. 10. Patancheru, A.P., India: International CroDS Research Institute for the Semi-Arid Tropics. 1-10 (1981).
  5. Pande, S., Krishna Kishore, G., Upadhyaya, H. D., Narayana Rao, J. Identification of sources of multiple disease resistance in mini-core collection of chickpea. Plant Disease. (2006).
  6. Pandey, P., Irulappan, V., Bagavathiannan, M. V., Senthil-Kumar, M. Impact of combined abiotic and biotic stresses on plant growth and avenues for crop improvement by exploiting physio-morphological traits. Frontiers in Plant Science. 8, (2017).
  7. Irulappan, V., Senthil-Kumar, M. Morpho-physiological traits and molecular intricacies associated with tolerance to combined drought and pathogen stress in plants. Biotechnologies of Crop Improvement, Volume 3: Genomic Approaches. (2018).
  8. Jensen, A. B., et al. Standard methods for fungal brood disease research. Journal of Apicultural Research. 52, (1), 1-39 (2013).
  9. Agrios, G. Plant Pathology: Fifth Edition. 9780080473 (2004).
  10. Coley-Smith, J. R., Cooke, R. C. Survival and germination of fungal sclerotia. Annual Review of Phytopathology. (1971).
  11. Nagamma, G., Saifulla, M., Sab, J., Pavitra, S. Screening of chickpea genotypes against dry root rot caused by Macrophomina phaseolina (tassi) goid. 10, (4), 1795-1800 (2015).
  12. Infantino, A., et al. Screening techniques and sources of resistance to root diseases in cool season food legumes. Euphytica. 147, (1-2), 201-221 (2006).
  13. Khaliq, A., et al. Integrated control of dry root rot of chickpea caused by Rhizoctonia bataticola under the natural field condition. Biotechnology Reports. 25, 00423 (2020).
鹰嘴豆的干根罗特病测定:详细方法
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Irulappan, V., Senthil-Kumar, M. Dry Root Rot Disease Assays in Chickpea: a Detailed Methodology. J. Vis. Exp. (167), e61702, doi:10.3791/61702 (2021).More

Irulappan, V., Senthil-Kumar, M. Dry Root Rot Disease Assays in Chickpea: a Detailed Methodology. J. Vis. Exp. (167), e61702, doi:10.3791/61702 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter